用于具有顺序pH调整的单通道自由流电泳的方法与流程

物理化学装置的制造及其应用技术用于具有顺序ph调整的单通道自由流电泳的方法1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2019年10月9日提交的标题为“用于具有顺序ph调整的单通道自由流电泳的方法”的美国临时专利申请序列号62/912,963的优先权，所述临时专利申请的全部公开内容据此通过引用并入。技术领域3.本文所述的一些实施例涉及用于分离和收集蛋白质样品的设备和方法。背景技术：4.包括等电聚焦(ief)的电泳是蛋白质分离的常见技术。ief是根据蛋白质和其它两性溶质的等电点(pi)以ph梯度分离它们的电泳技术。合成载体两性电解质是小的两性分子，其在施加电场之后快速建立ph梯度。一旦建立ph梯度，较慢运动的蛋白质和其它两性分子就将在其pi处集中并浓缩。ief可以在制备和分析级别上进行。由于制备级装置无法有效消散焦耳热并将对流混合保持在最低限度，制备级ief装置通常落后于它们的分析型对应物。另外，由于电解液与常见下游分析如质谱法不相容，可能需要后续纯化步骤。因此，商业获得的制备级ief装置遭受低吞吐量和不理想的问题。5.自由流电泳(ffe)是与毛细管电泳类似的技术，具有可比的分辨率，其中可以生成半制备和制备量的样品。ffe的两种典型分离模式是区带电泳(ze)和ief。在ffe系统中，样品分离和收集是连续过程。尽管ffe系统具有优于制备级毛细管ief装置的一些吞吐量和分辨率的优点，但此类ffe系统操作昂贵，因为它们在运行时消耗大量的试剂，例如两性电解质。此外，已知的ffe仪器设置和维护繁琐，并且气泡是不可重复性的来源。6.鉴于当前商业产品的严重缺点，本公开描述了用于维持用于样品分离和收集的连续流特征的单通道自由流电泳的装置和方法。本文所述的设备可操作以分离具有特定pi的分析物且具有中至高吞吐量以用于样品制备。与已知的ffe装置相比，本文所述的单通道装置通常允许低得多的试剂消耗，并且具有更简单的设置和操作。另外，与已知的ffe装置不同，本文所述的一些实施例不需要两性电解质。技术实现要素：7.本文所述的一些实施例涉及用于收集和分离含有生物材料或分析物如蛋白质的样品的设备和方法。8.本文所述的一些实施例涉及一种仪器，该仪器被配置为在样品流体动力学地流动通过中心通道时对含分析物混合物的样品进行电泳分级。该设备可以被配置为经由入口接收样品并且经由出口排出样品的至少一部分(例如，感兴趣的分级分析物)。该设备可以被配置为与样品的连续流动一起操作，使得在样品流体动力学地移动通过中心通道的同时将样品电泳分级。阳极电解液通道和阴极电解液通道可以平行于中心通道并在其相对侧设置。阳极电解液通道和阴极电解液通道可以配置为填充有电解液并分别连接到阳极和阴极。流体动力学屏障如多孔膜可以设置在中心通道与阳极电解液通道和阴极电解液通道中的至少一个之间。当通电时(即，当向阳极和阴极施加电势时)，阳极电解液和阴极电解液通道可以共同感应垂直于中心通道定向的电场。如下文进一步详细讨论的，具有不同于样品缓冲液和/或电解质缓冲液的ph的pi的分析物可以沿电场方向(垂直于流体动力学流的方向)迁移进入或通过流体动力学屏障并离开中心通道。因此，不具有与样品缓冲液和/或电解质缓冲液的ph匹配的pi的样品级分可以从样品的整体流中去除，并且具有与样品缓冲液和/或电解质缓冲液的ph匹配的pi的一种或多种分析物的含有富集级分(在一些情况下，基本上纯的级分)的级分可以通过出口离开中心通道。如本文进一步详细讨论的，可以通过控制样品和/或电解质缓冲液的ph来纯化感兴趣的特定分析物。9.在一些实施例中，设备的主体可以限定入口，该入口被配置为接收含分析物混合物的样品。在一些实施例中，分析物混合物可以包含蛋白质。设备的主体可以限定出口，该出口被配置为排出样品的分级部分(例如，含富集的或基本上纯的感兴趣的分析物)。设备的主体可以限定配置为耦接到阴极的阴极电解液通道和配置为耦接到阳极的阳极电解液通道。设备可以包括盖和设置在盖和主体之间的流体动力学屏障(例如，由纤维素、聚偏氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯或任何其他合适的材料构成)。流体动力学屏障、主体和盖可以共同形成入口和出口之间的中心通道，该中心通道平行于阴极电解液通道和阳极电解液通道。在一些实施例中，中心通道可部分地由流体动力学屏障的中空空间或开口限定。10.在一些实施例中，阴极电解液通道或阳极电解液通道中的至少一个可以流体连接到配置为含电解质缓冲液的储器。例如，储器可以含有mes-bistris缓冲液。在一些情况下，电解质缓冲液可以含有一种或多种聚合物，例如甲基纤维素(例如，按重量计0.1％至0.5％)。此类储器可具有100ml至500ml的体积。泵可以被配置为使电解液自储器通过阴极电解液通道和/或阳极电解液通道经由单独的回路再循环。在其他实施例中，泵可以被配置为使电解质缓冲液在返回储器之前自储器首先通过阳极电解液通道然后通过阴极电解液通道(或反之亦然)再循环。11.在一些实施例中，设备可包括阳极和阴极。阳极和阴极可以分别电耦接到阳极电解液通道和阴极电解液通道，使得当通电时，阳极电解液通道和阴极电解液通道共同施加跨过和垂直于中心通道的电场。12.在一些实施例中，如本文所述的设备的主体可以限定阴极电解液通道的入口和阴极电解液通道的出口。在一个实施例中，主体可以是塑料的和/或基本上防水的。13.在一些实施例中，分析物混合物可以包括具有1至11的等电点(pi)的肽。如本文进一步详细讨论的，电解质缓冲液和/或样品缓冲液可以被配置为对样品的分析物进行分级，使得一种或多种感兴趣的分析物基于其pi点被选择性富集或纯化。因此，在一些实施例中，电解质缓冲液可以具有0.1至14的ph值，使得具有在该范围内的相应pi值的分析物可以被选择性富集或纯化。14.在一些实施例中，流体动力学屏障的孔可具有25nm至800nm的中值特征长度(例如，直径)。在一些实施例中，流体动力学屏障可具有100μm至200μm的厚度。在一些实施例中，中心通道可具有1mm至10mm的宽度。在一些实施例中，中心通道可具有10cm至20cm的长度。15.本文所述的一些实施例涉及对分析物混合物进行分级的方法。样品可流动通过单通道自由流电泳装置的中心通道。电场可垂直于样品的流动方向经由平行于中心通道的含有电解质缓冲液的阳极电解液通道和阴极电解液通道施加。中心通道可以电耦接和/或离子耦接，但通过流体动力屏障与阳极电解液通道和阴极电解液通道中的至少一个流体隔离。可根据感兴趣的分析物的等电点和电解质缓冲液和/或样品缓冲液的ph值将感兴趣的分析物与样品分离。可将含有感兴趣的分析物的样品级分与分析物混合物分离并收集。该级分可含有感兴趣的富集或基本上纯的分析物。16.在一些实施例中，该方法可以包括使电解质缓冲液自储器并通过阳极电解液通道和/或阴极电解液通道循环。在一些实施例中，该方法可以包括跨阳极电解液通道和阴极电解液通道施加电压以产生电场。在一些实施例中，该方法可以包括使电解质缓冲液自储器循环，使得电解质缓冲液在返回储器之前可以流动通过阳极电解液通道和阴极电解液通道。在一些实施例中，如本文所述的方法可以包括使电解质缓冲液自储器循环，使得电解质缓冲液可以在两个单独的回路中流动通过阳极电解液通道和阴极电解液通道。17.在一些实施例中，如本文所述的方法中使用的样品级分可以含有以5μl/分钟至15μl/分钟的速率收集的感兴趣的分析物。在一些实施例中，电解质缓冲液的ph值可以顺序调整。在一些实施例中，电解质缓冲液的ph值可以通过修改mes和bistris的比率来顺序调整。在一些实施例中，电解质缓冲液的ph值可以与样品中含有的样品缓冲液相同。18.在一些实施例中，电解质缓冲液和/或样品的ph值可以例如通过计量泵或阀顺序调整。因此，具有不同等电点的多个分析物可基于电解质缓冲液和/或样品缓冲液的ph在级分流动通过中心通道和/或收集的时间期间顺序分离。在一些实施例中，可以恒定速率收集感兴趣的分析物。附图说明19.图1a和1b说明根据实施例的单通道自由流电泳装置的组装。图1a示出组装的装置。图1b示出装置的分解图，其示出了三个部件：通常由塑料制成的主体、由多孔膜材料制成的中间段，以及通常由玻璃或金属制成的定位在装置底部的盖。20.图2a和2b示出根据实施例的用于单通道自由流电泳装置的电解质缓冲液的再循环方案。图2a示出具有单个回路的再循环的实施例。图2b示出具有两个单独回路的再循环的实施例。21.图3a-3c示出pi范围为3.4至10.1的肽混合物的分级实例。在此实例中，缓冲液体系基于mes-bistris。通过改变mes和bistris的比率调整缓冲液ph。图3a示出缓冲液ph为5.8的肽混合物的分级。图3b示出缓冲液ph为6.3的肽混合物的分级。图3c示出缓冲液ph为6.7的肽混合物的分级。22.图4a和4b示出包含酸性igg分子的肽混合物的分级实例。在此实例中，缓冲液体系基于mes-bistris。图4a示出缓冲液ph为6.3的肽混合物的分级。图4b示出缓冲液ph为6.5的肽混合物的分级。23.图5示出碱性蛋白质赫赛汀的分级实例。使用2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(ampd)作为缓冲液，并且ph从8.8变化至9.4。24.图6是根据实施例的根据一种或多种感兴趣的蛋白和分析物混合物的等电点将它们顺序分离的方法的流程图。25.图7示出根据实施例的具有至少六个部件的装置的分解图：顶盖、间隔件、底盖、两个缓冲液罐和电极，以及两个膜片。具体实施方式26.虽然本文中已示出和描述本公开的各种实施例，但本领域技术人员将显而易见，此类实施例仅以实例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域的技术人员可想到许多变化、更换和取代。应理解，可采用本文描述的本公开的实施例的各种替代方案。27.如本说明书所用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，术语“成员”旨在意指单个成员或成员的组合，“材料”旨在意指一种或多种材料或其组合。28.如本文所用，术语“蛋白质”是指蛋白质、寡肽、肽和类似物，包括含有非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物的蛋白质和模拟肽结构。术语“蛋白质”还指具有各种等电点的蛋白质、寡肽、肽和类似物。29.如本文所用，术语“分析物”是指如本文所述的待检测或分离的任何分子或化合物。合适的分析物可以包括但不限于小化学分子，诸如例如环境分子、临床分子、化学物质、污染物和/或生物分子。更具体地、此类化学分子可以包括但不限于农药、杀虫剂、毒素、治疗和/或滥用药物、激素、抗生素、抗体、有机材料、蛋白质(例如，酶、免疫球蛋白、和/或糖蛋白)、核酸(例如，dna和/或rna)、脂质、凝集素、碳水化合物、全细胞(例如，原核细胞如致病性细菌和/或真核细胞如哺乳动物肿瘤细胞)、病毒、孢子、多糖、糖蛋白、代谢物、辅因子、核苷酸、多核苷酸、过渡态类似物、抑制剂、营养素、电解液、生长因子和其他生物分子和/或非生物分子，以及它们的片段和组合。本文所述的一些分析物可以是蛋白质，例如酶、药物、细胞、抗体、抗原、细胞膜抗原和/或受体或其配体(例如，神经受体或其配体、激素受体或其配体、营养素受体或其配体、和/或细胞表面受体或其配体)。30.如本文所用，术语“阴极电解液”可以指在电泳装置的阴极侧上的电解液。如本文所用，术语“阳极电解液”可以指在电泳装置的阳极侧上的电解液。在一些实施例中，在电泳装置的两侧上使用共同电解液。31.如本文所用，术语“样品”是指含有待检测或分离的一种或多种分析物的组合物。样品可以是异质的，含有各种组分(例如，不同蛋白质)或均质的，含有一种组分。在一些情况下，样品可以是天然存在的生物材料和/或人造材料。此外，样品可以呈天然或变性形式。在一些情况下，样品可以是单个细胞(或单个细胞内容物)或多个细胞(或多个细胞内容物)、血液样品、组织样品、皮肤样品、尿液样品、水样品和/或土壤样品。在一些情况下，样品可以来自活生物体，例如真核生物、原核生物、哺乳动物、人、酵母和/或细菌，或者样品可以来自病毒。在一些情况下，样品可以是一种或多种干细胞(例如，可以分裂无限时间段并产生特定细胞的任何细胞)。干细胞的合适实例可以包括但不限于胚胎干细胞(例如，人胚胎干细胞(hes))和非胚胎干细胞(例如，间充质、造血、诱导多能干细胞(ips细胞)或成体干细胞(msc))。32.本公开的仪器和方法大体上涉及根据样品中含有的感兴趣的分析物的等电点(pi)分离和收集它们。在一些实施例中，可以顺序分离和收集各种感兴趣的分析物。如本文所述，单通道自由流电泳系统允许蛋白质样品与ph控制的缓冲液混合并且连续地流入通道中，同时施加不平行于流动方向的电场。电场使带电分析物沿电场方向或沿与电场方向相反的方向迁移，使得带电分析物远离流体动力学流的方向移动，并且在一些情况下，离开中心通道，将它们与不带电和/或带电较少的分析物分离。在一些实施例中，电场垂直于流体动力学流的方向定向，导致非目标分析物从通道垂直迁移。在其它实施例中，电场可具有不平行于流体动力学流方向的任何合适定向，使得电场的至少一个分量(例如，矢量分量)导致带电分析物沿垂直于流体动力学流方向的方向移动。如本文所述，特征(例如，电场和中心通道)在它们基本垂直时是“垂直的”。如本文所用，基本垂直是指在90度(加或减小于5度)处彼此定向的特征。33.在一些实施例中，多孔膜被配置为形成通道的至少一部分。因此，具有不平行于通道的方向(例如，如由非平行电场诱导的)的速度矢量的非目标分析物可以离开样品的通道和整体流体动力学流，并进入多孔膜。在一些此类实施例中，通道部分地由多孔膜的中心中的中空空间限定。在一些实施例中，通道的侧壁可以由多孔膜材料限定，缓冲液离子和蛋白质可以通过多孔膜材料迁移。34.本公开规定，根据背景缓冲液ph，pi具有正电荷或负电荷的蛋白质将由施加到如本文所述的装置或设备的电场驱出通道。该装置或设备可以从其带电的对应物中分离出中性分子(例如，具有与背景缓冲液的ph匹配的pi的分析物)。此类中性分子可保留在通道中且流入位于通道末端处的收集容器。本公开规定，通过顺序改变背景缓冲液(例如，样品缓冲液和/或电解质缓冲液)的ph，可以一次一个地收集不同pi值的蛋白质，导致取决于其电荷的蛋白质分级。35.图1a和1b描绘了根据实施例的单通道自由流电泳装置或设备。所述装置包括：(1)主体150(即，顶盖)、(2)多孔膜160(也称为间隔件)和(3)底盖170。主体限定彼此平行的两个缓冲液通道140，其被配置为填充有电解质缓冲液。通常，一个通道被配置为含有阳极电解液，并且另一个通道被配置为含有阴极电解液。主体150、多孔膜160和底盖170共同限定平行于两个缓冲液通道140且在两个缓冲液通道140之间的中心通道。入口120允许样品(通常含有分析物混合物)进入中心通道，并且出口130允许在装置的相对侧处收集样品级分。如本文所述，当通道(或其它特征)与另一通道(或其它特征)基本平行时，该通道(或其它特征)与另一通道(或其它特征)“平行”。如本文所用，基本平行是指特征偏移小于30度、小于10度或0度，包括其间的所有范围和子范围。36.主体150通常由防水和非导电材料构成，例如塑料(例如，丙烯酸、聚碳酸酯、环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚乙烯或聚苯乙烯)，但可由任何合适的材料构成。37.多孔膜160设置在主体150与底盖170之间，并且底盖170与主体150一起限定中心通道。主体150限定中心通道的顶部，而底盖170限定中心通道的底部。多孔膜160充当主体150与底盖170之间的间隔件，使得多孔膜的厚度限定中心通道的高度。如图1a和1b所示，来自多孔膜160的中空空间或开口限定中心通道的长度和宽度。38.多孔膜160被配置为通过样品(当其流动通过中心通道时)和电解质缓冲液(当其流动通过缓冲液通道140时)在相对侧上润湿。多孔膜160被配置为将样品电和/或离子耦接到电解质缓冲液，同时防止或阻碍流体动力学流从中心通道进入缓冲液通道140。39.多孔膜160可由纤维素、聚偏氟乙烯或聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)或任何其它合适材料制成。多孔膜160通常被配置为允许离子和/或分析物迁移进入/穿过多孔膜160，同时防止流体动力学流体流动。如本文所公开，“防止或阻碍流体动力学流”或“流体隔离”是指相对于中心通道将体积流速降低至少95％、至少99％、至少99.9％或至少100％，包括所有范围和其间的子范围，以体积为基础，相对于通过中心通道的流量。40.尽管一般将实施例描述为含有多孔膜160，但应理解，任何合适的物体或结构可设置在中心通道与阳极缓冲液通道和/或阴极缓冲液通道中的至少一个之间。例如，流体动力学障碍可以被配置为将样品电和/或离子耦接到电解质缓冲液，同时防止或阻碍流体动力学流从中心通道进入缓冲通道140。例如，适用于电泳的凝胶或其它材料、微通道网络、纳米通道网络、多孔膜160和/或任何其它合适的结构或材料可充当流体动力学障碍，并且设置在中心通道与阳极缓冲液通道和阴极缓冲液通道中的至少一个之间。41.底盖170可由无孔材料制成。在一些实施例中，无孔材料可以是玻璃。在一些实施例中，无孔材料可以是铝。在一些实施例中，无孔材料是电绝缘的。在一些实施例中，无孔材料是不导电的。在一些实施例中，由ptfe、pvdf或任何其它合适的绝缘和/或疏水性材料制成的薄膜可以施加到底盖170以防止蛋白质吸附到底盖170，并提供电隔离(如果需要)。在一些实施例中，绝缘材料的薄膜可以减少电渗流。在一些实施例中，绝缘材料的薄膜可以减少底盖170的ζ电位的大小。在一些实施例中，绝缘和/或疏水性材料的薄膜可以减少或防止蛋白质或其它分析物粘附到底盖170。在一些实施例中，绝缘材料的薄膜可以定位在底盖170与多孔膜160之间。在一些实施例中，由绝缘材料制成的薄膜可以定位在s主体150的底部与多孔膜160之间。在一些实施例中，由绝缘材料制成的薄膜具有约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm的厚度，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，组装装置的底盖170可以放置在通过冷冻冷却剂的再循环来调节温度的热电冷却器或冷块的顶部。42.阴极缓冲液通道被配置为耦接到阴极，并且阳极缓冲液通道被配置为耦接到阳极。在一些实施例中，装置或设备可包括阳极和阴极。在一些实施例中，电极(即，阴极和/或阳极)可以由铂制成。在一些实施例中，电极可以由铜制成。在一些实施例中，电极可以由石墨制成。在一些实施例中，电极可以由钛制成。在一些实施例中，电极可以由黄铜制成。在一些实施例中，电极可以由银制成。在一些实施例中，电极可以由碳纤维材料制成。在一些实施例中，电极可以由金制成。在一些实施例中，电极可由不锈钢或适合于电泳过程的任何材料制成。43.如图1a和1b所示，电解质缓冲液可以储存在电解质缓冲液罐内，该电解质缓冲液罐通过端口110流体耦接到阳极电解质缓冲液通道和/或阴极电解质缓冲液通道。在其它实施例中，缓冲液通道140本身可以是缓冲液储器。缓冲液储器可具有10ml至1000ml、20ml至900ml、30ml至800ml、40ml至700ml、50ml至600ml、60ml至500ml、70ml至400ml、80ml至300ml、90ml至200ml、100ml至150ml、100ml至500ml、100ml至400ml、100ml至300ml、100ml至200ml的体积，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，缓冲液储器可具有100ml至500ml、100ml至400ml、100ml至300ml、100ml至200ml的体积，包括其间的所有范围和子范围。在其它实施例中，缓冲液储器可具有100ml至500ml的体积。44.在一些实施例中，缓冲液(即，阳极电解液和阴极电解液)通道140可以位于主体的任一侧，与中心通道平行。具有用于样品分离的单通道(例如，单个“中心”通道)的实施例可以是有利的，因为具有此类设计的试剂或缓冲液消耗往往低于具有用于样品分离的多个通道的设计，与已知装置相比，这可以降低分离和收集所需感兴趣的分析物的总成本。然而，应理解，具有用于样品分离的多个通道的其它设计可是可能的。45.在一些实施例中，如本文所述的装置或设备可以仅包含一个入口120和仅一个出口130。在一些实施例中，单个入口120和单个出口130可以是优选的，因为它避免了在使用多个入口和/或出口时可能发生的不平衡流动的潜在困难。然而，应理解，在其它实施例中，多个入口和/或出口可用于例如增加吞吐量。如本文所述的装置或设备的另一个优点是减少可截留在通道内部的气泡的形成。包括在本装置或设备中的入口120、出口130和/或通道的大小可以是窄的，这有利于稳定的液体填充并且避免类似于微流体装置的湍流。在一些实施例中，入口120和出口130可以垂直于缓冲液通道140和中心通道定向。46.多孔膜160可以防止或基本上阻碍流体动力学流，同时允许离子和分析物的电动(和/或电泳)输送。通过预防或基本上阻碍流体动力学流，同时允许分析物电动输送通过多孔膜160，本装置或设备被配置为基本上仅允许目标分析物(即，感兴趣的分析物)沿中心通道向下流体动力学地输送到出口130。47.例如，当背景ph值(例如，中心通道和/或缓冲液通道140的ph值)设置在6.0时，具有6.0的pi值的分析物沿中心通道向下自由流体动力学地输送到出口130，而具有非6.0的pi值的分析物沿与流体动力学流不平行的方向移动，朝向和/或进入多孔膜160。转移到多孔膜160中的分析物离开流体动力学流，并且不随着流体动力学流朝向出口130移动。因此，多孔膜160可操作以滤除非目标分析物。48.在一些实施例中，中心通道可具有约1mm至约10mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm的宽度，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，中心通道可具有约1cm至30cm、5cm至25cm、10cm至30cm、10cm至约20cm、约10cm至约19cm、约10cm至约18cm、约10cm至约17cm、约10cm至约16cm、约10cm至约15cm的长度，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，中心通道具有约10cm至约20cm的长度。49.在一些实施例中，多孔膜160的孔径范围可为约25nm至约800nm、约30nm至约700nm、约40nm至约600nm、约50nm至约500nm、约60nm至约400nm、约70nm至约300nm、约80nm至约200nm、约90nm至约100nm、约35nm至约750nm、约45nm至约650nm、约55nm至约550nm、约65nm至约450nm，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，多孔膜160的孔径可以是任何合适的尺寸，只要其与本文公开的装置或设备相容，或至少允许目标分析物渗透。在一些实施例中，多孔膜160的厚度范围可以为约100μm至约200μm、约110μm至约190μm、约120μm至约180μm、约130μm至约170μm、约140μm至约150μm，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，多孔膜160的厚度范围为约100μm至约200μm、约90nm至约600μm、100nm至500μm、200nm至400μm、300nm至300μm、400nm至200μm、500nm至100μm、600nm至90μm、700nm至80μm、800nm至70μm、900nm至60μm、1μm至50μm、10μm至40μm、20μm至30μm，包括其间的所有范围和子范围。50.图7描绘了根据实施例的单通道自由流电泳装置或设备，其包括：(1)可以由玻璃制成的顶盖750，或任何其他合适的材料，(2)可由塑料或任何其他合适的材料制成的底盖770，(3)定位在顶盖与底盖之间的间隔件764，(4)两个平行膜762、764，(5)定位在顶盖750顶部的入口720，(6)定位在底盖770底部的出口730，(7)阳极电解质缓冲液罐742，和(8)阴极电解质缓冲液罐744。阳极电解质缓冲液罐742和阴极电解质缓冲液罐744可以充当平行电极，使得电压可以施加到阳极电解质缓冲液罐742和阴极电解质缓冲液罐744内的缓冲液。图7的实施例不同于图1的实施例，主要因为与具有将中心通道电和/或离子耦接到两个电解质缓冲液通道140的单个多孔膜160不同，图7的实施例具有两个多孔膜762、764，一个将中心通道电和/或离子耦接到缓冲液罐742，并且另一个将中心通道电和/或离子耦接到阴极电解质缓冲液罐744。图7的各种组件在结构和/或功能上可以类似于图1的那些。另外，图7设备的整体功能与图1设备类似。51.两个多孔膜762、764定位为限定中心通道的侧面。中心通道的顶部和底部分别由顶盖750和底盖770限定。间隔件765限定中心通道的高度。两个多孔膜762、764可各自被配置为由流动通过中心通道的样品在一侧上润湿，并且由缓冲液(例如，来自缓冲液罐742、744)在另一侧上润湿。多孔膜760可以被配置为使得缓冲离子和/或蛋白质可以迁移进入/穿过膜，同时防止流体动力学流。如本文进一步详细讨论的，一种或多种感兴趣的分析物可以与非目标分析物分离，非目标分析物可以从中心通道迁移进入/穿过多孔膜760，然后可以在出口730收集一种或多种分级的目标分析物。52.图2a示出根据实施例的用于单通道自由流电泳装置的单回路电解质缓冲液再循环方案，其中入口220允许样品进入单中心通道，并且出口230允许在装置的相对侧处收集样品级分。图2b示出根据实施例的用于单通道自由流电泳装置的双回路电解质缓冲液再循环方案，其中入口220'允许样品进入单中心通道并且出口230'允许在装置200'的相对侧处收集样品级分。在一些实施例中，阴极电解质缓冲液通道244或阳极电解质缓冲液通道242中的至少一个流体连接到含有电解质缓冲液的储器290。图2a和2b示出的示意图可以使用任何合适的设备实施，例如图1和/或7的设备。53.在一些情况下，在样品经由入口220引入到中心通道中之前，冷却器或冷块(例如，耦接到底板)的温度可以向下调节到5℃至15℃，包括其间的所有范围和子范围。温度稳定后，可储存在体积为100ml至500ml或如本文所公开的其它合适体积的缓冲液储器中的电解质缓冲液可以用蠕动泵或另一合适的泵280通过装置的缓冲液通道再循环。电解质缓冲液通过每个缓冲液通道的再循环可以用单个流体回路来完成，如图2a所示。例如，泵280可以将电解质缓冲液从缓冲液储器290沿一个缓冲液通道向下输送并通过另一缓冲液通道运回。54.在其他情况下，电解质缓冲液可以使用两个流体回路通过两个缓冲液通道再循环，如图2b所示。例如，泵280'可以将电解质缓冲液从缓冲液储器290'输送到阳极电解质缓冲液通道242'和阴极电解质缓冲液通道244'中的每一个的一端，并且由阳极电解质缓冲液通道和阴极电解质缓冲液通道的相对端离开(例如，返回缓冲液储器)。55.在其他情况下(图2a或2b未示出)，电解质缓冲液可以经由完全分离的回路通过缓冲液通道循环。例如，泵可以将阳极电解质缓冲液从专用阳极电解质缓冲液储器输送通过阳极电解质缓冲液通道，并且另一个单独的泵可以将阴极电解质缓冲液从阴极电解质缓冲液储器输送通过阴极电解质缓冲液通道。56.电解质缓冲液(例如，一个或多个缓冲液储器中含有的缓冲液)通常含有电解液和聚合物。在一些实施例中，电解质缓冲液可以是mes缓冲液。在一些实施例中，电解质缓冲液可以是bistris缓冲液。在一些实施例中，电解质缓冲液可以包括适合于电泳过程的任何缓冲液，例如tris/硼酸盐/edta、tris/乙酸盐/edta等。在一些实施例中，电解质缓冲液可以含有甲基纤维素。在一些实施例中，储器可以含有电解质缓冲液，其具有0.01％至1％、0.05％至1％、0.5％至1％、0.1％至0.5％、0.1％至0.4％、0.1％至0.3％、0.1％至0.2％的甲基纤维素，包括其间的所有范围和子范围。57.在一些实施方案中，阴极电解液和阳极电解液在缓冲液罐或储器中重新混合，从而在使用期间保持恒定的ph并保持缓冲液的容量。用于再循环的通道的电阻可以是穿过中心通道和一个或多个多孔膜的装置的电阻的至少50倍、40倍、30倍、20倍、10倍，包括其间的所有范围和子范围。这有效地防止了通过再循环储器或通过通道回路的“短回路”，如图2a所示。58.在一些实施例中，样品缓冲液可用于制备含有感兴趣的分析物的样品。在一些实施例中，电解质缓冲液与具有匹配ph的样品缓冲液相同，使得样品可以在存在电渗流的情况下维持在恒定ph。为了减缓电渗流并且允许更有效地控制分级过程，可以将浓度为0.1％-0.5％的聚合物如甲基纤维素添加到电解质缓冲液中。在一些实施例中，样品可以是交换到预定样品缓冲液中的缓冲液，并且可以在进入装置之前在ph控制缓冲液中实时地进一步稀释。59.本公开提供了通过使用单通道自由流电泳根据分析物的pi值将感兴趣的分析物与样品分离的方法。图6是根据实施例的分离感兴趣的分析物的方法的流程图。在610处，样品缓冲液可以与分析物混合物组合以形成样品。在620处，样品可以通过入口引入并流动通过单通道自由流电泳装置的中心通道。样品可以通过中心通道泵送，使得样品从中心通道的入口流体动力学地流到中心通道的出口。在625处，缓冲液泵可以使电解质缓冲液从缓冲液储器并通过电解液通道再循环，所述电解液通道平行于中心通道延伸并设置在中心通道的任一侧。在640处，耦接到电解液通道的电极可以通电，使得电场垂直于中心通道和样品的流动方向施加。在一些实施例中，阳极电解液通道、中心通道和阴极电解液通道可以电和/或离子耦接但通过多孔膜流体隔离。60.在640处，通过垂直于中心通道施加电场，具有与感兴趣分析物的pi值不同的pi值的分析物将远离中心通道的方向迁移，朝向、进入和/或穿过一个或多个多孔膜。样品通过中心通道的流动速率和/或电场的强度可以控制离开中心通道的出口的分级样品的纯度。在630处，可以通过控制电解质缓冲液和/或样品缓冲液的ph来选择性地隔离感兴趣的分析物，使得具有不同于一种或多种缓冲液的ph值的pi值的分析物被选择性地拒绝进入/穿过一个或多个多孔膜。然而，应理解，不平行于中心通道的任何电场将具有垂直于中心通道的矢量分量，使得具有不同于感兴趣的分析物的pi值的pi值的分析物将沿不平行于流体动力学流方向的方向迁移以及朝向、进入和/或穿过一个或多个多孔膜。61.在650处，可以通过在630调整电解质缓冲液和/或样品缓冲液的ph来收集多种感兴趣的分析物和/或样品的多个纯化级分。在一些情况下，可将样品分成多个等分试样，每个等分试样与具有不同ph的样品缓冲液混合。运行每个等分试样后，可以调整电解质缓冲液的ph以匹配下一个等分试样的ph。空白品可在等分试样之间运行。在其他情况下，样品可以连续运行，并且当收集到足够体积的每个样品级分时，可以在运行期间(例如，利用计量泵或阀)调整样品缓冲液和/或电解质缓冲液。62.在一些实施方案中，如本文所述的样品中的分析物混合物可以包括具有为1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3的不同等电点的肽，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，储器可以含有电解质缓冲液，其具有0.1至14、0.5至13、1至14、2至13、3至12、4至11、5至10、6至9、7至8的ph值，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施例中，电解质缓冲液的ph值可以通过修改mes和bistris的比率来顺序调整。在一些实施例中，电解质缓冲液的ph值可以通过改变电解质缓冲液的温度来顺序调整。不希望受任一理论的束缚，缓冲液的pka值将响应于温度改变而改变，并且由此改变ph值。63.举例来说，当收集具有对应于ph 3.5的pi值的样品(例如，感兴趣的分析物)的足够级分时，电解质缓冲液和样品缓冲液的ph值可以从ph 3.5增至ph 5.5。在其它实例中，当收集具有对应于ph 6.0的pi值的样品(例如，感兴趣的分析物)的足够级分时，电解质缓冲液和样品缓冲液的ph值可从ph 6.0增至ph 7.5。在其它实例中，当收集具有对应于ph 11.0的pi值的样品(例如，感兴趣的分析物)的足够级分时，电解质缓冲液和样品缓冲液的ph值可从ph 11.0降至ph 10.5。在本公开的其它方面，电解质缓冲液的ph值不需要进行修饰以从样品收集感兴趣的分级分析物。例如，可以通过以受控方式向中心通道施加压力或真空并将不需要的pi片段(即，不具有感兴趣的pi值的片段)推出通道，从而将目标片段引导到收集容器中，来实现从样品收集感兴趣的分级分析物。在又一个实例中，可以通过施加电渗流通过流体动力学障碍以将不需要的pi片段(即，不具有感兴趣的pi值的片段)推出通道，从而将目标片段引导到收集容器中，来实现从样品收集感兴趣的分级分析物。64.在一些实施例中，感兴趣的分级分析物经由装置或设备的出口离开单通道电泳装置。在一些实施例中，在650处，样品可以从装置的出口收集。在一些实施例中，样品可以连续地从装置的出口收集。如本文所述的装置或设备可以维持连续分离和收集的特征，这允许对含有感兴趣的分析物的样品级分的吞吐量的优异灵活性。在一些实施例中，可以从装置的出口收集样品级分，速率为1μl/分钟至50μl/分钟、5μl/分钟至15μl/分钟、2μl/分钟至40μl/分钟、3μl/分钟至30μl/分钟、15μl/分钟至45μl/分钟，包括其间的所有范围和子范围。65.尽管图6中未示出，但在一些实施例中，可以在引入样品并收集对应于具有等于新调整的ph的pi的蛋白质的后续样品(例如，感兴趣的分析物)之前运行空白样品。对于任何数量的ph值，可以重复该过程以确保收集的准确性。在630处，可以使用计量泵或计量阀自动完成缓冲液ph调整。66.尽管图6中未示出，但在一些实施例中，在电泳开始之前，装置可以通过使25％乙醇溶液流入中心通道而首先预润湿。在一些实施例中，装置通过使具有任何合适浓度的乙醇溶液流入中心通道来预润湿。在一些实施例中，装置通过使0.1％tween 20溶液流入中心通道来预润湿。在一些实施例中，装置通过使具有任何合适浓度的tween 20溶液流入中心通道来预润湿。使乙醇溶液或tween 20溶液流入中心通道或膜可以最小化通道中的气泡形成。在一些实施例中，在乙醇溶液或tween 20溶液中孵育5分钟至10分钟可确保一个或多个膜完全润湿。67.在一些实施例中，样品级分可以含有以如下速率收集的感兴趣的分析物：1μl/分钟至50μl/分钟、5μl/分钟至15μl/分钟、2μl/分钟至40μl/分钟、3μl/分钟至30μl/分钟、15μl/分钟至45μl/分钟，包括其间的所有范围和子范围。68.作为示例，图3a-图3c示出了使用mes-bistris缓冲液对pi值在3.4至10.1范围内的肽混合物进行分级，pi值通过可从商业获得的ief(例如等电聚焦系统或技术)测量。在一些实施例中，可以通过调整mes与bistris的比率来改变ph值。样品是pi值在3.4、5.85、6.15、9.9和10.1的五种肽的混合物。通过将缓冲液ph从5.8顺序改变至6.7，在分级后，pi值不在pi值的此范围(例如，pi值为3.4、9.9和10.1)内的肽几乎不可检测。当缓冲液ph从5.8增加到6.7时，pi值为5.85和6.15的肽的相对量发生变化。图3c示出了在ph 6.7，pi值为5.85的肽变得不可检测，并且仅可以收集pi值为6.15的单一肽。69.作为另一个示例，图4b示出了通过使用mes-bistris缓冲液，通过使用如本文所述的装置或设备，pi值在5.6-5.9范围内的igg的分级。在一些实施例中，可以通过调整mes与bistris的比率来改变ph值。样品是此igg的四个片段的混合物，pi值为5.65、5.72、5.8和5.9。如图4a所示，缓冲液ph为6.3时，在分级后，pi值为5.65的片段是不可检测的，而具有较高pi值的片段增加了其相对丰度。图4b示出随着缓冲液ph增加到6.5，在分级过程之后，pi为5.65和5.72的两个片段均不可检测，而pi值为5.9的片段的相对量从3.5％增加到约50％。70.图5示出了使用如本文所述的装置或设备的碱性蛋白质分级的实例。作为实例，具有pi值为8.62、8.73、8.85和8.95的四个主要片段的赫赛汀单克隆抗体可以通过使用2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(ampd)作为缓冲液进行分级。在一些实施例中，可以通过使用任何其它合适的缓冲液来处理赫赛汀单克隆抗体的分级。不希望受任一理论的束缚，ampd具有7.8至9.7的有效ph范围。在8.8的缓冲液ph下，pi为8.63的相对次要峰可成为最丰富的峰，这表示该峰的总峰面积的百分比从约13.4％增加到约83.5％。71.图5还示出了当缓冲液ph增加到9.0时，pi值为8.73的第二峰可以从34.9％富集到83.7％，而其它峰的丰度可以显著减少。在ph 9.2，第三峰，即分级前的主峰，可以从36.1％富集到68.3％，而pi值为8.63的第一峰不能再被检测到。在ph 9.4，8.95的pi片段为70.2％，相比之下，在分级过程之前为14.7％。在ph 9.4，具有8.63和8.73的pi值的片段未被检测。观察到收集片段pi值和缓冲液ph的略微不匹配，这可能是由于存在eof，因为eof可能扭曲感兴趣的分级分析物的收集。另一个合理的解释是ph缓冲液导致的测量误差。72.当上述设备和/或方法指示以某一次序发生的某些事件和/或程序时，可以修改某些事件和/或程序的次序。另外，某些步骤和/或程序可以在可能的情况下在并行过程中同时执行，以及顺序执行。









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