脂质纳米粒子的冻干组合物

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及不含核酸的脂质纳米粒子的冻干组合物和使用该冻干组合物的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法。背景技术：2.为了将使用sirna等寡核酸的核酸疗法、使用mrna或pdna的基因疗法投入实际应用，需要有效且安全的核酸递送载体。病毒载体是具有高表达效率的核酸递送载体，但正在开发可以更安全地使用的非病毒核酸递送载体。3.由于使用具有季胺的阳离子性脂质的阳离子性脂质体带正电荷，因此它们可以与带负电荷的核酸通过静电相互作用形成脂质复合物(lipoplex)，从而可以将核酸递送至细胞内。此外，利用季胺与核酸发生静电相互作用，制备不含核酸的阳离子性脂质体的冻干组合物，并通过与核酸的水溶液进行再水合形成脂质复合物，因此也可以作为基因导入试剂使用(专利文献1、2)。4.然而，通过这种方法制备成的脂质复合物难以控制粒径，并且来自带正电荷的阳离子脂质的细胞毒性成为问题。5.因此，使用有在酸性条件下带正电荷且在中性附近不带电荷的在分子内具有叔胺的离子性脂质的脂质纳米离子(称为脂质纳米粒子(lipidnanoparticle)，或lnp)被开发，并且目前最通常使用的是使用非病毒核酸递送载体(非专利文献1)。6.作为使用有分子内具有叔胺的离子性脂质的脂质纳米粒子，也有在离子性脂质中添加分解性基团的例子(专利文献3)。7.如上所述，已经开发出各种非病毒载体，但核酸通常是不稳定的化合物，因此其作为制剂的稳定性仍然存在问题。8.作为提高作为制剂的稳定性的方法之一，尝试将包封有核酸的脂质纳米粒子冻干，并在使用时进行再水合，以重构脂质纳米粒子(专利文献4和非专利文献2)。9.虽然这些方法作为提高包封有特定核酸的脂质纳米粒子的保存稳定性的方法是有用的，但作为更简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中的方法存在问题。10.作为将任意核酸简便地包封在脂质纳米粒子中的方法，可以举出如专利文献1和2中记载的方法，制备不含核酸的冻干组合物，然后用核酸的水溶液进行再水合的方法。11.但是，使用在分子内具有叔胺的离子性脂质得到的脂质纳米粒子，由于制备后的表面电荷为弱负性至中性，因此不与核酸发生静电相互作用，无法通过专利文献1和2中公开的不含核酸的冻干组合物后用核酸水溶液再水合的方法，制备核酸包封脂质纳米粒子。12.如上所述，没有方法以高核酸包封率将任意核酸包封在脂质纳米粒子中。现有技术文献专利文献13.专利文献1：日本专利第4919397号公报专利文献2：日本专利第4598908号公报专利文献3：日本专利第6093710号公报专利文献4：国际公开第2017/218704号非专利文献14.非专利文献1：genetherapy6:271-281,1999非专利文献2：biol.pharm.bull.41,1291-1294(2018)技术实现要素：发明所要解决的问题15.本发明所要解决的问题是提供一种现有技术无法实现的可以高效且简便地包封任意核酸的冻干组合物，以及提供一种使用该冻干组合物的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法。解决问题的技术方案16.本发明人鉴于上述问题，经过不懈努力，结果发现，在酸性缓冲液中制备不含核酸的脂质纳米粒，进一步加入冷冻保护剂进行冷冻干燥，然后用含有核酸的水溶液进行再水合，由此可以高效且简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中。此外，使用通过该方法制备成的脂质纳米粒子，进行基因向细胞内导入实验，发现通过提高冻干前的冷冻保护剂的浓度，可以实现向细胞内均匀的基因导入，从而完成了本发明。17.即，本发明包括以下内容：[1]一种冻干组合物，其是脂质纳米粒子的冻干组合物，该脂质纳米粒子的冻干组合物不含核酸而包含离子性脂质、甾醇、peg脂质、在ph1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液成分及冷冻保护剂，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为10:1～1000:1。[0018][2]根据[1]所述的冻干组合物，进一步包含磷脂。[0019][3]根据[1]或[2]所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为30:1～1000:1。[0020][4]根据[1]～[3]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂的浓度以冻干前的组合物计为80～800mg/ml。[0021][5]根据[1]～[4]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂的浓度以冻干前的组合物计为160～800mg/ml。[0022][6]根据[1]～[5]中任一项所述的冻干组合物，其中，离子性脂质是由式(1)表示的化合物：[0023][化1][0024](式(1)中，r1a和r1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，xa和xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，r2a和r2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，ya和yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，za和zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，r3a和r3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或碳原子数为12～22的脂肪族烃基)。[0025][7]根据[1]～[6]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是二糖。[0026][8]根据[1]～[6]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是蔗糖。[0027][9]一种包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其包括以下步骤：a)将包含离子性脂质、甾醇及peg脂质的醇溶液与在ph1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液混合，制备不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液的步骤，b)将不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液与冷冻保护剂混合，得到包含80～800mg/ml的冷冻保护剂且ph1～6的混合物的步骤，c)将步骤b得到的混合物冻干，得到冻干组合物的步骤，d)将冻干组合物与包含核酸且任选包含0～25v/v％的醇的水溶液混合，任选将混合物在0～95℃下温育0～60分钟，得到包封核酸的脂质纳米粒子的步骤，以及e)通过透析、超滤或稀释，将得到的包封核酸的脂质纳米粒的外水相更换为中性缓冲溶液的步骤。[0028][10]根据[9]所述的方法，进一步包含如下步骤：在步骤a中，制备脂质纳米粒子悬浮液后，通过透析、超滤或稀释，将外水相更换为在ph1～6具有缓冲作用的其他酸性缓冲液。[0029][11]根据[9]或[10]所述的方法，在步骤a中，醇溶液进一步包含磷脂。[0030][12]根据[9]～[11]中任一项所述的方法，在步骤b中，混合物中的冷冻保护剂的浓度为160～800mg/ml。[0031][13]根据[9]～[12]中任一项所述的方法，其中，离子性脂质是式(1)表示的化合物。[0032][14]根据[9]～[13]中任一项所述的方法，其中，冷冻保护剂是二糖。[0033][15]根据[9]～[13]中任一项所述的方法，其中，冷冻保护剂是蔗糖。[0034][16]一种脂质纳米粒子的冻干组合物的制造方法，所述脂质纳米粒子的组合物不含核酸而包含离子性脂质、甾醇、peg脂质、在ph1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液及80～800mg/ml的冷冻保护剂。[0035][17]根据[16]所述的方法，其中，脂质纳米粒子的组合物进一步包含磷脂。[0036][18]根据[16]或[17]所述的方法，其中，冻干前的组合物中的冷冻保护剂的浓度为160～800mg/ml。[0037][19]根据[16]～[18]中任一项所述的方法，其中，离子性脂质是式(1)表示的化合物。[0038][20]根据[16]～[19]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是二糖。[0039][21]根据[16]～[19]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是蔗糖。[0040][22]一种核酸导入剂，其包含[1]～[8]中任一项所述的冻干组合物。[0041][23]一种将核酸递送到细胞内的方法，其包括：在生物体外，使包封有核酸的[22]所述的核酸导入剂与细胞接触。[0042][24]一种将核酸递送到细胞内的方法，其包括：将包封有核酸的[22]所述的核酸导入剂以递送至靶细胞的方式给予至生物体。[0043][25]一种将核酸导入细胞内的方法，其包括以下步骤：a)将包含离子性脂质、甾醇及peg脂质的醇溶液与在ph1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液混合，制备不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液的步骤，b)将不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液与冷冻保护剂混合，得到包含80～800mg/ml的冷冻保护剂且ph1～6的混合物的步骤，c)将步骤b得到的混合物冻干，得到冻干组合物的步骤，d)将冻干组合物与包含所述核酸且任选包含0～25v/v％的醇的水溶液混合，任选将混合物在0～95℃下温育0～60分钟，得到包封核酸的脂质纳米粒子的步骤，e)通过透析、超滤或稀释，将得到的包封核酸的脂质纳米粒的外水相更换为中性缓冲溶液的步骤，以及f)在生物体外，使得到的包封核酸的脂质纳米粒子与该细胞接触的步骤。[0044][26]根据[25]所述的方法，进一步包含如下步骤：在步骤a中，制备脂质纳米粒子悬浮液后，通过透析、超滤或稀释，将外水相更换为在ph1～6具有缓冲作用的其他酸性缓冲液。[0045][27]一种将核酸导入靶细胞内的方法，包括以下的步骤：a)将包含离子性脂质、甾醇及peg脂质的醇溶液与在ph1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液混合，制备不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液的步骤，b)将不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液与冷冻保护剂混合，得到包含80～800mg/ml的冷冻保护剂、ph1～6的混合物的步骤，c)将步骤b得到的混合物冻干，得到冻干组合物的步骤，d)将冻干组合物与包含核酸且任选包含0～25v/v％的醇的水溶液混合，任选将混合物在0～95℃下温育0～60分钟，得到包封核酸的脂质纳米粒子的步骤，e)通过透析、超滤或稀释，将得到的包封核酸的脂质纳米粒的外水相更换为中性缓冲溶液的步骤，以及f)将得到的包封核酸的脂质纳米粒子以递送至靶细胞的方式给予至生物体的步骤。[0046][28]根据[27]中所述的方法，进一步包含如下步骤：在步骤a中，制备脂质纳米粒子悬浮液后，通过透析、超滤或稀释，将外水相更换为在ph1～6具有缓冲作用的其他酸性缓冲液。发明效果[0047]本发明涉及不含核酸的脂质纳米粒子的冻干组合物及使用该冻干组合物的脂质纳米粒子的制备方法。本发明的冻干组合物通过以含有核酸的水溶液进行再水合，可以高效且简便地制备包封有任意核酸的脂质纳米粒子。本发明的脂质纳米粒子的制备方法通过在本发明的冻干组合物中加入任意核酸水溶液和进一步加入醇并温育，可以进一步提高核酸的包封率。当使用利用本发明的方法制备的脂质纳米粒子进行基因导入时，可以将基因均匀地导入细胞中。此外，利用本发明方法制备的脂质纳米粒粒径为50～200nm，粒径分布窄，因此有利于生物体内的基因导入。附图说明[0048]图1是评价蔗糖浓度对向细胞内基因导入的均一性的影响图。图2是评价蔗糖浓度对向细胞内基因导入的表达强度的影响图。图3是评价作为磷脂使用dopc时的脂质组成对向细胞内基因导入效率的影响图。图4是评价作为磷脂使用popc时的脂质组成对向细胞内基因导入效率的影响图。图5是评价作为磷脂使用dope时的脂质组成对向细胞内基因导入效率的影响图。图6是评价作为磷脂使用pope时的脂质组成对向细胞内基因导入效率的影响图。图7是评价小鼠体内(invivo)的mrna表达效率的图。图8是评价小鼠体内ctl活性的图。图9是在向细胞内的基因导入效率方面，通过常规方法制备的粒子与本发明的粒子的的比较图。图10是在小鼠体内的mrna表达效率方面，通过常规方法制备的粒子与本发明的粒子的比较图。具体实施方式[0049]以下，对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限于此。[0050]本发明涉及一种冻干组合物，其是脂质纳米粒子的冻干组合物，该脂质纳米粒子的冻干组合物不含核酸而包含离子性脂质、甾醇、peg脂质、在ph1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液成分及冷冻保护剂，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为10:1～1000:1。[0051]脂质纳米粒子是指具有两亲性脂质的亲水基团朝向界面的水相侧排列的膜结构的粒子。“两亲性脂质”是指具有表现出亲水性的亲水基团和表现出疏水性的疏水基团这个两者的脂质。作为两亲性脂质，可列举例如离子性脂质、磷脂、peg脂质等。本发明的脂质纳米粒子中，作为膜的成分含有离子性脂质、甾醇和peg脂质，并且可以进一步含有磷脂。脂质纳米粒子的粒径没有特别限定，优选为10nm～500nm，更优选为30nm～300nm。粒径例如可以使用zetasizernano(malvern公司)等粒径分布测定装置进行测定。脂质纳米粒子的粒径可以通过脂质纳米粒子的制备方法进行适当调整。在本发明中，粒径是指通过动态光散射法测定得到的平均粒径(个数平均)。在本发明中，“总脂质”是指脂质的总量。作为脂质，可列举离子性脂质、甾醇、peg脂质和磷脂。在本发明中，“不含核酸”或“无核酸”是指实质上不含有核酸，核酸含量在检测限以下。在本发明中，“包封核酸的脂质纳米粒子”是指，在脂质纳米粒子内部包封有核酸的脂质纳米粒子。[0052]本发明的冻干组合物通过如下方式得到：通过将离子性脂质、甾醇、peg脂质或进一步的磷脂溶解在水溶性有机溶剂中，并与酸性缓冲液混合，通过诱导组织化而得到脂质纳米粒子，在该脂质纳米粒子中，进一步加入冷冻保护剂进行冻干。作为水溶性有机溶剂，可列举例如叔丁醇、乙醇等醇。[0053]离子性脂质作为本发明中可以使用的离子脂质，只要是由叔氨基和疏水基团构成，并且可以构成脂质纳米粒子即可。作为离子性脂质的具体例，可列举1,2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷(dodap)、1,2-二油氧基-3-二甲氨基丙烷(dodma)、1,2-二亚油酰氧基-3-二甲氨基丙烷(dlindma)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(dlin-kc2-dma)、4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂(称为dlin-mc3-dma或mc3)、下式(1)或式(2)的化合物，优选下式(1)、式(2)的化合物、dodma、mc3，最优选下式(1)的化合物。式(1)[0054][化2][0055](式(1)中，r1a和r1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，xa和xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，r2a和r2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，ya和yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，za和zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，r3a和r3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或碳原子数为12～22的脂肪族烃基。[0056]r1a和r1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，并且可以是直链状，也可以具有支链，但优选为直链状。该亚烷基的碳原子数优选为1～4，更优选为1～2。作为碳原子数为1～6的亚烷基，具体可列举亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基、四亚甲基、异亚丁基、五亚甲基和新戊基。r1a和r1b优选各自独立地为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基或四亚甲基，最优选各自为亚乙基。[0057]r1a和r1b可以相同也可以不同，但优选、r1a和r1b为相同基团。[0058]xa和xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，优选各自独立地表示碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基。[0059]碳原子数为1～6、且叔氨基1个的非环状烷基叔氨基中的碳原子数1～6的烷基可以是直链状，可以是支链状，也可以是环状。该烷基的碳原子数优选为1～3。作为碳原子数1～6的烷基，具体地可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等，优选甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选甲基。[0060]碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基的优选的具体结构以x1表示。[0061][化3][0062]x1的r5表示碳原子数1～6的烷基，可以是直链状，可以是支链状，也可以是环状。该烷基的碳原子数优选为1～3。作为碳原子数1～6的烷基，具体地可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等，优选甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选甲基。[0063]具有2至5个碳原子和1至2个叔氨基的环状亚烷基叔氨基中的碳原子数优选为4至5。具有2至5个碳原子和1至2个叔氨基的环状亚烷基叔氨基的具体实例包括亚氮丙啶基、亚氮杂环丁基、亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚咪唑啉基、亚哌嗪基，优选亚吡咯烷基、亚哌啶基，最优选亚哌啶基。[0064]碳原子数为2～5且叔氨基数为1的环状亚烷基叔氨基的优选的具体结构以x2表示。[0065][化4][0066]x2的p为1或2。当p为1时，x2为亚吡咯烷基，当p为2时，x2为亚哌啶基。优选p为2。[0067]碳原子数为2～5且叔氨基数为2的环状亚烷基叔氨基的优选的具体的構造以x3表示。[0068][化5][0069]x3的w为1或2。w为1时，x3为亚咪唑啉基，w为2时，x3为亚哌嗪基。[0070]xa与xb可以相同，也可以不同，但优选xa与xb是相同的基团。[0071]r2a和r2b各自独立地表示碳原子数为为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，优选各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基。[0072]碳原子数为8以下的亚烷基可以是直链状，也可以具有支链，优选为直链状。当该亚烷基中包含的碳原子数优选为6以下，最优选为4以下。作为碳原子数为8以下的亚烷基，具体地可列举为亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、四亚甲基、异亚丁基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基等，优选亚甲基、亚乙基、亚丙基、四亚甲基，最优选亚乙基。[0073]碳原子数8以下的氧二亚烷基是指，介入有醚键的亚烷基(亚烷基-o-亚烷基)，所存在的2个亚烷基的碳原子数的总和为8个以下。这里，所存在的2个亚烷基可以相同也可以不同，优选相同。作为碳原子数8以下的氧二亚烷基，具体可列举：氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基、氧二亚丁基等。优选为氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基，最优选为氧二亚乙基。[0074]r2a与r2b可以相同也可以不同，优选r2a与r2b是相同的基团。[0075]ya和yb与各自独立地表示独立地为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，优选各自独立地表示键、酰胺键、氨基甲酸酯键，更优选各自独立地表示酯键或酰胺键，最优选各自为酯键。ya和yb的成键的朝向并无限制，ya和yb为酯键的情况下，优选呈-za-co-o-r2a-和-zb-co-o-r2b-的结构。[0076]ya和yb可以相同也可以不同，但优选ya和yb是相同的基团。[0077]za和zb各自独立地表示由碳原子数为3～16具有至少1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团。该芳香族化合物中包含的碳原子数优选为6～12，最优选为6～7。另外，该芳香族化合物中包含的芳香环优选为1个。[0078]作为碳原子数为3～16的芳香族化合物中包含的芳香环的种类，关于芳香族烃环可列举苯环、萘环、蒽环，关于芳香杂环可列举咪唑环、吡唑环、噁唑环、异噁唑环、噻唑环、异噻唑环、三嗪环、吡咯环、呋喃环、嘧啶环、哒嗪环、吡嗪环、吡啶环、嘌呤环、蝶啶环、苯并咪唑环、吲哚环、苯并呋喃环、喹唑啉环、酞嗪环、喹啉环、异喹啉环、香豆素环、色酮环、苯并二氮卓环、吩噁嗪环、吩噻嗪环、吖啶环等，优选苯环、萘环、蒽环，最优选苯环。芳环可以具有取代基，作为该取代基，可列举碳原子数为2～4的酰基、碳原子数2～4的烷氧基羰基、碳原子数2～4的氨基甲酰基、碳原子数2～4的酰氧基、碳原子数2～4的酰氨基、碳原子数2～4的烷氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、碳原子数1～4的烷基对氨基苯磺酰基、碳原子数1～4的烷基磺酰基、碳原子数6～10的芳基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、碳原子数1～4的烷基、碳原子数1～4的脲基、碳原子数1～4的烷氧基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为6～10的芳氧基等，作为优选的实例，可列举乙酰基、甲氧基羰基、甲基氨基甲酰基、乙酰氧基、乙酰胺基、甲氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲基对氨基苯磺酰基、苯基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基，甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、脲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、苯基、苯氧基等。[0079]作为za和zb的优选的具体结构，可列举z1。[0080][化6][0081]式中，s表示0～3的整数，t表示0～3的整数，u表示0～4的整数，u个r4各自独立地表示取代基。[0082]z1的s优选为0～1的整数，更优选为0。[0083]z1的t优选为0～2的整数，更优选为1。[0084]z1的u优选为0～2的整数，更优选为0～1的整数。[0085]z1的r4是不会抑制该阳离子性脂质的合成过程中反应的碳原子数为3～16的芳香族化合物中所含的芳香环(苯环)的取代基。作为该取代基，碳原子数2～4的酰基、碳原子数2～4的烷氧羰基、碳原子数2～4的氨基甲酰基、碳原子数2～4的酰氧基、碳原子数2～4的酰氨基、碳原子数2～4的烷氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、碳原子数1～4的烷基对氨基苯磺酰基、碳原子数1～4的烷基磺酰基、碳原子数6～10的芳基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、碳原子数1～4的烷基、碳原子数1～4的脲基、碳原子数1～4的烷氧基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为6～10的芳氧基等，作为优选的实例，可列举乙酰基、甲氧基羰基、甲基氨基甲酰基、乙酰氧基、乙酰胺基、甲氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲基对氨基苯磺酰基、苯基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基，甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、脲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、苯基、苯氧基等。r4存在多个的情况下，各r4与可以相同也可以不同。[0086]za与zb可以相同或不同，但优选za与zb是相同的基团。[0087]r3a和r3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物由来的残基，或来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基，优选各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物由来的残基、或碳原子数12～22的脂肪族烃基，最优选各自独立地表示碳原子数12～22的脂肪族烃基。[0088]作为具有羟基的脂溶性维生素，可列举例如，视黄醇、麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、骨化醇、钙化醇、二氢麦角甾醇、二氢速甾醇、生育酚、生育三烯酚等。具有羟基的脂溶性维生素优选为视黄醇。[0089]具有羟基的甾醇衍生物，可列举例如胆固醇、胆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇及麦角甾醇等，优选为胆固醇或胆甾烷醇。[0090]碳原子数12～22的脂肪族烃基可以为直链状，也可以具有支链。该脂肪族烃基可以为饱和，也可以为不饱和。不饱和脂肪族烃基的情况下，该脂肪族烃基中包含的不饱和键的数量通常为1～6个、优选1～3个、更优选1～2个。不饱和键中包含碳-碳双键和碳-碳三键，但优选碳-碳双键。该脂肪族烃基中包含的碳原子数优选为13～19，最优选为13～17。脂肪族烃基中包含烷基、烯基、炔基等，但优选包含烷基或烯基。作为碳原子数12～22的脂肪族烃基，具体地可列举十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、异硬脂基、1-己基庚基、1-己基壬基、1-辛基壬基、1-辛基十一烷基、1-癸基十一烷基等。碳原子数12～22的脂肪族烃基优选十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基，特别优选十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基。[0091]本发明的一个方式中、r3a和r3b表示的碳原子数12～22的脂肪族烃基源自脂肪酸。在该情况下，来自脂肪酸的羰基碳包含在式(1)中的-co-o-。作为脂肪族烃基的具体例，在使用亚油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳二烯基，在使用油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳烯基。[0092]r3a与r3b可以相同或不同，但优选r3a与r3b是相同的基团。[0093]本发明的一个方式中、r1a与r1b相同，xa与xb相同，r2a与r2b相同，ya与yb相同，za与zb相同，r3a与r3b相同。[0094]作为式(1)所示的阳离子性脂质的优选的实例，可列举以下的阳离子性脂质。[阳离子性脂质(1-1)]阳离子性脂质(1)其中，r1a和r1b各自独立地表示碳原子数1～6的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)；xa和xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基(例如-n(ch3)-)，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基(例如亚哌啶基)；r2a和r2b各自独立地表示碳原子数8以下的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基、亚丙基)；ya和yb各自独立地表示酯键或酰胺键；za和zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且至少具有1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团(例如-c6h4-ch2-、-ch2-c6h4-ch2-)；r3a和r3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素(例如生育酚)与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基(例如十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基)。[0095][阳离子性脂质(1-2)]阳离子性脂质(1)，其中，r1a和r1b各自独立地表示碳原子数为1～4的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)；xa和xb各自独立地表示碳原子数为1～3且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基(例如-n(ch3)-)、或碳原子数为2～5且叔氨基数为1的环状亚烷基叔氨基(例如亚哌啶基)；r2a和r2b各自独立地表示碳原子数为6以下的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基、亚丙基)；ya和yb各自独立地表示酯键或酰胺键；za和zb各自独立地表示由碳原子数为6～12且具有1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团(例如-c6h4-ch2-、-ch2-c6h4-ch2-)；r3a和r3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素(例如生育酚)与琥珀酸酐的反应物的残基，或碳原子数13～19为脂肪族烃基(例如十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基)。[0096][阳离子性脂质(1-3)]阳离子性脂质(1)，其中，r1a和r1b各自独立地表示碳原子数1～2的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)；xa和xb各自独立地表示x1：[0097][化7][0098](式中、r5是碳原子数1～3的烷基(例如甲基))、或x2：[0099][化8][0100](式中，p为1或2)；r2a和r2b各自独立地表示碳原子数4以下的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基、亚丙基)；ya和yb各自独立地表示酯键或酰胺键；za和zb各自独立地表示z1：[0101][化9][0102](式中，s为0～1的整数，t为0～2的整数，u为0～2的整数(优选0)，u个r4各自独立地表示取代基)；r3a和r3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素(例如生育酚)与琥珀酸酐的反应物的残基，或碳原子数13～17的脂肪族烃基(例如十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基)。[0103]作为式(1)所示的阳离子性脂质的具体例，可列举以下的o-ph-p3c1、o-ph-p4c1、o-ph-p4c2、o-bn-p4c2、e-ph-p4c2、l-ph-p4c2、hd-ph-p4c2、o-ph-amide-p4c2、o-ph-c3m。[0104][表1-1][0105][表1-2]xa-r1a-s-的结构。同样地，nb是1时，r3b隔着yb和r2b与xb键合，nb是0时，呈r3b-xb-r1b-s-的结构。[0114]na与nb可以相同也可以不同，优选na与nb相同。[0115]r1a和r1b独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，可以为直链状，也可以具有支链，优选为直链状。作为碳原子数1～6的亚烷基，具体地可列举亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙烯基、四亚甲基、异亚丁基、五亚甲基、亚新戊基等。r1a和r1b优选亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基或四亚甲基，最优选亚乙基。[0116]r1a与r1b可以相同也可以不同，优选r1a与r1b是相同的基团。[0117]r2a和r2b独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，可以为直链状，可以具有支链，优选为直链状。作为碳原子数1～6的亚烷基，可列举作为r1a和r1b的碳原子数1～6的亚烷基的示例所列举的物质。r2a和r2b优选亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基或四亚甲基，最优选三亚甲基。[0118]r2a与r2b可以相同也可以不同，优选r2a与r2b是相同的基团。[0119]ya和yb与独立地为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，优选酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键，最优选酯键。ya和yb的成键的朝向并无限制，ya为酯键时，优选呈r3a-co-o-r2a-的结构，yb为酯键时，优选呈r3b-co-o-r2b-的结构。[0120]ya与yb可以相同也可以不同，优选ya与yb是相同的基团。[0121]r3a和r3b与各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基，优选各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基，最优选各自独立地表示碳原子数12～22的脂肪族烃基。[0122]作为具有羟基的脂溶性维生素，可列举例如视黄醇、麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、骨化醇、钙化醇、二氢麦角甾醇、二氢速甾醇、生育酚、生育三烯酚等。具有羟基的脂溶性维生素优选生育酚。[0123]作为具有羟基的甾醇衍生物，可列举例如胆固醇、胆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇及麦角甾醇等，优选为胆固醇或胆甾烷醇。[0124]碳原子数12～22的脂肪族烃基可以是直链状，也可以具有支链。该脂肪族烃基可以为饱和的，也可以为不饱和的。为不饱和脂肪族烃基时，该脂肪族烃基中包含的不饱和键的数量通常为1～6个，优选为1～3个，更优选为1～2个。不饱和键中包含与碳-碳双键和碳-碳三键，优选碳-碳双键。该脂肪族烃基中包含的碳原子数优选为13～19，最优选为13～17。脂肪族烃基中包含烷基、烯基、炔基等，但优选包含烷基或烯基。作为碳原子数12～22的脂肪族烃基，具体地可列举十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、异硬脂基、1-己基庚基、1-己基壬基、1-辛基壬基、1-辛基十一烷基、1-癸基十一烷基等。碳原子数12～22的脂肪族烃基优选十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基，特别优选十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基。[0125]本发明的一个方式中、r3a和r3b表示的碳原子数12～22的脂肪族烃基源自脂肪酸。在该情况下，来自脂肪酸的羰基碳包含在式(1)中的-co-o-。作为脂肪族烃基的具体例，在使用亚油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳二烯基，在使用油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳烯基。[0126]r3a与r3b可以相同或不同，但优选r3a与r3b是相同的基团。[0127]本发明的一个方式中、r1a与r1b相同，xa与xb相同，r2a与r2b相同，ya与yb相同，r3a与r3b相同。[0128]作为以式(2)所示的阳离子性脂质的具体例，可列举以下的b-2、b-2-5、ts-p4c2、l-p4c2、o-p4c2。[0129][表2][0130]接着对式(1)所示的阳离子性脂质(以下，称为阳离子性脂质(1))的制造方法进行说明。[0131]阳离子脂质(1)具有-s-s-(二硫键)键。因此，作为制备方法，可列举：制备具有r3a-co-o-za-ya-r2a-xa-r1a-的sh(硫醇)化合物和具有r3b-co-o-zb-yb-r2b-xb-r1b-的sh(硫醇)化合物，然后通过对它们进行氧化(偶联)得到含有-s-s-键的阳离子脂质(1)的方法，依次合成含有-s-s-键的化合物所必需的部分，最终得到阳离子脂质(1)的方法。优选后者的方法。[0132]如下列举后者的方法的具体例，但制造方法并不限定于此。[0133]作为起始化合物，可列举：包含-s-s-键的两末端羧酸、两末端胺、两末端异氰酸酯、两末端醇、具有甲磺酰基等离去基团的两末端醇、具有对硝基苯基碳酸酯基等离去基团的两末端碳酸酯等。[0134]例如，制造r1a和r1b相同为r1，xa和xb相同为x，r2a和r2b相同为r2，ya和yb相同为y，za和zb相同为z，且r3a和r3b相同为r3的阳离子性脂质(1)时，可以通过如上所示的合成路径得到作为目标的式(1’)的阳离子性脂质物。[0135][化12][0136]使包含-s-s-键的化合物(i)中的两末端官能团(fg1)与具有仲胺及在末端具有一个官能团(fg2)的化合物(ii)中的仲胺反应合成化合物(iii)。具有r3的化合物(iv)与具有羟基和反应性官能团(fg3)的z的化合物(v)中的羟基反应，合成化合物(vi)，最终可以通过化合物(vi)的反应性官能团(fg3)与化合物(iii)的反应性官能团(fg2)反应，得到包含-s-s-键、r1、x、r2、y、z及r3的式(1’)的阳离子性脂质。[0137]上述的制造方法中，化合物(iii)可以通过us2014/0335157a1或国际公开第2016/121942号中记载的方法制造。[0138]对于化合物(iv)和化合物(v)之间的反应，作为催化剂，可以使用碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、三乙胺、4-二甲氨基吡啶(以下称为“dmap”)等碱催化剂，在对甲苯磺酸、甲磺酸等酸催化剂的存在下、或在无催化剂下进行。[0139]此外，可以使用二环己基碳二亚胺(以下称为“dcc”)、二异丙基碳二亚胺(以下称为“dic”)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下称为“edc”)等缩合剂，可以使化合物(iv)与化合物(v)直接反应，另外使用缩合剂将化合物(iv)转变为酸酐等之后再使其与化合物(v)反应。[0140]化合物(iv)的投料量相对于化合物(v)通常为1～50mol当量，优选为1～10mol当量。[0141]在化合物(iv)与化合物(v)的反应中使用的催化剂可根据待反应的化合物种类适当选择。[0142]催化剂量相对于化合物(v)为0.05～100mol当量，优选为0.1～20mol当量，更优选为0.1～5mol当量。[0143]作为在化合物(iv)与化合物(v)的反应中使用的溶剂，只要是不会抑制反应的溶剂，可以没有特殊限制地使用。可列举例如水、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。这些中，优选氯仿、甲苯。[0144]反应温度通常为0～150℃，优选为0～80℃，更优选为10～50℃。反应时间通常为1～48小时，优选为1～24小时。[0145]通过上述反应得到的反应物(vi)可通过萃取纯化、重结晶、吸附纯化、再沉淀、柱色谱法、离子交换色谱法等常规的纯化法进行适当纯化。[0146]当化合物(iii)与化合物(vi)反应时，如化合物(iv)与化合物(v)的反应，作为催化剂，可以使用碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、三乙胺、4-二甲氨基吡啶等碱催化剂作为碱催化剂，也可以在在对甲苯磺酸、甲磺酸等酸催化剂的存在下、或在无催化剂下进行。[0147]另外，可以使用dcc、dic、edc等缩合剂，使化合物(iii)与化合物(vi)直接反应，另外，也可以使用缩合剂使化合物(vi)转变为酸酐等之后，再使其与化合物(iii)反应。[0148]化合物(vi)的投料量相对于化合物(iii)通常为1～50mol当量，优选为1～10mol当量。[0149]在化合物(iii)与化合物(vi)的反应中使用的催化剂可根据待反应的化合物种类适当选择。[0150]催化剂量相对于化合物(iii)为0.05～100mol当量，优选为0.1～20mol当量，更优选为0.1～5mol当量。[0151]作为在化合物(iii)与化合物(vi)的反应中使用的溶剂，只要是不会抑制反应的溶剂，可以没有特殊限制地使用。可列举例如水、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。这些中，优选氯仿、甲苯。[0152]反应温度通常为0～150℃，优选为0～80℃，更优选为10～50℃。反应时间通常为1～48小时，优选为1～24小时。[0153]通过上述反应得到的阳离子性脂质(1)可通过萃取纯化、重结晶、吸附纯化、再沉淀、柱色谱法、离子交换色谱法等常规的纯化法进行适当纯化。[0154]式(2)所示的阳离子性脂质(以下，也称为阳离子性脂质(2))可以通过us2014/0335157a1记载的方法制造。[0155]磷脂磷脂可以用作脂质纳米粒子的脂质膜构成成分。作为磷脂的实例，有1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pc)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(pe)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸(ps)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油(pg)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷脂酸(pa)或这它们的溶血体，具体的有1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(ddpc)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dlpc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dmpc)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dspc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dopc)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dlopc)、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(depc)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(mppc)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(mspc)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pmpc)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pspc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(sopc)，可以使用将这些pc转换为适当的pe、ps、pg、pa的物质。[0156]作为本发明中使用的磷脂，优选pc或pe，进一步优选dopc、popc、dope(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、pope(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。[0157]甾醇甾醇可以用作调节脂质纳米粒子的脂质膜的流动性的成分。作为甾醇的实例，有胆固醇、麦角甾醇、植物甾醇、酵母甾醇(zymosterol)、齐莫烯醇(zymostenol)、链甾醇、豆甾烷醇、二氢羊毛甾醇和7-脱氢胆固醇，优选胆固醇、麦角甾醇、植物甾醇，更优选胆固醇。[0158]peg脂质peg脂质用于在脂质纳米粒子表面包覆亲水性聚乙二醇(peg)以抑制粒子间相互聚集而成的稳定剂，或用于在给予至生物体时抑制生物体成分与粒子之间的相互作用。peg区域可以是任意分子量的物质。在一些实施方式中，peg区域具有200-10,000da的分子量，并且可以是直链或支链的。[0159]作为peg脂质的实例，有peg-磷脂和peg-神经酰胺、peg-二酰基甘油、peg-胆固醇，优选peg分子量为1,000-10,000的二酰基甘油peg，更优选peg分子量为1,000～10,000的二肉豆蔻基甘油peg或二硬脂酰基甘油。[0160]酸性缓冲液和酸性缓冲液成分可以使用在酸性区域具有缓冲作用的缓冲液或缓冲液成分。“酸性缓冲液成分”是指从酸性缓冲液中实质上除去水而得到的成分。酸性缓冲液成分中所含的水的程度可以为低于约5w/v％、或低于4％w/v、或低于3w/v％、或低于2w/v％、或低于1％w/v。具体来说，可列举hcl/kcl缓冲液、对甲苯磺酸/对甲苯磺酸钠盐缓冲液、酒石酸盐/naoh缓冲液、柠檬酸/naoh缓冲液、邻苯二甲酸氢钾/hcl缓冲液、甘氨酸/hcl缓冲液、反式-乌头酸/naoh缓冲液、甲酸/甲酸钠缓冲液、柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、3,3-二甲基戊二酸/naoh缓冲液、3,3-二甲基戊二酸/naoh/0.1m nacl缓冲液、苯乙酸/苯乙酸钠盐缓冲液、乙酸/乙酸钠缓冲液、琥珀酸/naoh缓冲液、邻苯二甲酸氢钾/naoh缓冲液、二甲胂酸钠/hcl缓冲液、马来酸hna/naoh缓冲液、马来酸/tris/naoh缓冲液，磷酸缓冲液，kh2po4/naoh缓冲液、咪唑/hcl缓冲液、s-可力丁(2,4,6-三甲基吡啶)/hcl缓冲液、三乙醇胺hcl/naoh缓冲液、5,5-二乙基巴比妥钠/hcl缓冲液、n-甲基吗啉/hcl缓冲液、焦磷酸钠/hcl缓冲液、mes缓冲液、苹果酸缓冲液、ada缓冲液、pipes缓冲液、aces缓冲液、hepes、bes、bis-tris缓冲液、bis-tris丙烷缓冲液、无水碳酸钠缓冲液、甘氨酰甘氨酸缓冲液、mops、mopso、tes。[0161]优选在ph1～6、更优选在ph3～6具有缓冲作用的酸性缓冲溶液或酸性缓冲液成分，可列举酒石酸/naoh缓冲溶液、柠檬酸/naoh缓冲溶液、邻苯二甲酸氢钾/hcl缓冲溶液、甘氨酸/hcl缓冲液、反式乌头酸/naoh缓冲液、甲酸/甲酸钠缓冲液、柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、3,3-二甲基戊二酸/naoh缓冲液、3,3-二甲基戊二酸/naoh/0.1m nacl缓冲液、苯乙酸/苯乙酸钠盐缓冲液、乙酸/乙酸钠缓冲液、琥珀酸/naoh缓冲液、邻苯二甲酸氢钾/naoh缓冲液、二甲胂酸钠/hcl缓冲液、马来酸氢钠/naoh缓冲液、马来酸/tris/naoh缓冲液、磷酸缓冲液、kh2po4/naoh缓冲液、mes缓冲液、苹果酸缓冲液、bis-tris缓冲液、甘氨酰甘氨酸缓冲液等，进一步优选苹果酸缓冲液或mes缓冲液。[0162]本发明的脂质纳米粒子的冻干组合物在将该冻干组合物100～500mg在0～30℃的注射用蒸留水1～5ml中悬浮时，优选ph为1～6，更优选ph为3～6。[0163]脂质纳米粒子的制备方法作为用于制备脂质纳米粒子的“诱导组织化的操作”的实例，可列举使用微通道或涡流的醇稀释法、单纯水合法、超声处理、加热、涡流、醚注入法、法式压制法、胆酸法、ca2+融合法、冻结-熔融法、反相蒸发法等本身公知的方法，优选使用微通道或涡流的醇稀释法，更优选为使用微通道的醇稀释法。使用微通道的醇稀释法的粒子制备例如可以使用nanoassemblr(precision nanosystems公司)进行。制备成的脂质纳米粒可通过超滤、透析、稀释等操作，更换外水相的缓冲液。[0164]冷冻保护剂作为本发明中可以使用的冷冻保护剂，可以使用单糖、糖醇、二糖、寡糖、多糖或聚合物，具体地可列举甘油醛、赤藓糖、海藻糖、核糖、来苏糖、木糖、阿拉伯糖、阿洛糖、塔罗糖、古洛糖、葡萄糖、阿卓糖、甘露糖、半乳糖、艾杜糖、苏酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、赤藓糖醇、甘油、异麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、肌醇、蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、2-o-α-d-吡喃葡萄糖-d-葡萄糖(kojibiose)、黑曲霉糖、低聚异麦芽糖、异海藻糖、新海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二糖、甘露二糖、蜜二糖、6-o-alpha-d-吡喃半乳糖基-d-果糖(melibiulose)、新乳糖、蔗糖(galactosucrose)、4-o-l-吡喃鼠李糖基-β-d-吡喃葡萄糖、新橙皮糖、芦丁糖、芸香糖、蚕豆糖、木二糖、樱草糖、海藻糖胺、麦芽糖醇、乳糖胺、乳糖醇、三氯蔗糖、棉子糖、潘糖、麦芽三糖、松三糖、龙胆三糖、水苏糖、环糊精、羟丙基-β-环糊精、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等，优选为二糖，进一步优选为非还原性的二糖，最优选为蔗糖。[0165]作为冷冻保护剂的浓度，作为冻干前的浓度优选为80～800mg/ml，更优选为160～800mg/ml。作为冷冻保护剂与冻干后的总脂质的重量比，优选为总脂质的10～1000倍，更优选为30～1000倍。[0166]冻干步骤冻干步骤可以在医学领域中已知的玻璃容器(或例如玻璃安瓿瓶)或双室容器等任意合适的容器中进行。可以将经过含有冷冻保护剂稳定的本发明的脂质纳米粒子组合物导入玻璃容器中。添加到容器中的组合物的体积可以是0.1～20ml、或1～10ml。可以使用任何冻干步骤(包括医学领域中已知的步骤)。例如，参见remington’s pharmaceutical sciences,18th ed.,mack publishing co.,easton,penn.(1990)。冻干步骤可以包括在约-55℃～约-30℃的温度下冷冻经冷冻保护剂稳定的脂质纳米粒子组合物。经冷冻的组合物可以是冻干的组合物的经干燥的形态。在一些实施例中，冷冻步骤可以在几分钟内逐渐将温度从室温升高到最终温度。温度梯度可为约1℃/min。在一些实施例中，干燥步骤可以在约0～250mtorr、或50-150mtorr的压力下，在约-55℃～约40℃的温度下进行。干燥步骤可以在直到室温的高温区域中持续长达数天的指定时间。固体的冻干组合物中的残留水的程度低于约5w/v％、或低于4％w/v、或低于3w/v％、或低于2w/v％、或低于1％w/v。[0167]再水合步骤再水合步骤是向本发明的冻干组合物添加含有核酸的水溶液以制备包封核酸的脂质纳米粒子的步骤。添加包含如下核酸的水溶液，所述核酸的水溶液中核酸的量为冻干组合物中包含的总脂质与核酸的比例如为总脂质/核酸＝1～1000nmol/μg，优选总脂质/核酸＝50～500nmol/μg，可以通过吹吸(pipetting)或涡旋混合来制备包封核酸的脂质纳米粒子。另外，为了提高核酸的包封率，在再水合时可以添加醇，作为醇可以使用甲醇、乙醇、正丁醇、叔丁醇，优选乙醇。含有核酸的水溶液中的醇浓度为0～50v/v％，优选0～30v/v％，更优选0～25v/v％。另外，为了进一步在再水合步骤中提高核酸包封的效率，可以在加入含有核酸水溶液、进一步加入醇后，对冻干组合物进行温育。温育条件例如为0～100℃、0～120分钟，优选0～95℃、0～60分钟。[0168]将外水相更换为中性缓冲液的步骤可以通过将再水合步骤中得到的包封核酸的脂质纳米粒子的外水相更换为中性缓冲液，制备可用作核酸导入剂的包封核酸的脂质纳米粒子。作为将外水相更换为中性缓冲液的方法，可以列举基于透析、超滤或稀释的方法。作为中性缓冲液，可列举磷酸缓冲生理食盐水(pbs)、tris-hcl缓冲液、ada、pipes、pipes倍半钠、aces、mops、bes、mopso、bes、mops、tes、hepes、tapso、popso、hepso等。中性缓冲液的ph值为6～8。[0169]将核酸包封在本发明的脂质纳米粒子的冻干组合物中，并使其与细胞接触，由此可以在生物体内和/或生物体外将该核酸导入在该细胞中。因此，本发明提供一种核酸导入剂，其含有上述本发明的脂质纳米粒子的冷冻干燥组合物。另外，本发明还提供一种核酸导入剂，其含有使用本发明的脂质纳米粒子的冻干组合物制备成的包封核酸的脂质纳米粒子。[0170]本发明的核酸导入剂可以将任意核酸导入细胞内。作为核酸的类型，可列举dna、rna、rna的嵌合核酸、dna/rna的杂合体等，但并不限定于此。另外，核酸可以使用1～3条链的任意核酸，但优选为单链或双链。核酸可以是作为嘌呤或嘧啶碱基的n-葡糖苷的其它类型的核苷酸、或具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如，市售的肽核酸(pna)等)、或具有特殊键的其它低聚物(需要说明的是，该低聚物含有存在于dna、rna中那样的碱基配对、具有允许碱基附着的构型的核苷酸)等。此外，该核酸还可以是例如：附加公知修饰的核酸、具有本领域已知的标记的核酸、加帽的核酸、经甲基化的核酸、将1个以上天然核苷酸用类似物取代而成的核酸、经分子内核苷酸修饰的核酸、具有无带电荷结合(例如，甲基磺酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸、具有含电荷的键或含硫键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸、具有例如蛋白质(例如，核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-l-赖氨酸等)、糖(例如，单糖等)等侧链基团的核酸、具有插入性化合物(例如，吖啶、补骨脂素等)的核酸、含有螯合化合物(例如，金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性的金属等)的核酸、含有烷基化剂的核酸、具有经修饰的键的核酸(例如，α异构体型的核酸等)等。[0171]能够在本发明中使用的dna的种类没有特殊限制，可根据使用目的而适当选择。可列举例如质粒dna、cdna、反义dna、染色体dna、pac、bac、cpg寡核苷酸等，优选为质粒dna、cdna、反义dna，更优选为质粒dna。质粒dna等环状dna可通过限制性内切酶等被消化，也可以用作线性dna。[0172]能够在本发明中使用的rna的种类没有特殊限制，可根据使用目的而适当选择。可列举例如：sirna、mirna、shrna、反义rna、信使rna(mrna)、单链rna基因组、双链rna基因组、rna复制子、转运rna、核糖体rna等，优选为sirna、mirna、shrna、mrna、反义rna、rna复制子。[0173]对于本发明中使用的核酸，优选利用本领域技术人员通常使用的方法进行纯化。[0174]出于例如疾病的预防和/或治疗的目的，可以将包封有核酸的本发明的核酸导入剂给予至生物体内(in vivo)。因此，本发明中使用的核酸优选为对某种指定疾病具有预防和/或治疗活性的核酸(预防/治疗用核酸)。作为这样的核酸，可列举例如可用于称为基因治疗的核酸等。[0175]作为包封有核酸的本发明的酸导入剂，可用作药物递送系统，用于将核酸等选择性地递送到特定细胞内，可用于例如基于向树突细胞的抗原基因转染的dna疫苗、肿瘤的基因治疗、利用rna干扰抑制靶基因的表达等。[0176]包封有核酸的本发明的脂质纳米粒子的粒径优选为10nm～500nm、更优选为30nm～300nm。粒径的测定可使用zetasizer nano(malvern公司)进行。脂质纳米粒子的粒径可通过脂质纳米粒子的制备方法而适当调整。[0177]包封有核酸的本发明的脂质纳米粒子的表面电位(ξ电位)优选为-15～+15mv、进一步优选为-10～+10mv。在以往的基因转染中，主要使用表面电位为正的带电粒子。这作为用于促进与具有负电荷的细胞表面的硫酸肝素之间的静电性相互作用、从而促进向细胞摄取的方法是有用的，但正的表面电荷存在会在细胞内与递送核酸之间的相互作用而抑制核酸从载体的释放、或因mrna与递送核酸之间的相互作用而抑制蛋白质合成的可能性。通过将表面电荷调整至上述范围内，可以解决该问题。表面电荷的测定可使用zetasizer nano进行。脂质纳米粒子的表面电荷可根据脂质纳米粒子的构成成分的组成而进行调整。[0178]以下，对使包封有核酸的脂质纳米粒子与细胞在生物体外(in vitro)接触的步骤进行具体说明。[0179]细胞在使其与该脂质纳米粒子接触的数天前悬浮在适当的培养基中，并在适当的条件下进行培养。在与脂质纳米粒子接触时，细胞可以在增殖期，也可以不在增殖期。[0180]该接触时的培养液可以是含血清的培养基也可以是不含血清的培养基，但培养基中的血清浓度优选为30重量％以下、更优选为20重量％以下。培养基中包含过量的血清等蛋白质时，存在阻碍该脂质纳米粒子与细胞的接触的可能性。[0181]该接触时的细胞密度没有特殊限定，可考虑细胞的种类等而适当设定，但通常在1×104～1×107细胞/ml的范围。[0182]在这样制备的细胞中，添加例如包封有上述核酸的脂质纳米粒子的悬浮液。该悬浮液的添加量没有特殊限定，可考虑到细胞数等而适当设定。关于与细胞接触时的脂质纳米粒子的浓度，只要能够实现目标核酸向细胞内的导入则没有特殊限定，作为脂质浓度，通常为1～100nmol/ml、优选为10～50nmol/ml，作为核酸的浓度，通常为0.01～100μg/ml、优选为0.1～10μg/ml。[0183]将上述悬浮液添加至细胞后，对该细胞进行培养。培养时的温度、湿度、co2浓度等可考虑到细胞的种类而适当设定。细胞为源自哺乳动物的细胞的情况下，通常，温度约为37℃、湿度约为95％、co2浓度约为5％。另外，培养时间也可以考虑到所使用的细胞的种类等条件而适当设定，但通常为0.1～76小时的范围、优选为0.2～24小时的范围、更优选为0.5～12小时的范围。上述培养时间如果过短，则可能导致核酸无法充分导入细胞内，培养时间如果过长，则可能导致细胞变弱。[0184]通过上述培养，核酸被导入细胞内，但优选将培养基更换为新鲜的培养基、或向培养基中添加新鲜的培养基而进一步继续培养。细胞为源自哺乳动物的细胞的情况下，新鲜的培养基优选包含血清或营养因子。[0185]另外，通过如上所述地使用包封有核酸的脂质纳米粒子，不仅在生物体外(in vitro)，而且在生物体内(in vivo)也能够将核酸导入细胞内。即，通过将包封有核酸的本发明的脂质纳米粒子给予至对象，可使该脂质纳米粒子到达并接触靶细胞，从而在生物体内将包封在该脂质纳米粒子的核酸导入细胞内。作为能够给予该脂质纳米粒子的对象，没有特殊限定，可列举例如：哺乳类(例如，人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如，鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如，蛙等)、鱼类(例如，斑马鱼、青鳉鱼(rice-fish)等)等脊椎动物、昆虫(例如，蚕、蛾、果蝇等)等无脊椎动物、植物等。作为包封有核酸的脂质纳米粒子的给予对象，优选为人或其它哺乳动物[0186]靶细胞的种类没有特殊限定，通过使用包封有核酸的脂质纳米粒子，可以向各种组织(例如，肝脏、肾脏、胰脏、肺、脾脏、心脏、血液、肌肉、骨、脑、胃、小肠、大肠、皮肤、脂肪组织等，优选为肝脏、肾脏、脾脏)中的细胞导入核酸。[0187]作为向导入有核酸和/或核酸以外的化合物的脂质纳米粒子的对象(例如，脊椎动物、无脊椎动物等)的给予方法，只要是能够使该脂质纳米粒子到达并接触靶细胞，从而将导入至该脂质纳米粒子的化合物导入细胞内的方法则没有特殊限定，可考虑导入化合物的种类、靶细胞的种类、部位等而适当选择本身公知的给予方法(例如，口服给予、非口服给予(例如，静脉内给予、肌内给予、局部给予、经皮给予、皮下给予、腹腔内给予、喷雾等)等)。该脂质纳米粒子的给予量只要在能够实现化合物向细胞内的导入的范围则没有特殊限定，可考虑到给予对象的种类、给予方法、导入化合物的种类、靶细胞的种类、部位等而适当选择。[0188]将包封有核酸的脂质纳米粒子作为核酸导入剂使用的情况下，可以按照常规方法进行制剂。[0189]提供该核酸导入剂作为研究用试剂的情况下，该本发明的核酸导入剂可以将包封有核酸的脂质纳米粒子直接使用，或使用与例如水或除水以外的生理学上可接受的液体(例如，水溶性溶剂(例如，苹果酸缓冲液等)、有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、dmso、叔丁醇等)或水溶性溶剂与有机溶剂的混合液等)形成的无菌性溶液或悬浮液来提供。本发明的核酸导入剂可适当地包含本身公知的生理学上可接受的添加剂(例如，赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、稳定剂、结合剂等)[0190]另外，提供该核酸导入剂作为药物的情况下，该本发明的核酸导入剂可以直接使用包封有核酸的脂质纳米粒子、或通过与药学上可接受的公知添加剂(例如，载体、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、结合剂等)一起使用，并将它们以常规认可的制剂实施所要求的单位用量形式进行混和，由此可以制造为口服剂(例如，片剂、胶囊剂等)或非口服剂(例如注射剂、喷雾剂等)，优选制造为非口服剂(更优选为注射剂)。[0191]本发明的核酸导入剂除可用于成人以外，还可以作为儿童用制剂。实施例[0192]以下，对本发明的实施例进行更为详细的说明，但本发明完全不受到该实施例的限定。[0193]在实施例的说明中使用的简称的含义分别如下所述。chol:胆固醇dmg-peg2k：1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油，甲氧基聚乙二醇(pegmw2000)dspc：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱dopc：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱popc：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱dope：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺pope：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺pbs：磷酸缓冲生理盐水mes：2-吗啉乙磺酸dpbs：dulbecco's磷酸缓冲生理盐水[0194]比较例1～3的冻干组合物的制备作为比较例，通过如下所述地制备中性脂质纳米粒子后添加冷冻保护剂进行冻干来制备冻干组合物。在表4所示的脂质组成中，将脂质的叔丁醇溶液和苹果酸缓冲液(ph3,20mm)用nanoassemblr(流速比：缓冲液/脂质＝6/1(v/v)，总流速：1ml/min)进行混合。该溶液用mes缓冲液(ph5.5,20mm)稀释，使用amicon进行超滤并置换为ph7.4的pbs置换。作为理论值，以使脂质浓度为200nmol/100μl地浓缩并回收lnp，向其中添加蔗糖溶液100μl并混合。使用vertis advantage plus el-85冻干机对该溶液进行冻干。关于冻干，先将溶液在-55℃常压下冷冻14～21小时，接着减压至200mtorr，并以每次10℃升高温度。设定升温程序，历时3小时升温10℃地将温度升温至-20℃，在-10℃以上历时2小时使温度升高10℃，并在该温度下静置1小时。当温度升至30℃时，通过在该温度下静置3小时然后恢复至常压并回收样品。[0195]实施例1～59的冻干组合物的制备在表5所示的脂质组成中，将脂质的叔丁醇溶液和苹果酸缓冲液(ph3.0,20mm)用nanoassemblr(流速比：缓冲液/脂质＝6/1(v/v)，总流速：1ml/min)进行混合。向该lnp溶液中加入等量的蔗糖溶液(使蔗糖终浓度为80mg/ml、160mg/ml、320mg/ml、433mg/ml)并混合，进行分装使脂质的量为200nmol和600nmol。使用vertis advantage plus el-85冻干机对该溶液进行冻干。关于冻干，先将溶液在-55℃常压下冷冻14～21小时，接着减压至200mitol，并以每次10℃升高温度。设定升温程序，历时3小时升温10℃地将温度升温至-20℃，在-10℃以上历时2小时使温度升高10℃，并在该温度下静置1小时。当温度升至30℃时，通过在该温度下静置3小时然后恢复至常压并回收样品。[0196]实施例60～70的冻干组合物的制备在表5所示的脂质组成中，将脂质的叔丁醇溶液和mes缓冲液(ph5.0,20mm)用nanoassemblr(流速比：缓冲液/脂质＝6/1(v/v)，总流速：1ml/min)进行混合。之后的操作与实施例1～59同样地进行。[0197]比较例1-3和实施例1-59的冻干组合物的再水合在表4和表5所示的条件下，以总脂质/mrna(或sirna或pdna)＝200nmol/μg的比率，在冻干组合物中添加mrna、sirna、pdna的水溶液(使用rnase free，含有12.5％或25％etoh)，并用移液器混合。用mes缓冲液(ph5.5,20mm)稀释，使用amicon进行超滤，并用ph7.4的pbs置换。以使mrna(或sirna或pdna)浓度为2.5g/ml地浓缩并回收lnp，使用ribogreen(注册商标)试剂或picogreen(注册商标)试剂测定核酸的回收率和包封率。使用zetasizer测量粒径和ξ电位。[0198]回收率、包封率的测定(1)将包封核酸的lnp溶液，用dpbs稀释2.5倍，将得到的溶液制备250μl(理论值1μg/ml)。(2)作为标准曲线，将已知浓度的mrna溶液用dpbs稀释，并使mrna浓度色2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、0ng/ml，将得到的各溶液制备250μl。(3)ribogreen试剂或picogreen试剂在以下表中所示的条件下制备(1孔的量)。为了n＝2的分析用而制备(标准曲线+样品数+1)×2的量。[0199][表3][0200](4)黑色96孔板的各well中，将(1)、(2)中制备的溶液各加入50μl，然后加入a液50μl或b液50μl。(5)用铝箔遮蔽板并在摇床上温育5分钟(100～500rpm)。(6)用酶标仪测定荧光(激发：480nm,发射：520nm)。(7)按照以下的计算式算出回收率、包封率。[0201][数1][数1][0202]实施例60～63的冻干组合物的再水合以总脂质/mrna＝200nmol/μg的比例将mrna(rnasefree)的水溶液加入到冻干组合物中，通过吹吸混合，然后在95℃下温育5分钟。用mes缓冲液(ph5.5,20mm)稀释，使用amicon进行超滤并用ph7.4的pbs置换。以使mrna浓度为2.5μg/ml地浓缩并回收lnp，使用ribogreen试剂测定核酸回收率和包封率。使用zetasizer测量粒径和ξ电位。[0203]实施例64、65的冻干组合物的再水合以总脂质/mrna＝200nmol/μg的比例将mrna(rnasefree)的水溶液加入到冻干组合物中，通过吹吸混合，然后在95℃下温育5分钟。使用ribogreen试剂测定核酸的回收率、包封率。使用zetasizer测量粒径和ξ电位。[0204]实施例66～70的冻干组合物的再水合以总脂质/mrna＝200nmol/μg的比例将mrna(rnasefree)的水溶液加入到冻干组合物中，通过吹吸混合，然后用mes缓冲液(ph5.5,20mm)稀释，使用amicon进行超滤并用ph7.4的pbs置换。以mrna浓度为2.5μg/ml地浓缩并回收lnp，使用ribogreen试剂测定核酸回收率和包封率。使用zetasizer测量粒径和ξ电位[0205]使用的mrna、sirna、pdna的序列如下所述。mrna：cleancap(注册商标)flucmrna(trilink公司)cleancap(注册商标)egfpmrna(trilink公司)cleancap(注册商标)epomrna(5mou)(trilink公司)cleancap(注册商标)ovamrna(trilink公司)pdna：pcdna3.1-luc(biomaterials2011,32,6342.中记载的方法)sirna：sifvii(2'-f)正义5'-ggaucaucucaagucuuacdt*dt-3'反义5'-guaagacuugagaugauccdt*dt-3'dt：脱氧胸苷(deoxythymidine)*：硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkage)大写字母：天然(2'-oh)核糖核苷酸(native(2'-oh)ribonucleotides)小写字母：2'-氟修饰核苷酸(2'-fluoro-modifiednucleotides)[0206][表4]表4.比较例的冻干物的组成及再水合条件制备中性的脂质纳米粒子后添加冷冻保护剂冻干后再水合注1：蔗糖与总脂质的重量比[0207][表5-1]表5.实施例的冻干物的组成及再水合条件[0208][表5-2][0209][表5-3][0210][表5-4][0211][表5-5][0212][表5-6][0213][表5-7]注1：蔗糖与总脂质的重量比[0214]按照操作，将比较例的中性脂质纳米粒子的冻干组合物的进行再水合，评价粒子物理性质、核酸回收率、包封率，结果如表6所示。如表6的评价结果所示，在中性脂质纳米粒的冻干组合物中，在用核酸水溶液进行再水合时，核酸与离子性脂质不发生静电相互作用，无法将核酸包封在脂质纳米粒子中。[0215][表6]表6.脂质纳米粒子的物性评价结果1[0216]按照操作，对使作为冷冻保护剂的蔗糖浓度变化的酸性脂质纳米粒子的冻干组合物件再水合，评价粒子物理性质、核酸的回收率、包封率，将结果示于表7。如表7的评价结果所示，实施例1～3的酸性冻干组合物中，可以有效地包封核酸。进一步地，可以通过提高如表7所示的作为冷冻保护剂的蔗糖的浓度来提高核酸的包封效率，可以制备作为粒子物理性质的粒子分布小的脂质纳米粒子。[0217][表7]表7.脂质纳米粒子的物性评价结果2[0218]按照操作，通过改变再水合时的乙醇浓度来评价离子物理性质、核酸回收率、包封率，将结果示于表8。如表8的评价结果所示，可以通过添加乙醇来提高核酸包封率。[0219][表8]表8.脂质纳米粒子的物性评价结果3[0220]按照操作，通过改变再水合时的核酸的种类来评价离子物理性质、核酸回收率、包封率，将结果示于表9。如表9的评价结果所示，不依赖于核酸种类，均可以有效地包封核酸。[0221][表9]表9.脂质纳米粒子的物性评价结果4(由核酸种类产生的影响)[0222]按照操作，通过改变磷脂的种类和脂质组成来评价离子物理性质、核酸回收率、包封率，将结果示于表10。如表10的评价结果所示，不依赖于磷脂的种类和脂质组成，均可以有效地包封核酸。[0223][表10-1]表10.脂质纳米粒子的物性评价结果5(由磷脂的种类、脂质组成产生的影响)[0224][表10-2]实施例29690.137-7.358781实施例30660.142-6.218986实施例311200.106-8.879191实施例321120.101-10.68989实施例331000.112-4.848484实施例34990.113-4.88585实施例351020.104-5.958787实施例36850.137-2.797979实施例37880.162-1.697474实施例381060.122-8.418686实施例39860.121-6.138484实施例778.550.102-4.2696.482.1实施例531090.092-6.496790实施例54880.124-6.557391实施例55810.125-5.668287实施例56950.103-6.527187实施例57790.158-5.537586实施例58870.126-4.36292实施例59970.123-4.096486[0225]按照操作，通过改变离子性脂质的种类来评价离子物理性质、核酸回收率、包封率，将结果示于表11。如表11的评价结果所示，不依赖于离子性脂质的种类，均可以有效地包封核酸。[0226][表11-1]表11.脂质纳米村子的物性评价结果6(由离子性脂质的种类产生的影响)[0227][表11-2]实施例66141.70.209-3.4151.260.9实施例67113.20.186-5.7568.675.4实施例6882.90.114-6.0387.590.1实施例69120.60.138-2.3761.870.3实施例70124.10.152-2.8462.769.2[试验例1][0228]利用封入egfp-mrna的lnp的表达强度和每个细胞的表达效率的评价通过实施例中记载的方法制备封入表达egfp的mrna的lnp溶液。在转染24小时前，将作为人白血病t细胞的jurkat细胞以5.0×104个细胞/1ml/孔接种在1.2cm孔中。24小时后，将制备好的lnp溶液加入1.2cm孔中，使mrna为0.1μg，通过培养期培养24小时。将培养液更换为用facs缓冲液(0.5％牛血清白蛋白(bsa)、含有0.1％nan3的pbs)，用流式细胞仪(novocyte；acea biosciences公司制造)进行测定，进行导入有基因的细胞的分析。表达egfp的细胞比例示于图1，egfp的表达强度示于图2。如图1和图2所示，使用本发明的冻干组合物制备的包封核酸的脂质纳米粒子可以有效地将基因导入细胞内，进一步通过提高作为冷冻保护剂的蔗糖的浓度，从而可以提高细胞内基因导入的均一性、表达强度。[试验例2][0229]使用封入luc-mrna的脂质纳米粒子的细胞内基因导入效率的评价通过实施例中记载的方法制备封入有表达荧光素酶的mrna的lnp溶液。在转染24小时前，将作为人白血病t细胞的jurkat细胞以2.0×105个细胞/1.9ml/培养皿接种在3.5cm培养皿中。24小时后，将含有d-荧光素(rpmi1640)的培养基100μl添加到每个培养皿中，使最终浓度为0.1mm。这里，加入制备的lnp溶液，使mrna为0.4μg，并放置在培养型光度计kronosdio中。每3小时对萤光素酶的发光强度进行2分钟测量。从获得的表达时间变化起，计算24或48小时的累积发光强度。结果示于图3～6。如图3～6所示，使用dopc、popc、dope、pope中的任一种作为磷脂，可以有效地将基因导入细胞，使用pope时基因导入效率最高。[试验例3][0230]小鼠体内mrna表达效率的评价通过实施例中记载的方法制备封入有表达促红细胞生成素的mrna的lnp溶液。将制备的lnp溶液用pbs稀释，使mrna浓度为5μg/ml。将稀释的封入mrna的lnp以10μl/g体重的剂量(以mrna的给予量为0.05mg/kg)对6周龄的雌性balb/c小鼠进行尾静脉内给予。给予后1、3、6、9、24小时从小鼠尾静脉采血15μl。采集的血液立即与0.3μl肝素溶液(5000u/5ml)混合。将各血样在离心条件下(25℃、2000g、20min)进行离心分离，回收上清液。上清液中的促红细胞生成素浓度使用小鼠促红细胞生成素quantikine elisa试剂盒(r&d systems制造)并通过试剂盒方案中记载的方法测量。结果示于图7。如图7所示，如实施例39制备的粒子的活性最高，但在实施例39、22和38中均确认到小鼠体内mrna表达。[试验例4][0231]使用卵清蛋白(ova；模型抗原)的ctl活性的评价使用ova作为模型抗原进行抗原特异性细胞毒性t细胞活性(ctl活性)的评价。通过实施例中记载的方法制备封入有表达ova的mrna的lnp。将制备的lnp溶液用pbs稀释使mrna浓度为1μg/ml。将稀释的封入mrna的lnp以每只小鼠0.1μgmrna对6周龄c57bl6/j小鼠进行后背部皮下给予。给予后7天进行ctl测定。ctl测定：从未对抗原致敏的6周龄c57bl6/j小鼠采集脾脏，先用5ml注射器接着用镊子在rpmi培养基中分散开，制备脾细胞。通过40μm细胞过滤器后，离心(4℃，500g，5分钟)。除去上清液，将细胞团悬浮在红细胞裂解缓冲液中，5分钟后，再次进行离心(4℃，500g，5分钟)。除去上清液，加入rpmi培养基，计数细胞数。将细胞悬浮至1.0×107个细胞/ml，并分为以下两个处理组。靶细胞群；加入ova表位(siinfekl肽)稀释400倍，静置30分钟后离心(4℃、500g、5分钟)。将细胞悬浮至1.0×107个细胞/ml，用5μm的cfse染色制备靶细胞组。对照细胞组；悬浮至1.0×107个细胞/ml，用0.5μm的cfse染色，得到对照细胞组。将等量的靶细胞组和对照细胞组的溶液混合，如上所述从免疫的小鼠尾静脉给予细胞总数为1.0×107个的细胞混合物。给予20小时后，采集小鼠脾脏，用流式细胞仪(novocyte；acea biosciences公司制造)测量cfse的荧光。通过实验确认对照细胞组的测定数几乎没有变化。对于各组，计算靶细胞组与对照细胞组的存活率。从pbs给予小鼠(非免疫组)中的靶细胞的存活率确定0％的细胞毒性t细胞活性，并根据免疫小鼠中的靶细胞的存活率计算各样品的细胞毒性t细胞活性，从而评价ova特异性细胞毒性t细胞活性。如图8所示，如实施例62、实施例65制备的粒子的活性最高，但在实施例60、62、64和65中均观察到可赋予抗原特异性细胞毒性t细胞活性。[0232]比较例4的脂质纳米粒子的制备通过不经过冷冻干燥步骤的常规已知方法，按照以下操作制备粒子。以脂质组成ss-op/胆固醇/dopc/dmg-peg2k＝52.5/40/7.5/1.5(mol)，以总脂质/mrna＝200nmol/μg的比率，通过nanoassemblr(流速比：缓冲液/脂质＝3/1(v/v)、总流速：4ml/min)混合脂质的乙醇溶液和mrna的苹果酸缓冲液溶液(ph3.0,20mm,含有30mmnacl)。该溶液用mes缓冲液(ph5.5,20mm)稀释，使用amicon进行超滤并用ph7.4的pbs置换。将mrna用pbs稀释至作为理论值的10μg/ml，得到脂质纳米粒子。[0233]实施例71的冻干组合物的制备以脂质组成ss-op/胆固醇/dopc/dmg-peg2k＝52.5/40/7.5/1.5(mol)，通过nanoassemblr(流速比：缓冲液/脂质＝7/1(v/v)、总流速：1ml/min)混合脂质的乙醇溶液和苹果酸缓冲液溶液(ph3.0,20mm)。该溶液用mes缓冲液(ph6,20mm)稀释，使用amicon进行超滤并置换为mes缓冲液(ph6,20mm)。用mes缓冲液(ph6,20mm)将总脂质稀释至400nmol/100μl并回收。向该溶液中加入等量的蔗糖溶液(蔗糖终浓度160mg/ml)并用涡旋混合器混合。将200μl分装到安瓿中并使用eyela冻干机进行冻干。关于冷冻干燥，设定为先将溶液在常压-40℃冷冻3小时，接着减压至200mtorr，在-40℃静置20小时，-30～0℃下每10℃静置6小时，10～30℃下每10℃静置3小时。程序完成后，压力恢复到常压并采集样品。[0234]实施例71的冻干组合物的再水合在回收的冻干样品中加入添加有luc-mrna2μg的水200μl，使总脂质/mrna为200nmol/μg，通过吹打进行混合。然后，在95℃下温育5分钟，用200μl的pbs中和。[0235]实施例72的冻干组合物的制备以脂质组成ss-op/胆固醇/dopc/dmg-peg2k＝52.5/40/7.5/1.5(mol)，通过nanoassemblr(流速比：缓冲液/脂质＝7/1(v/v)、总流速：16ml/min)混合脂质的乙醇溶液和苹果酸缓冲液溶液(ph3.0,20mm)。该溶液用mes缓冲液(ph6,20mm)稀释，使用amicon进行超滤并置换为mes缓冲液(ph6,20mm)。用mes缓冲液(ph6,20mm)将总脂质稀释至400nmol/100μl并回收。向该溶液中加入等量的蔗糖溶液(蔗糖终浓度160mg/ml)并用涡旋混合器混合。将200μl分装到安瓿中并使用eyela冻干机进行冻干。关于冷冻干燥，设定为先将溶液在常压-40℃冷冻3小时，接着减压至200mtorr，在-40℃静置20小时，-30～0℃下每10℃静置6小时，10～30℃下每10℃静置3小时。程序完成后，压力恢复到常压并采集样品。[0236]实施例72的冻干组合物的再水合在回收的冻干样品中加入添加有hepo-mrna2μg的水200μl，使总脂质/mrna为200nmol/μg，通过吹打进行混合。然后，在37℃下温育15分钟，用200μl的pbs中和。[0237]测定比较例4、实施例71和72的粒子物理性质和核酸的包封率，将结果示于表12。[0238][表12][试验例5][0239]使用hela细胞的体外的基因表达活性的评价使用按照操作制备得到的比较例4和实施例71的粒子，按照以下操作评价细胞的基因表达强度。在转染24小时前，将hela以5.0×104个细胞/1.9ml/培养皿接种在3.5cm在培养皿中。24小时后，将含有d-荧光素(rpmi1640)的培养基100μl添加到每个培养皿中，使最终浓度为0.1mm。这里，加入制备的lnp溶液，使mrna为0.4μg，并放置在培养型光度计kronosdio中。每1小时对萤光素酶的发光强度进行2分钟测量。结果如图9所示。与比较例4相比，实施例71的纳米粒子在体外显示约34倍高的基因表达活性。[试验例6][0240]小鼠体内基因表达活性的评价使用按照操作制备的比较例4和实施例72的粒子，以与试验例3的方法相同的方式评价小鼠中的基因表达强度。结果示于图10。与比较例4相比，实施例72的纳米粒子在体内显示出约1.7倍高的基因表达活性。[0241][制造例1]o-ph-p4c2的合成《油酸的酸酐化》在室温下将70.0g(248mmol)油酸(日油株式会社制造)溶解在560g氯仿中并冷却至10～15℃。在此向其中滴加将25.1g(121mmol)dcc(株式会社大阪合成有机化学研究所制造)溶解在140g氯仿中的悬浮液，在10～25℃下反应2个小时。过滤反应溶液后，用蒸发器浓缩滤液。将得到的浓缩物用210g己烷再溶解，过滤除去不溶物。将得到的滤液用蒸发器浓缩，得到油酸酐64.2g。[0242]《4-油酰氧基苯乙酸的合成》将43.1g(78.9mmol)油酸酐和6.00g(39.4mmol)4-羟基苯乙酸(东京化成工业株式会社制造)溶解在647g氯仿中。向其中加入1.93g(15.8mmol)dmap(广荣化学株式会社制造)，并在室温下反应9小时。将反应溶液用216g的10％乙酸水溶液洗涤两次，用216g离子交换水洗涤两次，然后将12.9g硫酸镁(关东化学株式会社制造)加入到有机层中并搅拌30分钟。过滤硫酸镁后，将滤液通过蒸发器上浓缩。将浓缩物用284g己烷再溶解，过滤不溶物，然后用168g乙腈萃取6次。回收乙腈层，用蒸发器浓缩，得到粗品18.1g。将得到的粗品14.5g过柱纯化，得到4-油酰氧基苯乙酸3.66g。[0243]《o-ph-p4c2的合成》0.350g(0.929mmol)通过us2014/0335157a1中描述的方法合成的双{2-[4-(2-羟乙基)哌啶基]乙基}二硫化物(di-4pe体)、0.813g(1.95mmol)4-油酰氧基苯乙酸及0.0454g(0.372mmol)dmap在室温下，溶解在10.5g氯仿中。向其中加入0.534g(2.79mmol)edc，混合物在30～35℃下反应4小时。反应溶液用7.00g的20％食盐水洗涤两次，然后用0.350g硫酸镁脱水。过滤硫酸镁后，用蒸发器浓缩滤液，得到1.10g粗品。将得到的粗品过柱纯化，得到0.722g的o-ph-p4c2。[0244][制造例2]e-ph-p4c2的合成《d-α-生育酚琥珀酸的酸酐化》在室温下将70.0g(132毫摩尔)d-α-生育酚琥珀酸(sigma-aldrich公司制造)溶解在560g氯仿中并冷却至10～15℃。向其中滴加将13.7g(66mmol)dcc(株式会社大阪合成有机化学研究所制造)溶解在140g氯仿中的悬浮液，并使混合物在10～25℃下反应2个小时。过滤反应溶液后，用蒸发器浓缩滤液。将得到的浓缩物用210g己烷再溶解，过滤除去不溶物。将得到的滤液用蒸发器浓缩，得到64.2g的d-α-生育酚琥珀酸酸酐。[0245]《4-(d-α-生育酚半琥珀酰)苯乙酸的合成》将43.1g(41.3mmol)d-α-生育酚琥珀酸酐和3.13g(20.6mmol)4-羟基苯乙酸(东京化成工业株式会社制)溶解在氯仿647g中。向其中加入1.01g(8.26mmol)dmap(广荣化学株式会社制造)，并在室温下反应9小时。将反应溶液用216g的10％乙酸水溶液洗涤两次，用216g离子交换水洗涤两次，然后将12.9g硫酸镁(关东化学株式会社制造)加入到有机层中并搅拌30分钟。过滤硫酸镁后，将滤液在蒸发器上浓缩。将浓缩物用284g己烷再溶解，过滤不溶物，然后用168g乙腈萃取6次。回收乙腈层，用蒸发器浓缩，得到粗品17.0g。将得到的粗品13.6g过柱纯化，得到4-(d-α-生育酚半琥珀酰基)苯乙酸3.44g。[0246]《e-ph-p4c2的合成》在室温下将0.350g(0.929mmol)di-4pe、1.04g(1.95mmol)4-(d-α-生育酚半月桂基)苯乙酸及0.0454g(0.372mmol)dmap溶解在10.5g氯仿中。向其中加入0.534g(2.79mmol)edc，在30～35℃下反应4小时。反应溶液用7.00g的20％食盐水洗涤两次，然后用0.350g硫酸镁脱水。过滤硫酸镁后，用蒸发器浓缩滤液，得到1.31g粗品。将得到的粗品过柱纯化，得到0.860g的e-ph-p4c2。产业上的可利用性[0247]根据本发明，可以高效地将核酸导入至细胞内，因此可以用于核酸药物、基因治疗、生物化学实验中。[0248]本技术基于日本技术的日本特愿2019-176253，其全部内容包含在本说明书中。









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