一种蜡样芽孢杆菌及其在降解油茶饼粕茶皂素中的应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及一种蜡样芽孢杆菌及其在降解油茶饼粕茶皂素中的应用， 属于微生物技术领域。背景技术：2.目前，关于微生物发酵油茶饼粕中茶皂素的研究已有很多，有细菌类 发酵，也有霉菌类发酵等。然而，细菌类发酵一般需要复合菌种发酵，其 复配工艺繁琐；霉菌类发酵的降解效果好但发酵时间过长。因此，急需开 发出一种发酵效率高、成本低的茶皂素发酵技术。技术实现要素：3.本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌及其在降解油茶饼粕茶皂素中的应 用，可以有效解决上述问题。4.本发明是这样实现的：5.一种蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)n-4，其保藏号为cctcc no：m2022624。6.一种上述蜡样芽孢杆菌在降解油茶饼粕茶皂素中的应用。7.上述蜡样芽孢杆菌在降解油茶饼粕茶皂素中的应用，包括以下步骤：8.s1，调节油茶饼粕含水量，灭菌，冷却至室温；9.s2，接种蜡样芽孢杆菌；10.s3，发酵一段时间后测定茶皂素降解率。11.在一些实施例中，所述含水量为100wt％-120wt％。12.在一些实施例中，所述接种的接种量为8wt％-12wt％。13.在一些实施例中，所述发酵条件为：温度31-33℃，时间为24-120h。14.本发明的有益效果是：15.本发明蜡样芽孢杆菌降解油茶饼粕茶皂素的降解率高，同时发酵效率 高，发酵时间短。16.本发明蜡样芽孢杆菌降解油茶饼粕茶皂素过程中，不需添加其他菌种 和物质，单菌发酵，避免了复合菌种发酵的繁琐复配工艺，条件易控制， 成本低。附图说明17.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中 所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的 某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员 来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关 的附图。18.图1是本发明实施例1提供的筛菌及应用过程图。19.图2是本发明实施例2提供的初始含水量(a)、发酵温度(b)、接种量 (c)、发酵时间(d)对茶皂素降解率的影响图。20.图3是本发明实施例2提供的各因素交互作用对茶皂素降解率影响的 响应面和等高线图。具体实施方式21.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合 本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全 部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范 围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在 限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基 于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提 下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。22.在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解 为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此， 限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特 征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具 体的限定。23.本发明提供一种蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)n-4，其保藏号为 cctcc no：m 2022624，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中 国武汉，邮编430072，保藏日期为2022年5月13日。该菌种为自然发酵 的油茶饼中分离出来。24.一种上述蜡样芽孢杆菌在降解油茶饼粕茶皂素中的应用。25.上述蜡样芽孢杆菌在降解油茶饼粕茶皂素中的应用，包括以下步骤：26.s1，调节油茶饼粕含水量，灭菌，冷却至室温；27.s2，接种蜡样芽孢杆菌；28.s3，发酵一段时间后测定茶皂素降解率。29.在一些实施例中，所述含水量为100wt％-120wt％，进一步优选为 109.9wt％。30.在一些实施例中，所述接种的接种量为8wt％-12wt％，进一步优选为 10wt％。31.在一些实施例中，所述发酵条件为：温度31-33℃，进一步优选为31.1℃； 时间为24-120h,进一步优选为48h。32.本发明实施例的蜡样芽孢杆菌降解油茶饼粕茶皂素的降解率高，同时 发酵效率高，发酵时间短，不需添加其他菌种和物质，单菌发酵，避免了 复合菌种发酵的繁琐复配工艺，条件易控制，成本低。33.实施例134.蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)n-4的具体筛菌过程：35.1.分离纯化：10g自然发酵的油茶饼加适量无菌水，于33℃、150r/min 振荡30min，静置备用。将此油茶饼菌悬液梯度稀释，然后取10-2～10-4稀 释度的菌悬液于lb、na及pda固体培养基上涂布，置33℃培养箱中培 养48h。分离挑选单菌落，在平板上进行4次划线纯化，进行编号，将其存 于固体培养基(斜面)中，倒30％甘油保存-20℃冰箱。36.2.初筛：从保藏的斜面上挑取一环接种于固体培养基进行活化，重复两 次，然后挑单个菌落于相应液体培养基上于33℃，150r/min震荡培养48h 作为种子液，最后用稀释涂布于添加10％茶皂素的平板上，33℃倒置培养 48h，进行菌落计数。菌落数为108～109cfu/ml时记为”+++”，菌落数为103～108cfu/ml时记为”++”，菌落数《105cfu/ml表示为”‑“，各菌株分别重复三 次，取平均值。取初筛时活菌数高于103cfu/ml的菌株进行复筛。37.3.复筛：将初筛得到的菌株在150r/min摇床的条件下培养48h得到种 子液，按10％的接种量接入含水量为80％的油茶饼粕中，33℃发酵48h， 结束后取出测定其茶皂素降解率，3个平行。根据各菌株对茶皂素不同的降 解能力，选择茶皂素降解率高的菌株n-4进行下一步实验。参照《伯杰细 菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，对菌种进行16srdna测序， 对菌种进行形态学观察以及生理和生化试验。16srdna的序列如seq idno:1所示。菌株经过革兰氏染色后呈蓝紫色及不规则长杆状，是革兰氏阳 性菌；其菌落大，表面粗糙不透明，扁平，不规则圆形。其生理生化特性 如表1所示。38.表1生理生化试验结果[0039][0040]将菌株n-4的16srdna测序结果录入ncbi数据库进行blast比较，构 建系统发育树，结合形态学观察以及生理和生化试验，n-4与蜡样芽孢杆菌 具有很高的相似性，鉴定为蜡样芽孢杆菌。该菌种命名为蜡样芽孢杆菌 (bacillus cereus)n-4，并进行保藏。[0041]实施例2[0042]利用实施例1分离筛选所得的n-4菌株对油茶饼粕中的茶皂素进行发 酵降解。[0043]菌种活化步骤为：菌株在33℃、ph＝3于营养琼脂培养基上活化，种子 液为33℃、150r/min的摇床中培养22h(由菌株的生长曲线确定)。[0044]通过选取可能对茶皂素降解率有影响的初始含水量、发酵温度、发酵 时间、接种量四个因素进行单因素实验；在单因素的结果基础下，保持节 约时间的理念，确定发酵时间48h，选用其他三个因素，将茶皂素降解率作 为响应值，进一步利用三因素三水平进行常用于优化微生物发酵的工艺参 数的box-behnken响应面设计。茶皂素提取采用密闭加热浸提法，含量测 定采用香草醛硫酸显色法。实验结果如图2和图3所示。[0045]在图2a中，发酵温度、发酵时间、接种量分别为33℃、48h、10wt％。[0046]在图2b中，初始含水量、发酵时间、接种量分别为110wt％、48h、10wt％。[0047]在图2c中，初始含水量、发酵温度、发酵时间分别为110wt％、31℃、 48h。[0048]在图2d中，初始含水量、发酵温度、接种量分别为110wt％、31℃、 10％。[0049]由图2和图3可知，在初始含水量为100wt％～120wt％，发酵温度为 31℃～33℃，接种量为8％～10％，发酵时间为24h～120h的范围之间时， 菌株n-4对茶皂素的降解率均在50％以上，可有效降解油茶饼中的茶皂素。 此时按照n-4菌株固态发酵降解饼粕中茶皂素的最佳工艺条件含水量 109.9wt％，温度31.1℃，接种量10.0％，发酵时间48.0h。在此最佳工艺条 件下，茶皂素降解率为36.04％。[0050]另外，通过design-expert13软件进行结果分析得到模型中最佳条件下 茶皂素降解率的最佳预测值34.31％。软件预测方法为：通过单因素试验选 择含水量、温度、接种量进行响应面，输入这三个参数会自动得到13组试 验的随机设计，按此进行发酵，然后得到13组茶皂素降解率数据，输入软 件，自动生成最优值。在此条件再去进行验证试验。[0051]实际值与预测值相差不大，吻合良好，说明响应面法优化降解油茶饼 中茶皂素的发酵工艺是可行的。此模型时间少效率高，稳定性强。[0052]实施例3[0053]对实施例2中最佳条件下的发酵产物进行基本成分的测定。灰分测定 参照gb 5009.4—2016；蛋白质测定参照gb 5009.5—2016；脂肪测定参照 gb 5009.6—2016；粗纤维测定参照gb/t 5009.10—2003；单宁测定参照 ny/t 1600-2008；还原糖测定参照3，5-二硝基水杨酸(dns)比色法。结 果如表2所示。[0054]表2油茶饼发酵前后基本成分的测定结果[0055][0056]由表2可知，对比发酵前后的物质变化，得到了蛋白质、总黄酮、总 必须氨基酸等均显著增加，茶皂素、单宁、总糖等均显著下降的结果。通 过电子舌和风味分析结果，证明了油茶饼粕经发酵后苦味、涩味会显著减 少；风味物质会产生明显差异，也新增了3,3-二甲基辛烷、丙位庚内酯等风 味物质。本研究在保证油茶饼粕兼具营养成分增加、有毒物质减少的特性 时，实现了油茶饼粕的高附加值利用，为后期的饲用价值提供了理论基础。[0057]以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对 于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。









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