一种Scalarane降二倍半萜类化合物及其提取方法与应用与流程

有机化合物处理,合成应用技术一种scalarane降二倍半萜类化合物及其提取方法与应用技术领域1.本发明属于海洋生物及医药技术领域，具体涉及一种从产自西沙群岛附近海域的海洋动物杯叶海绵phyllospongia foliascens中经提取、分离纯化得到的新型scalarane降二倍半萜类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。背景技术：2.海绵是一种低等的海洋底栖动物，在进化的过程中形成强大的化学防御体系，能够产生很多结构新颖并且具有强抗肿瘤活性的次级代谢产物，一直是海洋药物研究的热点对象。3.杯叶海绵phyllospongia foliascens产自西沙群岛附近海域，属寻常海绵纲(demospongiae)，网角海绵目(dictyoceratida)，角骨海绵科(spongiidae)动物。目前，文献报道从该属海绵中分离得到的次级代谢产物主要为scalarane二倍半萜类化合物，这些scalarane二倍半萜类化合物具有强大的抗肿瘤谱，显示了强烈的抗肿瘤活性，如从phyllospongia lamellose中分离得到的scalarane二倍半萜类化合物phyllospongin b对人乳腺癌细胞mcf-7、人结肠癌细胞hct-116、人肝癌细胞hepg2显示了较强的细胞毒活性，ic50值分别为4.40、1.21和2.71μm(参见文献：hassan m,rateb m e,hetta m,et al.scalarane sesterterpenes from the egyptian red sea sponge phyllospongia lamellosa.tetrahedron,2015,71(4):577-583.)。4.目前，文献报道的scalarane型二倍半萜类化合物都是6/6/6/6环骈合的母核结构，未见报道从该属海绵中分离得到具有抗肿瘤活性的罕见6/6/6/5环骈合scalarane型降二倍半萜类化合物。技术实现要素：5.本发明的第一个目的是提供一种scalarane降二倍半萜类化合物。6.本发明的第二个目的是提供一种所述scalarane降二倍半萜类化合物的提取方法。7.本发明的第三个目的是提供一种所述scalarane降二倍半萜类化合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：9.本发明的第一方面，提供了一种scalarane降二倍半萜类化合物或其药用盐，结构选自以下结构的一种：[0010][0011]所述scalarane降二倍半萜类化合物是从杯叶海绵phyllospongia foliascens中经提取、分离纯化得到的化合物。[0012]所述药用盐选自有机酸盐、无机酸盐、碱盐。[0013]所述无机酸选自盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸、硝酸。[0014]所述有机酸选自乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸。[0015]所述碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠。[0016]本发明的第二方面，提供了一种所述scalarane降二倍半萜类化合物的提取方法，包括以下步骤：[0017]第一步，制备总提物：[0018]将干燥的杯叶海绵phyllospongia foliascens粉碎后，用体积比为1:1的二氯甲烷:甲醇混合溶剂超声提取，杯叶海绵phyllospongia foliascens与混合溶剂的质量体积比为1:(1.5～3)，每次至少1小时，共2～5次，合并提取液，减压浓缩得到总提物；[0019]第二步，分离纯化：[0020]1)将第一步获得的总提物经减压液相柱色谱vlc，以石油醚:乙酸乙酯＝100:1，50:1，25:1，10:1，5:1，3:1，1:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到11个组分fr.a–k；[0021]2)对组分fr.f进行正相硅胶柱色谱，石油醚:乙酸乙酯＝1:0，20:1，15:1，10:1，5:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到6个组分fr.f1–f6；[0022]3)对组分fr.f5组经反相高效液相，条件为98％甲醇/水，水中含有0.1％甲酸，流速2ml/min，检测波长为236nm，得到化合物1；[0023]4)对组分fr.h进行反相ods柱色谱，40％甲醇/水-100％甲醇/水为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到8个组分fr.h1–h8；[0024]5)对组分fr.h3组经反相高效液相，条件为88％甲醇/水，水中含有0.1％甲酸，流速2ml/min，检测波长为236nm，得到化合物2。[0025]本发明的第三方面，提供了一种所述scalarane降二倍半萜类化合物或其药用盐在制备抗肿瘤的药物中的应用。[0026]所述肿瘤细胞选自人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231、人肝癌细胞株hep g2(hepg2)、人前列腺癌耐药细胞株c4-2-enz、人乳腺癌细胞株mcf-7、人大细胞肺癌细胞nci-h460(h460)、人结肠癌细胞ht-29。[0027]体外活性试验证明，本发明化合物1和2对人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231、人肝癌细胞株hep g2(hepg2)、人前列腺癌耐药细胞株c4-2-enz、人乳腺癌细胞株mcf-7、人大细胞肺癌细胞nci-h460(h460)、人结肠癌细胞ht-29等多种不同的肿瘤细胞均有较强的抑制活性。其中化合物2对人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231、人肝癌细胞株hep g2(hepg2)、人前列腺癌耐药细胞株c4-2-enz、人乳腺癌细胞株mcf-7、人大细胞肺癌细胞nci-h460(h460)、人结肠癌细胞ht-29的ic50值分别为13.17、9.64、0.74、1.13、2.02以及1.15μm，对部分肿瘤细胞的抑制效果优于阳性对照药。因此可用于制备抗肿瘤药物。[0028]由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：[0029]本发明化合物的制备方法简单易行，抗肿瘤活性显著。本发明为研究和开发新的抗肿瘤药物提供了新的模板分子和苗头分子，为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。[0030]本发明的化合物经体外活性试验证明，对人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231、人肝癌细胞株hep g2(hepg2)、人前列腺癌耐药细胞株c4-2-enz、人乳腺癌细胞株mcf-7、人大细胞肺癌细胞nci-h460(h460)、人结肠癌细胞ht-29等多种不同的肿瘤细胞均有显著的抑制活性，本发明的化合物1和2对人前列腺癌耐药细胞株c4-2-enz抑制的ic50值分别为1.67μm和0.74μm，效果明显优于阳性对照药替莫唑胺(ic50值为18.22μm)，另外特别值得一提的是，本发明的化合物2对mcf-7、h460和ht-29抑制的ic50值分别为1.13μm、2.02μm和1.15μm，抗肿瘤效果明显优于阳性对照药替莫唑胺，部分结果优于文献报道的相似结构phyllospongin b(对mcf-7的ic50值为4.40μm，参见文献：hassan m,rateb m e,hetta m,et al.scalarane sesterterpenes from the egyptian red sea sponge phyllospongia lamellosa.tetrahedron,2015,71(4):577-583.)。因此可用于制备抗肿瘤药物。具体实施方式[0031]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。[0032]本发明所用的杯叶海绵phyllospongia foliascens于2019年12月采自西沙群岛附近海域，由上海交通大学医学院仁济医院林厚文教授鉴定，样本保存在海军军医大学特色医学中心海洋生物医药与极地医学研究室，样品编号为xs-2019.12。文献(zhang hong-jun，yi yang-hua，yang fan，chen wan-sheng，lin hou-wen.sesterterpenes and a new sterol from the marine sponge phyllospongia foliascens.molecules,2010,15(2):834-841.)记载公开了杯叶海绵phyllospongia foliascens。[0033]实施例1[0034]制备本发明化合物[0035]1、制备总提物[0036]将干燥的600.0g杯叶海绵phyllospongia foliascens粉碎后，用1000ml二氯甲烷:甲醇(1:1)混合溶剂超声提取，每次1小时，共3次，合并提取液，减压浓缩得到29.7g总提物；[0037]2、分离纯化[0038]1)将总提物经减压液相柱色谱(vlc)，以石油醚:乙酸乙酯＝100:1，50:1，25:1，10:1，5:1，3:1，1:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到11个组分fr.a–k；[0039]2)对组分fr.f进行正相硅胶柱色谱，石油醚:乙酸乙酯＝1:0，20:1，15:1，10:1，5:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到6个组分fr.f1–f6；[0040]3)对组分fr.f5组经反相高效液相，条件为98％甲醇/水(0.1％甲酸)，流速2ml/min，检测波长为236nm，即得化合物1(保留时间为26.6分钟)；[0041]4)对组分fr.h进行反相ods柱色谱，40％甲醇/水-100％甲醇/水(180min)为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到8个组分fr.h1–h8；[0042]5)对组分fr.h3组经反相高效液相，条件为88％甲醇/水(0.1％甲酸)，流速2ml/min，检测波长为236nm，即得化合物2(保留时间为45.0分钟)。[0043]化合物1和化合物2的结构如下所示：[0044][0045]3、结构鉴定[0046]本发明所得化合物1和2经nmr、hresims、ir、uv等多种现代光谱技术，确定了其化学结构。[0047]化合物1：白色粉末；uv(meoh)λmax 224(3.58)；ir(kbr)vmax 2955,2929,2869,1733,1682,1462,1380,1328,1266,1166,1102,1014cm–1；hresims m/z[m+na]+479.3504(calcd.c30h48o3na)；1h和3c nmr核磁共振谱数据见表1所示。[0048]化合物2：白色粉末；uv(meoh)λmax 192(4.32),237(4.08)；ir(kbr)vmax 3481,2957,2928,2872,2848,1729,1677,1594,1507,1460,1164,1016,966,776,622cm–1；hresims m/z[m+na]+495.3449(calcd.c30h48o4na)；1h和3c nmr核磁共振谱数据见表1所示。[0049]表1化合物1和化合物2的核磁共振谱数据[0050][0051][0052]a measured at 500mhz for 1h nmr and 125mhz for 13c nmr in cdcl3；[0053]实施例2[0054]本发明化合物的体外抗肿瘤活性实验：[0055]对本发明化合物1和2进行了体外抗肿瘤实验，所用肿瘤细胞株如下：[0056]人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231，购自atcc，atcc号为htb-26；人肝癌细胞株hep g2(hepg2)，购自atcc，atcc号为hb-8065；人前列腺癌耐药细胞株c4-2-enz基于人前列腺细胞株c4-2(购自atcc，atcc号为crl-3314)构建；人乳腺癌细胞株mcf-7，购自atcc，atcc号为htb-22；人大细胞肺癌细胞nci-h460(h460)，购自atcc，atcc号为htb-177；人结肠癌细胞ht-29，购自atcc，atcc号为htb-38。[0057]人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231在添加了10％非透析胎牛血清(fbs)、青霉素(100单位/ml)和链霉素(10μg/ml)的leibovitz l-15培养基中，于37℃培养；人肝癌细胞株hep g2(hepg2)和人乳腺癌细胞株mcf-7在添加了10％非透析fbs、青霉素(100单位/ml)和链霉素(10μg/ml)的基础eagle培养基中，于37℃培养；人前列腺细胞株c4-2，培养在添加了10％非透析fbs、胰岛素(0.1μg/ml)、275ng/ml三碘甲状腺原氨酸、88.6ng/ml载脂蛋白转铁蛋白、4.9ng/ml d-生物素、251.8ng/ml腺嘌呤、青霉素(100单位/ml)和链霉素(10μg/ml)的dmem/f12(4:1)培养基中，于37℃培养；人前列腺细胞株c4-2-enz构建，在c4-2细胞中加恩杂鲁胺，并使药物浓度从开始的10μmol/l增加到40μmol/l(每20天更替一下加药浓度)下连续培养3个月以上，用cck8检测c4-2-enz细胞对恩杂鲁胺治疗的敏感性，以评估其耐药性能；人大细胞肺癌细胞nci-h460，培养在添加了10％非透析胎牛血清(fbs)，青霉素(100单位/ml)和链霉素(10μg/ml)的rpmi-1640培养基中，于37℃培养；人结肠癌细胞株ht-29，培养在添加了10％非透析胎牛血清(fbs)，青霉素(100单位/ml)和链霉素(10μg/ml)的mccoy's 5a培养基中，于37℃培养。[0058]对于细胞生长抑制分析，将上述细胞以密度为1×105个细胞/孔，每孔100μl细胞悬液，接种于corning公司96孔板中。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃下，5％co2的条件下)。然后用完全培养基配制不同浓度的待测化合物，给板中的细胞换含有待测化合物(实施例1制备的化合物1和2)的培养基，将培养板在培养箱孵育48小时，使用cck-8细胞增殖毒性检测法(参见日本同仁cck-8试剂盒说明书)来评估细胞存活力。简言之，检测前更换新鲜培养基，向每孔加入10μl cck-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。[0059]表2化合物1和2对肿瘤细胞的半数有效抑制浓度(μm)[0060][0061]由表2可见，化合物1和2对多种不同的肿瘤细胞株均表明有一定的抑制作用，其中化合物2对人三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231、人肝癌细胞株hep g2(hepg2)、人前列腺癌耐药细胞株c4-2-enz、人乳腺癌细胞株mcf-7、人大细胞肺癌细胞nci-h460(h460)、人结肠癌细胞ht-29的ic50值分别为13.17、9.64、0.74、1.13、2.02以及1.15μm，对部分肿瘤细胞的抑制效果优于阳性对照药。因此可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药提供了新的先导化合物。[0062]以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。









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