一种鉴定燕窝基原的ARMS-PCR引物组、试剂盒及其检测方法与用途与流程

有机化合物处理,合成应用技术一种鉴定燕窝基原的arms-pcr引物组、试剂盒及其检测方法与用途技术领域1.本发明涉及燕窝基原检测技术领域，特别涉及一种鉴定燕窝基原的arms-pcr引物组、试剂盒及其检测方法与用途。背景技术：2.燕窝是指雨燕目雨燕科的部分雨燕和金丝燕属的几种金丝燕分泌出来的唾液，再混合其他物质所筑成的巢穴。主产于马来西亚、印度尼西亚、泰国和缅甸等东南亚国家及我国的福建和广东沿海地带。燕窝含有丰富的糖类、有机酸、游离氨基酸以及特征物质——唾液酸，具有一定的营养价值。具体到燕窝基原而言，不同燕窝基原的燕窝具有差异，尤其体现于不同基原的燕窝具有其不同的组成占比、形态、口感等，如：唾液酸占比不同。不同燕窝基原的燕窝具有区别特征，因此，对于燕窝基原的鉴定显得必要。对燕窝基原的鉴定不仅有利于燕窝的科学研究，也方便对市场流通的燕窝产品进行鉴定，避免市场流通假冒伪劣产品，对燕窝的整个生产销售环境具有良好的促进效果。3.然而，现有的燕窝基原鉴定方法仍存在诸多不足，无法实现较为准确、快速的燕窝鉴定。如，现有技术中常见的就是采用感官鉴定、理化性质鉴定，虽然该类方法较为简单，但准确性不足、灵敏度低、重现性差。因此，现有技术亟需一种准确度高、灵敏度高、具有重现性的燕窝基原鉴定方法，以弥补现有技术常见鉴定方法所存在的不足。4.四引物扩增受阻突变体系pcr(tetra-primer arms-pcr)技术是一种在普通pcr基础上发展起来的单核苷酸多态性(snp)分型技术，扩增受阻突变体系是牛顿等人在1989年发明，其基本原理是由于taq dna聚合酶缺乏3'→5'外切酶的活性，因此以低于正常末端配对引物的速度延伸3'末端错配的引物；当错配碱基的数目达到一定数量时，3'末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能继续延伸，从而导致反应终止，即无法得到特异长度的扩增条带，说明模板dna与引物3'末端没有发生相应的突变。如果聚合酶链反应的结果显示出特异长度扩增条带，即表明模板dna上有与引物3'末端相应的突变。引入错配碱基至引物3'端倒数第二或三位，如果错配碱基3'端最强错配是g/a和c/t，在引物中引入一个弱错配c/a，c/t；如果错配碱基3'端中等错配是(a/a、c/c、g/g和t/t)，在引物中引入一个中等错配。tetra-primer arms-pcr技术需要根据其具体snp位点设计4条不同的引物，分别在snp位点两侧设计2条内引物和在snp位点上下游不同距离分别设计2条外引物。在传统的tetra-primer arms-pcr中，一般直接用电泳来检测扩增产物。tetra-primer arms pcr反应由于tetra-primer arms pcr反应中的上游引物和下游引物到突变点距离有差异，因此在电泳图谱中获得特异性条带大小也不同。根据3'末端特异性引物阻断类型和电泳图谱中条带大小以及有无，可以直接判断个体的基因型。5.本技术意在结合arms-pcr特点，解决现有技术中在燕窝基原鉴定技术领域常用鉴定方法的不足，提供一种准确、快速、灵敏的鉴定方法及相关引物、试剂等。技术实现要素：6.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种鉴定燕窝基原的arms-pcr引物组、试剂盒及其检测方法与用途，结合arms-pcr技术实现燕窝基原的鉴定，操作简单、鉴定快速、灵敏度高、准确性高，便于快速对燕窝产品溯源，并有效减小劳动强度。7.本发明的首要目的在于克服现有形态学鉴定难点，提供一种鉴定燕窝基原的引物组。8.本发明的上述目的通过以下方案予以实现：9.一种鉴定燕窝基原的引物组，包括第一引物组和/或第二引物组；所述第一引物组包括：上游外引物af/1-553bp-f、下游外引物af/1-553bp-r、上游内引物af/1-a-201bp-f、下游内引物af/1-g-402bp-r；第二引物组包括：上游外引物am-nd2-463bp-f、下游外引物am-nd2-463bp-r、上游内引物am-nd2-a-317bp-f、下游内引物am-nd2-g-201bp-r；序列分别为af/1-553bp-f：tctagcaatcattgaataatagcctgagc；af/1-553bp-r：agaaggttagtagagtcagtttggggttg；af/1-a-201bp-f：caccatcctcttcataacatccaca；af/1-g-402bp-r：ggtgaggagggttgggtctagttac；am-nd2-463bp-f：cccattccacttctgatttccagaagtcc；am-nd2-463bp-r：tttaggtaggaagcctgttaggggtggg；am-nd2-a-317bp-f：tatttcttctaccaccttagggggcgga；am-nd2-g-201bp-r：cggacctgtgtttggtttagtcccctc。10.在本发明的一个以上实施例中，对不同来源的燕窝样品进行鉴定，通过第一引物组能够有效鉴定其中的爪哇金丝燕燕窝，通过第二引物组则能有效鉴定其中的大金丝燕燕窝，通过第一引物组、第二引物组的配合，即使燕窝来源不同，仍能够有效的鉴定燕窝的生物基原。通过本技术中的引物组，能够有效鉴定燕窝样品的生物基原，且应用引物组进行扩增而鉴定的方式较现有人工辨别、理化指标鉴别等方式更加准确，且操作方便、效率高，便于投入实际生产、研究中使用，包括产品溯源、燕窝基因组研究等。11.优选地，第一引物组用于鉴定爪哇金丝燕燕窝，第二引物组用于鉴定大金丝燕燕窝。在本发明的一个实施例中，通过检测燕窝样品dna在第一引物组、第二引物组下是否成功扩增以及扩增条带的特征，从而分别鉴定出燕窝样品是否为与第一引物组相应的爪哇金丝燕生物基原，或与第二引物组相应的大金丝燕生物基原。12.上述引物组也可以理解为两个引物组独立或配合的鉴定，如，一种用于鉴定爪哇金丝燕燕窝的引物组合，包括四条特异性引物，四条特异性引物分别为上游外引物af/1-553bp-f、下游外引物af/1-553bp-r、上游内引物af/1-a-201bp-f、下游内引物af/1-g-402bp-r，四条特异性引物的引物序列分别为：af/1-553bp-f：tctagcaatcattgaataatagcctgagc；af/1-553bp-r：agaaggttagtagagtcagtttggggttg；af/1-a-201bp-f：caccatcctcttcataacatccaca；af/1-g-402bp-r：ggtgaggagggttgggtctagttac；和/或，一种用于鉴定大金丝燕燕窝的引物组合，包括四条特异性引物，四条特异性引物分别为上游外引物am-nd2-463bp-f、下游外引物am-nd2-463bp-r、上游内引物am-nd2-a-317bp-f、下游内引物am-nd2-g-201bp-r，四条特异性引物的引物序列分别为：am-nd2-463bp-f：cccattccacttctgatttccagaagtcc；am-nd2-463bp-r：tttaggtaggaagcctgttaggggtggg；am-nd2-a-317bp-f：tatttcttctaccaccttagggggcgga；am-nd2-g-201bp-r：cggacctgtgtttggtttagtcccctc。13.本发明的再一目的在于提供一种鉴定燕窝基原的arms-pcr试剂盒，含有上述的引物组。通过所述试剂盒，便于结合常见的pcr设备、试剂实现燕窝基原的鉴定。14.优选地，arms-pcr试剂盒还包括用于扩增的pcr试剂。在本发明的一个以上实施例中，是通过arms-pcr方式进行样品dna的扩增，并根据引物的扩增结果以实现鉴别过程。试剂盒含有相应用于扩增的pcr试剂，有利于一步到位的准备主要所需材料，通过单个试剂盒即能满足鉴定所需的主要试剂。15.优选地，pcr反应体系包括如下组分2×tsingke master mix、上述引物组、待鉴定燕窝dna、mgcl2、dntps、taq dna polymerase。arms-pcr。16.优选地，pcr反应体系引物组中各引物浓度相同。在本发明的一个以上实施例中，第一引物组所应用的pcr体系中第一引物组各引物浓度相同，第二引物组所应用的pcr体系中第二引物组各引物浓度相同。17.优选地，其pcr反应体系为20μl，包括如下组分：18.在本发明的一个以上实施例中，第一引物组、第二引物组采用上述pcr体系进行模板dna的扩增，并获得了可用于鉴定的有效扩增条带。19.优选地，其pcr工作程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，40个循坏；最后再72℃延伸10min。20.本发明的再一目的在于提供一种燕窝基原鉴定的arms-pcr检测方法，包括如下步骤：a1、提取待鉴别燕窝的dna；a2、设计扩增特异基原dna的arms-pcr引物，并以a1获取的dna为模板配置arms-pcr反应体系；如，以步骤(1)中提取的dna为模板，采用上述的引物组配制pcr反应体系进行pcr扩增；a3、依据pcr扩增结果鉴定其燕窝基原，即比较arms-pcr扩增结果是否与所采用arms-pcr引物的预期扩增条带相应而鉴定待鉴别燕窝的基原是否为arms-pcr引物代表的燕窝基原。21.步骤a3中所述的鉴定的方法为：若凝胶上出现arms-pcr引物相应的燕窝基原特异性条带即可判断待鉴别样品是arms-pcr引物代表的燕窝基原；反之，不是arms-pcr引物代表的燕窝基原。22.优选地，步骤a2中arms-pcr引物为上述引物组，所述特异基原为爪哇金丝燕燕窝和/或大金丝燕燕窝。23.优选地，步骤a1中通过异硫氰酸胍法提取燕窝样品中dna。24.优选地，步骤a1具体包括步骤：a11、将研碎后的燕窝加入1.5ml离心管中，加入200μl te缓冲液，混匀；a12、再加入400μl异硫氰酸胍液，涡旋混匀55℃水浴消化1h,期间不停颠倒匀，直至溶液透明；a13、加入300μl tris-饱和酚(25:24:1)和300μl二氯甲烷/异戊醇(24:1)，剧烈振荡15s，13000r/min离心10min；a14、取上清，加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡15s，13000r/min离心10min；a15、取上清及氯仿层，加入0.8倍体积的异丙醇，12000r/min离心10min；a16、弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀；室温下放置使残余乙醇完全挥发；a17、加入25ul te缓冲液溶解dna沉淀，dna样品于-20℃保存。25.优选地，步骤a3中将pcr产物用1～3％琼脂糖凝胶进行电泳，以获取条带是否扩增以及扩增的长度等结果。更优选地，电泳步骤中：电压为100v，电泳50min。26.本发明的再一目的在于提供上述引物组在制备鉴定燕窝基原的产品中的用途。基于上述引物组，能够有效的鉴定燕窝生物基原，据此，可制备出含有该引物组或通过该引物组检测的产品以投入实际应用，所述产品包括试剂盒、含有该引物组信息的测序平台等。27.与现有技术相比，本发明的有益效果为：相较于现有技术常用的感官鉴定、理化性质鉴定，采用arms-pcr在基因序列层次上的鉴定更为准确、灵敏，同时，较其他常见分子生物学检测方法，操作更为简单，不需要过多的复杂设备、预处理等过程，兼具准确度、灵敏度的同时保障了arms-pcr的简单可操作性，便于投入实际生产、鉴定中使用。且采用本技术的arms-pcr引物、试剂盒、检测方法以鉴定燕窝，能提高现有技术中燕窝检测效率，便于对燕窝产品实现有效、准确的溯源，并降低劳动强度。附图说明28.图1是arms-pcr的引物对于爪哇金丝燕的电泳结果。其中：m:dna maker(2000bp)，1-9号样品分别为：n5、n6、n7、n8、n9、n14、n11、n13、n19，10-18号样品为：d1、d2、d3、z1、z2、z3、x1、x2、x3；具体的，1代表n5；2代表n6；3代表n7；4代表n8；5代表n9；6代表n14；7代表n11；8代表n13；9代表n19；10代表d1；11代表d2；12代表d3；13代表z1；14代表z2；15代表z3；16代表x1；17代表x2；18代表x3。其中n9，n11，n13，n19是泰国洞燕大金丝燕。29.图2是arms-pcr的引物对于大金丝燕的电泳结果。其中：m：dna maker(2000bp)；1号样品为：n9；2号样品为：n11；3号样品为：n5；4号样品为n13；5代表n19；6号样品为n6。其中n5、n6是爪哇金丝燕的样品。具体实施方式30.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。31.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。32.现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。实施例133.(一)实验材料：34.本实施例中采用的燕窝样品如表1所示，其中燕窝样品均为已鉴定样品。35.表1：选取来自不同金丝燕属(aerodramus)的燕窝样品foward、am-nd2-g-201bp-reverse，由北京擎科新业生物技术有限公司制备)。39.(三)实验仪器：40.h1850r型高速冷冻离心机(购于湖南长沙湘仪仪器有限公司)、sartorius bsa224s型分析天平(购于赛多利斯科学仪器有限公司)、超纯水系统(购于默克密理博实验室设备(上海)有限公司)、hh-s型恒温水浴锅(购于巩义市予华仪器有限公司)、s1000tm thermal cycel pcr仪购于bio-rad中国公司、universal hood ii凝胶成像仪(购于bio-rad中国公司)、电泳仪(power pactm basic 041br125814)(购于bio-rad中国公司)、微波炉(ptof23p-a5(so))(购于galanz公司)、超灵敏全白动成像分析(购于普诺森生物科技有限公司)、synergy h1全自动多功能酶标仪(购于biotek公司)。41.(四)实验过程42.a1、dna提取43.分别取25mg表1中的燕窝样品，使用异硫氰酸胍法提取dna。液氮研碎各燕窝样品，称取25-30mg；具体步骤如下：44.(1)将研碎后的燕窝加入1.5ml离心管中，加入200μl te缓冲液(ph8.0，1×te缓冲液：10mm ph 8.0tris-hcl、0.1mm edta定容至100ml)，混匀；45.(2)再加入400μl异硫氰酸胍液，涡旋混匀55℃水浴消化1h，期间不停颠倒匀，直至溶液透明；46.(3)加入300μl tris-饱和酚(购于北京雷根生物技术有限公司，苯酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1)和300μl二氯甲烷/异戊醇(二氯甲烷/异戊醇按体积比24:1计算)，剧烈振荡15s，13000r/min离心10min；47.(4)取上清，加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡15s，13000r/min离心10min；48.(5)取上清及氯仿层，加入0.8倍体积的异丙醇，12000r/min离心10min；49.(6)弃上清，加入1ml 70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，室温下放置使残余乙醇完全挥发；50.(7)加入25μl te缓冲液溶解dna沉淀，dna样品于-20℃保存。51.a2、arms-pcr引物设计52.于ncbi中nucteotide下载aerodramusfuciphagus(爪哇金丝燕)和aerodramus maximus(大金丝燕)的nd2序列，使用primer preimer 5.0软件设计arms-pcr引物(如表2所示)，arms-pcr引物鉴定表1中的燕窝基原。53.表2：arms-pcr引物54.a3、arms-pcr扩增、产物电泳鉴定55.(1)arms-pcr扩增体系及程序56.pcr反应体系为20μl，其中，2×tsingke master mix 7.5μl，四个引物各0.5μl(10μm)，dna模板(浓度100ng/μl)7μl，mgcl2(3mm)1μl，dntps(0.4mm)2μl，taq dna聚合酶(1.25u/25μl)0.5μl，余量为ddh2o。57.pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸60s，40个循坏；最后一个循坏后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳法，1.5％琼脂糖tae凝胶电泳，1×tae溶液配制，电压100v，50min，于凝胶成像仪下观察电泳结果。该技术pcr反应条件时间95分钟，然后使用1.5％琼脂糖，检测电泳条带，操作全部步骤使用时间145分钟。58.(2)将上述arms-pcr扩增体系及程序应用于鉴定爪哇金丝燕的arms-pcr引物(上游外引物af/1-553bp-f、下游外引物af/1-553bp-r、上游内引物af/1-a-201bp-f、下游内引物af/1-g-402bp-r)和表1的18种样品，实施鉴定过程。具体的，表1样品中南部9个样品(n5-n9,n11,n13,n14,n19)，中部3个样品(z1-z3)，东部3个样品(d1-d3)，西部3个样品(x1-x3)。59.完成上述arms-pcr扩增及产物电泳鉴定过程，结果如图1所示，n5、n6、n7、n8、n14、d1-d3、z1-z3、x1-x3的样品电泳扩增条带长度为533bp、402bp、201bp；n9、n11、n13、n19样品没有条带。该结果与表1已鉴定结果一致。60.(3)将上述arms-pcr扩增体系及程序应用于鉴定大金丝燕的arms-pcr引物(上游外引物am-nd2-463bp-f、下游外引物am-nd2-463bp-r、上游内引物am-nd2-a-317bp-f、下游内引物am-nd2-g-201bp-r)和表1中的6种样品(包括n9、n11、n5、n13、n19、n6)，实施鉴定过程。61.完成上述arms-pcr扩增及产物电泳鉴定过程，结果如图2所示，其中，1代表n9、2代表n11、3代表n5、4代表n13、5代表n19、6代表n6，电泳产物n9、n11、n13、n19样品的结果电泳扩增条带长度分别为463bp、317bp、201bp，n5、n6样品没有条带。该结果与表1已鉴定结果一致。62.通过上述arms-pcr扩增结果可得，本技术提供的arms-pcr引物组及相应的检测方法能够有效的鉴定燕窝基原，且准确度高，可再现。如上述对爪哇金丝燕、大金丝燕的鉴定，结果均与已鉴定结果一致，表明本技术提供的arms-pcr引物、检测方法均具有实用性，便于投入实际鉴定过程中使用，实现燕窝基原的鉴定。且采用arms-pcr方法进行鉴定，较其他方法能够显著提高检测效率，便于快速扩增和对燕窝产品溯源，降低劳动强度。实施例263.本实施例提供一种鉴定燕窝基原的arms-pcr试剂盒，包含实施例1中的引物组。64.具体的，含有第一引物组和/或第二引物组；所述第一引物组包括：上游外引物af/1-553bp-f、下游外引物af/1-553bp-r、上游内引物af/1-a-201bp-f、下游内引物af/1-g-402bp-r；第二引物组包括：上游外引物am-nd2-463bp-f、下游外引物am-nd2-463bp-r、上游内引物am-nd2-a-317bp-f、下游内引物am-nd2-g-201bp-r。65.其arms-pcr反应体系为20μl，包括如下组分：pcr反应体系为20μl，包括如下组分：66.arms-pcr试剂盒使用过程中，其arms-pcr工作程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，40个循坏；最后再72℃延伸10min。67.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。









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