枯草芽孢杆菌菌株及其用途的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本技术要求于2020年9月7日提交的韩国专利申请号10-2020-01141670的优先权，其全部内容作为本技术的参考。2.本发明涉及枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)id-a05菌株及其用途，并且更具体而言，涉及一种具有治疗龋洞和牙周疾病并改善口臭的所有效果的新型枯草芽孢杆菌菌株，枯草芽孢杆菌菌株的一种培养基，枯草芽孢杆菌菌株的一种培养上清液，一种包含枯草芽孢杆菌菌株或其培养基或培养上清液作为活性成分的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物，以及一种准药物组合物，一种包含枯草芽孢杆菌菌株或其培养基或培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物和食品组合物。背景技术：3.最近，由于不正确的饮食习惯和衰老，免疫力降低并且营养和代谢紊乱增加，因此患有牙周疾病的患者数量增加。牙周疾病的直接原因是在牙齿中不断形成的被称为牙菌斑的细菌膜以及在没有去除牙菌斑的情况下变硬的鳞屑。当牙菌斑和鳞屑积聚时，牙龈从牙齿上脱落，导致牙齿与牙龈之间发炎。4.牙周疾病是指与破坏软组织(诸如牙周韧带和牙齿周围的牙龈)以及硬组织(诸如牙槽骨)的炎性疾病相关联的症状。5.当牙槽骨等随着年龄的增长而先天和后天退化时，牙周疾病将发展，并且代表性的牙周疾病包括牙龈炎和牙周炎症、牙槽骨骨营养不良等。牙龈炎是最初的牙周疾病，其中在牙龈的软组织中发生炎症，并且症状相对较轻并且恢复处于可逆的状态。牙周炎症是这样一种情况，其中牙龈炎未得到治疗且炎症在牙龈和耻骨周围发展，并且当由细菌毒素刺激的慢性炎症反应发展时，牙龈与牙齿之间的间隙被分开并且形成感染的牙周袋。随着牙周炎症严重，牙周袋的深度变深，并且最终在牙周韧带中引起炎症，并发生骨丢失。另外，当由于在牙槽骨中成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收的代谢中的各种因素，骨吸收超过骨形成时，骨量降低到极限以下，并且发生牙槽骨形成障碍，诸如牙槽骨质疏松症。6.在牙周疾病中，通过改善患者的口腔卫生建立来预防是最重要的，而在临床上，主要进行手术治疗，诸如非手术或手术刮治、牙根规划、牙龈刮除术、以及利用新附着应用的牙周组织再生等。然而，在这些手术治疗方法中，大多数情况下治疗是麻烦的，有效的治疗是困难的，治疗限于当疾病进行到一定程度时的治疗而不是疾病的预防，并且当不进行治疗时，疾病是长期进展的。进一步，作为另外的治疗，已经使用全身抗生素和局部持续释放剂的服用，但是即使在不必要的部位中，药物也被过度递送，从而导致副作用，并且最近，已经报道显示抗生素抗性的牙周疾病细菌引起严重的问题。7.龋洞是指蛀牙和其中牙齿硬组织被侵蚀和丧失的症状，并被称为龋齿。龋洞是感染性细菌疾病，其引起疼痛，其中牙齿的一部分硬钙化组织被溶解和破坏，从而导致丧失牙齿，并且其占据牙齿疾病的最大部分，发病率增加。根据korean dental association的报告，90％或更多的儿童患有龋齿，并且80％或更多的成人患有牙龈疾病。这些疾病的主要原因是由细菌、食物与唾液的相互作用引起的口腔中微生物的感染。8.同时，口臭是指来源于口腔和邻近器官的气味，并且许多人在日常生活中申诉口臭带来的不便。85％至90％的口臭来源于口腔，特别是来源于舌背。口臭的主要成分是挥发性硫化合物，并且挥发性硫化合物总量的90％是由半胱氨酸制成的硫化氢和甲硫氨酸制成的甲硫醇组成。这些成分是由厌氧细菌产生，并且舌背成为最重要的生境。该位置是未被唾液很好地清洁的地方，并且具有许多小凹陷，在这些小凹陷中细菌持续存活。厌氧细菌产生挥发性硫化合物作为口臭的原因是最重要的，但还由诸如龋洞和牙周炎症之类的其它口腔疾病引起。9.经常在口臭患者的口腔中发现的细菌是具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、中间普雷沃菌(prevotella intermedia)和牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)。在相关技术中，多形杆状菌(bacteroides)和卟啉单胞菌属(porphyromonas)是已知与普雷沃菌属(prevotella)相同属的类似细菌。涉及许多种引起口臭的厌氧细菌，但引起口臭的代表性细菌是具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)和牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)。10.近年来，尝试使用乳酸菌在体外抑制厌氧细菌的增殖。乳酸菌是通过发酵碳水化合物来产生作为最终代谢产物的乳酸的细菌，并且乳酸菌存在于人和动物的口腔和消化道中，并通常用于诸如朝鲜泡菜或酸奶之类的发酵食品的生产过程中。然而，虽然乳酸菌在被施用于口腔时如金属盐或消毒剂一样被唾液稀释，但是乳酸菌被立即吞咽，使得存在的问题是乳酸菌难以保留在口腔中。另外，诸如嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)和干酪乳杆菌(lactobacillus casei)之类的乳酸菌在体外产生强酸以抑制厌氧细菌的增殖，但在健康人的口腔中，乳酸菌产生的强酸被唾液的缓冲作用中和，并且因此难以抑制其它细菌的增殖。此外，由于强酸导致龋齿，因此当这些细菌在口腔中长时间施用时，存在口腔卫生不佳的问题。11.另一方面，在相关领域中存在具有改善龋洞、改善牙周疾病和改善口臭的一种功能的菌株，但几乎不存在具有改善龋洞、牙周疾病和口臭的所有功能的菌株。12.现有技术13.专利文件14.(专利文件1)韩国专利登记号10-195675915.(专利文件2)韩国专利登记号10-162955116.公开内容17.技术问题18.因此，本发明人在努力寻找对牙周疾病的治疗显示出优异活性的菌株时发现特定的枯草芽孢杆菌菌株具有治疗或预防龋洞和牙周疾病的优异效果和改善口臭的优异效果，然后完成了本发明。19.因此，本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌id-a05菌株(登录号：kctc14184bp)。20.本发明的另一目的是提供枯草芽孢杆菌id-a05菌株的一种培养基。21.本发明的另一目的是提供枯草芽孢杆菌id-a05菌株的一种培养上清液。22.本发明的另一目的是提供一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物。23.另外，本发明的另一目的是提供一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物。24.另外，本发明的另一目的是提供一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物。25.本发明的另一目的是提供一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的准药物组合物。26.另外，本发明的另一目的是提供一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的准药物组合物。27.另外，本发明的另一目的是提供一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的准药物组合物。28.本发明的另一目的是提供一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物。29.另外，本发明的另一目的是提供一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物。30.另外，本发明的另一目的是提供一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物。31.本发明的另一目的是提供一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的食品组合物。32.另外，本发明的另一目的是提供一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的食品组合物。33.另外，本发明的另一目的是提供一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的食品组合物。34.本发明的另一目的是提供一种包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的牙膏组合物。35.另外，本发明的另一目的是提供一种由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的牙膏组合物。36.另外，本发明的另一目的是提供一种基本上由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的牙膏组合物。37.本发明的另一目的是提供一种包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的漱口剂组合物。38.另外，本发明的另一目的是提供一种由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的漱口剂组合物。39.另外，本发明的另一目的是提供一种基本上由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的漱口剂组合物。40.本发明的另一目的是提供一种包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的含漱剂组合物。41.另外，本发明的另一目的是提供一种由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的含漱剂组合物。42.另外，本发明的另一目的是提供一种基本上由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的含漱剂组合物。43.本发明的另一目的是提供枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液用于制备用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药剂的用途。44.本发明的另一目的是提供一种治疗龋洞、牙周疾病或口臭的方法，其包括将有效量的包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液的组合物施用于有需要的对象。45.技术方案46.为实现本发明的目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌id-a05(保藏号：kctc14184bp)菌株。47.为实现本发明的另一目的，本发明提供了枯草芽孢杆菌id-a05菌株的一种培养基。48.为实现本发明的另一目的，本发明提供了枯草芽孢杆菌id-a05菌株的一种培养上清液。49.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物。50.另外，本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物。51.另外，本发明提供了一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物。52.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的准药物组合物。53.另外，本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的准药物组合物。54.另外，本发明提供了一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的准药物组合物。55.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物。56.另外，本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物。57.另外，本发明提供了一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物。58.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的食品组合物。59.另外，本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的食品组合物。60.另外，本发明提供了一种基本上由枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的食品组合物。61.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的牙膏组合物。62.另外，本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的牙膏组合物。63.另外，本发明提供了一种基本上由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的牙膏组合物。64.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的漱口剂组合物。65.另外，本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的漱口剂组合物。66.另外，本发明提供了一种基本上由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的漱口剂组合物。67.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的含漱剂组合物。68.另外，本发明提供了一种由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的含漱剂组合物。69.另外，本发明提供了一种基本上由枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液组成的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的含漱剂组合物。70.为实现本发明的另一目的，本发明提供了枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液用于制备用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药剂的用途。71.为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种治疗龋洞、牙周疾病或口臭的方法，其包括将有效量的包含枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液的组合物施用于有需要的对象。72.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。以下参考文献向本领域技术人员提供了本发明说明书中使用的各种术语的一般定义：singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology(第2版，1994)；the cambridge dictionary of science and technology(walkered.，1988)；以及hale&marham，the harper collins dictionary of biology。73.在下文中，将详细描述本发明。74.本发明提供了一种枯草芽孢杆菌id-a05菌株(保藏号：kctc14184bp)。75.菌株可以是选自菌株本身、菌株裂解物、菌株浓缩物、菌株提取物和菌株干燥产物中的至少一种。76.在本发明中，术语“芽孢杆菌”是指在自然界中广泛分布的需氧或兼性厌氧革兰氏阳性芽胞杆菌属，并且属于芽胞杆菌属的微生物包括贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)、枯草芽孢杆菌等。本发明人将属于枯草芽孢杆菌的新型菌株鉴定为具有如下治疗或预防龋洞和牙周疾病效果的芽孢杆菌属细菌。77.根据本发明的枯草芽孢杆菌id-a05(保藏号kctc14184bp)菌株是来源于发酵食品的新型枯草芽孢杆菌菌株。尽管在本发明中枯草芽孢杆菌id-a05菌株是从发酵食品中分离并鉴定，但获得途径不限于此。78.作为用于微生物鉴定和分类的16s rdna测序分析的结果，证实了通过以下实例从发酵食品分离的菌株与枯草芽孢杆菌99％相同。枯草芽孢杆菌id-a05菌株于2020年5月11日存托于korea research institute of bioscience and biotechnology(保藏号：kctc14184bp)。79.本发明的枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液的特征在于具有对牙周疾病的致病菌的抗菌效果、对炎性细胞因子分泌的抑制效果、对生物膜产生的抑制效果以及对作为口臭主要原因的挥发性硫化合物(vsc)的抑制效果。80.这在本发明的实施方案中很好地示出。81.在本发明的一个实施方案中，将从发酵食品中分离的新型枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液接种到牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)(牙周疾病的代表性致病菌)和tyb培养基中，然后测量吸光度。结果，证实了枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液对pgi具有优异的抗菌效果(参见实施例5)。82.进一步，在本发明的另一实施方案中，为证实枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液的生物膜抑制效果，将培养基分配在涂有唾液的96孔板中(4小时，37℃)，然后分别以25％和0.5％的浓度接种牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)和具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum；fnu)，并且同时处理样品并在37℃下厌氧培养4天，并证实其结果。结果，证实了枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液具有优异的生物膜抑制效果(参见实施例6和7)。83.进一步，在本发明的另一实施方案中，为证实枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液的炎性细胞因子分泌抑制效果，将hgf-1细胞以1×104细胞/孔接种在96孔板上并培养24小时，将候选组处理24小时并随后用50μg/ml的牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)-lps处理24小时，并且收集并分析上清液。结果，证实了枯草芽孢杆菌id-a05菌株抑制炎性细胞因子的分泌(参见实施例9)。84.本发明提供了枯草芽孢杆菌id-a05菌株的一种培养基。85.本发明的术语“培养基”是指其中培养本发明的枯草芽孢杆菌id-a05菌株的液体培养基，并且包含具有菌株的胰蛋白酶大豆培养基(tsb)。86.本发明提供了新型枯草芽孢杆菌菌株的一种培养上清液。87.本发明的术语“培养上清液”是指其中培养本发明的枯草芽孢杆菌id-a05菌株并随后去除细胞的液体培养基，并且包含没有细胞的胰蛋白酶大豆培养基(tsb)。[0088]“液体培养基”是不含琼脂的液体培养基，并且用于微生物的增殖和用于细菌的生物化学测试、增殖和检测代谢物。[0089]使用振荡培养法培养分离的枯草芽孢杆菌菌株。振荡培养法是通过将三角瓶等固定在往复振荡器或旋转振荡器上连续振荡而有效通气和搅拌的方法。在振荡培养的情况下，将菌株在含有胰蛋白胨17g/l、大豆胨3g/l、右旋糖2.5g/l、氯化钠5g/l和磷酸氢二钾2.5g/l的tsb培养基(mb细胞)中在37℃和200rpm的条件下培养40小时。在培养完成后，将培养基以13,000rpm离心20分钟以去除细胞并获得培养上清液。使用8.25％ hcl将培养上清液的ph校正至6.5，然后使用0.22μm过滤器对培养上清液进行抗菌化以完全去除细胞。[0090]为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药物组合物。[0091]本发明的术语“治疗”是指用于获得有益的或优选的临床结果的方法。对于本发明的目的，有益的或优选的临床结果包括无限制地减轻症状、减小疾病范围、使疾病状况稳定(即，不恶化)、延迟或降低疾病进展速度、改善或暂时减轻和缓解疾病状况(部分或全部)、以及是否可检测。另外，“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性方法。上述治疗不仅包括预防性病症，还包括已经发生的病症所需的治疗。[0092]本发明的术语“龋洞”是指保护牙齿牙本质的牙釉质被在糖、淀粉等被口腔中栖息的细菌分解时所产生的酸损坏。[0093]本发明的术语“牙周疾病”可以是选自牙龈炎、牙周炎症、牙龈出血、牙龈退缩、牙周袋、冠周炎和牙周脓肿中的至少一种，优选牙龈炎，但不限于此。[0094]本发明的术语“生物膜”是指其中各种微生物(包括牙菌斑中的细菌)彼此凝结的现象，并且当生物膜未被擦去而变厚并且其中的病理性细菌的数量增加而无法用于我们身体的防御时，发生口腔疾病。[0095]根据本发明的药物组合物可以配制成合适的形式，其单独地或与药学上可接受的载体组合地含有枯草芽孢杆菌菌株或其培养基或培养上清液，并且还可以含有赋形剂或稀释剂。“药学上可接受的”是指生理上可接受的并且当施用于人类时不会引起诸如胃肠道病症、头晕等之类的过敏反应或与其类似的反应的无毒组合物。[0096]药学上可接受的载体可以进一步包括例如用于口服施用的载体或用于肠胃外施用的载体。用于口服施用的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。另外，用于口服施用的载体可以包括用于口服施用肽制剂的各种药物递送材料。另外，用于肠胃外施用的载体可以包括水、合适的油、盐水、含水葡萄糖、乙二醇等，并且可以进一步包括稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。除了上述成分之外，本发明的药物组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂等。其它药学上可接受的载体和药剂可以指本领域已知的那些。[0097]本发明的组合物甚至可以通过任何方法施用于包括人类在内的哺乳动物。例如，本发明的组合物可以口服或肠胃外施用。肠胃外施用方法不限于此，但可以是静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠道、局部、舌下或直肠内施用。[0098]本发明的药物组合物可以根据如上所述的施用途径而被配制成用于口服施用或肠胃外施用的制剂。[0099]在用于口服施用的制剂的情况下，本发明的组合物可以使用本领域已知的方法配制成口服崩解膜剂、粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等。例如，通过将活性成分与固体赋形剂混合，将混合物粉碎，加入合适的佐剂，然后将混合物加工成颗粒混合物，可以将口服制剂制成片剂或糖衣片剂。合适的赋形剂的实例可以包括填充剂，诸如：糖，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇和麦芽糖醇等；淀粉，包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉等；纤维素，包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素等；明胶；聚乙烯吡咯烷酮等。在一些情况下，可以加入交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或藻酸钠作为崩解剂。另外，本发明的药物组合物可以进一步包括抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。[0100]用于肠胃外施用的制剂可以通过本领域已知的方法配制成贴剂、注射剂、乳膏剂、洗剂、外用软膏剂、油剂、保湿剂、凝胶剂、气雾剂和鼻吸入剂的形式。这些制剂描述于药物化学中通常已知的所有处方中。[0101]为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的准药物组合物。[0102]在本发明的实施方案中，为证实从发酵食品中分离的枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液对口臭的效果，测试了作为口臭主要原因的挥发性硫化合物(vsc)的产生抑制活性。结果，证实了枯草芽孢杆菌id-a05菌株的培养上清液具有优异的vsc产生抑制效果(参见实施例8)。[0103]本发明的术语“口臭”是来源于口腔和邻近器官的气味，其通常给他人或你自己带来不愉快。口臭的主要原因是挥发性硫化合物(vsc)，其通过由口腔中存在的细菌降解食物残渣、唾液、血液、口腔粘膜细胞等中含有的氨基酸和蛋白质而产生。当分析挥发性化合物时，甲基硫醇(ch3sh)和硫化氢(h2s)占90％，这是腐烂的蛋和腐烂的洋葱的气味。[0104]本发明的“改善”是指至少降低与病症的减轻或治疗相关联的参数(例如，症状的程度)的所有动作。[0105]本发明的术语“准药物”包括对应于纤维中的一种的产品、橡胶产品或与其类似的用于治疗、减轻、治愈或预防人类或动物疾病的产品、弱作用于人体或不直接作用于人体且不是机构或机器及其类似的那些产品、以及用于灭菌、除虫及其类似目的以用于预防感染性疾病的制剂。[0106]在本发明中，准药物可以是选自漱口剂、含漱剂、抗液体剂、牙膏、卫生垫、一次性衬垫、面膜、眼绷带、绷带、弹性绷带、石膏绷带、圆柱形弹性绷带、纱布、药棉、急救绷带、除臭剂、软膏和泥敷剂中的至少一种，但不限于此。[0107]为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的健康功能食品组合物。[0108]本发明的术语“健康功能食品”包括使用物理、生物化学、生物技术方法给予食品附加值以便为特定目的起作用和表达对应食品的功能的食品组，或被设计和加工以充分表达食品组合物的生物防御节律调节、疾病预防和恢复等的内部调节功能的食品。[0109]本发明的健康功能食品组合物可用于治疗或预防龋洞和牙周疾病或改善口臭。[0110]在本发明中，健康功能食品组合物可以是选自片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂组成的制剂中的至少一种制剂，但不限于此。[0111]另外，根据每种一般方法，组合物可以以口服制剂(诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等)、外用制剂、栓剂和无菌可注射溶液的形式配制和使用。可包括在包括化合物的组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。在制剂的情况下，制剂可通过使用通常使用的稀释剂或赋形剂(诸如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)来制备。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且固体制剂可以通过将至少一种赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)与提取物混合来制备。进一步，除了简单的赋形剂之外，还可以使用诸如硬脂酸镁、滑石之类的润滑剂。用于口服施用的液体制剂对应于混悬剂、口服液体制剂、乳剂、糖浆剂等，并且除了作为通常使用的简单稀释剂的水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、混悬剂、乳剂、冻干剂和栓剂。作为非水溶液和混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)、可注射酯(诸如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可以使用硬脂(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂酯(laurinum)、甘油明胶等。[0112]为实现本发明的另一目的，本发明提供了一种包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分的用于预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的食品组合物。[0113]根据本发明的食品组合物可以与已知在龋洞、牙周疾病或口臭方面有效的已知活性成分相组合地以组合物形式制备，并且包括所有形式，诸如营养补剂、保健食品、食品添加剂等。这些类型的食品组合物可以根据本领域已知的一般方法来以各种形式制备。例如，保健食品可以制备为含有本发明的食品组合物的茶、果汁和饮料的形式，并且可以通过将包含贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)菌株或其培养基或培养上清液作为活性成分的食品组合物造粒、包封或粉化来摄取。[0114]进一步，健康功能食品可以通过将本发明的食品组合物加入到饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例如，罐装水果、瓶装食品、果酱、酸果酱等)、鱼、肉及其加工食品(例如，火腿、香肠、腌制牛肉等)、面包和面条(例如，乌冬面、荞麦面条、拉面、意大利面条、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖果、乳制品(例如，黄油、奶酪等)、食用植物油、人造黄油、植物蛋白、甑煮食品、冷冻食品、各种调味品(例如，豆酱、酱油、酱汁)等等中来制备。[0115]在本发明的食品组合物中，除了贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)菌株或其培养基或培养上清液之外，还可以使用含矿物质的化合物(诸如维生素b、c和e、β-胡萝卜素、ca、mg和zn)以及诸如磷脂(诸如卵磷脂或麦芽酚)、寡糖、氨基酸等之类的化合物作为辅助成分。其中，更优选的是可以通过混合和使用维生素c和e、β-胡萝卜素、麦芽酚等中的2至3种成分来增强生物活性效应。[0116]进一步，除了这些成分之外，为诱人，可以通过混合天然香料或天然汁液(诸如李子香料、柠檬香料、菠萝香料或草药香料)、天然色素(诸如叶绿酸和类黄酮)、增甜成分果糖、蜂蜜、糖醇和糖、以及酸化剂(诸如柠檬酸和柠檬酸钠)来使用已知的添加剂。[0117]在本发明的食品组合物中，枯草芽孢杆菌菌株或其培养基或培养上清液的优选含量可以是相对于食品总重量的约0.01至10重量％。优选地，当以0.1mg/kg/天至200mg/kg/天的量服用食品组合物时，可以表现出预防或改善龋洞、牙周疾病或口臭的效果。[0118]本发明提供了枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液用于制备用于治疗龋洞、牙周疾病或口臭的药剂的用途。[0119]本发明提供了一种治疗龋洞、牙周疾病或口臭的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的含有枯草芽孢杆菌菌株、其培养基或其培养上清液的组合物。[0120]本发明的术语“有效量”是指当施用于对象时表现出改善、治疗、预防、检测和诊断龋洞、牙周疾病或口臭或者抑制或减少龋洞、牙周疾病或口臭的效果的量。“对象”可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人类在内的动物，并且还可以是来源于动物的细胞、组织和器官。对象可以是需要所述效果的患者。[0121]本发明的术语“治疗”全面地指改善龋洞、牙周疾病或口臭或这些疾病的症状，并且可以包括治疗或基本上预防这些疾病或改善其状况，并且包括减轻、治疗或预防来源于这些疾病的症状或大多数症状，但不限于此。[0122]本文中的术语“包含”以与“包括”或“特征在于”相同的含义使用，并且不排除在根据本发明的组合物或方法中未具体提及的附加成分或方法步骤。除非另有说明，术语“由…组成”是指排除附加元件、步骤或成分等。术语“基本上由…组成”是指除了在组合物或方法的范围内的所述物质或步骤之外，还包括基本上不影响其基本性质的物质或步骤。[0123]有利效果[0124]根据本发明，包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株的组合物、其培养基或培养上清液对龋洞和牙周疾病的致病菌表现出抗菌、抗炎和生物膜抑制作用，从而具有预防或治疗龋洞和牙周疾病或改善口臭的优异效果。附图说明[0125]图1示出了牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)的抗菌测试结果。[0126]图2示出了评价在牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)的抗菌评价中具有优异效果的菌株样品的生物膜功效的结果。[0127]图3示出了使用扫描电子显微镜(sem)测量生物膜抑制效果的结果。[0128]图4示出了评价生物膜去除功效的结果。[0129]图5a至5c示出了牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)分泌的lps对三种细胞因子il-1β、il-6和tnf-α的抑制功效结果。[0130]图6示出了测试vsc产生抑制活性的结果。[0131]图7示出了变形链球菌(streptococcus mutans；smu)的抗菌测试结果。[0132]图8示出了评价变形链球菌(streptococcus mutans；smu)衍生的生物膜形成抑制功效的结果。[0133]图9示出了使用扫描电子显微镜(sem)评价变形链球菌(streptococcus mutans；smu)衍生的生物膜形成抑制功效的结果。[0134]本发明的模式[0135]在下文中，将详细描述本发明。[0136]然而，以下实施例仅仅是对本发明的说明，并且本发明的内容不限于以下实施例。[0137]实施例1：枯草芽孢杆菌的分离[0138]使用无菌盐液以多级稀释法将发酵食品液体稀释，涂抹在固体培养基上，并且在37℃下培养2至3天。将固体培养基上的各个菌落在37℃的液体培养基中培养2至3天。通过macrogen co.，ltd.(seoul，korea)对16s rdna进行测序和全基因组测序来鉴定纯分离的菌株。[0139]实施例2：枯草芽孢杆菌的16s rdna鉴定[0140]使用qiaamp fast dna stool mini kit(qiagen，germany)进行基因组dna提取。使用27f(5’‑agagtttgatcmtggctcag-3’)(序列编号：1)和1492r(5’‑tacggytaccttgttacgactt-3’)(序列编号：2)引物通过聚合酶链反应方法进行16srdna的碱基序列扩增。向macrogen co.，ltd.请求对应位点的碱基测序，并使用785f(5’‑ggattagataccctggta-3’)(序列编号：3)和907r(5’‑ccgtcaattcmtttragttt-3’)(序列编号：4)引物进行。使用ncbi blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)服务中的16s数据库进行由碱基测序完成的每个菌株的16s rdna测序鉴定。作为16s rdna测序标准鉴定结果，用枯草芽孢杆菌以99％的相似性鉴定和分析id-a05。然而，由于难以精确地区分枯草芽孢杆菌(b.subtilis)与类似物种(诸如暹罗芽孢杆菌(b.siamensis)、贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)和解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens))，因此基于16s rdna序列，通过全基因组分析进行更详细的鉴定分析。[0141]实施例3：枯草芽孢杆菌的全基因组测序和使用全基因组的鉴定[0142]向macrogen co.，ltd.请求进行全基因组测序，并且使用dneasy blood&tissue kit(qiagen，germany)提取基因组dna，然后使用pacbio rs ii(pacific biosciences，usa)和illumina miseq(illumina，usa)进行杂交测序。[0143]使用其全基因组测序已被常规地完成以登记在ncbi基因组数据库中的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)dsm 7(fn597644.1)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)ncib 3610(cp034484.1)、暹罗芽孢杆菌(b.siamensis)scsio 05746(cp025001.1)和贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)fzb42(cp000560.2)的全基因组序列以及其全基因组测序已被完成的id-a01、id-a02、id-a03和id-a04的全基因组序列通过平均核苷酸同一性(ani)分析进行使用全基因组信息的鉴定分析。在jspeciesws(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/)中使用blast算法(anib)进行ani分析。作为使用全基因组序列分析anib的结果，id-a05菌株分别显示出与比较菌株的76.28％、98.79％、76.37％和76.32％同源性。通过该分析，发现菌株id-a05是枯草芽孢杆菌。[0144]根据本发明的新型枯草芽孢杆菌id-a05菌株(保藏号：kctc14184bp)于2020年5月11日存托于korean biological resources center(kbrc)。[0145]实施例4：样品制备[0146]将各菌株接种在tsb培养基中并在37℃和200rpm下培养40小时。将培养基离心(13,000rpm，20分钟，4℃)，然后通过去除细胞来取出上清液，然后使用0.22μm过滤器进行抗菌化以制备样品。[0147]实施例5：抗菌功效评价(牙周疾病)[0148]对牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)(牙周疾病的代表性致病菌)测试抗菌活性。本实验中使用的pgi菌株是从kribb的korean collection for type cultures(kctc)购买的牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)kctc 5352(模式菌株)。将pgi在tyb培养基中在37℃下厌氧培养24小时。将pgi和样品以10％接种在tyb培养基中并培养24小时，然后测量600nm处的吸光度。[0149]结果，如下图1所示，在用菌株id-a05培养上清液处理的培养基中测得吸光度非常低，从而证实抗菌效果优异。[0150]实施例6：生物膜功效评价－预防模型(牙周疾病)[0151]对在牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)抗菌评价中具有最优异效果的菌株样品进行生物膜功效评价。通过预防模型方法进行评价方法，其中将培养基分配在涂有唾液的96孔板中(4小时，37℃)，分别以25％和0.5％的浓度接种牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)和具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum；fnu)，同时用样品处理，然后在37℃下厌氧培养4天，然后证实其结果。[0152]将形成的生物膜用0.1％结晶紫试剂染色，并测量595nm处的吸光度。生物膜形成越多，显示的吸光度越高，从而通过吸光度比较证实测试样品的生物膜抑制效果。[0153]结果，如下图2所示，在用菌株id-a05培养上清液处理的培养基中测得吸光度低，从而证实生物膜产生抑制效果优异。[0154]实施例7：使用扫描电子显微镜(sem)测量生物膜抑制效果(牙周疾病)[0155]对于生物膜诱导，用唾液涂覆带有盖玻片的24孔板(4小时，37℃)。将培养基分配在每个孔中并分别以25％和0.5％的浓度接种牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)和具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum；fnu)。同时处理样品，然后在37℃下厌氧培养4天以诱导生物膜的形成。去除形成有生物膜的每个测试孔的培养基成分，然后冷冻干燥以制备和捕获sem样品。[0156]实施例8：生物膜功效评价－治疗模型(牙周疾病)[0157]将培养基分配在涂有唾液的96孔板中(4小时，37℃)，然后分别以25％和0.5％的浓度接种牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)和具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)，并在37℃下厌氧培养4天以充分形成生物膜。此后，在更换培养基的同时处理样品并在37℃下进一步厌氧培养3天，并证实其结果。将形成的生物膜用0.1％结晶紫试剂染色并测量595nm处的吸光度。生物膜形成越多，显示的吸光度越高，从而通过吸光度比较证实测试样品的生物膜去除效果。[0158]结果，如下图4所示，在用菌株id-a05的培养上清液处理的培养基中测得吸光度低，并且证实生物膜去除效果优异。[0159]实施例9：抗炎功效评价(牙周疾病)[0160]在牙周炎症或口腔健康中，已知从牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)分泌的脂多糖(lps)分泌炎性细胞因子il-1β、il-6和tnf-α。为测量候选组的炎性细胞因子分泌抑制能力，将hgf-1细胞以1×104细胞/孔接种在96孔板中并培养24小时。将候选组处理24小时，然后将lps以50μg/ml处理24小时，并且收集上清液用于分析。使用elisa测定试剂盒根据手册来测试分泌的细胞因子的数量，并在读板机450nm处测量。[0161]作为测试结果，如图5a、5b和5c所示，证实了当候选组被处理时，lps引起的细胞因子分泌受到抑制。另外，证实了当候选组被处理时，所有三种细胞因子il-1β、il-6和tnf-α均减少。[0162]实施例10：挥发性硫化合物(口臭)的评价[0163]挥发性硫化合物(vsc)包括硫化氢(h2s)、甲基硫醇(ch3sh)、二甲基硫醚(ch3sch3)等作为口臭的主要原因，并且其中h2s和ch3sh占90％或更多。vsc主要由牙周疾病的致病菌产生，并且在牙周疾病患者中具有高浓度。为证实对口臭的效果，测试了vsc产生抑制能力。病原体为牙周疾病的致病菌，并且与具有vsc产生能力的牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis；pgi)和具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum；fnu)菌株联用。作为fnu菌株，模式菌株具核梭杆菌(f.nucleatum)kctc 2640购自kribb的korean collection for type cultures(kctc)。分别将pgi和fnu接种在tyb和rcb培养基中，并在37℃的厌氧室中培养24小时。将5％的pgi和fnu以及10％的样品接种在与tyb和rcb培养基以1:1混合的培养基中，并在37℃下培养24小时。为测量在培养后产生的h2s，通过亚甲蓝方法显色培养基，然后测量668nm处的吸光度。[0164]结果，如下图6所示，在用菌株id-a05的培养上清液处理的培养基中测得吸光度低，并且证实挥发性硫化合物产生抑制效果优异。[0165]实施例11：抗菌功效效果(龋洞)[0166]测试了作为龋洞的主要致病菌的变形链球菌(streptococcus mutans；smu)的抗菌活性。作为测试中使用的smu菌株，变形链球菌kctc 3065作为模式菌株从kribb的korean collection for type cultures(kctc)获得。将smu在co2培养箱中在37℃的bhi培养基中培养24小时。将smu和样品以10％接种在bhi培养基中并培养24小时，然后进行活细胞计数分析。[0167]结果，如下图7所示，在用菌株id-a05的培养上清液处理的培养基中测得吸光度非常低，从而证实抗菌效果优异。[0168]实施例12：生物膜功效评价(龋洞)[0169]对于生物膜诱导，培养以10％接种在bhi中的变形链球菌(smu)(5％ co2培养箱，18小时)。将培养基离心(9,000rpm，5分钟，4℃)以固定细菌，在反应培养基(具有1％蔗糖的bhi)中以约1×106cfu/ml稀释，并且接种菌液以包括10％(v/v)的样品。每24小时将培养基更换为包括10％(v/v)样品的反应培养基，并在相应条件下诱导膜形成达3天(72小时)作为合适的生物膜形成日期。[0170]对于生物膜功效评价，进行结晶紫染色方法。在用甲醇固定并用0.1％结晶紫染色后，用乙醇进行重建。对于每个步骤均包括洗涤过程，并且测量595nm处的膜形成程度。[0171]结果，如下图8所示，在用菌株id-a05的培养上清液处理的培养基中测得吸光度非常低，从而证实生物膜抑制效果优异。[0172]实施例13：使用扫描电子显微镜(sem)测量生物膜抑制效果(龋洞)[0173]对于生物膜诱导，培养以10％接种在bhi中的smu(5％co2培养箱，18小时)。将培养基离心(9,000rpm，5分钟，4℃)以固定细菌，在反应培养基(具有1％蔗糖的bhi)中以约1×106cfu/ml稀释并制备。为促进作为sem测量所需的预处理过程的金属涂覆，将盖玻片置于板孔上，从而进行测试以在盖玻片上诱导生物膜，并将稀释的smu接种在每个孔中以包括10％(v/v)的样品。每24小时将培养基更换为包括10％(v/v)样品的反应培养基，并在相应条件下诱导膜形成达3天(72小时)作为合适的生物膜形成日期。此后，洗涤用生物膜诱导的盖玻片以转移到新的板上，然后进行冷冻干燥过程以用于sem测量。[0174]结果，如下图9所示，证实了在用菌株id-a05衍生的培养上清液处理的盖玻片中生物膜形成的程度非常低，并且抗菌效果优异。[0175]工业实用性[0176]根据本发明，本发明中提供的包含枯草芽孢杆菌id-a05菌株、其培养基或培养上清液的组合物对龋洞和牙周疾病的致病菌表现出抗菌、抗炎和生物膜抑制效果，从而用于治疗或预防龋洞和牙周疾病或改善口臭，并且因此工业实用性非常优异。[0177]保藏号[0178]保藏机构名称：korea research institute of bioscience and biotechnology(kribb)[0179]保藏号：kctc14184bp[0180]保藏日期：20200511[0181]保藏机构名称：kribb，181，ipsin-gil，jeongeup-si，jeollabuk-do，korea(56212)[0182]关于在原始存托物的情况下国际承认用于专利程序国际表格接收的微生物存托的budapest条约[0183]根据规则7.1发布[0184]to.yoon，woong seop[0185]ildong pharmaceutical，2，baumoe-ro 27-gil，seocho-gu，seoul，korea[0186][0187]表bp/4[0188]单页[0189](经确认，与原文无差异。)[0190]代理人：专利代理人lee，hee sook，专利代理人kim，seok man









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