一种猫CD62L多肽抗原及其多克隆抗体的制备方法和应用与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一种猫cd62l多肽抗原及其多克隆抗体的制备方法和应用技术领域1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种猫cd62l多肽抗原及其多克隆抗体的制备方法和应用。背景技术：2.cd62l，又称为l选择素，属于淋巴结归巢受体，表达于造血细胞某些分化阶段，包括大多数b细胞和未致敏t细胞（初始t细胞、t记忆干细胞和中央记忆t细胞）以及大多数单核细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞。3.cd62l介导白细胞与内皮细胞最初的滞留和滚动，对于未致敏淋巴细胞归巢到外周淋巴结和派氏集合淋巴结过程中起着重要作用。除此之外，cd62l介导白细胞迁移到炎症部位，对伤后或炎症后白细胞贴壁滚动、黏附、渗出及组织的病理变化有重要的作用。4.因此，在炎症或创伤后cd62l表达量增高，而对cd62l的检测将能够反应组织的炎症情况。目前对宠物的疾病检测手段以及相关研究并未完善，因此，制备抗猫cd62l蛋白的多克隆抗体对于评价猫体内的炎症、创伤和健康状态以及了解其他疾病的进展具有重要意义。本发明填补了缺乏商品化抗猫cd62l多克隆抗体的空白，为cd62l在宠物方面的研究提供了基础资料。技术实现要素：5.本发明的目的是提供一种猫cd62l多肽抗原及其多克隆抗体的制备方法；本发明的另一目的是提供上述抗猫cd62l多克隆抗体的应用。6.本发明的目的是由以下技术方案实现的：7.一种猫cd62l蛋白多肽，序列如seq id no .1所示。8.一种抗猫cd62l多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：9.猫cd62l多肽序列合成修饰多肽，将合成的修饰多肽与klh载体蛋白交联形成复合蛋白，用复合蛋白免疫动物，共免疫4次，取免疫动物的血制备抗血清，protein g纯化柱法纯化抗血清中的抗猫cd62l多克隆抗体。10.一种利用上述方法制备的抗猫cd62l多克隆抗体。11.该抗体效价在1:128000以上。12.所述抗体在western blot及其他生物学免疫检测中的应用。13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：14.1.本发明将与klh载体蛋白交联后的cd62l多肽作为免疫原，对新西兰兔进行免疫和3次加强免疫，取免疫后兔子的血制备抗血清，之后通过protein g纯化柱法将抗血清纯化得到抗猫cd62l多克隆抗体，随后进行elisa效价检测，western blot检测抗体的灵敏度和特异性，本方法简单，快速，成本低。15.2.本方法制备的抗猫cd62l多克隆抗体效价高，灵敏度高，能特异识别出猫脾脏组织的cd62l，能够应用于猫cd62l的生物学免疫检测。16.3.本发明填补了抗猫cd62l多克隆抗体的空白，为猫的一些基础研究奠定基础。附图说明17.图1为western blot图，图中免疫印迹的目的条带大小在35 kda-48 kda之间的条带，与猫cd62l蛋白的理论分子量（43 kda）大小一致。实施方式18.实施例1：实验动物的免疫19.选取2只适龄的新西兰雄兔作为免疫动物，取分装后的偶联蛋白与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混匀后，用注射乳化器乳化，乳化结束后免疫新西兰兔具体免疫程序见表1。20.表1抗原免疫程序表21.免疫次数天数抗原剂量免疫途径第一次第0天500ul+500ul完全佐剂背部皮下注射第二次第14天500ul+500ul不完全佐剂背部皮下注射第三次第28天500ul+500ul不完全佐剂背部皮下注射第四次第42天500ul+500ul不完全佐剂背部皮下注射22.第四次免疫一周后采用颈动脉放血的方式收集兔子血液，制备血清。23.实施例2：亲和层析柱纯化抗体24.采用protein g纯化柱法对制备的多克隆抗体进行纯化。裸肽与琼脂凝胶偶联后用binding buffer闭24h；1 m nacl清洗10个柱体积后用pbs（ph=7.4）清洗5个柱体积，将血清加入柱中，重复6次；pbs清洗后用elution buffer洗脱；用1 m tris(ph=9.0)将蛋白ph调至7；10000rpm，10 min离心后收集上清，用30 kda超滤管浓缩，用pbs置换并调整抗体浓度至2 mg/ml。加bsa(1%)，甘油(50%)，proclin 300(0.1%)，使抗体终浓度为1 mg/ml。纯化后的抗体保存-80℃冰箱中。25.实施例3：间接elisa法测定抗体的效价26.将cd62l与klh偶联蛋白包被elisa板，4℃下包被过夜；次日甩掉板中液体，在吸水纸上拍干板子，用2% bsa室温（25℃）封闭2h，用抗猫cd62l多克隆抗体作不同浓度稀释，pbst洗板，1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000，空白孔取未经免疫的兔血清做对照，37℃，1h；洗板后加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔的二抗，37℃孵育1h。洗板后加入tmb进行显色反应，硫酸终止反应后测定450nm波长的吸光度。新西兰兔抗血清效价在1:128000以上，效价检测结果如表2所示。27.表2抗猫cd62l多克隆抗血清的效价（2次重复）28.抗体稀释倍数抗体效价抗体效价1:10003.64123.62411:20003.6563.66121:40003.63283.64191:80003.49943.54871:160003.17253.15351:320002.69212.5581:640001.40181.391:1280000.78190.5914空白0.04370.043329.实施例4：western blot分析抗猫cd62l多克隆抗体的特异性30.按照标准方法配制sds-page凝胶，将8 μl蛋白浓度为10 mg/ml的组织裂解液加入垂直电泳槽的上样孔中，恒压80v电泳，待样本跑过浓缩胶，换成恒压120v，电泳至溴酚蓝指示剂跑至分离胶底部时终止电泳，采用湿转膜方法恒压90v电转80分钟，将蛋白转膜至nc膜。将实例2中获得的抗猫cd62l多克隆抗体作为一抗，1：1000稀释，4℃震荡过夜，然后用hrp标记的羊抗兔抗体在室温下震荡2小时，采用特超敏ecl化学发光试剂盒（碧云天）显色，曝光17s，得到免疫印迹结果。结果如图1，本发明中的抗猫cd62l多克隆抗体灵敏度高，可在猫脾脏组织裂解液中检测到分子量35 kda-48 kda之间的条带，与猫cd62l蛋白预期相对分子量相符。31.以上所述仅是本发明的优选实施方式，仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的范围，在不脱离本发明技术方案和原理的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。技术特征：1.一种猫cd62l抗原多肽，其特征在于：氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种根据权利要求1所述猫cd62l多肽的多克隆抗体制备方法，其特征在于：将权利要求1所述猫cd62l多肽序列合成修饰多肽，将合成的修饰多肽与klh载体蛋白交联形成复合蛋白，用复合蛋白免疫动物，共免疫4次，取免疫动物的血制备抗血清，protein g纯化柱法纯化抗血清中的抗猫cd62l多克隆抗体。3.一种根据权利要求2制备方法得到的抗猫cd62l多克隆抗体。4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：该抗体效价在1:128000以上。5.权利要求3所述的抗猫cd62l多克隆抗体在western blot及其他生物学免疫检测中的应用。技术总结本发明公开了一种猫CD62L多肽抗原及其多克隆抗体的制备方法和应用，属于生物工程技术领域，猫CD62L多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述抗猫CD62L蛋白的多克隆抗体，以猫CD62L多肽与KLH蛋白偶联后得到的免疫原免疫动物获得。本发明所述抗猫CD62L多克隆抗体具有成本低、适用广、灵敏度高等特点，能够用于Western Blot等生物学免疫检测实验。利用本发明所述的多克隆抗体，可识别猫组织样本中的CD62L，可用于相关疾病的检测与诊断，为相关疾病的研究与治疗奠定重要的基础。病的研究与治疗奠定重要的基础。技术研发人员：王煦鋆 闫述琦 仇雅婷受保护的技术使用者：卫仕宠物营养研究院（芜湖）有限公司技术研发日：2023.03.19技术公布日：2023/7/4









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