发酵乳杆菌E1及其在制备预防或治疗肠道炎症药物中的应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术发酵乳杆菌e1及其在制备预防或治疗肠道炎症药物中的应用技术领域1.本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及发酵乳杆菌e1及其在制备预防或治疗肠道炎症药物中的应用。背景技术：2.肠炎是由于各种原因引起的肠道炎症反应，如肠道细菌、病毒等病原维生素感染或受到免疫损害、放射线损害、饮食刺激、药物刺激等因素。临床表现主要有发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、稀水便或黏液脓血便，部分患者还可有里急后重感。肠炎按发病原因不同，分为感染性和非感染性两类。按病程长短不同，分为急性肠炎和慢性肠炎两类。肠炎严重时可引起脱水和电解质紊乱，甚至威胁生命。3.肠炎传统的治疗方法可分为现代医学治疗和中药治疗方法。益生菌作为肠道内源性和免疫性防御屏障，能够拮抗致病菌，具有安全、可控、有效、副作用小的特点，是治疗肠炎的理想方法。当前国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国，而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。4.因此，提供发酵乳杆菌e1及其在制备预防或治疗肠道炎症药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：5.有鉴于此，本发明提供了发酵乳杆菌e1及其在制备预防或治疗肠道炎症药物中的应用。6.炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞(粒细胞、巨噬细胞)会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物，创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。用葡聚糖硫酸钠(dss)诱导斑马鱼肠道炎症，促使斑马鱼中性粒细胞发生免疫应答。7.采用转基因中性粒细胞荧光鱼(呈绿色)，可在荧光显微镜在观察到dss诱导斑马鱼肠道中性粒细胞数量比正常斑马鱼明显增加。8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：9.一株发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)e1，其保藏编号为cgmccno.21777，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月01日，分类命名为发酵乳杆菌lactobacillus fermentum。10.进一步，所述的发酵乳杆菌e1在制备预防或治疗肠道炎症药物中的应用。11.进一步，所述的发酵乳杆菌e1在制备抑制dss诱导中性粒细胞往斑马鱼肠道处聚集药物中的应用。12.进一步，所述发酵乳杆菌e1为菌悬液。13.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了发酵乳杆菌e1及其在制备预防或治疗肠道炎症药物中的应用，发酵乳杆菌e1是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，发酵乳杆菌e1能够抑制dss诱导中性粒细胞往斑马鱼肠道处聚集，此为利用发酵乳杆菌e1开发预防或治疗肠道炎症药物提供理论参考和指导依据。附图说明14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。15.图1附图为本发明发酵乳杆菌e1在mrs固体培养基上的菌落形态；16.图2附图为本发明发酵乳杆菌e1抑制dss诱导中性粒细胞往斑马鱼肠道聚集直观图；17.其中，a：正常组；b：模型组；c：阳性对照组；d：1×104cfu/ml发酵乳杆菌11739；e：1×105cfu/ml发酵乳杆菌11739；f：1×106cfu/ml发酵乳杆菌11739；g：1×104cfu/ml发酵乳杆菌e1；h：1×105cfu/ml发酵乳杆菌e1；i：1×106cfu/ml发酵乳杆菌e1；18.图3附图为本发明发酵乳杆菌e1抑制dss诱导中性粒细胞往斑马鱼肠道聚集统计图。具体实施方式19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。20.斑马鱼为tg(mpx：egfp)中心粒细胞绿色荧光斑马鱼和ab系斑马鱼。21.葡聚糖硫酸钠(dss)(medchemexpress)；美莎拉嗪(medchemexpress)；发酵乳杆菌11739(atcc 11739)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。22.实施例1发酵乳杆菌e1分离、鉴定及保藏23.(1)分离：24.1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管中，用1ml无菌枪头充分吹打混匀，备用。25.2)在6个无菌1.5ml离心管中各加入900μl的无菌生理盐水。26.3)从第1个装有10-1样品稀释液的离心管中，吸取100μl的液体加入第2个离心管(10-2)，稀释到10-2；27.4)从第2个装有10-2样品稀释液的离心管中，吸取100μl的液体加入第3个离心管(10-3)，稀释到10-3；28.5)重复上个步骤，一直稀释到10-4、10-5、10-6、10-7。29.6)从装有10-4样品稀释液的离心管中吸取100μl的样品稀释液分别接种于mrs固体培养基、bhi固体培养基上，将100μl的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。30.7)重复上个步骤，完成10-5、10-6、10-7稀释梯度的稀释涂布。31.8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。32.9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至mrs固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。33.10)将平板上的纯菌落接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。34.(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组dna，通过pcr技术利用16s rdna通用引物27f和1492r扩增16s rdna全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。35.其中，通用引物27f和1492r的引物序列如下：36.27f：5’‑agagtttgatcctggctcag-3’；seq id no.1；37.1492r：5’‑ggttaccttgttacgactt-3’；seq id no.2。38.实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16s rdna鉴定，其中菌株e1被鉴定为发酵乳杆菌，其16s rdna序列如seq id no.3所示。39.taccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgcaggcgagttgcagcctgcagtccgaactgagaacggttttaagagatttgcttgccctcgcgagttcgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatctgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaacttaatgctggcaactagtaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtcattgcgttcccgaaggaaacgccctatctctagggttggcgcaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctccggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagtctcagcgtcagttgcagaccaggtagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcattccaccgctacacatggagttccactaccctcttctgcactcaagttatccagtttccgatgcacttctccggttaagccgaaggctttcacatcagacttagaaaaccgcctgcactctctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttaaataccgtcaacgtatgaacagttactctcatacgtgttcttctttaacaacagagctttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggtgttgctccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtatgggccgtgtctcagtcccattgtggccgatcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaggccgttaccccaccaacaagctaatgcaccgcaggtccatccagaagtgatagcgagaagccatcttttaagcgttgttcatgcgaacaacgctgttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttgtcccccgcttctgggcaggttacctacgtgttactcacccgtccgccactcgttgg；seq id no.3。40.菌株e1单菌落接种到mrs固体培养基上，在37℃有氧条件下生长良好，菌落乳白色、边缘整齐，呈球形、表面光滑(图1)。菌株e1已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月01日，分类命名为发酵乳杆菌lactobacillusfermentum，保藏编号为cgmccno.21777。41.实施例2发酵乳杆菌e1菌悬液(菌体)的制备42.将发酵乳杆菌e1活化培养后接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经pbs两次洗涤后，将菌体用pbs重新悬浮，调整细胞浓度为1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml得到菌悬液(菌体)。43.实施例3发酵乳杆菌11739菌悬液(菌体)的制备44.将发酵乳杆菌11739活化培养后接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经pbs两次洗涤后，将菌体用pbs重新悬浮，调整细胞浓度为1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml得到菌悬液(菌体)。45.实施例4发酵乳杆菌e1对dss诱导中性粒细胞往斑马鱼肠道处聚集的影响46.挑选健康tg(mpx：egfp)斑马鱼(3dpf)置于6孔细胞培养板(涉及9组，采用两块6孔细胞培养板)中，每组1个孔，每孔15条(一个孔15条鱼，统计每条鱼的肠道处中性粒细胞数)，正常组加入5ml pbs，模型组、阳性对照组(美沙拉嗪)、发酵乳杆菌11739干预组(1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml)、发酵乳杆菌e1干预组(1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml)均加入5ml 0.5％dss溶液(w/w)，置于生化培养箱28℃孵育78h后，用pbs洗涤每组斑马鱼3遍，然后正常组和模型组加入5ml pbs；阳性对照组加入5ml 50μg/ml美沙拉嗪溶液；发酵乳杆菌11739干预组分别加入1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml发酵乳杆菌e1，每孔5ml；发酵乳杆菌11739干预组分别加入1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml发酵乳杆菌11739，每孔5ml，置于生化培养箱28℃继续孵育48h后，置于荧光显微镜下观察斑马鱼肠道处中性粒细胞聚集情况并拍照记录。47.采用spss 19.0软件统计处理数据，实验数据均用数据表示，用t-检验分析，与正常组相比：###p《0.005，与模型组相比：&&&p《0.001；用单因素方差分析，与模型组相比：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.005。48.发酵乳杆菌e1抑制dss诱导中性粒细胞往斑马鱼肠道处聚集的实验结果如图2和图3所示。49.由图2和图3可知，正常组的斑马鱼肠道处有少量中性粒细胞聚集(15.40±0.89个)，而模型组的斑马鱼肠道处有大量中性粒细胞聚集。同时模型组斑马鱼肠道处的中性粒细胞数为31.07±1.26个，与正常组(15.40±0.89个)相比较差异性显著(p《0.005)，说明本次dss诱导斑马鱼肠道炎症模型建立成功。50.由图2和图3可知，阳性对照组(美莎拉嗪)的斑马鱼肠道处仅有少量中性粒细胞聚集。同时阳性对照组(美莎拉嗪)斑马鱼肠道处的中性粒细胞数为18.13±0.86个，与模型组(31.07±1.26个)相比较差异性显著(p《0.005)。因此，美莎拉嗪具缓解肠道炎症的作用，与临床结果一致。发酵乳杆菌11739干预组(1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml)的斑马鱼肠道处有大量中性粒细胞聚集，与模型组相似。同时发酵乳杆菌11739浓度为1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml时，斑马鱼肠道处的中性粒细胞数分别为28.67±1.30个、29.46±1.42个、27.66±2.16个，与模型组(31.07±1.26个)相比均无显著性差异(p》0.05)。另外，发酵乳杆菌e1组的斑马鱼肠道处也仅有少量中性粒细胞聚集，与阳性对照组(美沙拉嗪)相似；同时发酵乳杆菌e1浓度为1×104cfu/ml、1×105cfu/ml和1×106cfu/ml时，斑马鱼肠道处的中性粒细胞数分别为25.67±1.55个、23.93±1.75个、19.20±1.24个，与模型组(31.07±1.26个)相比较差异性显著(p《0.05)。因此，上述结果表明，发酵乳杆菌e1能够抑制dss诱导中性粒细胞往斑马鱼肠道处聚集，表现出良好的缓解肠道炎症的潜能。51.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。









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