包含可光切割蛋白的外排体及其用途的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本公开内容涉及包含可光切割蛋白的外排体及其用途，并且更具体地，涉及包含含有靶蛋白和可光切割蛋白(mmaple3)的融合蛋白的外排体及其用途。2.本技术要求基于于2020年2月10日提交的韩国专利申请no.10-2020-0015696和于2021年2月4日提交的韩国专利申请no.10-2021-0015837的优先权，并且公开在相应申请的说明书和附图中的全部内容均并入本技术。背景技术：3.大多数当前的蛋白质治疗靶向细胞膜蛋白。然而，许多疾病的致病因子主要存在于细胞内部，并且为了靶向这些致病因子，需要用于将治疗性蛋白质递送到细胞中的技术。4.因此，最近研究了许多用于将靶蛋白直接引入到细胞中的方法，并且这些中之一，即使用脂质纳米粒递送治疗性蛋白质的技术，其问题在于脂质纳米粒不能有效地与治疗性蛋白质分离；以及用于使用在病毒的胞内穿透过程中发挥主要作用的蛋白质转导结构域(protein transduction domain，ptd)进行递送的技术，其问题在于蛋白质转导结构域在暴露于体液(例如血液或肠液)时被降解。5.因此，需要用于将治疗性蛋白质有效地递送至细胞内部的技术，以便靶向存在于细胞内部的特定疾病的致病因子。6.在另一方面，外排体是由脂质双层构成的囊泡，并且是细胞分泌至细胞外部的物质的组成成分。为了在介导细胞-细胞通讯和细胞免疫中发挥功能性作用，已知外排体发挥运输(递送)蛋白质、生物活性脂质和rna(mirna)(其均是细胞中的生物分子)的作用。这种外排体也正在作为神经系统疾病(例如阿尔茨海默病等)的生物标志物而被研究，并且还用于开发药物递送系统，例如特定药物的纳米载体，这归因于足以穿透分隔脑脊液与血液的血脑屏障(blood-brain barrier，bbb)的高选择性透过性。7.关于用于递送治疗性蛋白质的技术，韩国专利公开no.10-2018-0036134公开了用于使用光特异性结合蛋白来制备包含超阻遏物-iκ蛋白的外排体的方法，以及用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，其包含通过所述制备方法制备的外排体作为活性成分；以及日本专利申请公开no.2019-528674公开了用于大量生产包含载物蛋白的外排体的方法、用于制备外排体的载体、通过所述方法制备的包含载物蛋白的外排体以及用于通过使用由此制备的外排体将载物蛋白装载在细胞溶胶的方法。8.然而，上述文件公开了光特异性结合蛋白作为外排体中融合蛋白的组分，并且这使用了两种光特异性结合蛋白如cibn-cry2系统，因此当两种构建体在细胞中表达时，则必须将这两种构建体共转染，并因此效率降低，并且在产生外排体的同时必须向细胞连续施加488nm的光，因此其可影响细胞，并且会发生外排体中所含运载蛋白的量的损失。另外，存在以下缺点：当外排体形成之后，在不存在光的条件下维持cibn和cry2的结合时，运载蛋白不能自由移动，并且可与外排体特异性蛋白质结合；待融合到运载蛋白的cry2的尺寸大到65kda，因此其可影响运载蛋白的固有功能；以及为了确定其在细胞内是否良好表达，必须单独融合和使用荧光蛋白(例如egfp)，以及因此无法确定cry2和cibn的结合在没有给予光时是否脱落。9.因此，本发明人试图克服使用cibn-cry2系统的常规已知蛋白质递送技术的缺点，并且开发用于将蛋白质安全且有效地递送到细胞中的方法。技术实现要素：10.技术问题11.本发明人发现，当向含有其中可光切割蛋白mmaple3与待递送到细胞中的靶蛋白组合的融合蛋白的外排体辐照光时，mmaple3被切割以将外排体中的靶蛋白安全且有效地释放到靶细胞中，从而在此基础上完成了本公开内容。12.因此，本公开内容的一个目的是提供包含含有靶蛋白、可光切割蛋白和外排体特异性标志物蛋白的融合蛋白的外排体及其用途。13.然而，本公开内容实现的技术问题不限于前述问题，并且本公开内容中所属领域的技术人员从以下描述可清楚地理解未提及的其他问题。14.技术方案15.为了实现上述目的，本公开内容提供了包含含有靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的外排体。16.另外，本公开内容提供了用于将靶蛋白递送到细胞中的组合物，其包含外排体作为活性成分。17.此外，本公开内容提供了用于在体外将靶蛋白递送到细胞中的方法，其包括向包含含有靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的外排体辐照光；以及18.用经光辐照的外排体处理靶细胞。19.此外，本公开内容提供了用于递送到细胞中的蛋白质候选药物的筛选方法，其包括(a)向包含含有蛋白质候选药物和mmaple3的融合蛋白的外排体辐照光；20.(b)用经光辐照的外排体处理靶细胞；以及21.(c)当mmaple3在靶细胞中表现出荧光时，则确定所述蛋白质候选药物被递送到细胞中。22.作为本公开内容的一个实施方案，融合蛋白还可包含外排体特异性标志物蛋白。23.另外，本公开内容提供了用于制备融合蛋白的方法，其包括以下步骤：24.(s1)分别扩增靶蛋白和mmaple3的cdna；25.(s2)将靶蛋白和mmaple3的扩增cdna组合成一条cdna，以制备编码包含靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的cdna；以及26.(s3)通过将编码融合蛋白的cdna引入到载体中并随后将其转染到细胞中来表达融合蛋白。27.此外，本公开内容提供了用于制备外排体的方法，其包括以下步骤：28.(s1)分别扩增靶蛋白和mmaple3的cdna；29.(s2)将靶蛋白和mmaple3的扩增cdna组合成一条cdna，以制备编码包含靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的cdna；以及30.(s3)将编码融合蛋白的cdna转染到外排体产生细胞中，并从细胞培养基中分离和纯化外排体。31.作为本公开内容的一个实施方案，其可包括于在(s2)中将靶蛋白和mmaple3的扩增cdna组合成一条cdna之前，将mmaple3的扩增cdna和外排体特异性标志物蛋白的cdna组合成一条cdna。32.作为本公开内容的另一个实施方案，(s3)中对外排体的分离可使用选自tff(tangential flow filtration，切向流过滤)、超速离心、尺寸排阻色谱和外排体分离试剂盒中的一种方法。33.作为本公开内容的另一个实施方案，mmaple3可包含seq id no:1的氨基酸序列。34.作为本公开内容的另一个实施方案，mmaple3可由包含seq id no:2的核苷酸序列的基因编码。35.作为本公开内容的另一个实施方案，靶蛋白可以是待递送到细胞中的蛋白质。36.作为本公开内容的另一个实施方案，靶蛋白可以是用于治疗疾病的蛋白质或用于诊断疾病的蛋白质。37.作为本公开内容的另一个实施方案，外排体特异性标志物蛋白可以是选自cd9、cd63和cd81中的一种或更多种。38.作为本公开内容的另一个实施方案，外排体中的mmaple3可通过向外排体辐照光的步骤来切割。39.作为本公开内容的另一个实施方案，光的波长可以为401nm至480nm。40.另外，本公开内容提供了用于将靶蛋白递送到细胞中的方法，其包括用于将包含含有融合蛋白的外排体的组合物施到对象中的方法，所述融合蛋白包含靶蛋白和mmaple3。41.此外，本公开内容提供了包含含有融合蛋白的外排体的组合物用于将靶蛋白递送到细胞中的用途，所述融合蛋白包含靶蛋白和mmaple3。42.此外，本公开内容提供了包含含有靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的外排体用于产生用于将靶蛋白递送到细胞中的制剂的用途。43.技术效果44.根据本公开内容的外排体包含含有蓝色荧光蛋白(tagbfp)、可光切割蛋白(mmaple3)和外排体特异性标志物蛋白(cd9)的融合蛋白，并且确定了当向外排体辐照405nm的光时，可光切割蛋白mmaple3被切割，并因此外排体中的蓝色荧光蛋白可被递送到靶细胞中。另外，确定了当向含有cre融合蛋白(cre-mmaple3-cd9)的外排体辐照405nm的光时，外排体中的cre蛋白可被递送到动物器官中。因此，预期根据本公开内容的含有可光切割蛋白的外排体通过将多种治疗性蛋白质安全且有效地递送到细胞中而可有效地用于蛋白质治疗领域。附图说明45.图1示意性地示出了根据本公开内容一个实施方案的其中靶蛋白(蓝色荧光蛋白)、可光切割蛋白和外排体特异性标志物蛋白组合的融合蛋白的结构及其特征。46.图2示出了根据本公开内容一个实施方案的融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的制备过程和确定其在细胞中表达的结果。47.图3a简要地示意性地示出了cibn-cry2系统。48.图3b简要地示意性地示出了根据本公开内容一个实施方案的mmaple系统。49.图4a是通过共聚焦显微镜根据本公开内容一个实施方案在hek293t细胞中确定了对融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)进行光辐照的切割效果的结果。50.图4b以图形示出了上图4a中所示的荧光强度。51.图4c是通过western印迹根据本公开内容一个实施方案在hek293t细胞中确定了对融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)进行光辐照的切割效果的结果。52.图5示意性地示出了根据本公开内容一个实施方案的外排体的分离和纯化过程。53.图6a是通过nta根据本公开内容一个实施方案测量了包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体的尺寸的结果。54.图6b是通过dls根据本公开内容一个实施方案测量了包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体的尺寸的结果。55.图6c是通过microbca根据本公开内容一个实施方案测量了包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体的浓度的结果。56.图6d是根据本公开内容一个实施方案测量了包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体的ζ电位的结果。57.图6e是根据本公开内容一个实施方案的包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体的低温电子显微术(cryo-tem)图像观察的结果。58.图6f是通过western印迹根据本公开内容一个实施方案确定了外排体中融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)通过光辐照的切割效果的结果。59.图6g是通过荧光强度测量根据本公开内容一个实施方案确定了外排体中融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)通过光辐照的切割效果以及确定了蓝色荧光蛋白是否包含在外排体中的结果。60.图7是根据本公开内容一个实施方案的根据存在或缺乏对包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体进行triton x-100、蛋白酶(蛋白酶k)和光的处理来确定靶蛋白是否分解的结果。61.图8a和8b是根据本公开内容一个实施方案的确定了外排体中蓝色荧光蛋白递送到细胞中的效果的结果。62.图9是确定在根据本公开内容一个实施方案将包含融合蛋白(cre-mmaple3-cd9)的外排体施用到动物中时外排体中cre蛋白被递送在动物器官中的效果的结果。具体实施方式63.本公开内容提供了包含含有靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的外排体。64.另外，本公开内容提供了用于将靶蛋白递送到细胞中的组合物，其包含外排体作为活性成分。65.此外，本公开内容提供了用于制备融合蛋白的方法，其包括以下步骤：66.(s1)分别扩增靶蛋白和mmaple3的cdna；67.(s2)将靶蛋白和mmaple3的扩增cdna组合成一条cdna，以制备编码包含靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的cdna；以及68.(s3)通过将编码融合蛋白的cdna引入到载体中并随后将其转染到细胞中来表达融合蛋白。69.另外，本公开内容提供了用于制备外排体的方法，其包括以下步骤：70.(s1)分别扩增靶蛋白和mmaple3的cdna；71.(s2)将靶蛋白和mmaple3的扩增cdna组合成一条cdna，以制备编码包含靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的cdna；以及72.(s3)将编码融合蛋白的cdna转染到外排体产生细胞中，并从细胞培养基中分离和纯化外排体。73.在本公开内容中，所述方法可包括：于在(s2)中将靶蛋白和mmaple3的扩增cdna组合成一条cdna之前，将mmaple3的扩增cdna和外排体特异性标志物蛋白的cdna组合成一条cdna。74.在本公开内容中，(s3)可以是将编码融合蛋白的cdna转染到外排体产生细胞中，并用包含青霉素/链霉素的不含fbs的dmem培养基更换细胞培养基，并随后收集培养基，并从收集的培养基中分离和纯化外排体。75.在本公开内容中，在(s3)中对外排体的分离可使用选自tff(切向流过滤)、超速离心、尺寸排阻色谱和外排体分离试剂盒中的一种方法，但不限于此。76.在本公开内容中，“融合蛋白”是由两种或更多种蛋白质融合而产生的蛋白质，并且可包含靶蛋白和mmaple3，并且还可包含外排体特异性标志物蛋白。构成融合蛋白的靶蛋白、mmaple3和外排体特异性标志物蛋白可以是组合成一个的形式，并且例如，其可以按次序为靶蛋白-mmaple3-外排体特异性标志物蛋白的顺序，并且当需要对靶蛋白进行追踪时，其可以按外排体特异性标志物蛋白-mmaple3-靶蛋白的顺序，但对它们的结合顺序没有限制。77.在本公开内容中，“靶蛋白”是以与可光切割蛋白组合的形式存在于外排体中的蛋白质，并且意指待递送到靶细胞或组织中的蛋白质。靶蛋白可以是用于治疗疾病的蛋白质或用于诊断疾病的蛋白质，并且对其类型没有限制。例如，癌症抑制蛋白p53作为靶蛋白被递送到癌细胞中，并因此可表现出治疗癌症的效果，以及可通过将正常的parkin蛋白递送到由于parkin蛋白中发生突变引起的异常功能导致的帕金森病的神经元中来表现出治疗帕金森病的效果，并且在下一代干细胞治疗的研究中，oct4、sox2、c-myc和klf4蛋白，作为yamanica因子，其是最重要的过程(即将患者体细胞去分化成干细胞的过程)中所需的蛋白质，被递送到患者体细胞中，并因此可去分化成干细胞，而无需目前用于干细胞去分化的病毒。另外，通过将肌分化诱导蛋白(例如，肌细胞生成蛋白和myod)作为靶蛋白递送，可显示出对退行性肌病(例如，以进行性肌无力、萎缩和肌纤维坏死等为特征的肌营养不良，等等)的治疗效果，通过递送以在为神经退行性疾病之一的痴呆中具有颅神经保护作用而著称的nrf2和bdnf蛋白，可表现出对痴呆的治疗效果，以及通过递送将白色脂肪细胞分化成褐色脂肪细胞的褐色脂肪诱导因子(例如pgc1α、ppar-γ)，可显示出对代谢性疾病的治疗效果。在本公开内容的一个实施方案中，使用蓝色荧光蛋白tagbfp确定了其被递送到细胞中，并且使用cre蛋白确定了其被递送到动物器官中。78.在本公开内容中，“将靶蛋白递送到细胞中”意指将以与可光切割蛋白组合的形式存在于外排体中的靶蛋白从外排体转移到靶细胞内部。79.在本公开内容中，“mmaple3”是一种可光切割蛋白，并且“可光切割蛋白”意指当暴露于特定波长的光时被切割的蛋白质。80.在本公开内容中，mmaple3可包含seq id no:1的氨基酸序列，并且可由包含seq id no:2的核苷酸序列的基因编码。81.在本公开内容中，“外排体特异性标志物蛋白”是位于外排体外膜的蛋白质，并且例如，其可以是选自cd9、cd63和cd81中的一种或更多种，并且根据本公开内容一个实施方案可以是cd9，但不限于此。82.在本公开内容中，cd9可包含seq id no:3的氨基酸序列，并且可由包含seq id no:4的核苷酸序列的基因编码。83.在本公开内容中，“外排体”是分泌至细胞外部具有由脂质双层构成之膜结构、作为收集蛋白质、dna、rna等、用于细胞之间信号传导的膜囊泡，并且存在于几乎所有真核生物的体液中。外排体的直径可以是10nm至400nm、10nm至350nm、10nm至300nm、10nm至250nm、10nm至200nm、10nm至150nm、50nm至350nm、50nm至300nm、50nm至250nm、50nm至200nm、50nm至150nm、100nm至300nm、100nm至200nm或100nm至150nm，并且当多个囊泡与细胞膜融合时，其自细胞中释放，或者其立即自细胞膜中释放。84.所述外排体可通过使用本领域已知的用于提取外排体的方法来制备，并且对提取方法没有限制。85.另外，本公开内容提供了用于在体外将靶蛋白递送到细胞中的方法，其包括向包含含有靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的外排体辐照光；以及86.用经光辐照的外排体处理靶细胞。87.另外，本公开内容提供了用于递送到细胞中的蛋白质药物的筛选方法，其包括(a)向包含含有蛋白质候选药物和mmaple3的融合蛋白的外排体辐照光；88.(b)用经光辐照的外排体处理靶细胞；以及89.(c)如果mmaple3在靶细胞中表现出荧光，则将蛋白质候选药物确定为递送到细胞中的蛋白质药物。90.在本公开内容中，外排体中的mmaple3可通过向外排体辐照光而被切割，并随后，光的波长可以为401nm至480nm、401nm至470nm、401nm至460nm、401nm至450nm、401nm至440nm、401nm至430nm、401nm至420nm、或401nm至410nm，并且400nm或更小的光是紫外光(uv)并且当在处理细胞或外排体时可损伤细胞或外排体，并且波长超过480nm的光当在处理细胞时也可影响细胞。在本公开内容中，对光的波长没有限制，只要其在401nm至480nm内即可，但是根据本公开内容的一个实施方案，优选地，其可以是405nm。91.在本公开内容中，在(c)中，mmaple3在其未切割时可表现出绿色荧光，并且在切割时可表现出红色荧光。92.另外，本公开内容提供了用于将靶蛋白递送到细胞中的方法，其包括将包含含有融合蛋白的外排体的组合物施用到对象中，所述融合蛋白包含靶蛋白和mmaple3。93.在本公开内容中，“对象”意指需要靶蛋白的对象，并且更具体地，其意指人或非人的灵长类，或者哺乳动物，例如小鼠、狗、猫、马和牛。94.在本公开内容中，“施用”意指通过任何合适的方法将本公开内容的指定组合物供给到对象中。95.此外，本公开内容提供了包含含有融合蛋白的外排体的组合物用于将靶蛋白递送到细胞中的用途，所述融合蛋白含有靶蛋白和mmaple3。96.另外，本公开内容提供了包含含有靶蛋白和mmaple3的融合蛋白的外排体用于产生用于将靶蛋白递送到细胞中的制剂的用途。97.在本公开内容的一个实施例中，制备了其中蓝色荧光蛋白(tagbfp)、可光切割蛋白(mmaple3)和外排体特异性标志物蛋白(cd9)组合的融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)，并且与其他可光切割蛋白类型相比，当使用mmaple3时显示出优势，并且确定了与cibn-cry2系统相比mmaple系统显示出的优势(参见实施例1)。98.在本公开内容的另一个实施例中，确定了当融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)在hek293t细胞中过表达，并随后辐照405nm的光时，mmaple3被405nm的光切割(参见实施例2)。99.在本公开内容的另一个实施例中，确定了当从融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)在其中过表达的hek293t细胞的培养基中分离和纯化外排体时，mmaple3被405nm的光切割(参见实施例3)。100.在本公开内容的另一个实施例中，作为根据存在或缺乏对包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体进行triton x-100、蛋白酶(蛋白酶k)和405nm光的处理来确定靶蛋白降解的结果，确定了靶蛋白没有被蛋白酶降解，并且405nm的光不影响外排体的脂质双层，除非通过triton x-100处理，可人为透过外排体的脂质双层(参见实施例4)。101.在本公开内容的一个实验例中，确定了，当对包含融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体辐照405nm的光，并用其处理hek293t细胞时，蓝色荧光蛋白被递送到细胞中(参见实验例1)。102.在本公开内容的一个实验例中，确定了，当向包含cre融合蛋白(cre-mmaple3-cd9)的外排体辐照405nm的光，并且将其施用到经遗传修饰的小鼠中时，外排体中的cre蛋白被递送到小鼠器官中，其中在cre蛋白被递送时，红色荧光蛋白(tdtomato)表达(参见实验例2)。103.在下文中，为了帮助理解本公开内容，提出了优选的实施例和实验例。然而，提供以下实施例和实验例仅是为了更容易理解本公开内容，而本公开内容的内容不受以下实施例和实验例的限制。104.实施例1.融合蛋白的制备和可光切割蛋白的特征比较105.1-1.融合蛋白制备106.制备了编码其中蓝色荧光蛋白(tagbfp)、可光切割蛋白(mmaple3)和外排体特异性标志物蛋白(cd9)组合的融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的cdna，并且由制备的cdna翻译的融合蛋白的结构及其特征示意性地示于图1中，并且tagbfp、mmaple3和cd9各自的氨基酸序列和编码它们的基因序列示于下表1中。107.[表1][0108][0109][0110][0111]具体地，首先分别制备编码tagbfp、mmaple3和cd9的cdna并通过pcr进行扩增，并将扩增的mmaple3和cd9的cdna通过pcr组合成一条cdna(mmaple3-cd9)。然后，通过pcr将mmaple3-cd9 cdna和tagbfp cdna组合成一条cdna(tagbfp-mmaple3-cd9)，以产生编码融合蛋白的cdna。本公开内容中使用的引物示于下表2中。[0112][表2][0113][0114]随后，通过使用ecor1和xba1限制性酶将编码融合蛋白的cdna克隆到pcmv14载体中，使得融合蛋白在哺乳动物细胞中表达。当通过使用pei(聚乙烯亚胺)将pcmv14-tagbfp-mmaple3-cd9转染到hek293t细胞中时，如图2中所示，确定了融合蛋白的表达。[0115]1-2.根据可光切割蛋白类型的特征比较[0116]通过参考常规文献(s.wang,et al,proc.natl.acad.sci.u.s.a.111,8452-8457(2014))，通过比较多种可光切割蛋白(pafp)(例如dendra2、meos2、tdeos、mkikgr和kaede等)和mmaple3的特征，确定了在与其他可光切割蛋白相比时，mmaple3显示出优势。[0117]作为结果，如下表3中所示，确定了，许多可光切割蛋白在寡聚化倾向和内聚方面普遍具有强烈的形成寡聚体的倾向，然而mmaple3具有强烈的保持单体和弱内聚的倾向。[0118]关于显示出用于切割的光的波长的switchλ结果，确定了kikgr和kaede需要400nm或更小的光才能被切割，而400nm或更小是uv(紫外光)并且当处理细胞或外排体时可损伤细胞或外排体，然而在辐照400nm或更大的光的情况下，在细胞内表达之后被切割或通过添加至外排体而被切割时是更安全的，并且mmaple3在400nm或更大的光下被切割。[0119]在细胞中表达的可光切割蛋白中，可存在直至测量到荧光才完全折叠的可光切割蛋白，并且在完全折叠的可光切割蛋白中，其中仅一些被光切割显示出荧光，并且可以确定，由于mmaple3具有高水平的定位数/细胞，因此被切割的效率并显示出荧光优于其他可光切割蛋白，所述定位数/细胞表明通过荧光检出的pafp(可光激活的荧光蛋白)数目/细胞/实际pafp的表达水平。[0120]另外，虽然大多数可光切割蛋白具有酸敏感性，但在mmaple3的情况下，没有报道酸敏感性。[0121][表3][0122]pafp寡聚化聚集switchλ(nm)定位数/细胞酸敏感性dendra2单体-405.4801,810高meos2弱二聚体+4051,290中等tdeos四聚体-4051,800namkikgr单体+3903,800高kaede四聚体+380na中等mmaple3单体-40512,300na[0123]1-3.cibn-cry2系统与mmaple系统的比较[0124]图3a所示的cibn-cry2系统使用了两种光特异性结合蛋白，因此应始终使用两种构建体，并且在这种情况下，由于应共转染两种构建体，因此效率会降低。例如，当转染效率为80％时，所有两种构建体均转染到一个细胞中的概率变成64％。在另一方面，图3b中所示的mmaple系统使用了一种构建体，因此可在细胞中以更好的效率将其表达。[0125]另外，cibn-cry2系统的缺点是其可影响细胞，因为在产生外排体期间应向细胞连续施加488nm的光，并且由于光对cibn和cry2的结合效率不能达到100％而导致外排体中所含运载蛋白的量的损失，但是mmaple系统是安全的，因为在开始时运载蛋白与可光切割蛋白和外排体特异性标志物融合，并因此当细胞形成外排体时不会损失运载蛋白，并且不需要将光直接施加至细胞。[0126]此外，在cibn-cry2系统中，可出现在形成外排体之后在无光条件下无法维持cibn和cry2结合的情况，并且在这种情况下，运载蛋白不能自由移动并且可与外排体特异性蛋白结合，然而mmaple系统在形成外排体之后通过向外排体施加光来切割可光切割蛋白，并随后被切割的效率非常高，并且当切割效率高时，意味着在外排体中产生了许多可自由移动的运载蛋白。[0127]此外，cibn-cry2系统的缺点是其由于cry2的尺寸大到65kda而可影响运载蛋白的固有功能，荧光蛋白(例如egfp)应单独融合和使用，以确定其在细胞中是否良好表达，以及没有办法确定cry2和cibn的结合在不给予光时是否被破坏，而mmaple系统由于与运载蛋白连接的可光切割蛋白片段在被切割之后尺寸为仅10kda而影响运载蛋白固有功能的可能性非常低，由于可光切割蛋白本身是荧光蛋白而可通过绿色荧光来确定其在细胞内是否合适地表达，以及可在用光处理外排体之后通过红色荧光来确定可光切割蛋白是否被很好地递送。[0128]如上所述，与包含cibn-cry2系统的可光切割蛋白和光特异性结合蛋白的其他类型的情况相比，当融合蛋白中包含根据本公开内容的可光切割蛋白mmaple3时，显示出如上实施例1-2和1-3中的优势，以及相应地，通过使用包含本公开内容的可光切割蛋白mmaple3的融合蛋白的实验，确定了将蛋白质递送到细胞中的效果。[0129]实施例2.融合蛋白递送的确定[0130]在接种hek293t细胞之后24小时，通过上述实施例1-1的方法，使用pei来转染tagbfp-mmaple3-cd9 cdna，以使其在hek293t细胞中过表达，并随后通过辐照405nm的光，通过共聚焦显微镜和western印迹在hek293t细胞中确定光切割的效果。[0131]共聚焦显微镜观察的实验结果确定了在转染之后24小时通过蓝色荧光(tagbfp)和绿色荧光(mmaple3)，使用共聚焦显微镜(lsm700)得到了融合蛋白的表达(在图4a中)，并且通过降低的绿色荧光强度(切割之前的mmaple3)和增强的红色荧光强度(切割之后的mmaple3)确定了融合蛋白的递送，测量了荧光强度并将其示于图4b中。[0132]作为结果，如图4a和4b中所示，鉴于在辐照405nm的光之前显示出mmaple3本身的绿色荧光，而在辐照405nm的光之后显示出红色荧光，可确定mmaple3蛋白被切割，并且确定了405nm的光辐照时间越长，可光切割蛋白(mmaple3)切割越多，因此绿色荧光降低且红色荧光增加。[0133]另外，在转染之后24小时，向细胞辐照405nm的光持续5分钟，使用western印迹，使用t-per缓冲液提取蛋白质，并通过电泳来分离提取的蛋白质，并随后确定融合蛋白的表达以及405nm的光对融合蛋白的切割；作为结果，如图4c中所示，通过观察到在辐照405nm的光之后未切割的融合蛋白的量随时间推移减少而切割的融合蛋白区段的量增加，在hek293t细胞中确定了对mmaple3蛋白的切割效果。[0134]实施例3.外排体分离和纯化[0135]从上述实施例2中过表达融合蛋白的hek293t细胞的培养基中，通过切向流体过滤系统分离和纯化外排体。[0136]具体地，在接种hek293t细胞之后24小时，通过使用pei来转染tagbfp-mmaple3-cd9 cdna，并且在转染之后24小时，用不含fbs的dmem(1％ps(青霉素/链霉素))培养基更换细胞培养基。在更换培养基之后24小时，首次收集培养基，再次添加不含fbs的dmem(1％ps)培养基，并且在24小时之后，第二次收集培养基。通过tff(切向流过滤)方法从首次和第二次收集的培养基中分离和纯化外排体。外排体的分离和纯化过程示意性地示于图5中。[0137]在通过该方法分离和纯化外排体之后，通过nta(nanoparticle tracking assay，纳米粒追踪测定)、dls(dynamic light scattering，动态光散射)和microbca(bicinchoninic acid assay，二喹啉甲酸测定)测量包含融合蛋白的外排体的浓度和尺寸。[0138]作为nta测量的结果，如图6a中所示，显示外排体的平均直径为132nm；作为dls测量的结果，如图6b中所示，外排体的平均直径确定为117.7±10.28nm；以及作为microbca测量的结果，如图6c中所示，显示包含融合蛋白的外排体的蛋白质浓度为1487mg/ml，并且确定了一个外排体中含有的蛋白质的量为39.13ng。[0139]此外，作为测量外排体的ζ电位的结果，如图6d中所示，其确定为平均-19.3±0.8mv，并且外排体的低温电子显微术(cryo-tem)图像观察数据示于图6e中(比例尺：100nm)。[0140]另外，作为通过western印迹在外排体中确定405nm的光对融合蛋白的切割效果的结果，如图6f中所示，通过观察到在辐照405nm的光之后未切割的融合蛋白的量随时间推移减少而切割的融合蛋白区段的量增加，在外排体中确定了对mmaple3蛋白的切割效果。[0141]作为通过biotek微板阅读仪机器来测量蓝色荧光、绿色荧光和红色荧光的强度以确定405nm光对融合蛋白的切割效果以及外排体中是否再次包含蓝色荧光蛋白的结果，如图6g中所示，确定了，在辐照405nm的光之前和之后，蓝色荧光强度没有差异，并且观察到在辐照405nm光之后绿色荧光强度大大降低，而红色荧光强度增加，由此确定了对外排体中融合蛋白的切割效果以及外排体中是否包含蓝色荧光蛋白。[0142]实施例4.外排体中靶蛋白位置的确定[0143]为了确定上述实施例3中分离的含有融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体(+mmaple3外排体)中靶蛋白(tagbfp)的位置，进行了蛋白酶消化测定。[0144]具体地，确定了根据使得能够透过外排体脂质双层的蛋白酶(蛋白酶k)和triton x-100的处理对靶蛋白的降解。[0145]作为结果，如图7中所示，可发现，除非使用triton x-100人为地透过外排体的脂质双层，否则存在于包含靶蛋白(tagbfp)的外排体内部的蛋白质(alix)不会被降解并被良好保护而免于蛋白酶(蛋白酶k)。在另一方面，确定了，无论是否用triton x-100处理，具有外排体外部结构域的蛋白质(lamp2)均被蛋白酶降解。另外，确定了405nm的光不会影响该外排体的脂质双层。[0146]实验例1.外排体中蛋白质进入细胞的确定[0147]对于上述实施例3中分离的含有融合蛋白(tagbfp-mmaple3-cd9)的外排体(+mmaple3外排体)，以从hek293t细胞培养溶液中分离和纯化的不含特定蛋白质的外排体(+阴性外排体)作为对照组，用405nm的光进行处理并用它们处理hek293t细胞。[0148]具体地，在接种hek293t细胞之后24小时内，以5×109颗粒/ml的浓度用含有tagbfp-mmaple3-cd9融合蛋白的外排体进行处理，并且在外排体处理之后24小时内，用4％多聚甲醛固定hek293t细胞，并随后用cytation 5细胞成像仪来确定蓝色荧光蛋白的递送。[0149]作为结果，如图8a中所示，观察到，当用含有mmaple3的外排体处理时，在细胞中显示出蓝色荧光(tagbfp)，并且确定了，在用光处理外排体时，绿色荧光(fl mmaple3)降低而红色荧光(cl mmaple3)提高。[0150]另外，作为确定通过相同方法用外排体处理hela细胞之后细胞中蓝色荧光蛋白的递送的结果，如图8b中所示，确定了，在hela细胞中也显示出蓝色荧光，并且确定了，当用光处理外排体时，绿色荧光降低而红色荧光提高。[0151]由此可确定，在含有tagbfp-mmaple3-cd9的外排体中，通过405nm的光处理，mmaple3被切割，并从而将蓝色荧光蛋白(tagbfp)递送到细胞中。[0152]实验例2.外排体中蛋白质向动物器官中的递送的确定[0153]用405nm的光处理通过如上述实施例3所述的方法分离的含有cre融合蛋白(cre-mmaple3-cd9)的外排体，并且在将其施用到经遗传修饰的小鼠中，cre蛋白被递送时，其中红色荧光蛋白(tdtomato)表达。[0154]具体地，将磷酸缓冲盐水(pbs)或经光处理的外排体(cre:maplex)以500μg施用到经遗传修饰的小鼠的尾静脉中，并随后在1、6和24小时之后用ivis小动物成像仪测量红色荧光的强度。[0155]作为结果，如图9中所示，确定了，红色荧光的强度在其中施用了经光处理的外排体的小鼠的肝中提高，如图9中所示。由此可确定，在含有cre-mmaple3-cd9的外排体中，通过405nm的光处理，mmaple被切割，并从而将cre蛋白有效地递送到器官中。[0156]上述对本公开内容的描述是出于举例说明，并且本公开内容所属领域的技术人员可理解在不改变本公开内容的技术精神或基本特征的情况下，可将其容易地修改成其他特定形式。因此，应理解上述实施例在所有方面均是举例说明性的并且不是限制性的。[0157]工业实用性[0158]预期根据本公开内容的含有可光切割蛋白的外排体通过将多种治疗性蛋白质安全且有效地递送到细胞中而可有效地用于蛋白质治疗领域。









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