一种ICP-MS联用检测人血浆中铋浓度的方法与流程

测量装置的制造及其应用技术一种icp-ms联用检测人血浆中铋浓度的方法技术领域1.本发明属于生物分析领域，具体涉及一种电感耦合等离子体质谱(icp-ms)联用定量检测人血浆中铋浓度的方法。背景技术：2.铋(bismuthum，bi)属于金属元素，被认为是周期表中最重的稳定元素。铋剂在临床中的应用已经超过两个多世纪，如：胶体果胶铋胶囊、胶体果胶铋颗粒和枸橼酸铋钾片，它不中和胃酸，也不会影响胃肠功能，主要用于保护胃粘膜损伤、治疗消化道溃疡及抗幽门螺旋杆菌感染。3.铋可抑制幽门螺杆菌产生的蛋白酶、脂酶及磷脂酶，抑制胃蛋白酶原的合成且能降低胃蛋白酶的活性，刺激黏液糖蛋白的分泌，并可和黏液中的蛋白质结合形成黏液屏障，加强对胃肠黏膜的保护作用。铋剂对耐药的幽门螺杆菌菌株具有明显抑菌作用，甚至还有直接杀菌的作用，铋剂与抗生素联合使用对耐药的幽门螺杆菌菌株具有体外协同抑菌和杀菌作用，可以克服抗生素治疗幽门螺杆菌时的耐药问题，提高幽门螺杆菌的根除率。4.国家药品监督管理局《关于发布可豁免或简化人体生物等效性(be)试验品种的通告》(2018年第32号)进行人体药代pk比较研究，受试制剂人体铋吸收不应高于参比制剂，且由于长期服用，铋会在人体蓄积，达到一定量引起副反应，所以，铋浓度检测方法的开发有利于药物的安全使用和铋剂药物一致性评价。5.目前用于测定铋浓度的方法有比色分析法、示波极谱法、碳糊电极示波极谱阳极溶出法、原子吸收分光光度法。其中，碳糊电极示波极谱阳极溶出采用复杂的消解法进行样品前处理，样品使用量为0.5ml全血；.原子吸收分光光度法采用消解法测定血浆中bi浓度，血浆样品使用量为1ml，其最低血浆检测浓度为1μg/l，但一次只能测量一种元素且动态范围较窄。6.中国专利cn 111562303a中公开电感耦合等离子体质谱联用技术检测人血清中铋bi浓度的方法，采用的血清样品前处理方法为：血清样本解冻后取200μl置于10ml离心管中，加入浓硝酸4ml，在75℃烘箱中加热并蒸干，取出放冷，加2％的硝酸5ml，涡旋混匀，4500r·min-1低温8℃，离心10min，取上清液进样检测。由此可知，前处理过程复杂，且蒸干放冷过程耗时较长，不适用于大批量生物样本的检测要求；在样品前处理过程中，先加入了4ml的浓硝酸，在75℃的烘箱中加热并蒸干后，又加入了5ml 2％的硝酸，硝酸蒸干的过程不仅对人体和环境有危害，长时间进样高浓度的硝酸还会腐蚀进样锥和截取锥，减少仪器的寿命。另外，在样品前处理过程中，受试者为比格犬，血清用量为200μl，血清用量大，不易取得，对大批量的血清样品检测增加了很大难度。7.鉴于上述的缺陷，需开发更简单、可靠且环保的样品预处理方法，用于人血浆中铋元素的测定。技术实现要素：8.本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种icp-ms联用检测人血浆中铋浓度的方法，在样品前处理的过程中以曲拉通作为表面活性剂，采用简单直接稀释的前处理方法，使待测样品和溶剂混合均匀，具体所需血浆量少、操作简单、重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小等优点，可用于临床药代动力学样本监测。9.本发明的技术方案如下：10.一种icp-ms联用检测人血浆中铋浓度的方法，它包括以下步骤：11.(1)人血浆样品前处理：取待测血浆样品，加入内标工作溶液和稀释剂，振荡及离心后取上清液，即得待测样品；所述内标工作溶液中内标为铊，稀释液为0.5～1.5％硝酸溶液；所述稀释剂为0.01～0.03％曲拉通溶液，，其中，所述曲拉通溶液中溶剂为0.5～1.5％硝酸溶液；12.(2)电感耦合等离子体-质谱联用检测：采集模式为no gas模式，rf功率为1550w，蠕动泵速度为0.10rps，雾化室温度为2℃，样本深度为10.0mm，样品引入速度为0.3 0rps，样品引入时间为70s，稳定时间为30s；13.(3)标注曲线的制备：分别取一系列浓度的铋标准溶液加入空白血浆，混合后得到不同浓度标准曲线样本溶液，按步骤(1)中样品前处理的方法制备，取上清液按步骤(2)采用电感耦合等离子体-质谱检测，记录每个浓度的铋对应的峰面积；以铋和内标的峰面积比值为纵坐标，以铋的浓度为横坐标x，建立铋的线性回归方程；14.(4)人血浆中bi元素浓度的测定：将待测人血浆样品，按步骤(1)中样品前处理的方法制备，按步骤(2)中采用的电感耦合等离子体-质谱联用检测的进行检测，记录铋对应的峰面积，将铋和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算所述待测血浆样本中铋的浓度。15.理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，与被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。要求内标元素极少或不存在于人体血浆中；内标元素与分析元素质量数接近，且电离能接近；内标元素的浓度与分析元素的浓度相当。相对于目前常用去内标，例如，铑，本发明选取铊tl元素作为内标元素，在其他条件的配合下，具有血浆量少、操作简单、重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小等优点。16.在制备内标工作溶液的过程中，为使元素离子保持稳定，选用0.5～1.5％硝酸溶液为稀释液，内标工作溶液的制备包括：取铊标准溶液加入稀释液进行稀释，得到浓度为20.0ng/ml的内标工作溶液；所述稀释液为0.5～1.5％硝酸溶液。其中，硝酸溶液中硝酸的浓度可以但不局限于0.5％、0.8％、1％、1.2％或1.5％，优选地，稀释液为1％硝酸溶液。17.对于本发明而言，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取100μl人血浆样品，加入100μl内标溶液工作溶液和2800μl 0.01～0.03％曲拉通溶液，振荡及离心后取上清液，待进样，在曲拉通溶液中溶剂为0.5～1.5％硝酸溶液。18.在步骤(1)中，本发明在样品前处理的过程中以曲拉通作为表面活性剂，有利于血浆基质的溶解，富集离子，形成均匀的溶液体系，也防止icp-ms雾化器、矩管的堵塞。采用简单直接稀释的前处理方法，所选择的稀释剂为0.01～0.03％曲拉通溶液，在曲拉通溶液中溶剂为0.5～1.5％硝酸溶液。19.优选地，所选择的稀释剂为0.01％曲拉通溶液，在曲拉通溶液中溶剂为1％硝酸溶液。20.进一步地，在样品前处理的过程中，振荡及离心的条件为：以1600rpm/min的速度振荡5min，再于4℃的条件下以4000rpm/min的速度离心10min。21.在一种优选方案中，人血浆样品前处理包括：向聚丙烯离心管中加入100μl人血浆样品，再加入100μl内标溶液工作溶液(20.0ng/ml)和2800μl 0.01％曲拉通溶液(溶剂为1％硝酸溶液)，将离心管在多管混合器上振荡样品5min(1600rpm)，4℃离心5min(4000rpm)，将全部上清液转移至新离心管待测。22.对于本发明而言，在步骤(2)中，采用自动进样器进样时，具体参数条件如下：采集模式为no gas模式，峰形3个点，重复次数6，扫描/重复次数100，积分时间0.999s，rf功率1550w，rf匹配1.66v，采样深度10.0mm，雾化器1.35l/min，蠕动泵速度为0.10rps，雾化室温度2℃，分析物/质量铋bi/209，内标物/质量铊tl/205，自动进样器深度155mm，样品引入速度为0.3rps，样品引入时间70s，稳定时间30s。具体参数条件如下表1所示。23.表1：icp-ms仪器参数[0024][0025]在步骤(3)中，不同浓度标准曲线样本溶液中铋的浓度依次为0.200ng/ml，1.00ng/ml，3.00ng/ml，10.0ng/ml，30.0ng/ml，60.0ng/ml，90.0ng/ml和100ng/ml。[0026]标注曲线样品溶液按照如下步骤制备：取100μl空白血浆基质配制含铋元素浓度为0.500ng/ml，1.00ng/ml，3.00ng/ml，10.0ng/ml，30.0ng/ml，60.0ng/ml，90.0ng/ml和100ng/ml 8个浓度水平的标准曲线样品，和1.50ng/ml(lqc)，8.00ng/ml(mqc)、75.0ng/ml(hqc)低、中、高质控样品，加入100μl内标溶液(20.0ng/ml)和2800μl 0.01％曲拉通溶液(溶剂为1％硝酸溶液)进行样品稀释。稀释样品在多管混合器上振荡样品5min(1600rpm)，后4℃离心5min(4000rpm)，将全部上清液转移至离心管待测。[0027]在步骤(3)中，分别取一系列浓度的铋标准溶液加入空白血浆，混合后得到不同浓度标准曲线样本溶液，按步骤(1)中样品前处理的方法制备，取上清液按步骤(2)采用电感耦合等离子体-质谱检测，记录每个浓度的铋对应的峰面积；以铋和内标的峰面积比值为纵坐标，以铋的浓度为横坐标x，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量，方程表达式，y＝ax+b，权重因子1/x2，相关系数r》0.99，计算得到待测血浆中bi的浓度。[0028]在步骤(4)中，待测人血浆样品中铋的浓度为0.200～100ng/ml。[0029]本发明提供的检测方法，在样品前处理过程中加入曲拉通作为表面活性剂，避免加入浓硝酸等危险试剂，前处理方法简单，安全性高。本方法选择性良好，分析物、内标和内源性物质之间均无干扰。铋元素基质效应，总基质效应因子为99.0～101，总体精密度为0.9％。高脂(300mg/dl甘油三酯)和溶血(2％溶血)基质均不影响铋元素测定准确度和精密度。批内、批间准确度范围为-3.7～8.2％，精密度不超过4.4％。铋元素稳定性，样品在-20℃/-80℃5次冻融稳定，室温条件下放置24h稳定，制备后样品室温条件下放置94h稳定，样品在-20℃/-80℃冻存138天稳定，含待测物的全血样品在冰浴件下放置2h稳定。[0030]采用本发明的技术方案，优势如下:[0031](1)本发明提供的检测方法，使用样本量仅为100μl，所用样本量较少，且分析时间较少，适用于大批量血浆样品的检测。[0032](2)本发明的线性范围为0.200ng/ml～100ng/ml，该线性范围较宽，定量下限低，适用于分析不同规格给药后的血浆样品，应用范围较广且可以避免做多次方法学验证。[0033](3)本发明的方法进行了包括特异性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率、稳定性的全部方法验证，可用于临床药代动力学样本监测，能用于评价铋剂在人体内的生物等效性及其安全用药。附图说明[0034]图1是标准曲线；[0035]图2是样品图谱。具体实施方式[0036]通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。[0037]材料与方法[0038]1.仪器与试剂[0039]1.5ml，2.0ml，10ml，15ml，50ml ep管(axygen/corning incorporate/探索平台)、10μl，20μl，100μl，200μl，1000μl移液枪/连续分液器(eppendorf)；迷你漩涡混合器；heraeusmuitifuge x1r离心机(thermofisher)、millidirectq纯水仪(millipore)；自动进样器autosampler sps 4(agilent)，icp-ms 7800(agilent)；高相液相色谱(shimadzu lc-30ad系列)；质谱(api 5500，applied biosystems/sciex)；纯水仪(millidirectq，millipore)；微量天平(xp6，mettler toledo)；离心机(heraeusmuitifuge x1r，thermofisher)；浓硝酸金属元素分析cnw technologies；曲拉通sigma；实验室制备的超纯水；铋标准溶液(bismuth standard for icp，1000±2mg/l，批号bcbz3947)来于sigma-aldrich，开封前室温，开封后储存于4℃冰箱，有效期2022.08；铊标准溶液(1000μg/ml，批号19c018)室温，国家有色金属及电子材料分析测试中心、有效期2021.12.08。[0040]2.方法设定[0041]采用自动进样器进样时，icp-ms仪器参数如下：采集模式为no gas模式，峰形3个点，重复次数6，扫描/重复次数100，积分时间0.999s，rf功率1550w，rf匹配1.66v，采样深度10.0mm，雾化器1.35l/min，蠕动泵速度为0.10rps，雾化室温度2℃，分析物/质量铋bi/209，内标物/质量铊tl/205，自动进样器深度155mm，样品引入速度(蠕动泵)0.3rps，样品引入时间70s，稳定时间30s，后运行进样针清洗液1％硝酸溶液，冲洗速度(蠕动泵)0.3rps，在冲洗口冲洗30s，后运行冲洗冲洗液1％硝酸溶液，冲洗速度(蠕动泵)0.1rps在冲洗瓶冲洗90s，在冲洗口冲洗20s。[0042]3.标准品溶液的配制[0043]取铋标准溶液适量，用1％硝酸溶液作为稀释液，梯度稀释，配制一系列浓度为4.00ng/ml、20.0ng/ml、60.0ng/ml、200ng/ml、600ng/ml、1,200ng/ml、1,800ng/ml、2,000ng/ml、20,000ng/ml的铋元素标准工作溶液，和浓度为4,000ng/ml、1,500ng/ml、160ng/ml、30.0ng/ml、10.0ng/ml的质控工作溶液。内标工作溶液的配制：取铊标准溶液适量，用1％硝酸溶液作为稀释液溶解，得到最终浓度为20.0ng/ml的内标工作溶液，保存于室温。[0044]4.标准曲线样品及质控样品的配制[0045]对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品，其配制过程举例如下：在285μl空白血浆中加入15.0μl相应的工作溶液，混合均匀，配制体积可据实际情况适当调整。配成浓度分别为0.200ng/ml，1.00ng/ml，3.00ng/ml，10.0ng/ml，30.0ng/ml，60.0ng/ml，90.0ng/ml和100ng/ml 8个浓度水平的标准曲线样品，和1.50ng/ml(lqc)，8.00ng/ml(mqc)、75.0ng/ml(hqc)的质控样品。[0046]5.样品前处理[0047]人血浆样品前处理：向聚丙烯离心管中加入100μl的人血浆样品，然后加入100μl的内标工作溶液(20.0ng/ml)和2800μl 0.01％曲拉通溶液(溶剂为1％硝酸溶液)。将离心管在多管混合器上振荡样品5min(1600rpm)，4℃离心5min(4000rpm)，将全部上清液转移至新离心管待测。[0048]对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品，按照上述方法进行处理。[0049]6.方法学考察内容[0050]根据2015年新版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容：特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、稳定性。[0051]结果与讨论[0052]1.1选择性考察[0053]由6批来自不同供体基质配制的双空白样品，化合物通道和内标通道干扰均符合要求，数据结果见表2。配制三个不加内标的定量上限，内标的响应未超过空白样品内标的5.00％，证明分析物对内标无干扰。配制空白样品，空白样品中分析物的信号强度低于定量下限内标的5.00％，证明内标对分析物无干扰，具体数据见表3。[0054]表2选择性考察[0055][0056]表3干扰[0057][0058]6批来自不同供体的空白基质中加入定量下限的分析物，样品的准确度、精密度均符合要求，具体数据结果见表4。[0059]表4基质选择性考察[0060][0061]1.2基质效应[0062]使用6批来自不同供体基质，在lqc、mqc和hqc三个浓度水平计算经内标归一化的基质因子，每个浓度基质因子均小于15.0％。该方法中，基质效应不影响铋元素的测定，数据结果见表5。[0063]表5基质效应试验[0064][0065][0066]高脂(300mg/dl甘油三酯)和溶血(2％溶血)基质中加入待测物使成lqc、hqc浓度水平，经标样校准后，每个浓度水平上述样品的平均测定值与其理论值的偏差≤±15.0％，精密度≤15.0％。该方法条件下，溶血基质(≤2％溶血)和高脂基质(≤300mg/dl甘油三酯)均不影响铋元素测定准确度和精密度，具体数据结果见表6和7。[0067]表6溶血评价[0068][0069]表7高脂基质评价[0070][0071]1.3准确度、精密度试验[0072]三批四个浓度(定量下限、低、中、高浓度质控)，每个浓度6个样品，批内批间准确度符合要求，批内批间精密度符合要求。批内、批间的准确度和精密度见表8。[0073]表8批内、批间样品检测的精密度和准确度[0074][0075][0076]1.4稀释准确性[0077]稀释质控样品(200ng/ml)经5倍稀释后准确度和精密度良好。稀释质控样品(500ng/ml)经10倍稀释后准确度和精密度良好。稀释可靠性结果见表9和表10。[0078]表9稀释验证[0079][0080][0081]表10稀释验证[0082][0083]1.5稳定性考察[0084]新鲜配制含铋元素浓度分别为1.50ng/ml，75.0ng/ml的样品，每个浓度配制12ml，分装至少36个1.5ml聚丙烯离心管中，每管中约有300μl。考察基质在各条件下的稳定性，每个测试条件下，每个浓度水平测定6个重复的稳定性样品。稳定性样品的平均测定值与其理论值的偏差≤±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的精密度≤15.0％。[0085]-20℃冻融稳定性：样品在-20℃5次冻融稳定，具体数据见表11。[0086]-80℃冻融稳定性：样品在-80℃5次冻融稳定，具体数据见表12。[0087]表11冻融稳定性[0088]试验条件：-20℃条件下，反复冻融5次。[0089][0090][0091]表12冻融稳定性[0092]试验条件：-80℃条件下，反复冻融5次。[0093][0094]生物样品前处理过程中稳定性：样品室温条件下24h稳定，具体数据见表13。[0095]表13生物样品前处理过程中的稳定性(室温稳定性)[0096]试验条件：室温条件下放置24h。[0097][0098][0099]处理后样品稳定性：血浆样品处理后在自动进样器(室温)中放置94h稳定，具体数据见表14。[0100]表14制备后样品稳定性[0101]试验条件：室温条件下放置94h。[0102][0103]-20℃长期稳定性：样品在-20℃冻存138天稳定，具体数据见表15。[0104]-80℃长期稳定性：样品在-80℃冻存138天稳定，具体数据见表16。[0105]表15长期稳定性[0106]试验条件：-20℃条件下放置138天。[0107][0108][0109]表16长期稳定性[0110]试验条件：-80℃条件下放置138天。[0111][0112]样品离心分离前基质中待测物的稳定性：含待测物的全血样品在冰浴件下放置2h稳定，见表17。[0113]表17样品离心分离前基质中待测物稳定性[0114]离心条件：2000g，4℃离心10min[0115][0116]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。









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