肝素骨架合酶及其突变体与应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及一种肝素骨架合酶及其突变体与应用，具体涉及来源于动物奈瑟菌(neisseria animaloris)的肝素骨架合酶及其六种突变体与在肝素骨架合成中的应用，属于生物技术领域。背景技术：2.肝素(heparin,简称hp)，是一种重要的糖胺聚糖，是由d-β-葡糖醛酸(或l-α-艾杜糖醛酸)和n-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位所构成的。肝素有着巨大的药用价值，除抗凝作用等多种运用外，还可用于治疗心绞痛、肾病综合征、严重烧伤、类风湿性关节炎等，其需求量在国际上常年处于生物技术药物领域的前列。3.肝素的生产主要是从牛肺、猪肠粘膜等动物组织器官中提取获得，然而天然提取的方法安全性低，得率低，溶剂的消耗量大，环境污染严重，并且产品质量由于原材料差异大不易控制，在生产过程中容易引入杂质污染(如硫酸软骨素)。天然肝素基本单元的结构、数目各不相同，提取方法的不同也会导致不同的化学修饰，导致最后得到的肝素产物结构、构型、分子量各有异同，最终引起最终产物活性不均一，并且难以进行完善的质量监控，使肝素的品质和安全性都难以得到保障。4.2008年爆发的肝素大面积污染事件，造成近100位病人死亡，该事件的发生极大地促进了非动物来源肝素生产的发展。化学酶法合成策略因具有立体选择性强，产率高，反应温和，产品质量均一稳定，容易进行官能团的衍生和修饰，对于新药研制具有重要意义，有望发展成为一种理想的肝素寡糖的合成新技术。化学酶法所使用工具酶是推动该策略进一步发展的制约步骤。5.目前为止，已确认具有n-乙酰氨基葡糖转移酶活性的微生物来源的肝素骨架合酶(n-acetyl-d-glucosaminyltransferase)已有2种被报道，分别是来源于大肠杆菌k5中的kfia和来自卡氏杆菌中的gakfia。肝素骨架合酶的匮乏不但限制了该酶家族酶学特性的理论研究，也限制了化学酶法合成肝素体系的规模化应用。6.动物奈瑟菌(neisseria animaloris)是一种罕见的人畜共患病病原体，通常与狗或猫咬伤有关。动物奈瑟菌主要存在于犬类和猫科动物口腔，在被咬伤后会在人类和动物身上引起全身感染。搜索数据库并未见来源于该菌的糖胺聚糖骨架合酶基因被报道。技术实现要素：7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种肝素骨架合酶及其突变体与应用，本发明中的肝素骨架合酶为来源于动物奈瑟菌(neisseria animaloris)的高表达水平的肝素骨架合酶naglcnac-t，并经定点突变得到六种高活性突变体，该肝素骨架合酶及六种高活性突变体可应用于肝素寡糖的合成。8.术语说明：9.glca-pnp：中文全称为4-硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸，其作用是作为肝素寡糖合成的起始底物；10.udp-glcnac：中文全称为尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖，其作用是为肝素寡糖的合成提供乙酰葡萄糖胺供体；11.udp-glcntfa：中文全称为尿苷二磷酸-n-三氟乙酰氨基葡萄糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，提供三氟乙酰氨基葡萄糖供体；12.udp-galnaz：中文全称为尿苷二磷酸-n-叠氮乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，提供叠氮乙酰氨基半乳糖供体；13.udp-galnac：中文全称为尿苷二磷酸-n-乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，提供乙酰氨基半乳糖供体；14.udp-glc：中文全称为尿苷二磷酸-n-葡萄糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性提供葡萄糖供体；15.udp-gal：中文全称为尿苷二磷酸-n-半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，提供半乳糖供体。16.本发明技术方案如下：17.一种肝素骨架合酶naglcnac-t，其氨基酸序列如seq id no.2所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。18.本发明中，所述肝素骨架合酶naglcnac-t来源于动物奈瑟菌(neisseria animaloris)，重组表达水平是现有大肠杆菌k5肝素骨架合酶kfia重组表达水平的6.8倍。对上述肝素骨架合酶naglcnac-t进行定点突变，所得肝素骨架合酶突变体均具有较高的表达水平。19.一种肝素骨架合酶突变体naglcnac-t(c16l)，其氨基酸序列如seq id no.4所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；是将上述肝素骨架合酶氨基酸序列中第16位的半胱氨酸定点突变为亮氨酸。20.一种肝素骨架合酶突变体naglcnac-t(n25p)，其氨基酸序列如seq id no.6所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；是将上述肝素骨架合酶氨基酸序列中第25位的天冬酰胺定点突变为脯氨酸。21.一种肝素骨架合酶突变体naglcnac-t(i30l)，其氨基酸序列如seq id no.8所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；是将上述肝素骨架合酶氨基酸序列中第30位的异亮氨酸定点突变为亮氨酸。22.一种肝素骨架合酶突变体naglcnac-t(i111s)，其氨基酸序列如seq id no.10所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.9所示；是将上述肝素骨架合酶氨基酸序列中第111位的异亮氨酸定点突变为丝氨酸。23.一种肝素骨架合酶突变体naglcnac-t(s165k)，其氨基酸序列如seq id no.12所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.11所示；是将上述肝素骨架合酶氨基酸序列中第165位的丝氨酸定点突变为赖氨酸。24.一种肝素骨架合酶突变体naglcnac-t(s172a)，其氨基酸序列如seq id no.14所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.13所示；是将上述肝素骨架合酶氨基酸序列中第172位的丝氨酸定点突变为丙氨酸。25.本发明中，所述肝素骨架合酶突变体也有较高的重组表达水平，其酶活性相对于肝素骨架合酶naglcnac-t保持平稳或有不同程度的提升。26.一种重组载体，是在质粒载体中插入上述肝素骨架合酶naglcnac-t或上述肝素骨架合酶突变体的编码基因。27.根据本发明优选的，所述质粒载体为pet30a(+)。28.本发明中，含有目的基因的重组载体由南京金斯瑞公司合成。29.一种重组菌株，是将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。30.根据本发明优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选为含有pgro7质粒的大肠杆菌bl21(de3)。31.上述肝素骨架合酶naglcnac-t或上述肝素骨架合酶突变体在合成肝素糖链中的应用。32.根据本发明优选的，所述应用是以glca-pnp作为起始受体，udp-glcnac作为供体，生成结构为glcnac-glca-pnp的肝素骨架二糖。33.有益效果：34.本发明公开的肝素骨架合酶naglcnac-t，是一种全新来源的肝素骨架合酶，具备glcnac的转移酶活性。并且在最适条件下利用底物glca-pnp和udp-glcnac有效地合成肝素二糖骨架。并经过初步表达分析，naglcnac-t在每升普通的lb培养基可以表达超过100mg的可溶活性蛋白，相比已经投入应用的大肠杆菌k5肝素骨架合酶kfia，每升发酵液表达的酶活提高了5.22倍。并且本发明设计突变得到了比kfia活性更高的naglcnac-t突变体。本发明提高了肝素骨架合成中glcnac转移合成效率，极大地促进了肝素仿生合成应用化发展，为糖胺聚糖的研究发展开启了全新的一页。附图说明35.图1为肝素骨架合酶naglcnac-t及其突变体在重组大肠杆菌中可溶性表达纯化的sds-page检测结果图；36.图中：m为marker；其余各条带为纯化得到的naglcnac-t及其突变体的重组蛋白，nakfia为naglcnac-t，c16l为naglcnac-t(c16l)，n25p为naglcnac-t(n25p)，i30l为naglcnac-t(i30l)，i111s为naglcnac-t(i111s)，s165k为naglcnac-t(s165k)，s172a为naglcnac-t(s172a)；37.图2为肝素骨架合酶naglcnac-t的蛋白定量标准曲线；38.图3为肝素骨架合酶naglcnac-t与肝素骨架合酶kfia的表达量及受体底物反应转化率柱状图；39.图4为肝素骨架合酶naglcnac-t反应产物的hplc色谱图；40.图5为肝素骨架合酶naglcnac-t与肝素骨架合酶kfia的总酶活柱状图；41.图6为肝素骨架合酶naglcnac-t及其突变体的受体底物反应转化率柱状图；42.图7为肝素骨架合酶naglcnac-t反应产物glcnac-glca-pnp的质谱图；43.图8为肝素骨架合酶naglcnac-t反应产物glcnac-glca-pnp的1h-h cosy氢谱；44.图9为不同ph下肝素骨架合酶naglcnac-t催化体外寡糖合成时的受体底物反应转化率曲线；45.图10为不同金属离子下肝素骨架合酶naglcnac-t催化体外寡糖合成时受体底物反应转化率柱状图；46.图11为不同温度下肝素骨架合酶naglcnac-t体外催化寡糖合成时受体底物反应转化率曲线；47.图12为不同供体底物下肝素骨架合酶naglcnac-t体外催化寡糖合成时受体底物反应转化率柱状图；48.图中：n.d.代表该底物不能被naglcnac-t催化。具体实施方式49.下面结合实施例及说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。50.发明人通过使用blast序列比对进行生物信息学数据库搜索，发现动物奈瑟菌(neisseria animaloris，atcc29858)中一段基因形成的氨基酸序列与之前已经报道的大肠杆菌k5肝素骨架合酶kfia的氨基酸序列有55.7％的同源性，因此推测这段基因表达的蛋白产物可能具有肝素骨架合酶活性，在大肠杆菌表达系统中表达该蛋白，并将这段基因命名为naglcnac-t，核苷酸序列如seq id no.1所示，将其表达的蛋白产物命名为naglcnac-t，氨基酸序列如seq id no.2所示。51.同时，发明人对于检索到的kfia同源序列，进行序列同源分析，使用embl clustal omega工具进行多序列比对，并使用jalview软件对于氨基酸序列高保守区域进行分析。同时使用swiss-model工具对naglcnac-t进行蛋白质模拟建模，并使用hotspot wizard 2.0对该酶的活性中心进行预测。发现naglcnac-t的氨基酸序列的16位、25位、30位、111位、165位、172位，位于活性中心及高保守区域附近，对其进行定点突变极有可能提高naglcnac-t的催化活性。因此结合同源分析的在该六个位置的优势氨基酸，设计了naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)共计六个突变体，其中突变体naglcnac-t(c16l)的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示；突变体naglcnac-t(n25p)的核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示；突变体naglcnac-t(i30l)的核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示；突变体naglcnac-t(i111s)的核苷酸序列如seq id no.9所示，氨基酸序列如seq id no.10所示；突变体naglcnac-t(s165k)的核苷酸序列如seq id no.11所示，氨基酸序列如seq id no.12所示；突变体naglcnac-t(s172a)的核苷酸序列如seq id no.13所示，氨基酸序列如seq id no.14所示。52.本发明所采用的底物糖类试剂均购自于sigma公司。所有的naglcnac-t及其突变体的质粒均委托南京金斯瑞公司构建。使用的含有pgro7分子伴侣的bl21(de3)感受态细胞购买自takara公司。所采用的hplc检测方法均使用ymc的氨基柱，液相系统为日本岛津液相，紫外检测系统为spd-20a。检测naglcnac-t及其突变体催化产物通过色谱柱分离后各组分在310nm和254nm的紫外吸收，hplc流动相条件见表1：53.表1.检测肝素寡糖所使用hplc分析方法[0054][0055]实施例1.肝素骨架合酶naglcnac-t及其突变体的重组蛋白的表达和纯化[0056](1)表达菌株的构建[0057]将南京金斯瑞公司合成的重组质粒pet30a(+)-naglcnac-t转化入含有pgro7分子伴侣的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，在含卡那霉素(100μg/ml)和氯霉素(37μg/ml)的lb平板上培养12h，筛选转化子(同时进行阴性对照实验)，获得阳性转化子。[0058]按照上述相同方法得到六个突变体naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)的阳性转化子。[0059](2)naglcnac-t及其突变体重组蛋白的表达和纯化[0060]挑取naglcnac-t阳性转化子单菌落于30ml灭菌的lb培养基(含有100μg/ml卡那霉素和37μg/ml氯霉素)中，进行活化培养(37℃，225r/min)；将过夜活化培养的菌液按照1％接种量接入1l lb培养基(含有100μg/ml卡那霉素和37μg/ml氯霉素)中扩大培养，37℃，225r/min震荡培养大约4个小时至od600约为0.8，加入终浓度0.5mm iptg和1mg/ml l-阿拉伯糖，于22℃、225r/min条件下诱导16-18h，然后收集菌体，并用平衡缓冲液(20mm tris-hcl，ph＝8.00；0.5m nacl；10mm咪唑)重悬，冰上超声破碎(工作3s，间歇5s，振幅33％，能量1500kj，4℃)30min，将破碎后菌体12000rpm离心20min(4℃)，上清用0.22μm滤膜过滤，运用镍柱进行纯化，上样后用平衡缓冲液洗涤，然后用洗杂缓冲液(20mm tris-hcl，ph＝8.00；0.5m nacl；40mm咪唑)洗掉多余的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mm tris-hcl，ph＝8.00；0.5m nacl；250mm咪唑)洗脱得到目的蛋白。纯化得到的蛋白质保存在20％甘油，每管分装存于-80℃冰箱。[0061]按照上述相同方法纯化得到六个突变体naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)的重组蛋白。[0062]通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)对纯化后的naglcnac-t及其突变体重组蛋白进行鉴定(如图1所示)。结果显示naglcnac-t及其突变体naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)均成功使用此法纯化得到，且相对纯度都达到了90％以上。[0063]使用bca蛋白浓度测定试剂盒(碧云天p0011)对naglcnac-t进行定量。按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀。将标准品按0、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。加20μl样品到96孔板的样品孔中。各孔加入200μl bca工作液，37℃放置20-30分钟，用酶标仪测定a562，测得标准曲线，并根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。[0064]naglcnac-t蛋白定量的标准曲线如图2所示。经测定，naglcnac-t在每升lb培养基的重组表达量高达102mg/l，这是采用同样方式进行重组表达的大肠杆菌k5肝素骨架合酶kfia的蛋白表达量(～15mg/l)的6.8倍(如图3所示)，这表明naglcnac-t具有高表达水平，具有巨大的产业化应用前景。[0065]按照上述相同方法测定六个突变体naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)的表达水平，发现上述六个突变体相对于大肠杆菌k5肝素骨架合酶kfia，也具有较高的表达水平。[0066]实施例2.肝素骨架合酶naglcnac-t及其突变体活性的验证[0067](1)肝素骨架合酶naglcnac-t的glcnac转移酶活性验证[0068]用商业化glca-pnp(终浓度0.2mm)作为受体底物，udp-glcnac(终浓度0.3mm)作为供体底物进行反应，反应体系如表2所示；该反应置于37℃水浴锅中反应4h，沸水加热5min使酶失活从而终止反应，反应液用0.22μm的滤膜过滤后按照表1所述方法进行hplc检测，单糖受体的pnp基团在紫外310nm检测波长下有特异性吸收，流动相流速为0.5ml/min。[0069]使用同样的方法检测六个突变体naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)的glcnac转移酶活性。[0070]表2.naglcnac-t及其突变体的glcnac转移酶活性验证反应体系[0071][0072]检测结果如图4所示，naglcnac-t及各个突变体均具有glcnac转移酶活性，能将glcnac基团转移到glca-pnp的非还原端，生成肝素二糖glcnac-glca-pnp。其中，受体底物glca-pnp的反应转化率如图3所示，由反应转化率及蛋白酶的表达量计算得到蛋白酶的总酶活，结果如图5所示，naglcnac-t的每升发酵液的总酶活是大肠杆菌k5肝素骨架合酶kfia的5.22倍。[0073]按照表2的反应体系及上述处理方法对六个突变体的活性进行测定，37℃水浴锅中反应1h，各个突变体的受体底物glca-pnp的反应转化率如图6所示，结果显示各个突变体相对于naglcnac-t的活性均有不同程度的保持和提升，其中突变体naglcnac-t(c16l)和突变体naglcnac-t(s165k)活性最佳，这些突变体是高效催化肝素糖链合成的工具酶。[0074](2)肝素二糖glcnac-glca-pnp的质谱确证[0075]为了确认上述活性反应的产物结构为glcnac-glca-pnp，随后进行电喷雾电离质谱(esi-ms)分析。反应以较大规模进行以获得足够的二糖产物。产物通过p2柱进行纯化，然后在thermo lcq-deca上进行ms分析。ms的所有样品都是通过溶解在50％甲醇中制备的。ms实验在负离子模式下进行，喷雾电压为5kv，毛细管温度为275℃。[0076]质谱分析结果如图7所示，ms图谱中得到了与glcnac-glca-pnp(mw＝518.14)脱去一个质子后分子量相符合的峰(517.02)，并且其二倍峰(1034.72)同时被检测到，证明产物glcnac-glca-pnp的生成。[0077](3)肝素二糖glcnac-glca-pnp的核磁确证[0078]取约1mg上述活性反应产物glcnac-glca-pnp溶于500μl的重水中，使用600m核磁收集1h-nmr。如图8所示为1h-h cosy谱，其中化学位移值为5.35(d,j＝4.15hz,1h)的信号，说明glcnac与glca之间的键型为α键，从而证实所合成的二糖为肝素骨架。[0079]实施例3肝素骨架合酶naglcnac-t及其突变体的性质研究[0080](1)酶的体外反应最适反应ph测定[0081]反应体系如表2所示，除缓冲液ph外其他都不变，将tris-hcl缓冲液换成不同ph值的柠檬酸/磷酸盐/tris-hcl缓冲液，分别设置4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.5共计12个ph梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同上。[0082]结果如图9所示，结果说明该酶在广泛的ph范围内(6.5-9.5)具有活性，反应的最适ph为8.5。[0083](2)酶的体外反应最适金属离子的测定[0084]反应体系除金属离子外其他都不变，同时将mn2+换成相同浓度的离子mg2+、mn2+、ni2+、nh4+、cu2+、ca2+、k+、ba2+、zn2+进行反应，每种离子三个平行实验组，设置空白对照。其余处理条件同上。[0085]结果如图10所示，结果说明，该酶在mn2+、mg2+、ni2+存在的情况下均有最佳的催化活性，不加任何离子时反应程度较弱。[0086](3)反应温度对酶活影响的研究[0087]反应体系如表2，设置4℃，10℃，20℃，37℃，50℃共5个温度梯度点进行酶反应，每个梯度三组平行。测定反应温度对酶活力的影响。其余处理条件同上。[0088]结果如图11所示，表明酶反应最适的温度为37℃左右。[0089]按照上述相同方法对六个突变体naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)的性质进行研究，发现上述六个突变体与肝素骨架合酶naglcnac-t具有相似的性质，在广泛的ph范围内(6.5-9.5)具有活性，在mn2+、mg2+、ni2+存在的情况下均有最佳的催化活性，不加任何离子时反应程度较弱，反应最适的温度为37℃左右。[0090]实施例4肝素骨架合酶naglcnac-t的供体特异性研究[0091]为了确定naglcnac-t的底物特异性，使用商业化glca-pnp作为受体，udp-glcnac和其他种类结构类似的各种udp-糖作为供体(udp-galnac，udp-glc，udp-gal，udp-glcntfa，udp-galnaz，udp-glcnaz、udp-glcnh2)，按照表2体系进行反应。所有这些反应均在37℃水浴中进行4小时。最后反应产物按照表1所述的方法通过hplc分析。[0092]结果如图12所示，表明当受体是单糖glca-pnp时，在实验组所有中的单糖供体中，肝素骨架合酶naglcnac-t除了其天然底物udp-glcnac外，还可以以udp-glcntfa、udp-glcnaz为底物，但反应程度较弱。[0093]按照上述相同方法研究六个突变体naglcnac-t(c16l)、naglcnac-t(n25p)、naglcnac-t(i30l)、naglcnac-t(i111s)、naglcnac-t(s165k)、naglcnac-t(s172a)的供体特异性，发现上述六个突变体相对于与肝素骨架合酶naglcnac-t具有相似的供体特异性，除了其天然底物udp-glcnac外，还可以以udp-glcntfa、udp-glcnaz为底物，但反应程度较弱。









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