一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于环境微生物检测技术领域，具体涉及一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用。背景技术：2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。3.抗生素抗性基因(args)是一类新兴的环境污染物，对全球人类健康构成潜在威胁。施用畜禽粪肥和堆肥会使土壤中的args水平显著增高。牛粪及其堆肥常常作为改善农田土壤营养物质的肥料，其中可能含有大量的抗生素残留、args和可移动遗传元件(mges)，不仅导致施肥土壤中外源抗性基因的引入和增加其传播风险，还会使其通过抗生素选择性压力间接促进土著抗性菌的富集。4.施肥土壤中的args可能迁移进入蔬菜等农作物中，当人们食用未加工或简单加工的生菜、萝卜、黄瓜等蔬菜时，args可进一步通过食物链转移进人体，从而对人类健康构成潜在危害。一些粪肥来源的args可在农田土壤中存活较长的时间，且由于土壤微生物群落可作为植物微生物组的源，通过根际、叶际向植株内部组织迁移，因此施用畜禽粪肥/堆肥不仅可直接导致土壤抗性微生物的增加，还可能通过地下和地上的联系而导致地上部分可食植株中抗性微生物增加，进而对农产品安全和公众健康构成潜在威胁。技术实现要素：5.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法及其应用。本发明通过对不同施肥处理方式下农田生长的植株样品进行dna提取，并进行高通量定量pcr及高通量测序等，从而测定样品中args和细菌的多样性和相对丰度，进而分析潜在的耐药细菌及其在农田生态系统的传播途径，从而为科学施用粪肥和堆肥提供依据，因此具有良好的实际应用之价值。6.具体的，本发明涉及以下技术方案：7.本发明的第一个方面，提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法，所述方法包括：8.对不同施肥处理条件下农田生长获得的植株样品进行dna提取并进行检测分析，测定粪肥源耐药细菌以及它们携带的args和/或mges。9.其中，不同施肥处理包括不施用有机肥处理以及施用有机肥(所述有机肥优选为粪肥)处理；所述粪肥可以为经过堆肥处理和未经堆肥处理的猪粪肥、鸡粪肥和牛粪肥。10.所述植株可以为任意一种可以在农田中种植的植株，在本发明的一个具体实施方式中，所述植株为生菜。11.所述植株样品可以是植株的根部或叶部，从而获得根际、叶际和叶内相关微生物信息，进而用于检测分析args在土壤及植株中的传播。12.所述方法还包括：对有机肥进行dna提取并检测分析，测定其中的耐药细菌以及它们携带的args和/或mges；13.采用双边网络分析来获取施肥向植株中转移的抗性基因种类，对植株中粪肥来源的args和细菌属的相对丰度进行spearman相关性分析，筛选极显著相关(r》0.7,p《0.01)的细菌属，作为有机肥处理向植株中引入的潜在的耐药细菌种类。14.粪肥(包括牛粪和牛粪堆肥)源引入植株的耐药细菌包括但不限于euzebya、halomonas、luteimonas、nannocystis、haliangium、achromobacter、virgibacillus、caldilinea、glycomyces、thermobispora、saccharomonospora、thermobifida、actinomadur和glycomyces；携带的args是tnpa-04和/或sul2；15.更具体的，由牛粪堆肥引入到生菜中的耐药细菌属主要包括：携带aada-01的virgibacillus和achromobacter，携带blactx-m-02的planifilum、tepidimicrobium、desulfotomaculum和haliangium，以及携带tnpa-04的thermobifida、saccharomonospora、thermobispora、glycomyces、nannocystis、halomonas和luteimonas。16.本发明的第二个方面，提供上述检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法在农业管理中的应用。17.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：18.上述技术方案提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法，通过对不同施肥处理方式下农田生长的植株样品进行dna提取，并进行高通量定量pcr及高通量测序等，从而测定样品中args和细菌的多样性和相对丰度，分析由粪肥引入到施肥农田蔬菜中的潜在耐药细菌种类，在施用粪肥前和农业管理过程中，应采取有效措施减少或避免引入潜在的耐药细菌，以保护农产品安全和公众健康，因此具有良好的实际应用之价值。附图说明19.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。20.图1为本发明实施例1中双边网络分析揭示在牛粪、对照组生菜和施加牛粪处理的生菜中共有和特有的args的示意图，不同颜色的节点代表不同抗生素抗性类型的args，椭圆内的表示可能由牛粪转移进入生菜的args；21.图2为本发明实施例1中双边网络分析揭示在牛粪堆肥、对照组生菜和施加牛粪堆肥处理的生菜中共有和特有的args的示意图，不同颜色的节点代表不同抗生素抗性类型的args，椭圆内的表示可能由牛粪堆肥转移进入生菜的args；22.图3为本发明实施例1中双边网络分析展示来源于牛粪(a)和牛粪堆肥(b)的args与细菌属的spearman相关示意图，不同颜色的圆形节点代表不同抗生素抗性类型的args，不同颜色的方形节点代表不同属的细菌，节点大小与连接度成正比，边的宽度和相关系数成正比。具体实施方式23.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。24.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。25.结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。26.本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法，所述方法包括：27.对不同施肥处理条件下农田生长获得的植株样品进行dna提取并进行检测分析，测定粪肥源耐药细菌以及它们携带的args和/或mges。28.其中，不同施肥处理包括不施用有机肥处理以及施用有机肥(所述有机肥优选为粪肥)处理；所述粪肥可以为经过堆肥处理和未经堆肥处理的猪粪肥、鸡粪肥和牛粪肥；在本发明的一个具体实施方式中，所述粪肥包括直接风干粉碎的牛粪样品和牛粪堆肥样品。29.本发明的又一具体实施方式中，所述植株可以为任意一种可以在农田中种植的植株，在本发明的一个具体实施方式中，所述植株为生菜。30.所述植株样品可以是植株的根部或叶部，从而获得根际、叶际和叶内相关微生物信息，进而用于检测分析args在土壤及植株中的传播。31.本发明的又一具体实施方式中，所述方法还包括：对有机肥进行dna提取并检测分析，测定其中的耐药细菌以及它们携带的args和/或mges；32.本发明的又一具体实施方式中，为分析上述植株样品中不同部位和粪肥中的细菌群落特征，使用附有adapter和一个8-bp特异barcode序列的引物对341f：cctaygggrbgcascag(seq id no.1)和806r：ggactacnngggtatctaat(seq id no.2)对上述待测样品中的16s rrna基因的v3-v4区进行扩增。33.本发明的又一具体实施方式中，采用高通量定量pcr技术测定待测样品中args和mges的丰度和多样性；34.本发明的又一具体实施方式中，计算抗生素抗性基因(args)和可移动遗传元件(mges)的相对丰度可使用公式2-δct的方法进行；35.具体的，δct＝(ct目标args-ct16s rrna基因)。36.本发明的又一具体实施方式中，采用双边网络分析来获取施肥向植株中转移的抗性基因种类，对植株中粪肥来源的args和细菌属的相对丰度进行spearman相关性分析，筛选极显著相关(r》0.7,p《0.01)的细菌属，作为有机肥处理向植株中引入的潜在的耐药细菌种类。37.本发明的又一具体实施方式中，为了避免假阳性相关，在进行相关分析前，应只保留至少在一半的样品检出的args种类和细菌属。38.本发明的又一具体实施方式中，粪肥(包括牛粪和牛粪堆肥)源引入植株的耐药细菌包括但不限于euzebya、halomonas、luteimonas、nannocystis、haliangium、achromobacter、virgibacillus、caldilinea、glycomyces、thermobispora、saccharomonospora、thermobifida、actinomadur和glycomyces；携带的args是tnpa-04和/或sul2；39.本发明的又一具体实施方式中，由牛粪堆肥引入到生菜中的耐药细菌属主要包括：携带aada-01的virgibacillus和achromobacter，携带blactx-m-02的planifilum、tepidimicrobium、desulfotomaculum和haliangium，以及携带tnpa-04的thermobifida、saccharomonospora、thermobispora、glycomyces、nannocystis、halomonas和luteimonas。40.本发明的又一具体实施方式中，来自于牛粪的潜在耐药细菌属euzebya、haliangium、nannocystis、achromobacter、virgibacillus和thermobispora只在生菜根内检出，而在生菜叶内和叶际均未检出，表明这些细菌属是从土壤向生菜根内进行迁移的，且在生菜内的迁移能力有限；而牛粪来源的caldilinea属细菌可在生菜根内和叶内同时检出，表明其具有较强的迁移能力；牛粪来源的luteimonas、halomonas、glycomyces、saccharomonospora、thermobifida、georgenia和actinomadu属细菌可在生菜根内和叶际同时检出，表明这些潜在耐药菌除了可通过内部途径向生菜根内迁移外，还可通过气溶胶等外部途径向生菜叶际扩散；对于来源于牛粪堆肥的潜在耐药细菌属来说，desulfotomaculum、haliangium saccharomonospora、thermobispora和nannocystis只在生菜根内检出，表明其可通过施肥土壤向生菜根内迁移，且在生菜内部的迁移能力有限；而virgibacillus、achromobacter、planifilum、tepidimicrobium、thermobifida、glycomyces、halomonas和luteimonas可在生菜根内和叶际同时检出，表明这些潜在耐药细菌属可通过内部和外部途径同时向生菜迁移扩散。41.本发明的又一具体实施方式中，提供上述检测粪肥源耐药细菌在农田植株中传播的方法在农业管理中的应用。通过分析由粪肥引入到施肥农田蔬菜中的潜在耐药细菌种类，在施用粪肥前和农业管理过程中，应采取有效措施减少或避免引入潜在的耐药细菌，以保护农产品安全和公众健康。42.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。43.实施例144.本实施例提供了一种可检测粪肥中耐药细菌在农田植株中传播的方法。选择近十年没有施用有机肥历史的农田作为实验田，并设置三种处理：不施有机肥的对照处理，施用量为40t·ha-1的牛粪处理，施用量为40t·ha-1的牛粪堆肥处理。将在温室营养基质中培养了3周的生菜苗，按株距20cm，行距25cm种植在每一个地块上，移植后的第35天(生菜成熟期)进行取样。取样方法如下：随机选取5株长势一致的生菜植株，将生菜的地上和地下部分用乙醇消毒的剪刀分开，分别放入无菌的取样袋中，然后将收集的样品放置在冰上运回实验室，并将其放置在4℃冰箱中，用于提取生菜dna。45.将生菜根和叶样品在30％双氧水中浸泡30min，然后用无菌水清洗3次，再用70％的乙醇浸泡1min，之后再用无菌水清洗3次，用灭菌的滤纸吸干生菜根和叶上残留的水分。为证明生菜根和叶样品表面微生物已被完全去除，取最后一次冲洗液0.1ml，接种在tsb培养基中，置于转速为180rmp的摇床中在37℃条件下培养7天，培养液未出现浑浊，表明生菜根和叶表面微生物已被完全洗去。将预处理得到的生菜根和叶样品通过液氮冷冻多次研磨至粉状，取0.3g研磨的样品按照试剂盒制造商的说明，使用mobio powersoil dna提取试剂盒提取生菜根内和叶内dna。另取5.0g生菜叶，置于50ml离心管中，加入45ml灭菌的0.01m的磷酸盐缓冲液，30℃下200rmp震荡2h。之后用灭菌的纱布过滤除去植物组织，进一步将滤液全部用0.22μm的滤膜过滤，最后用灭菌的剪刀将滤膜剪碎后用mobio powersoil dna提取试剂盒提取生菜叶际dna。同时取0.1g风干粉碎的牛粪和牛粪堆肥样品，采取同一试剂盒按照其说明提取粪肥dna。46.为分析生菜样品不同部位和粪肥中的细菌群落结构特征，使用附有adapter和一个8-bp特异barcode序列的引物对341f：cctaygggrbgcascag和806r：ggactacnngggtatctaat对不同处理中的生菜根内、叶内和叶际以及牛粪和牛粪堆肥中的16s rrna基因的v3-v4区进行扩增。30μl的pcr混合液包含了15μl的高保真2×pcr master mix，0.2μm的正向和反向引物，约10ng的模板dna和无菌水。pcr热循环条件为：95℃下初始变性5min，然后进行30个循环的95℃下变性10s，50℃下退火30s，72℃下延伸30s，最后在72℃下再延伸5min。带有标记的pcr扩增产物用琼脂糖凝胶和genejettm凝胶回收试剂盒进行纯化，通过ion s5tm xl平台进行测序，原始的和单端的序列使用cutadapt过滤掉adapter和barcode序列后，用flash软件对有重叠序列的reads进行拼接，使用qiime将拼接序列中含n和低质量碱基较多的序列去除，使用uparse在碱基错配率≤3％的条件下对获得的高质量序列鉴定其可操作分类单元(otus)。在下游分析之前从每个样品中随机选择相同的测序数(28086reads)，以消除测序深度变化引起的差异。根据silva数据库基于“mothur algorithm”对每一个代表性otus序列进行分类学注释。得到样品中细菌群落在门、纲、目、科和属水平下的种类组成信息。47.采用高通量定量pcr技术测定样品中args和mges的丰度和多样性，该方法共有296对引物，其中包括了扩增args的285个引物对、扩增mges的10个引物对和扩增细菌16s rrna基因的1个引物对。285种args涵盖了目前所有常见的抗性基因类型，包括aminoglycoside(氨基糖苷)、β-lactamase(β-内酰胺)、fca(氟喹诺酮、喹诺酮、氟苯尼考、氯霉素和胺酰醇)、mlsb(大环内酯物-林肯(酰)胺-链霉杀阳菌素b类)、multidrug(多耐药性)、tetracycline(四环素)、vancomycin(万古霉素)和other(其它)抗性类型。10种mges基因包括2种整合酶基因和8种转座酶基因。48.将预制的pcr混合物装载到含有5184个纳米孔的芯片，使用wafergen smartchip real-time pcr系统执行高通量定量pcr。热循环程序的步骤是：先在95℃下活化10min，然后进行40个循环的95℃下变性30s，60℃下退火延伸30s。以ct＝31作为qpcr循环次数的检出限，并保留单一峰熔解曲线和扩增效率在90％-110％的试样孔。在三个重复样品中至少两个重复高于检出限的args才被视为阳性检测。用公式2-δct的方法计算args和mges的相对丰度，其中δct＝(ct目标args-ct16s rrna基因)。49.通过分析不同样品类型之间所共有和特有的args，被认为是一种可以研究抗性基因转移和扩散的有效方法。本研究使用双边网络分析来推断施肥向生菜中可能转移的抗性基因种类，一些特有的抗性基因只能在粪肥或施用粪肥农田种植的生菜中被检测，而对照处理的生菜样品中则不存在，因此推断这些抗性基因可能来自于农田施用的牛粪或者堆肥。同样地，一些特有的细菌属只能在粪肥或施用粪肥农田种植的生菜中被检测，而对照处理的生菜样品中则不存在，因此可以推断这些属的细菌可能来自于施用的牛粪或者堆肥。对生菜中粪肥来源的args和细菌属的相对丰度进行spearman相关性分析，筛选极显著相关(r》0.7,p《0.01)的细菌属，可作为牛粪或堆肥向生菜中引入的潜在的耐药细菌种类。为了避免假阳性相关，在进行相关分析前，应只保留至少在一半的样品检出的args种类和细菌属。50.通过以上分析，发现17种args可在牛粪和施加牛粪的农田生菜中同时被检出，而在对照组生菜中未检出，表明这些抗性基因可能是由牛粪引入到生菜中的args类型，如图1所示。类似地，23种args在堆肥和施加堆肥的生菜中同时被检出，而在对照组生菜中未检出，表明这些抗性基因可能是由牛粪堆肥引入到生菜中的args类型，如图2所示。51.采用同样的分析方法，发现牛粪或牛粪堆肥均可向生菜中引入53个属的细菌。进一步将这些细菌属分别与相同粪肥来源的args进行spearman相关性分析，发现euzebya、halomonas、luteimonas、nannocystis、haliangium、achromobacter、virgibacillus、caldilinea、glycomyces、thermobispora、saccharomonospora、thermobifida、actinomadur和glycomyces是由牛粪引入到生菜中的潜在耐药细菌属，这些细菌携带的args是tnpa-04和/或sul2(图3a)。可能由牛粪堆肥引入到生菜中的耐药细菌属主要包括：可能携带aada-01的virgibacillus和achromobacter，可能携带blactx-m-02的planifilum、tepidimicrobium、desulfotomaculum和haliangium，以及可能携带tnpa-04的thermobifida、saccharomonospora、thermobispora、glycomyces、nannocystis、halomonas和luteimonas(图3b)。52.通过分析粪肥源耐药细菌在土壤和蔬菜不同部位的分布情况，可进一步揭示施肥农田系统中粪肥源耐药细菌向蔬菜中传播的潜在途径。本研究发现在施用牛粪或牛粪堆肥的农田生菜中检出的潜在耐药细菌属全部能够在施肥土壤中检出，表明这些粪肥源耐药细菌可定殖于土壤中，并可能在蔬菜的生长过程中进一步向蔬菜扩散迁移。其中来自于牛粪的潜在耐药细菌属euzebya、haliangium、nannocystis、achromobacter、virgibacillus和thermobispora只在生菜根内检出，而在生菜叶内和叶际均未检出，表明这些细菌属是从土壤向生菜根内进行迁移的，且在生菜内的迁移能力有限；而牛粪来源的caldilinea属细菌可在生菜根内和叶内同时检出，表明其具有较强的迁移能力；牛粪来源的luteimonas、halomonas、glycomyces、saccharomonospora、thermobifida、georgenia和actinomadu属细菌可在生菜根内和叶际同时检出，表明这些潜在耐药菌除了可通过内部途径向生菜根内迁移外，还可通过气溶胶等外部途径向生菜叶际扩散。对于来源于牛粪堆肥的潜在耐药细菌属来说，desulfotomaculum、haliangium saccharomonospora、thermobispora和nannocystis只在生菜根内检出，表明其可通过施肥土壤向生菜根内迁移，且在生菜内部的迁移能力有限；而virgibacillus、achromobacter、planifilum、tepidimicrobium、thermobifida、glycomyces、halomonas和luteimonas可在生菜根内和叶际同时检出，表明这些潜在耐药细菌属可通过内部和外部途径同时向生菜迁移扩散。53.综上，分析由粪肥引入到施肥农田蔬菜中的潜在耐药细菌种类，在施用粪肥前和农业管理过程中，应采取有效措施减少或避免引入潜在的耐药细菌，以保护农产品安全和公众健康。54.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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