用于不依赖于模板的核酸合成的方法和试剂盒与流程

有机化合物处理,合成应用技术用于不依赖于模板的核酸合成的方法和试剂盒1.相关申请的交叉引用2.本件申请案主张在2019年12月23日提交的美国临时申请号16/725,420的优先权，所述申请案通过引用以其整体并入本案。技术领域3.本公开涉及一种用于核酸合成的方法和试剂盒，特别是一种用于不依赖于模板的核酸合成的方法与试剂盒。背景技术：4.在过去的几十年间，已经开发了免除dna模板的dna从头合成(de novo dna synthesis)。在目前可用的不依赖于模板的dna合成方法中，基于亚磷酰胺的化学dna合成自1980年代初期就已经广为人知，但此后基本上维持不变。所述基于亚磷酰胺的化学dna合成需要四个连续的反应步骤，包括去阻断(de-blocking)、偶联(coupling)、封端(capping)和氧化(oxidation)步骤，以将核苷添加至系于固体支撑物的另一核苷。然而，基于亚磷酰胺的化学dna合成的主要缺点之一是在上述反应步骤中无法避免有害化学物质的使用。5.由于对环境保护的需求不断提升，适用于dna合成的绿色科技已引起研究人员的注意。因此，可大幅降低有害化学物质使用的酶促dna合成(enzymatic dna synthesis)由于具有诸如较长链生成、较低错误率、较快速的循环时间、较低生产成本等优点，而看似具有前景。6.就不依赖于模板的酶促dna合成(template-independent enzymatic dna synthesis)而言，已经发现末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,tdt)是可将所有四种脱氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphates,dntp)附加至dna链的3'末端的不依赖于模板的dna聚合酶(template-independent dna polymerase)。tdt属于低保真度(low-fidelity)dna聚合酶的x家族(x family)。基于tdt的dna合成(tdt-based dna synthesis)仅需两个反应步骤，即从正在合成中的单链dna链延伸的3'端通过tdt进行单一核苷酸添加以及继而移除3'-保护基。尽管tdt及其同源物已应用于许多dna合成平台，但基于tdt的不依赖于模板的酶促dna合成由于令人不满意的产物长度、试剂可再用性、循环时间等而难以商品化。技术实现要素：7.因此，本公开的目的是提供一种用于合成核酸的方法和试剂盒，其可以减轻先前技术的至少一个缺点。8.所述方法包括提供起始子(initiator)，其具有位于3'末端的未受保护的核苷碱基和3'羟基；提供核酸聚合酶，其具有至少一个b家族dna聚合酶(family-b dna polymerase)的保守催化聚合酶结构域；提供核苷酸单体；以及在所述核酸聚合酶及至少一种属于二价阳离子的金属辅因子存在下，并且在模板不存在下，令所述起始子暴露于所述核苷酸单体使得所述核苷酸单体被并入所述起始子。9.所述试剂盒包括如上所述的起始子、如上所述的核酸聚合酶、至少一种如上所述的金属辅因子，以及如上所述的核苷酸单体。所述试剂盒依据如上所述的方法使用。附图说明10.本发明的其他特征和优点在以下参照附图的实施方案的详细说明中将变得明显，其中：11.图1是使用b家族dna聚合酶的核酸从头合成；12.图2是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在不同反应温度下使用kod1exo-dna聚合酶所获得的不依赖于模板的核酸合成的产物，其中符号“s”表示起始子dna的位置；13.图3是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在不同反应温度下使用ventexo-dna聚合酶所获得的不依赖于模板的核酸合成的产物，其中符号“s”表示起始子dna的位置；14.图4是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在不同反应温度下使用pfuexo-dna聚合酶所获得的不依赖于模板的核酸合成的产物，其中符号“s”表示起始子dna的位置；以及15.图5是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在只有mg2+或与mn2+组合的存在下使用ventexo-dna聚合酶、kod1exo-dna聚合酶或pfuexo-dna聚合酶所获得的不依赖于模板的核酸合成的产物，其中符号“s”表示起子始dna的位置，符号“v”、“k”、“p”分别表示ventexo-dna聚合酶、kod1exo-dna聚合酶和pfuexo-dna聚合酶。具体实施方式16.应理解，若有任何一件前案刊物在此被引述，所述前案刊物不构成下述承认：在任何国家或地区中，所述前案刊物形成本领域的常见一般知识的一部分。17.为了本说明书的目的，将被清楚地理解，术语“包含(comprising)”意指“包含但不限于”，且术语“包括(comprises)”具有对应的意义。18.除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与本文中描述的那些相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受限于所描述的方法和材料。19.申请人意外地发现到：可使用b家族dna聚合酶(其作为依赖于模板的dna聚合酶而广为人知)来进行不依赖于模板的核酸合成(即，核酸从头合成)。参阅图1，例示了使用b家族dna聚合酶的核酸从头合成流程图。20.b家族dna聚合酶(也称为b型dna聚合酶)是复制性和修复性聚合酶，其固有地具有催化聚合酶结构域和3'至5'核酸外切酶结构域，且可以在细菌(bacteria)、古细菌(archaea)、真核生物(eukaryotes)和病毒(viruses)中被发现。术语“催化聚合酶结构域”意指蛋白质的氨基酸序列的结构部分或区域，其具有所述蛋白质的催化dna/rna聚合酶活性，而其不含有其他催化活性，诸如编辑活性(例如，3'至5'核酸外切酶结构域的校正活性(proofreading activity))、用于在复制期间切除(excision)冈崎引物(okazaki primers)的活性，以及与其他蛋白质相互作用的活性。b家族dna聚合酶的催化聚合酶结构域具有共同的整体结构，其类似于右手而由拇指、手掌以及手指结构域所组成。最保守的区域是含有催化位点的手掌结构域。21.b家族dna聚合酶的示例包括，但不限于，细菌的b家族dna聚合酶(例如pol ii)、真核生物的b家族dna聚合酶(例如polα、polδ和polε，以及polζ)、古细菌的b家族dna聚合酶(例如pol b、pol bi、pol bii、pol biii、9°n、kod1、pfu、tgo，以及vent)，和病毒的b家族dna聚合酶(例如hsv-1、rb69、t4、b103，以及φ29)。22.因此，本公开提供一种用于合成核酸的方法，其包括：23.提供起始子，其具有位于3'末端的未受保护的核苷碱基和3'羟基；24.提供核酸聚合酶，其具有至少一个b家族dna聚合酶的保守催化聚合酶结构域；25.提供核苷酸单体；以及26.在所述核酸聚合酶和至少一种属于二价阳离子的金属辅因子存在下，并且在模板不存在下，使所述起始子暴露于所述核苷酸单体，使得所述核苷酸单体被并入所述起始子。27.如本文中所用的，“核酸(nucleic acid)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”或“核酸片段(nucleic acid fragment)”等术语是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且包含已知的天然存在的核苷酸或人工化学模拟物。如本文所用，术语“核酸”可与“寡核苷酸(oligonucleotide)”、“多核苷酸(polynucleotide)”、“dna”、“rna”、“基因(gene)”、“cdna”和“mrna”交换使用。28.一般而言，“模板(template)”是含有靶标核苷酸序列的聚核苷酸。在一些情况下，术语“靶标序列(target sequence)”、“模板多核苷酸(template polynucleotide)”、“靶标核酸(target nucleic acid)”、“靶标多核苷酸(target polynucleotide)”、“核酸模板(nucleic acid template)”、“模板序列(template sequence)”以及它们的变化可交换使用。具体而言，术语“模板”意指一条核酸链，在所述核酸链上，通过依赖于模板的核酸聚合酶的活性由核苷酸或核苷酸类似物合成互补的复本。在双链体(duplex)中，依照惯例，所述模板链被描绘和描述为“底(bottom)”链。相似地，所述非模板链通常被描绘和描述为“顶(top)”链。所述模板链也可称为“有义(sense)”链，而所述非模板链则被称为“反义(antisense)”链。29.术语“并入(incorporated)”或“并入(incorporation)”是指成为核酸的一部分。在关于核酸前体的并入的术语学上存在已知的灵活性。例如，核苷酸dgtp是脱氧核糖核苷三磷酸。当并入dna中，dgtp变成dgmp，即脱氧鸟苷单磷酸部分。虽然dna不包括dgtp分子，但人们可以说将dgtp并入dna中。30.术语“起始子”是指核酸要自其从头合成的单核苷、单核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸，或者它们的经修饰的类似物。术语“起始子”也可指具有3'羟基的异核酸(xeno nucleic acids,xna)或肽核酸(peptide nucleic acids,pna)。31.根据本公开，起始子可具有选自以下的序列：非自我互补的序列和形成非自我互补性的序列。术语“自我互补的(self complementary)”意指序列(例如核苷酸序列或pna序列)自我折叠(例如，序列的一个区域与所述序列的另一个区域结合或杂交)，从而产生可作为模板用于核酸合成的双链体、双链样结构。取决于序列的互补区域如何贴近在一起，所述链可形成，例如，发夹环(hairpin loops)、联结(junctions)、凸起(bulges)或者内部环(internal loops)。术语“形成自我互补性的(self complementarity forming)”用来描述一种序列(例如核苷酸序列、xna，或pna序列)，当所述序列充当模板时，自所述序列形成互补的延伸部分(即，基于充当模板的所述序列形成自我互补的序列)。例如，形成自我互补的序列可以是“atcc”。当“atcc”序列充当模板时，形成与所述序列互补的延伸部分“ggat”(即，形成了自我互补的序列“atccggat”)。32.术语“保守(conservative)”或“保守的(conserved)”用来描述含有在多个具有相同结构和/或功能的蛋白质中相同的氨基酸残基的结构域。保守氨基酸残基的区域对于蛋白质结构或功能可能是重要的。因此，在三维蛋白质中所鉴定出连续的保守氨基酸残基对于蛋白质结构或功能可能是重要的。33.例如，如albà(2001),genome biology,2(1)：reviews3002.1至review3002.4中所报导，b家族dna聚合酶具有区域i与ii(regions i and ii)，其形成催化聚合酶结构域活性位点的一部分，且其可能分别含有保守氨基酸残基“dt”和“slyps”。区域i可能横跨氨基酸残基512至582、氨基酸残基513至582或583，或者氨基酸残基535至604。区域ii可能跨越氨基酸残基375至441或442，或者氨基酸残基397至464。34.根据本公开，所述核酸聚合酶可进一步具有3'至5'核酸外切酶结构域，并且可以是选自由以下组成的组中的b家族dna聚合酶：细菌的b家族dna聚合酶、真核生物的b家族dna聚合酶、古细菌的b家族dna聚合酶，以及病毒的b家族dna聚合酶。在一些实施方案中，所述b家族dna聚合酶选自由以下组成的组：极端嗜热古生菌kod1(thermococcus kodakaraensis kod1)的b家族dna聚合酶、激烈火球菌(pyrococus furious,pfu)的b家族dna聚合酶和滨海热球菌(thermococcus litoralis)(vent)的b家族dna聚合酶。35.根据本公开，所述b家族dna聚合酶的3'至5'核酸外切酶结构域可以是无活性的。另选地，所述b家族dna聚合酶的3'至5'核酸外切酶的活性可以是降低的。又另选地，所述b家族dna聚合酶的3'至5'核酸外切酶结构域可以保持不变，且在本发明的方法中，可使用抑制剂来抑制所述b家族dna聚合酶的3'至5'核酸外切酶结构域。36.根据本公开，另选地，所述核酸聚合酶可仅具有前述的保守催化聚合酶结构域。在一些实施方案中，所述核酸聚合酶最初被设计为仅具有前述原始的保守催化聚合酶结构域。在其他实施方案中，所述核酸聚合酶是原始的具有3'至5'核酸外切酶结构域的b家族dna聚合酶，且所述结构域已经从所述核酸聚合酶中被移除。37.在一些实施方案中，所述起始子呈单链形式。38.在一些实施方案中，所述起始子具有至少五个核苷酸。在示例性的实施方案中，所述起始子具有四十五个核苷酸。39.在一些实施方案中，所述起始子在10℃至90℃范围内的温度下暴露于所述核苷酸单体，和/或所述起始子在不小于8.0(例如，8.8)的ph下暴露于所述核苷酸单体。40.根据本公开，所述核苷酸单体可以是天然核酸核苷酸，其组成要素为糖、磷酸酯基团和氮碱基。所述糖可以是rna中的核糖或dna中的2'-脱氧核糖。取决于所要合成的核酸是dna或rna，所述氮碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶。另选地，所述核苷酸单体可以是在三个组成要素中的至少一个上进行修饰的核苷酸。举例来说，所述修饰可发生在碱基层面上，产生经修饰的产物(诸如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2,6-嘌呤或溴-5-脱氧尿苷，以及任何其他允许杂交的经修饰的碱基)、在糖层面上(例如，通过类似物替换脱氧核糖)，或者，在磷酸酯基团层面上(例如，硼酸酯、烷基膦酸酯或者硫代磷酸酯衍生物)。41.根据本公开，所述核苷酸单体具有选自以下的磷酸酯基团：单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯和六磷酸酯。42.根据本公开，金属辅因子选自以下组成的组：mg2+、ca2+、sr2+、ba2+、mn2+、co2+、fe2+、ni2+、cu2+、zn2+和它们的组合。在示例性施方案中，所述金属辅因子是mg2+。在另一实施方案中，所述金属辅因子是mg2+与mn2+的组合。43.根据本公开，所述核苷酸单体具有可移除的阻断部分。所述可移除的阻断部分的示例包括但不限于，3'-o-阻断部分、碱基阻断部分和它们的组合。44.所述具有可移除的阻断部分的核苷酸单体也称为可逆性终止子。因此，所述具有3'-o-阻断部分的核苷酸单体也称为3'-阻断的可逆性终止子或3'-o-修饰的可逆性终止子，且所述具有碱基阻断部分的核苷酸单体也称为3'-未阻断的可逆性终止子或3'-oh未阻断的可逆性终止子。45.如本文所用，术语“可逆性终止子(reversible terminator)”是指经化学修饰的核苷酸单体。当所述可逆性终止子通过聚合酶被并入增长中的核酸内时，它阻断核苷酸单体进一步通过所述聚合酶并入。所述“可逆性终止子”碱基和核酸可通过化学或物理处理而去保护，并且在去保护之后，所述核酸可通过聚合酶一步延伸。46.3'-o-阻断部分的示例包括，但不限于，o-叠氮甲基、o-氨基、o-烯丙基、o-苯氧乙酰基、o-甲氧乙酰基、o-乙酰基、o-(对甲苯)磺酸酯、o-磷酸酯、o-硝酸酯、o-[4-甲氧基]-四氢噻喃基、o-四氢噻喃基、o-[5-甲基]-四氢呋喃基、o-[2-甲基,4-甲氧基]-四氢吡喃基、o-[5-甲基]-四氢吡喃基和o-四氢硫代呋喃基、o-2-硝基苄基、o-甲基和o-酰基。[0047]3'-未阻断的可逆性终止子的示例包括但不限于，7-[(s)-1-(5-甲氧基-2-硝苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-7-去氮atp、5-[(s)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-dctp、1-[(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-7-去氮-dgtp、5-[(s)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-dutp和5-[(s)-1-(2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-dutp。[0048]根据本公开，所述碱基阻断部分为可逆性染料-终止子。可逆性染料-终止子的示例包括但不限于，illumina novaseq的可逆性染料-终止子、illumina nextseq的可逆性染料-终止子、illumina miseq的可逆性染料-终止子、illumina hiseq的可逆性染料-终止子、illumina genome analyzer iix的可逆性染料-终止子、lasergen的闪电终止子(lightning terminator)，和helicos biosciences heliscope的可逆性染料-终止子。[0049]由于可逆性终止子是本领域技术人员所熟知且常用的，其更多细节为简洁目的在本文中省略。尽管如此，可应用的3'-阻断的可逆性终止子、可应用的3'-未阻断的可逆性终止子以及对于保护与去保护可应用的条件(即用于添加和消除所述可移除的阻断部分的条件)可以在例如gardner et al.(2012),nucleic acids research,40(15)：7404-7415、litosh et al.(2011),nucleic acids research,39(6)：e39以及chen et al.(2013),genomics proteomics bioinformatics,11：34-40中找到。[0050]根据本公开，所述起始子可连接至固体支撑物，且具有连接至所述固体支撑物的5'端。所述起始子可直接地附着至所述支撑物上，或者可经由连接子附着至所述支撑物上。[0051]根据本公开，固体支撑物的示例包括但不限于，微阵列、珠(经包被的或未-经包被的)、柱、光纤、拭子(wipes)、硝化纤维素、尼龙、玻璃、石英、重氮化膜(纸或尼龙)、硅树脂(silicones)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、磁性颗粒、塑料(诸如聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯)、凝胶形成材料(诸如蛋白质，例如，明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯聚合物、溶胶凝胶、多孔聚合物水凝胶、纳米结构表面、纳米管(诸如碳纳米管)和纳米颗粒(诸如金纳米颗粒或量子点)。[0052]此外，本发明提供一种用于合成核酸的试剂盒，其包括上述起始子、上述核酸聚合酶、上述的苷酸单体继而上述至少一种二价阳离子。所述试剂盒根据本发明的方法使用。[0053]本公开将就下面的实施例来做进一步说明，但应理解，这些实施例仅供例示说明用，而不应解释为本发明的实施上的限制。[0054]实施例[0055]实施例1.使用极端嗜热古生菌kod1(thermococcus kodakaraensis kod1)的b家族dna聚合酶进行不依赖于模板的核酸合成[0056]使用适量的下列成分制得合成反应混合物：单链起始子，其具有seq id no:1的核苷酸序列，以及具有未经保护的羟基的3'端和标记有荧光素亚磷酰胺(fluorescein amidite,fam)的5'端；脱氧核苷三磷酸，其充当核苷酸单体，且包括datp、dgtp、dctp和dttp；极端嗜热古生菌kod1的b家族dna聚合酶，其具有无活性的3'至5'核酸外切酶结构域且被称为kod1exo-dna聚合酶；以及tris-hcl缓冲液(ph8.8)。具体而言，所述合成反应混合物含有100nm的起始子、100μm的dntps和200nm的kod1exo-dna聚合酶。[0057]kod1exo-dna聚合酶如下制备。编码极端嗜热古生菌kod1的b家族dna聚合酶(没有内含肽但具有正常的3'至5'核酸外切酶结构域)的基因构建体由genomics biosci&tech co.所合成。为了获得kod1exo-dna聚合酶，通过将asp141置换为ala(d141a)以及将glu143置换为ala(e143a)来实现保守3’至5’核酸外切酶结构域的无活性，即修饰保守3'至5'核酸外切酶结构域的保守氨基酸残基“die”。具体而言，为了完成“d141a”和“e143a”氨基酸修饰，使用q5定点突变试剂盒(new england biolabs,ipswich,ma,usa)对上述基因构建体上所对应的核苷酸残基进行定点突变(site-directed mutagenesis)。将所得到的突变基因构建体于bl21(de3)细胞中进行表达，而所表达的蛋白质使用akta pure fplc系统(ge healthcare life sciences,marlborough,ma,usa)并依次通过histrap q和heparin柱进行纯化。由此所得到的kod1exo-dna聚合酶具有seq id no:2的氨基酸序列。[0058]将10μl的核酸合成反应混合物在下列温度中的一者下进行历时2分钟的预培育：10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃，以及90℃。随后，将适量的mg2+(充当金属辅因子)添加至各个反应混合物中以启动不依赖于模板的核酸合成，其被允许进行5分钟。通过添加以10μl的2x淬灭溶液(含有95％去离子甲酰胺和25mm乙二胺四乙酸)终止所述合成。[0059]将所得到的合成反应产物在98℃进行历时10分钟的变性。随后，通过15％变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶分析所述合成反应产物。通过amersham typhoon imager(ge healthcare life sciences,marlborough,ma,usa)观察凝胶双的所述合成反应产物。[0060]结果：[0061]如图2所示，kod1exo-dna聚合酶能在所测试的各个温度下进行不依赖于模板的核酸合成，从而显示：b家族dna聚合酶可用于在模板不存在下合成核酸。[0062]实施例2.使用滨海热球菌(thermococcus litoralis)(vent)的b家族dna聚合酶进行不依赖于模板的核酸合成[0063]不依赖于模板的核酸合成以及所述反应产物的分析大体上根据实施例1中所述的操作程序进行，但使用滨海热球菌(venttm)的b家族dna聚合酶(其具有无活性的3'至5'核酸外切酶结构域，因而被称为ventexo-dna聚合酶)。ventexo-dna聚合酶以与用于制备kod1exo-dna聚合酶相同的操作程序(参见实施例1)制备，但使用编码极端嗜热古生菌kod1的b家族dna聚合酶(没有内含肽但具有正常的3'至5'核酸外切酶结构域)的基因构建体。ventexo-dna聚合酶具有seq id no:3的氨基酸序列。[0064]结果：[0065]如图3所示，ventexo-dna聚合酶能在所测试的各个温度下进行不依赖于模板的核酸合成，从而显示：b家族dna聚合酶可用于在模板不存在下合成核酸。[0066]实施例3.使用激烈火球菌(pyrococus furious,pfu)的b家族dna聚合酶进行不依赖于模板的核酸合成[0067]不依赖于模板的核酸合成以及所述反应产物得到分析大体上根据实施例1中所述的操作程序进行，但使用pfu的b家族dna聚合酶(其具有无活性的3'至5'核酸外切酶结构域，因而被称为pfuexo-dna聚合酶)。pfuexo-dna聚合酶以与用于制备kod1exo-dna聚合酶相同的操作程序(参见实施例1)制备，但使用编码pfu的b家族dna聚合酶(没有内含肽但具有正常的3'至5'核酸外切酶结构域)的基因构建体。pfuexo-dna聚合酶具有seq id no:4的氨基酸序列。[0068]结果：[0069]如图4所示，pfuexo-dna聚合酶能在所测试的各个温度下进行不依赖于模板的核酸合成，从而显示：b家族dna聚合酶可用于在模板不存在下合成核酸。[0070]实施例4.通过b家族dna聚合酶与单一类型的二价阳离子或不同的二价阳离子组合进行不依赖于模板的核酸合成[0071]为了评估不同类型的二价阳离子是否会影响b家族dna聚合酶的不依赖于模板的核酸合成的效率，进行了下列实验。[0072]不依赖于模板的核酸合成以及所述反应产物的分析大体上根据实施例1中所述的操作程序进行，但使用kod1exo-dna聚合酶(实施例1中所述)、ventexo-dna聚合酶(实施例2中所述)和pfuexo-dna聚合酶(实施例3中所述)中的各者；将各个合成反应混合物在70℃下进行预培育；以及只将mg2+或将mg2+与mn2+的组合添加至各个反应混合物中。[0073]结果：[0074]如图5所示，在两种不同类型的二价阳离子存在下，使用三种b家族dna聚合酶中的任一者的不依赖于模板的核酸合成更有效率(更多新合成的核酸被发现)，从而证明：使用不同类型的二价阳离子的组合可以增强使用b家族dna聚合酶进行不依赖于模板的核酸合成的效率。[0075]本说明书中被引述的所有专利和文献通过引用以其整体并入本文。若有所冲突时，以本案中的详细说明(包含定义在内)为准。[0076]虽然已参照被认为是示范性的实施方案而描述本发明，但应理解：本公开不限于所描述的实施方案，而意欲涵盖被包括在最广泛的解释的精神与范畴中的各种不同的配置，以包含所有这类修改和等效配置。[0077][0078][0079][0080][0081][0082][0083][0084][0085]









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