一种细胞穿透肽及其应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种细胞穿透肽及其应用。背景技术：2.细胞质膜是阻止细胞摄取非主动运输的大多数分子的有效屏障，因此也妨碍治疗性物质的递送。除具有特性分子量、极性和/或静电荷的分子能(被动)扩散通过细胞膜，其他分子都必须通过受体介导或结合atp的转运分子主动转运。此外，电穿孔、阳离子脂质/脂质体、显微注射、病毒递送或聚合物包封等手段可人为迫使分子穿过细胞膜。但这些方法仅限于体外使用，不能成为将药物递送至细胞来预防或治疗医学疾病的工具。3.细胞穿透肽(cell-penetratinig peptide，cpp)也称为膜异位序列，用于克服质膜的不通透性，穿越细胞膜并进入细胞内部。cpp是非常有用的介质，可以将“货物”(如具有非常有限的活性期蛋白质、寡核苷酸、肽、核酸和其他药理活性化合物等)迁移至细胞中，由此实现期望的目的。另一方面，cpp具有可以以重组形式或与对象混合的形式将对象转染至细胞中的优点。因此，cpp为不可通过细胞质膜的分子提供了一个可行的方法。4.许多cpp对所应用的细胞具有严重副作用，因为实际上大部分衍生cpp的大多数蛋白质可作为抗微生物物质或发挥毒素的作用。例如，cpp可以导致由膜破裂引起的细胞质泄露，且还可以干扰膜蛋白质正常发挥功能。cpp还可以显示细胞毒性作用；许多cpp仅在体内环境中不能满足的某些非常特异的条件下发挥它们的功能。另一缺点是，cpp可以在细胞中快速降解。最后，由于许多已知的cpp衍生自非人蛋白质，常观察到毒性和/或免疫原性作用，其可以干扰这些肽的利用，例如在人类中用于治疗应用。5.因此，确保cpp具有与本领域公认的细胞穿透肽相比优异的细胞穿透率和细胞通透性、作为融合蛋白的适用性、以及没有免疫原性效应的专属技术优势是非常重要的。本发明在人体本身具有细胞穿孔作用的gasdermin家族蛋白中，筛选出四条具有细胞穿膜功能的多肽，其中gasderminc的穿膜功能段经优化截短后获得一条只有30个氨基酸的短肽gcp(gasderminc cell-penetratinig peptide，gcp)，它比本领域公认的细胞穿透肽h16相比具有更优异的细胞穿透率和细胞通透性；能与绿色荧光蛋白(egfp)融合表达并将不能独立渗透细胞膜的egfp内化进入细胞；且没有细胞毒性；最重要的是该cpp来源于人体自身蛋白质，不存在免疫原性，可用于人体成像或治疗。技术实现要素：6.本发明第一方面的目的，在于提供一种细胞穿透肽。7.本发明第二方面的目的，在于提供一种复合物。8.本发明第三方面的目的，在于上述穿透肽或复合物的相关生物材料。9.本发明第四方面的目的，在于提供上述复合物的制备方法。10.本发明第五方面的目的，在于提供上述穿透肽或复合物的应用。11.本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。12.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：13.本发明的第一个方面，提供一种细胞穿透肽gcp，其氨基酸序列为：14.a)seq id no.1、seq id no.14、seq id no.16、seq id no.18、seq id no.20、seq id no.22、seq id no.24、seq id no.26、seq id no.28任一项所示；或15.b)a)所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。16.所述的细胞穿透肽为介导递送生物活性分子进入细胞的肽。17.优选地，所述细胞穿膜肽gcp的氨基酸序列如seq id no.1所示。18.本发明的第二个方面，提供一种复合物，其包含：本发明第一方面所述的细胞穿透肽；和货物分子。19.优选地，所述货物分子融合在所述细胞穿透肽的n-末端或c-末端处。20.优选地，所述货物分子选自具有药物活性的分子、具有标记作用的分子、具有靶向作用的分子中的至少一种。21.优选地，所述具有药物活性的分子包括多肽、蛋白质、核酸、化合物的至少一种。22.优选地，所述具有标记作用的分子包括标签蛋白、核素或放射试剂中的至少一种。23.优选地，所述具有靶向作用的分子例如为cd34、cd56、cd3、表皮生长因子受体her和血管内皮生长因子受体vegfr等特异性结合的多肽或抗体。24.优选地，所述标签蛋白包括sumo、his6、mbp、flag、ha、荧光试剂等。25.优选地，所述荧光试剂包括egfp、ecfp、eyfp、mcherry、荧光染料、cy3、cy5等。26.优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白egfp，其氨基酸序列为：27.a)msrvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.2)；或28.b)seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。29.优选地，所述重组药物递送系统为gcp-egfp，其氨基酸序列为：30.a)seq id no.3、seq id no.13、seq id no.15、seq id no.17、seq id no.19、seq id no.21、seq id no.23、seq id no.25、seq id no.27任一项所示；31.b)a)所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。32.优选地，所述具有药物活性的分子包括gsdme，所述重组药物递送系统2为trap2，其氨基酸序列为：33.a)a)(seq id no.4)(其中，下方单下划线为sumo标签序列，着重点为穿透肽gcp的氨基酸序列；双下划线为gsdme的氨基酸序列)；或34.b)seq id no.4所示的半胱氨酸突变为丙氨酸或其它氨基酸后且功能相同或相似的氨基酸序列；或35.c)seq id no.4所示的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase3)识别的dmpdaah氨基酸序列突变为基质金属蛋白酶(mmps)识别的氨基酸序列；或36.d)seq id no.4所示的助溶蛋白sumo突变为其它非人源性同源蛋白质和/或其它亲水性蛋白质；或37.e)seq id no.4所示融合蛋白中各蛋白元件位置顺序的调整。38.本发明的第三个方面，提供蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料为下述(b1)～(b8)中的任一种：39.(b1)编码本发明第一方面所述穿透肽或本发明第二方面所述复合物的核酸分子；40.(b2)含有(b1)所述核酸分子的表达盒；41.(b3)含有(b1)所述核酸分子的重组载体；42.(b4)含有(b2)所述表达盒的重组载体；43.(b5)含有(b1)所述核酸分子的重组微生物；44.(b6)含有(b2)所述表达盒的重组微生物；45.(b7)含有(b3)所述重组载体的重组微生物；46.(b8)含有(b4)所述重组载体的重组微生物。47.优选地，所述微生物包括原核细胞和真核细胞。48.本发明的第四个方面，提供本发明的第一方面所述穿透肽或第二方面所述复合物的制备方法，培养本发明的第三方面的宿主细胞，得到穿透肽或复合物。49.本发明的第五个方面，提供本发明第一方面所述穿透肽或本发明第二方面所述的复合物或本发明第三方面所述的相关生物材料在制备产品中的应用。50.优选地，所述产品的功能为(1)～(5)中至少一种：51.(1)肿瘤靶向性；52.(2)诱导细胞焦亡；53.(3)药物递送；54.(4)肿瘤体内成像；55.(5)防治肿瘤。56.优选地，所述肿瘤为结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、腹膜癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、脑转移瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤、骨髓瘤和头颈癌中的至少一种。57.本发明的第六个方面，提供一种产品，包含本发明第一方面的穿透肽或本发明第二方面所述的复合物或本发明第三方面所述的生物相关材料。58.优选地，所述产品为药物。59.优选地，所述药物还可包含药学上可接受的辅料。60.本发明的有益效果是：61.本发明提供了一种在人体蛋白质中发现的细胞穿透肽，该细胞穿透肽是从人体本身具有细胞穿孔作用的gasdermin家族蛋白中筛选而来，针对以往细胞穿透肽在人体中使用具有免疫原性效应的问题，寻找了具有细胞穿透性的人体自身蛋白多肽，其中gasderminc的穿膜功能段经优化截短后获得的一条只有30个氨基酸的短肽gcp(gasderminc cell-penetratinig peptide，gcp)，它比本领域公认的细胞穿透肽h16相比具有更优异的细胞穿透率和细胞通透性；能与绿色荧光蛋白(egfp)融合表达并将不能独立渗透细胞膜的egfp内化进入细胞；且没有细胞毒性；最重要的是该cpp来源于人体自身蛋白质，不存在免疫原性，可用于人体成像或治疗，扩大了现有细胞穿透肽的适用范围，可将药物高效递送到细胞但不产生显著的细胞毒性和/或免疫原性效应，为药物递送提供了新的思路，在肿瘤等疾病的发现和治疗中具有重要意义。62.本发明还发现细胞穿膜肽gcp也能融合助溶蛋白元件sumo以及细胞焦亡元件gsdme，本发明首次针对激活抗肿瘤免疫蛋白gsdme设计构建了具有肿瘤细胞穿透性以及肿瘤环境特异性激活的融合蛋白，为抗癌靶向药的开发提供了新的思路；该融合蛋白相较于寻找并使用小分子激活gsdme的技术，本发明提供的融合蛋白合成简单、原核或真核表达使生产方便、作用效率高，更易于大规模生产和商业化应用。附图说明63.图1是筛选的穿膜肽融合egfp后的蛋白纯化结果图。64.图2是计算机筛选的gasdermin蛋白家族具有穿膜功能的肽段细胞穿透率结果图：其中，图2中a是a-egfp、e-egfp、c1-egfp、c2-egfp与h16-egfp分子相比，荧光率在胰腺癌细胞sw1990中的荧光显微镜观察结果图；图2中b是a-egfp、e-egfp、c1-egfp、c2-egfp与h16-egfp分子相比，荧光强度在胰腺癌细胞sw1990中的流式细胞术检测结果图；图2中c是a-egfp、e-egfp、c1-egfp、c2-egfp与h16-egfp分子相比，荧光率在鼻咽癌细胞sune2中的荧光显微镜观察结果图；图2中d是a-egfp、e-egfp、c1-egfp、c2-egfp与h16-egfp分子相比，荧光强度在鼻咽癌细胞sune2中的流式细胞术检测结果图。65.图3是c2穿透肽截短优化后的序列。66.图4是c2穿透肽截短后连接egfp蛋白纯化结果图。67.图5是c2穿透肽截短后连接egfp蛋白的细胞内化流式结果图：其中，图5中a是c2截短肽与egfp蛋白融合后的分子在非小细胞肺癌h358细胞中的流式细胞术检测荧光强度结果图；图5中b是c2截短肽与egfp蛋白融合后的分子在结肠癌rko细胞中的流式细胞术检测荧光强度结果图；图5中c是c2截短肽与egfp蛋白融合后的分子在正常人肾上皮hek-293t细胞中的流式细胞术检测荧光强度结果图。68.图6是gcp穿透肽连接egfp蛋白在肝癌细胞hepg2、结直肠癌细胞hct116中的细胞毒性检测结果图。69.图7是gcp-egfp蛋白在小鼠皮下肿瘤原位注射活体成像结果图。70.图8是trap2系统的构建示意图和诱导细胞焦亡的过程示意图。71.图9是gcp-gsdme mmp11 c-a-sumo蛋白纯化效果图，方框内条带是目的蛋白条带。72.图10是gcp-gsdme mmp11 c-a-sumo诱导hepg2和hct116细胞焦亡的效果图，白色箭头所指为焦亡细胞。具体实施方式73.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。74.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。75.实施例1gcp-egfp穿膜效果验证76.本实例以构建重组的细胞穿膜肽-绿色荧光蛋白egfp系统进行细胞穿膜和药物递送为例，并证实本发明的技术方案对的可行性以及优势。egfp蛋白是不能主动穿透细胞膜进入细胞内的蛋白且具有荧光，因此通过观察细胞内荧光的数量和强度可评价穿膜肽的作用。然而，穿膜肽一般具有细胞毒性和免疫原性，至今没有被批准用于临床治疗的细胞穿膜肽。77.一、cpp的筛选和优化78.1.人gasdermin家族蛋白穿膜序列的筛选79.本实施例前期使用计算机模拟软件，根据序列长度、净电荷、平均疏水性和穿膜肽的其他物理化学性质的算法，计算出四条来源于gasdermin家族蛋白、可能具有细胞穿膜功能的多肽，序列如表1所示。[0080][0081]2.seq id no.14序列优化[0082]将seq id no.14氨基酸序列以每次截短3个氨基酸的顺序，从n端开始，一共截短四次；c端也按每次截短3个氨基酸的顺序，一共截短四次，共获得8个截短序列，如图3所示。[0083]二、融合蛋白cpp-egfp的制备[0084]1.构建cpp-egfp表达载体[0085]合成含有上述筛选及优化的cpp和egfp等分子元件的dna序列并克隆到原核表达载体pet28a(质粒由江苏赛索飞生物科技有限公司合成构建)。将合成的pet28a-cpp-egfp质粒转化至e.coli bl(rosetta)感受态细胞，经卡纳抗性平板筛选阳性重组子，对其进行菌落pcr验证及dna测序验证，经ncbi blast比对分析测序结果。质粒置于-20℃长期保存，将测序正确的菌株加入25％甘油保存于-80℃。载体pet28a带有6*his标签，可用于his蛋白的表达纯化。[0086]2.cpp-egfp系统的表达纯化[0087](1)cpp-egfp均采用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导表达，分别使用不同的iptg浓度、作用温度和作用时间进行诱导表达条件的摸索。随后使用sds-page和考马斯亮蓝实验确定最佳表达条件。[0088]本实施例中将测序正确的cpp-egfp接种于含有卡那抗性(50ng/μl)的tb培养基中，37℃振荡培养过夜。次日将活化的菌种按1:100比例将菌液分别接入新鲜培养基扩大培养，在37℃以150rpm振荡培养至od600＝0.6时，将温度降低为18℃，继续培养1小时，然后加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，iptg终浓度为0.5mm，同样的条件继续诱导表达18h左右收集菌体，6000rpm于4℃离心10min，1×pbs缓冲液重悬菌体并再次离心收集菌体。将收集到的菌体再次用1×pbs缓冲液重悬至10％的菌液，使用高压破碎仪，700pa，4℃破碎2min。于4℃以20000rpm离心1h，弃沉淀，0.22mm孔径滤膜过滤上清，上清用于后续的纯化。[0089](2)cpp-egfp的纯化：将上述得到的上清与ni-nta琼脂糖凝胶重悬后4℃孵育2h(按照5g的菌体：1ml 50％ni-nta琼脂糖凝胶进行孵育)。ni-nta琼脂糖凝胶在孵育过程中颜色由蓝色变为棕色，过柱，收集20μl过柱液用于后续纯化效果验证。用含有30mm咪唑的1×pbs缓冲液洗涤3次，每次2倍柱体积。收集最后一次洗涤液20μl。接着用含有500mm咪唑的1xpbs缓冲液进行洗脱，若ni-nta琼脂糖凝胶重新变为蓝色，则说明基本洗脱完全。取20ul洗脱液留样，将纯化过程中留取的样品用10％sds-page检测融合蛋白的纯化效率。用10kd超滤管(millipore,货号：ufc900396)进行融合蛋白浓缩，3900g离心，4℃超滤至500μl，之后使用1×pbs冲洗浓缩液三次，并重复离心三次。获得的浓缩蛋白使用bca蛋白浓度检测试剂盒(thermo fisher，货号：23227)测得浓度并放置在-80℃保存。[0090]cpp-egfp的纯化效果如图1和图4所示，纯度均达到了90％以上，可以用于接下来的实验验证。[0091]egfp分子的氨基酸序列为：msrvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsge gegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.2)。[0092]h16-egfp分子的氨基酸序列为：hhhhhhhhhhhhhhhhmsrvskgeelftgv vpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.5)(其中，下划线为本领域公认的细胞穿膜肽h16的氨基酸序列，seq id no.6)。[0093]a-egfp分子的氨基酸序列为：fkrfhpfclvlrkrkstlfwgaryvrtmsrvskg eelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.7)(其中，下划线为gasdermina穿膜肽的氨基酸序列，seq id no.8)。[0094]e-egfp分子的氨基酸序列为：klqllslvtkkkrfwcwqrpkyqflsltlmsrvs kgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.9)(其中，下划线为gasdermine穿膜肽的氨基酸序列，seq id no.10)。[0095]c1-egfp分子的氨基酸序列为：pvkyllsatklrqfvilrkkkmsrvskgeelft gvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.11)(其中，下划线为gasderminc穿膜肽1的氨基酸序列，seq id no.12)。[0096]c2-egfp分子的氨基酸序列为：lrvkkkaltlqkgmvmaykrkqlvikekailis msrvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.13)(其中，下划线为gasderminc穿膜肽2的氨基酸序列，seq id no.14)。[0097]c2-2-egfp(即gcp-egfp)分子的氨基酸序列为：kkkaltlqkgmvmaykrk qlvikekailismsrvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.3)(其中，下划线为seq id no.14的截短肽gcp的氨基酸序列，seq id no.1)。[0098]c2-3-egfp分子的氨基酸序列为：altlqkgmvmaykrkqlvikekailismsrvs kgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.15)(其中，下划线为seq id no.14的截短肽3的氨基酸序列，seq id no.16)。[0099]c2-4-egfp分子的氨基酸序列为：lqkgmvmaykrkqlvikekailismsrvskge elftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.17)(其中，下划线为seq id no.4的截短肽14的氨基酸序列，seq id no.18)。[0100]c2-5-egfp分子的氨基酸序列为：gmvmaykrkqlvikekailismsrvskgeelf tgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.19)(其中，下划线为seq id no.14的截短肽5的氨基酸序列，seq id no.20)。[0101]c2-6-egfp分子的氨基酸序列为：lrvkkkaltlqkgmvmaykrkqlvikekai msrvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.21)(其中，下划线为seq id no.14的截短肽6的氨基酸序列，seq id no.22)。[0102]c2-7-egfp分子的氨基酸序列为：lrvkkkaltlqkgmvmaykrkqlvikemsr vskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.23)(其中，下划线为seq id no.14的截短肽7的氨基酸序列，seq id no.24)。[0103]c2-8-egfp分子的氨基酸序列为：lrvkkkaltlqkgmvmaykrkqlvmsrvsk geelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.25)(其中，下划线为seq id no.14的截短肽8的氨基酸序列，seq id no.26)。[0104]c2-9-egfp分子的氨基酸序列为：lrvkkkaltlqkgmvmaykrkmsrvskgee lftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk(seq id no.27)(其中，下划线为seq id no.14的截短肽9的氨基酸序列，seq id no.28)。[0105]三、cpp-egfp蛋白的穿膜功能验证[0106]本实施例首先比较计算机筛选出的来源于gasdermina、gasdermine、gasderminc的四条穿膜功能肽与本领域公认的h16穿膜肽的穿膜能力；选出比h16穿膜功能更强的穿膜肽再进行截短优化。体外使用纯化融合egfp的蛋白进行细胞实验，使用荧光显微镜和流式细胞术检测穿膜肽的穿膜功能。[0107]1.a-egfp、e-egfp、c1-egfp、c2-egfp与h16-egfp分子穿膜能力比较[0108](1)细胞来源和培养：人胰腺癌细胞sw1990来自美国模式培养物集存库(atcc)，货号为crl-2172；人鼻咽癌细胞sune2申请人团队实验室自行构建(doi:10.5732/cjc.011.10317)。以上细胞系均培养在含10％胎牛血清(invitrogen)dmem培养基(gbico)中；培养条件为5％co2，37℃。[0109](2)将sw1990和sune2分别铺在96孔板中，每孔1万个细胞；各分为7组，实验组中分别往培养孔中加入10μm egfp、a-egfp、e-egfp、c1-egfp、c2-egfp与h16-egfp分子，对照组中用pbs代替以上分子作相同处理；混匀，37℃培养处理细胞4小时。[0110](3)pbs清洗细胞两次，每孔加入50μl pbs，置于incucyte中拍摄活细胞白光及绿色荧光照片。结果如图2a和2c所示，c2-egfp分子在两种细胞中含绿色荧光的细胞较h16-egfp分子多。[0111](4)除去pbs，每个孔加50μl 0.25％胰酶消化细胞使其脱落培养皿壁；随后用每孔100μl完全培养液终止消化，细胞悬液收集到1.5ml ep管中，200g转速常温离心3分钟，收集细胞并用1ml pbs重悬，重复离心1次。[0112](5)去除上清，细胞用500μl pbs重悬，流式细胞仪检测绿色荧光强度。结果如图2b和2d所示，c2-egfp分子在两种细胞中的绿色荧光强度较h16-egfp分子强；说明了c2穿透肽具有较h16强的细胞穿透能力。[0113]2.c2穿透肽的截短优化[0114](1)按照图3序列对c2穿透肽进行截短，并融合egfp蛋白纯化，纯化结果如图4所示，纯度均达到了90％以上，可以用于接下来的实验验证。[0115](2)细胞来源和培养：人非小细胞肺癌细胞h358、人结肠癌细胞rko、正常人肾上皮细胞hek-293t来自美国模式培养物集存库(atcc)(货号：crl-5807；crl-2577；crl-3216)。h358和rko均培养在1640培养基中；hek-293t细胞培养在dmem培养基中；所有细胞均加含10％胎牛血清(invitrogen)；培养条件为5％co2，37℃。[0116](3)将细胞分别铺在96孔板中，每孔1万个细胞；各分为11组，实验组中分别往培养孔中加入10μm c2-egfp、c2-2-egfp、c2-3-egfp、c2-4-egfp、c2-5-egfp、c2-6-egfp、c2-7-egfp、c2-8-egfp、c2-9-egfp与h16-egfp分子，对照组中用egfp代替以上分子作相同处理；混匀，37℃培养处理细胞4小时。[0117](4)pbs清洗细胞两次，除去pbs，每个孔加50μl 0.25％胰酶消化细胞使其脱落培养皿壁；随后用每孔100μl完全培养液终止消化，细胞悬液收集到1.5ml ep管中，200g转速常温离心3分钟，收集细胞并用1ml pbs重悬，重复离心1次。[0118](5)去除上清，细胞用500μl pbs重悬，流式细胞仪检测绿色荧光强度。结果如图5所示，c2-2-egfp分子在三种细胞中的绿色荧光强度较h16-egfp、c2-egfp分子强；说明了c2-2穿透肽具有较h16、c2更强的细胞穿透能力。将筛选出的具有最强细胞穿透能力的c2-2多肽命名为gcp穿透肽，并用于后续实验验证。[0119]四、融合蛋白gcp-egfp的细胞毒性验证[0120]许多cpp对所应用的细胞具有严重副作用，因为实际上大部分衍生cpp的大多数蛋白质可作为抗微生物物质或发挥毒素的作用。因此，使用cck-8实验证明gcp-egfp不具有细胞毒性。[0121]1.分别取对数生长期的结直肠癌细胞hct116和人肝癌细胞hepg2(来源于atcc，货号hb-8065)，以0.25％胰酶消化、计数、接种于96孔培养板，每种细胞分7组，每组4个副孔，每孔加入100μl的细胞悬液，浓度为1×104个/ml，同时，将96孔细胞培养板四周加入100μl磷酸盐缓冲液(pbs)防止细胞培养液挥发，37℃，5％ co2培养箱，培养12小时使其贴壁。[0122]2.经pbs漂洗3次后，更换含不同浓度的gcp-egfp(0μm、1μm、10μm、20μm、40μm、80μm、160μm)的培养基继续培养24小时(0μm浓度用等体积的pbs代替)，弃培养液，pbs洗3次，均匀加入100μl cck-8稀释液(cck-8：培养基＝1:10)，置于37℃，5％co2孵育2h后，应用酶联免疫检测仪，在450nm波长处测得相应od值。[0123]3.用graphpad prism8软件进行作图并统计分析。结果如图6所示，细胞增殖cck-8实验证实gcp-egfp对细胞的ic50＞160μm，可认为几乎没有细胞毒性。[0124]五、融合蛋白gcp-egfp的体内递送功能验证[0125]1.本实验使用的小鼠为balb/c裸鼠2只，雌性，4-5周龄，购自广东省实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心。[0126]2.使用胰酶消化处于对数期的hct116细胞，使用完全培养液终止消化后进行细胞计数。经计数，分别取1000万个hct116细胞，并使用pbs洗涤两次，每次洗涤完成后均使用200g离心力离心5分钟，收集细胞。[0127]3.配置细胞稀释缓冲液重悬细胞，缓冲液成分为pbs:基质胶(康宁公司)＝1：1。随后分别使用1毫升缓冲液重悬hct116细胞，置于冰上备用。[0128]4.进行皮下成瘤实验：在小鼠背部右侧皮下注射hct116细胞悬液100μl(50万个)，饲养一周后开始进行成像实验。[0129]5.gcp-egfp给药方式为肿瘤原位注射给药，给药体积为50μl(100μg)，注射一次，分别于注射后的0h、0.5h、5h和24h进行小鼠活体成像，观察小鼠体内gcp-egfp的分布。实验结果如图7所示，gcp-egfp在肿瘤中可持续发光至少24h，说明gcp可作为体内药物递送载体。[0130]实施例2trap2系统的构建及其效果验证[0131]本实例以设计构建的trap2系统诱导细胞焦亡为例，展示并证实本发明的技术方案的可行性以及优势。具有成孔效应的蛋白gsmde是抑癌基因，参与抗肿瘤免疫，因此设计穿膜肽将gsdme蛋白效应n端带入细胞内诱导细胞焦亡对肿瘤的临床治疗具有重要意义。然而，至今尚没有用于针对gsdme的临床治疗药物。[0132]一、融合蛋白trap2分子的制备[0133](一)trap2分子工具的设计和构建[0134]合成含有gcp细胞穿膜肽分子元件，sumo蛋白等助溶蛋白序列，酶切位点突变为mmps剪切位点且半胱氨酸突变为丙氨酸的gsdme的dna序列并克隆到原核表达载体pet28a(质粒由江苏赛索飞生物科技有限公司合成构建)。将合成的pet28a-sumo-gcp-gsdme mmp11 ca质粒转化至e.coli bl(rosetta)感受态细胞，经卡纳抗性平板筛选阳性重组子，对其进行菌落pcr验证及dna测序验证，经ncbi blast比对分析测序结果。质粒置于-20℃长期保存，将测序正确的菌株加入15％甘油保存于-80℃。载体pet28a带有6*his标签，可用于his蛋白的表达纯化。trap2分子的构建示意图和被剪切过程示意图如图8所示。[0135](二)trap2系统的表达纯化[0136]1.trap2采用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导表达，分别使用不同的iptg浓度、作用温度和作用时间进行诱导表达条件的摸索。随后使用sds-page和考马斯亮蓝实验确定最佳表达条件。本实施例中将测序正确的菌液接种于含有卡那抗性(50ng/μl)的tb培养基中，37℃振荡培养过夜。次日将活化的菌种按1:100比例将菌液分别接入新鲜培养基扩大培养，在37℃以180rpm振荡培养至od600＝0.6时，降温至18℃，加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，iptg终浓度为0.5mm，同样的条件继续诱导表达18h左右收集菌体，5000rpm于4℃离心30min，1×pbs缓冲液重悬菌体并再次离心收集菌体。将收集到的菌体再次用1×pbs缓冲液重悬至10％的菌液，用于液氮和37℃反复冻融3次，然后冰浴超声30min(5s开，5s关)至菌液完全破碎(或者直接使用高压破碎仪，900pa，4℃破碎3min)。于4℃以10000rpm离心1h，弃沉淀，0.22mm孔径滤膜过滤上清，上清用于后续的纯化。[0137]2.将上述得到的上清与ni-nta琼脂糖凝胶重悬后4℃孵育2h(按照5g的菌体：1ml 50％ ni-nta琼脂糖凝胶进行孵育)。ni-nta琼脂糖凝胶在孵育过程中颜色由蓝色变为棕色，1000g，4℃离心1min，取20ul上清用于后续纯化效果验证，弃去大部分上清仅保留少许用于重悬ni-nta琼脂糖凝胶，上柱，用含有20mm咪唑的1×pbs缓冲液洗涤3次，每次2倍柱体积。收集最后一次洗涤液20ul。接着用含有300mm咪唑的1xpbs缓冲液进行洗脱，若ni-nta琼脂糖凝胶重新变为蓝色，则说明基本洗脱完全。取20ul洗脱液留样，将纯化过程中留取的样品用10％ sds-page检测融合蛋白的纯化效率。洗脱液使用10000g离心力离心10min，上清用10kd超滤管(millipore,货号：ufc900396)进行融合蛋白浓缩，4500g离心，4℃超滤至500μl，之后使用1×pbs冲洗浓缩液三次，并重复离心三次。获得的浓缩蛋白使用bca蛋白浓度检测试剂盒(thermo fisher，货号：23227)测得浓度并放置在-80℃保存。[0138]trap2的纯化效果如图9所示，纯度达到了90％以上，可以用于接下来的实验验证。sumo-gcp-gsdme mmp11 ca分子的氨基酸序列为：[0139](seq id no.4)(其中，下方单下划线为sumo标签序列，着重点为穿透肽gcp的氨基酸序列；双下划线为gsdme的氨基酸序列)。[0140]二、trap2诱导肿瘤细胞焦亡的效果验证[0141]本实施例验证了trap2诱导肿瘤细胞焦亡的效果。[0142](1)提前将肝癌细胞hepg2和肠癌细胞hct116(来自美国模式培养物集存库(atcc)，货号：hb-8065，ccl-247)铺在96孔细胞培养皿中，并分别加入100μg/ml的sumo-gcp-gsdme mmp11 ca及其对照溶剂pbs。[0143]使用incucyte活细胞分析系统在37℃环境下培养处理细胞6小时，结果如图10所示，sumo-gcp-gsdme mmp11 ca具有靶向肿瘤细胞诱导焦亡的作用。[0144]以上数据表明，gasderminc的穿膜功能段经优化截短后获得的只有30个氨基酸的短肽gcp，比本领域公认的细胞穿透肽h16相比具有更优异的细胞穿透率和细胞通透性；能与绿色荧光蛋白(egfp)融合表达并将不能独立渗透细胞膜的egfp内化进入细胞；且没有细胞毒性；最重要的是该cpp来源于人体自身蛋白质，不存在免疫原性，可用于人体成像或治疗。这对细胞穿透肽在药物递送和活体成像的使用范围产生重大意义。[0145]上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!