用于色素性视网膜炎的基因疗法的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术用于色素性视网膜炎的基因疗法1.本技术是申请日为2015年03月20日、中国申请号为201580026274.0、发明名称为“用于色素性视网膜炎的基因疗法”的发明申请的分案申请。2.本技术要求保护2014年3月21日提交的美国临时申请系列号61/969,027的优先权利益，其在本文以其整体通过提述并入。3.序列表4.通过提述将如下以ascii文本文件提交的内容整体并入本文：电脑可读形式(crf)的序列表(文件名：159792010040seqlist.txt，记录日期：2015年3月17日，大小：63kb).发明领域5.本发明涉及aav载体和使用aav载体治疗色素性视网膜炎的方法.技术实现要素：6.色素性视网膜炎(rp)是遗传性视网膜变性(inherited retinal degeneration)的最常见病因，其临床上的特征是夜盲症(night blindness)和周边视觉(peripheral vision)的丧失。视杆色素视紫红质(rod visual pigment rhodopsin)公认为体染色体显性rp(adrp)的最常见原因，尽管已经提出了许多针对视紫红质rp的治疗方法并在动物模型和临床研究中进行了测试，该疾病仍然无法治愈(kalloniatis，m.等(2004)clin.exp.optom.87(2)：65-80)。许多数据支持这样的观点，即视紫红质rp是一种蛋白质错误折叠疾病，其中突变体蛋白的错误折叠或错误装配改变其细胞命运并诱发细胞死亡(gregersen，n.等(2006)annu.rev.genomics hum.genet.7：103-24).视紫红质基因中已知的rp突变包括无义和短小、读框内缺失突变，其中视紫红质基因在密码子23(p23h)处的单一碱基取代占美国全部显性色素性视网膜炎病例的～7％(dryja，t.p.等(1995)proc.natl.acad.sci.u.s.a.92(22)：10177-81)。在培养的细胞中，与野生型(wt)蛋白不同，p23h突变体蛋白保留在er中，这导致对未折叠蛋白质反应(unfolded protein response；upr)的诱导、对蛋白酶体的抑制且突变体蛋白聚集成寡聚、高分子量形式(oligomeric，highmolecular weight species)，这种寡聚、高分子量形式形成胞内包含体(intracellular inclusion)(saliba，r.s.等(2002)j.cell sci.115：2907-18)。类似地，p23h视紫红质错误定位和/或聚集在动物rp模型的视杆细胞中(olsson，j.e.等(1992)neuron 9(5)：815-30)，表明细胞培养物模型可以预测这种疾病的体内模型。需要的是一种缓解rp症状的手段。7.本文描述的发明提供用于治疗哺乳动物中色素性视网膜炎的方法，包括将包含编码mir-708的载体的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus；raav)病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述raav载体包含编码mir-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的方法，包括将包含第一raav载体的第一raav病毒颗粒和包含第二raav载体的第二raav病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述第一raav载体包含编码mir-708的核酸，所述第二raav载体包含编码视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的方法，包括将包含raav载体的raav病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述raav载体编码mir-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎包括减少或预防与色素性视网膜炎相关的症状。在一些实施方案或本发明中，治疗色素性视网膜炎的方法包括减少与rp有关的症状的方法，预防视网膜变性的方法，用于阻滞rp进展的方法，提高感光细胞功能的方法，等等。rp的症状和/或病理包括但不限于失明、夜间视觉丧失、周边视野损失、erg功能丧失；视觉敏锐度和对比敏感度损失；视觉引导行为的丧失，视杆细胞功能下降，视杆细胞死亡，降低的暗视觉(scotopic vision)，视网膜细胞变化减少，感光细胞结构或功能的丧失；外核层(onl)变薄或变厚；外网层(opl)变薄或变厚；杆状和锥状外段的瓦解和之后的丧失(disorganization followed by loss of rod and cone outer segments)；杆状和锥状内段变短；双极细胞树突的回缩；视网膜内层包括内核层、内网层、神经节细胞(ganglion cell)层和神经纤维层的变薄或变厚；视蛋白错误定位；神经丝的过度表达；等等。在一些实施方案中，本发明提供预防视杆细胞功能退化和视杆细胞死亡和视锥细胞功能退化和视锥细胞死亡的方法.8.在一些方面，本发明提供治疗细胞中内质网(er)应激的方法，包括将包含raav载体的raav病毒颗粒施用至所述哺乳动物，所述raav载体包含编码mir-708的核酸。在一些实施方案中，所述哺乳动物患有或有风险罹患rp。在一些实施方案中，所述哺乳动物是患有rp或处于罹患rp的风险的人。在一些实施方案中，将所述raav颗粒施用至哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述细胞是眼细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞是感光细胞。在更进一步的实施方案中，所述细胞是视杆细胞.在一些实施方案中，所述方法包括减少er应激的一种或多种细胞标记物。在进一步的实施方案中，所述er应激的一种或多种细胞标记物是剪接的xbp-1、chop或grp78。在一些实施方案中，所述raav载体包含编码mir-708和视紫红质的核酸.在其他实施方案中，本发明提供用于治疗细胞中内质网(er)应激的方法，包括将包含编码mir-708的核酸的第一raav载体和包含含有编码视紫红质的核酸的第二raav载体的第二raav病毒颗粒施用至哺乳动物。9.在本发明的一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达mir-708。在进一步的实施方案中，所述启动子包括视紫红质激酶(rk)启动子或视蛋白启动子。在本发明的其他实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达视紫红质。在进一步的实施方案中，所述启动子包括rk启动子或视蛋白启动子。10.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用包含raav载体的raav颗粒，所述raav载体包含编码mir-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个rk启动子。在其他实施方案中，所述编码mir-708的核酸可操作地连接至第一rk启动子或第一视蛋白启动子，而所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二rk启动子或第二视蛋白启动子。在一些实施方案中，所述第一和/或第二视蛋白启动子包括mvm内含子(例如，seq id no：23的内含子)。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码mir-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，源自小鼠细小病毒(mvm)内含子的序列位于所述启动子的3’。在一些实施方案中，所述mmv内含子包含seq id no：23的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子还包含：i)cmv增强子；ii)源自光感受器特异性转录因子的序列；iii)源自视杆细胞特异性转录因子的序列；iv)源自神经视网膜碱性拉链因子(basic zipper factor)的序列；v)源自含视锥视杆同源框(cone rod homebox)的转录因子序列的序列；vi)cmv增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；vii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、cmv增强子和视蛋白启动子(-500至+17)；viii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、cmv增强子、视蛋白启动子(-500至+17)和mvm内含子；ix)包含seq id no：29的cmv增强子；x)包含seq id no：30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子序列；xi)包含seq id no：28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；xii)包含seq id no：29的cmv增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、包含seq id no：30的源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、包含seq id no：28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；xiii)包含seq id no：30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含seq id no：29的cmv增强子和包含seq id no：22的视蛋白启动子(-500至+17)；或xiv)包含seq id no：28的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含seq id no：29的cmv增强子、包含seq id no：22的视蛋白启动子(-500至+17)和包含seq id no：23的mvm内含子。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸嵌入在内含子中。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸包含内源性mir-708支架或mir-155支架。11.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用包含raav载体的raav颗粒，所述raav载体包含编码mir-708的核酸。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸包含seq id no：1的核酸。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸包含与seq id no：1具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸.12.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用包含raav载体的raav颗粒，所述raav载体包含编码视紫红质的核酸。在一些实施方案中，所述视紫红质是哺乳动物视紫红质或其功能等同物。在一些实施方案中，所述视紫红质是人视紫红质或其功能等同物.在一些实施方案中，所述视紫红质缺少3’非翻译区(utr)mir-708靶序列。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在mir-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失.在一些实施方案中，所述取代、插入或缺失降低或阻止mir-708进行的识别。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在mir-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失，其中所述mir-708靶序列是seq id no：19。在一些实施方案中，所述视紫红质的表达难以受到mir-708的抑制.在一些实施方案中，所述视紫红质包含seq id no：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与seq id no：2具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸包含seq id no：3的核酸。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸包含与seq id no：3具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。13.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用包含seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8或seq id no：9的多核苷酸的raav颗粒。在一些实施方案中，所述aav病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26或seq id no：27具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸。14.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用raav颗粒，其中所述aav病毒颗粒包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav2/2-7m8、aav dj、aav2 n587a、aav2 e548a、aav2 n708a、aav v708k、山羊aav、aav1/aav2嵌合型、牛aav或小鼠aav衣壳raav2/hbov1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav血清型5衣壳。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav血清型5酪氨酸突变体衣壳。15.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用包含编码mir-708的核酸的第一raav病毒颗粒和编码视紫红质的第二raav病毒颗粒。在一些实施方案中，所述第一raav颗粒和/或所述第二raav病毒颗粒包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav2/2-7m8、aav dj、aav2 n587a、aav2 e548a、aav2 n708a、aav v708k、山羊aav、aav1/aav2嵌合型、牛aav或小鼠aav衣壳raav2/hbov1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述第一raav病毒颗粒和/或所述第二raav病毒颗粒包含aav血清型5衣壳。在一些实施方案中，所述第一raav病毒颗粒和/或所述第二raav病毒颗粒包含aav血清型5酪氨酸突变体衣壳。16.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用raav颗粒，其中所述aav载体包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型itr。在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用包含第一raav载体的第一raav病毒颗粒和包含第二raav载体的第二raav病毒颗粒，所述第一raav载体包含编码mir-708的核酸，所述第二raav载体编码视紫红质。在一些实施方案中，所述第一raav载体和/或所述第二raav病毒载体包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型itr。17.在本发明的一些实施方案中，所述方法的raav载体包含aav血清型2itr。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒的itr和衣壳来自相同的aav血清型。在其他实施方案中，所述raav病毒颗粒的itr和衣壳源自不同的aav血清型。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav-5衣壳，并且其中所述载体包含aav2 itr。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav-5酪氨酸突变体衣壳，并且其中所述载体包含aav2 itr。18.在一些实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物中rp和/或er应激的方法，其中将raav颗粒注射至所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙中。在一些实施方案中，将所述raav施用至所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙中超过一个位置。在其他实施方案中，将所述raav颗粒玻璃体内(intravitreally)注射至所述哺乳动物。在一些实施方案中，至少10-30％的感光细胞(例如，视杆细胞)由所述aav转导。19.在一些实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物中rp和/或er应激的方法，其中所述哺乳动物在内源视紫红质基因中具有突变。在一些实施方案中，所述内源视紫红质基因中的突变是体染色体显性突变。在一些实施方案中，所述色素性视网膜炎是体染色体显性色素性视网膜炎。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述人具有内源性视紫红质基因中的p23h突变。20.在一些实施方案中，本发明提供治疗rp和/或er应激的方法，包括向哺乳动物施用包含编码mir-708的核酸的第一raav病毒颗粒和编码视紫红质的第二raav病毒颗粒，其中将所述编码mir-708的第一raav病毒颗粒和所述编码视紫红质的第二raav病毒颗粒同时施用哺乳动物。在一些实施方案中，将所述编码mir-708的第一raav病毒颗粒和所述编码视紫红质的raav病毒颗粒连续施用至哺乳动物。在一些实施方案中，首先将编码mir-708的raav病毒颗粒施用至哺乳动物，其次再将编码视紫红质的raav病毒颗粒施用至哺乳动物。在一些实施方案中，首先将编码视紫红质的raav病毒颗粒施用至哺乳动物，其次再将编码mir-708的raav病毒颗粒施用至哺乳动物。21.在本发明的一些实施方案中，所述raav病毒颗粒在药物组合物中.在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含药物上可接受的载剂.在一些实施方案中，本发明提供包含raav颗粒的组合物，所述raav颗粒包含raav载体，所述raav载体包含编码mir-708的核酸，其用于本文所述的方法中.在一些实施方案中，本发明提供包含raav载体的raav颗粒，所述raav载体包含编码mir708的核酸，用于根据本文所述的任何方法治疗色素性视网膜炎或降低er应激。在一些实施方案中，本发明提供第一raav颗粒和第二raav颗粒，所述第一raav颗粒包含含有编码mir708的核酸的raav载体，所述第二raav颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的raav载体，用于根据本文所述的任何方法治疗色素性视网膜炎或降低er应激。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含含有编码mir708和视紫红质的核酸的raav载体，用于根据本文所述的任何方法治疗色素性视网膜炎或降低er应激。22.在一些方面，本文描述的发明提供用于治疗哺乳动物中色素性视网膜炎的组合物，其包含重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，所述病毒颗粒包含编码mir-708的载体。在一些实施方案中，所述包含编码mir-708的核酸的raav载体还包含编码视紫红质的核酸。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的组合物，其包含第一raav病毒颗粒和第二raav病毒颗粒，所述第一raav病毒颗粒包含含有编码mir-708的核酸的第一raav载体，所述第二raav病毒颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二raav载体。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的组合物，其包含含有raav载体的raav病毒颗粒，所述raav载体包含编码mir-708和视紫红质的核酸。23.在一些方面，本发明提供用于治疗细胞中内质网(er)应激的组合物，其包含含有raav载体的raav病毒颗粒，所述raav载体包含编码mir-708的核酸。在一些方面，本发明提供用于治疗细胞中内质网(er)应激的组合物，其包含含有raav载体的raav病毒颗粒，所述raav载体包含编码mir-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，具有er应激的哺乳动物患有或有风险罹患rp。在一些实施方案中，具有er应激的哺乳动物是患有或有风险罹患rp的人。在一些实施方案中，将所述raav颗粒施用至所述哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述细胞是眼细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞是感光细胞。在更进一步的实施方案中，所述细胞是视杆细胞。在一些实施方案中，所述组合物减少er应激的一种或多种细胞标记物。在进一步的实施方案中，所述er应激的一种或多种细胞标记物是剪接的xbp-1、chop或grp78。在一些实施方案中，所述raav载体包含编码mir-708的核酸，进一步包含编码视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗细胞中内质网(er)应激的组合物，其包含第一raav载体和包含第二raav载体的第二raav病毒颗粒，所述第一raav载体包含编码mir-708的核酸，所述第二raav载体包含编码视紫红质的核酸。24.在本发明的一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达mir-708。在进一步的实施方案中，所述启动子包括视紫红质激酶(rk)启动子或视蛋白启动子。在本发明的其他实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达视紫红质。在进一步的实施方案中，所述启动子包括rk启动子或视蛋白启动子。25.在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗rp和/或er应激，其包含raav颗粒，所述raav颗粒包含含有编码mir-708和视紫红质的核酸的raav载体。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个rk启动子。在其他实施方案中，所述编码mir-708的核酸可操作地连接至第一rk启动子或第一视蛋白启动子，而所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二rk启动子或第二视蛋白启动子。在一些实施方案中，所述第一和/或第二视蛋白启动子包括mvm内含子(例如，seq id no：23的内含子)。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码mir-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，所述第一和/或第二视蛋白启动子包括mvm内含子(例如，seq id no：23的内含子)。在一些实施方案中，编码mir-708的核酸在编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，编码mir-708的核酸在编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，编码mir-708的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，源自小鼠细小病毒(mvm)内含子的序列位于所述启动子的3’。在一些实施方案中，所述mmv内含子包含seq id no：23的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子还包含i)cmv增强子；ii)源自光感受器特异性转录因子的序列；iii)源自视杆细胞特异性转录因子的序列；iv)源自神经视网膜碱性拉链因子的序列；v)源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；vi)cmv增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；vii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、cmv增强子和视蛋白启动子(-500至+17)；viii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、cmv增强子、视蛋白启动子(-500至+17)和mvm内含子；ix)包含seq id no：29的cmv增强子；x)包含seq id no：30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子序列；xi)包含seq id no：28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；xii)包含seq id no：29的cmv增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、包含seq id no：30的源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、包含seq id no：28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；xiii)包含seq id no：30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含seq id no：29的cmv增强子和包含seq id no：22的视蛋白启动子(-500至+17)；或xiv)包含seq id no：28的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含seq id no：29的cmv增强子、包含seq id no：22的视蛋白启动子(-500至+17)和包含seq id no：23的mvm内含子。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸嵌入在内含子中。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸包含内源性mir-708支架或mir-155支架。26.在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗rp和/或er应激，其包含raav颗粒，所述raav颗粒包含含有编码mir-708的核酸的raav载体.在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸包含seq id no：1的核酸。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸包含与seq id no：1具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。27.在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗rp和/或er应激，其包含raav颗粒，所述raav颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的raav载体。在一些实施方案中，所述视紫红质是哺乳动物视紫红质或其功能等同物。在一些实施方案中，所述视紫红质是人视紫红质或其功能等同物。在一些实施方案中，所述视紫红质缺少3’非翻译区(utr)mir-708靶序列。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在mir-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，所述取代、插入或缺失降低或阻止mir-708进行的识别。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在mir-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失，其中所述mir-708靶序列是seq id no：19。在一些实施方案中，所述视紫红质的表达难以受到mir-708的抑制.在一些实施方案中，所述视紫红质包含seq id no：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与seq id no：2具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列.在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸包含seq id no：3的核酸。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸包含与seq id no：3具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。28.在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗rp和/或er应激，其包含raav颗粒，所述raav颗粒包含seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8或seq id no：9的多核苷酸.在一些实施方案中，所述aav病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26或seq id no：27具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸.29.在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗rp和/或er应激，其包含raav颗粒，其中所述aav病毒颗粒包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav2/2-7m8、aav dj、aav2 n587a、aav2 e548a、aav2 n708a、aav v708k、山羊aav、aav1/aav2嵌合型、牛aav或小鼠aav衣壳raav2/hbov1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav血清型5衣壳。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav血清型5酪氨酸突变体衣壳。30.在一些实施方案中，本发明提供用于治疗rp和/或er应激的组合物，其包含含有编码mir-708的核酸的第一raav病毒颗粒和编码视紫红质的第二raav病毒颗粒。在一些实施方案中，所述第一raav颗粒和/或所述第二raav病毒颗粒包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav2/2-7m8、aav dj、aav2 n587a、aav2 e548a、aav2 n708a、aav v708k、山羊aav、aav1/aav2嵌合型、牛aav或小鼠aav衣壳raav2/hbov1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述第一raav病毒颗粒和/或所述第二raav病毒颗粒包含aav血清型5衣壳.在一些实施方案中，所述第一raav病毒颗粒和/或所述第二raav病毒颗粒包含aav血清型5酪氨酸突变体衣壳。31.在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗rp和/或er应激，其包含raav颗粒，其中所述aav载体包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型itr。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗rp和/或er应激的组合物，其包含第一raav病毒颗粒和第二raav病毒颗粒，所述第一raav病毒颗粒包含含有编码mir-708的核酸的第一raav载体，所述raav病毒颗粒包含编码视紫红质的第二载体。在一些实施方案中，所述第一raav载体和/或所述第二raav病毒载体包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11或aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型itr。。32.在本发明的一些实施方案中，所述组合物的raav载体包含aav血清型2itr。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒的itr和衣壳源自相同的aav血清型.在其他实施方案中，所述raav病毒颗粒的itr和衣壳源自不同的aav血清型。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav-5衣壳，并且其中所述载体包含aav2 itr。在一些实施方案中，所述raav病毒颗粒包含aav-5酪氨酸突变体衣壳，并且其中所述载体包含aav2 itr。33.在一些实施方案中，本发明提供组合物以在哺乳动物中治疗rp和/或er应激，其中所述哺乳动物具有内源性视紫红质基因中的突变。在一些实施方案中，所述内源性视紫红质基因中的突变是体染色体显性突变。在一些实施方案中，所述色素性视网膜炎是体染色体显性色素性视网膜炎。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述人具有内源性视紫红质基因中的p23h突变。34.在一些实施方案中，本发明提供试剂盒以在哺乳动物中治疗rp或降低er应激，其包含有效量的根据本文描述的方法的raav颗粒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的如本文所述的组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的raav颗粒，所述raav颗粒包含含有编码mir-708的核酸的raav载体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的raav颗粒，所述raav颗粒包含含有编码mir-708和视紫红质的核酸的raav载体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的第一raav颗粒和有效量的第二raav颗粒，所述第一raav颗粒包含含有编码mir-708的核酸的raav载体，所述第二raav颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二raav载体。在进一步的实施方案中，所述试剂盒包含将所述raav颗粒用于治疗色素性视网膜炎和/或降低er应激的说明书。在进一步的实施方案中，所述试剂盒包含关于在本文所述的任一方法中使用的说明书。35.在一些方面，本发明提供包含根据本文所述方法的有效量的raav颗粒的制品.在一些实施方案中，所述制品包含有效量的本文所述的任一组合物。在一些实施方案中，所述制品包含有效量的raav颗粒，所述raav颗粒包含含有编码mir-708的核酸的raav载体。在一些实施方案中，所述制品包含有效量的raav颗粒，所述raav颗粒包含含有编码mir-708和视紫红质的核酸的raav载体。在一些实施方案中，所述制品包含有效量的第一raav颗粒和有效量的第二raav颗粒，所述第一raav颗粒包含含有编码mir-708的核酸的raav载体，所述第二raav颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二raav载体。36.在一些方面，本发明提供包含源自mvm的内含子的核酸.在一些实施方案中，所述mvm内含子包含seq id no：23。在一些实施方案中，所述核酸还包含启动子。在一些实施方案中，所述核酸还包含增强子。在一些实施方案中，所述启动子位于所述mvm内含子的5’。在一些实施方案中，本发明提供包含所述核酸的表达构建体.在一些实施方案中，本发明提供包含所述核酸或所述表达构建体的载体。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸、表达构建体或载体的细胞。37.附图简述38.图1a和1b显示野生型(图1a)和p23h突变型(图1b)视紫红质在人视网膜色素上皮细胞中的定位。将细胞针对视紫红质(绿色)、α-微管蛋白(红色)和dna(蓝色)进行染色。野生型视紫红质的染色样式的特征在于膜定位(实心箭头)，而p23h突变视紫红质的染色样式的特征在于绕核(perinuclear)/网状(reticular)定位(虚线箭头)。39.图2a和2b显示p23h突变视紫红质形成非天然寡聚体并保留er特异性寡糖。(图2a)来自表达野生型(“wt”)或p23h突变视紫红质的细胞的洗涤剂可溶性提取物的蛋白质印迹。(图2b)来自表达野生型(“wt”)或p23h突变视紫红质的细胞的洗涤剂可溶性提取物的蛋白质印迹。提取物周内切糖苷酶h(endoglycosidase h)(“endo-h”)处理或不经处理.40.图3a和3b显示表达p23h视紫红质的细胞具有较高的upr标记物表达和较高的凋亡倾向。(图3a)c/ebp同源蛋白(chop；即ddit3)、结合免疫球蛋白(bip；即hspa5)和视紫红质基因在表达野生型(“wt”)或p23h突变视紫红质的细胞中的相对表达.使用δδct方法将各个基因的相对表达与β-葡糖醛酸糖苷酶(beta-glucoronidase)表达比较。(图3b)表达对照(pcdna)、野生型视紫红质或p23h突变视紫红质的细胞中凋亡细胞的百分比，通过tunel染色测量.41.图4显示用于在泛素启动子(鸡β-肌动蛋白，cba)或感光特异性(photoreceptor-specific)启动子(视紫红质激酶，rk)调控下表达mir-708的表达载体的构建的示意图。合成了编码mir-708的茎和环序列的dna并克隆至5’和3’mir-155支架序列之间。这种支架序列含有drosha在核中将pri-mir-708加工成pre-mir-708所需的靶位点，允许后续通过dicer在细胞质中对pre-mir-708进行加工。42.图5显示相对于未转染的细胞，视紫红质蛋白在表达mir-708或对照mirna的细胞中的表达。所有细胞均为表达具有3’utr mir708靶序列的mp23h视紫红质的hek-293细胞。将视紫红质蛋白表达相对于hgapdh表达标准化。视紫红质蛋白水平在mir708存在时与对照mir相比有所减少.43.图6显示与表达对照mirna(“乱序(scramble)”)的细胞相比，表达mp23h视紫红质的hek-293细胞在表达mir-708时具有降低的upr标记物基因chop和bip的rna水平。44.图7a和7b显示通过内源mir-708下调视紫红质依赖于视紫红质3’utr中mir-708靶序列的存在。将hek-293细胞用包括mir-708靶序列的小鼠p23h视紫红质基因(图7a)，或用缺少mir-708靶序列的人p23h视紫红质基因(图7b)转染。还将细胞用对照pre-mirna或抗mir-708 pre-mirna转染以抑制内源mir-708.相对于hgapdh蛋白测量视紫红质蛋白，并且相对于hgapdh mrna测量视紫红质mrna。还显示内源mir-708的水平(图7a和7b中的右侧轴和最右两栏)。45.图8描绘用于在视杆感光细胞中表达mir-708的aav载体的示意图。对相关的载体特征进行标示。46.图9a和9b显示使用aav载体表达mir-708下调p23h突变视紫红质.(图9a)在转染编码由rk启动子驱动的mir-708或对照mirna(“乱序(scramble)”)的载体时，weri或rpe细胞中mir-708的表达。表达相对于mir-16描绘。(图9b)相对于用对照质粒转染的细胞，在用prk-mir-708质粒转染的weri细胞中p23h视紫红质mrna的表达。47.图10a-10c显示aav5 mir-708载体的视网膜下递送导致小鼠视紫红质的敲低(knockdown)。(图10a)m视紫红质在注射aav5 mir-708或aav5 mir-对照的小鼠视网膜中的表达。(图10b)rdcvf在注射aav5 mir-708或aav5 mir-对照的小鼠视网膜中的表达。(图10c)mir-708在注射aav5 mir-708或aav5 mir-对照的小鼠视网膜中的表达。48.图11a和11b显示用aav5 mir-708处理眼降低视杆细胞介导、但视锥细胞不介导的反应。(图11a)三个代表性视网膜电图，代表在接受aav5 mir-708或aav5 mir-对照(“scram”)的眼中的暗视反应(scoptopic response)。(图11b)三个代表性视网膜电图，代表在与(图11a)相同的接受aav5 mir-708或aav5 mir-对照(“scram”)的眼中的明视反应(photopic response).49.图12提供mir-708内含子嵌入h视紫红质抑制/替代载体的示意图.50.图13显示如与mir-对照载体比较，内含子嵌入的mir-708载体降低m视紫红质、hchop和hbip在用p23h m视紫红质转染的weri细胞中的表达.51.图14显示在weri中mir-708由内含子嵌入载体的表达比非嵌入载体具有降低的表达，事先声明的是内含子嵌入载体prk-hrho-内含子mir-708也共表达h视紫红质。全部使用rk启动子驱动mir-708表达的载体比使用cba启动子的载体具有低几个数量级的表达。52.图15显示h视紫红质由内含子嵌入抑制/替代载体的表达难以通过共表达的mir-708敲低。h视紫红质rna的水平在用表达mir-708或mir-对照的载体转染的细胞中是相同的。53.图16显示在表达突变视紫红质的weri细胞中，mir-708抑制/替代载体降低xbp-1剪接(一种er应激的标记物)。这种降低仅在视紫红质转录物中存在3’utr mir-708靶序列的条件下被观察到。54.图17显示在视紫红质cdna的3’utr中具有mir-708人β-球蛋白内含子支架的载体的示意图。55.图18显示在视紫红质cdna的3’utr中具有mir-708人β-球蛋白内含子支架的载体比在5’utr具有支架的载体产生更高的h视紫红质和mir-708表达。56.图19显示另一种载体设计的示意图，其使用单独的启动子来驱动mir-708(rk启动子)和h视紫红质(小鼠视蛋白启动子)的表达。57.图20显示用指定载体转染的weri细胞中h视紫红质(左)和mir-708(右)表达。将表达表示为针对dna标准品计算的拷贝数。58.图21a-21c显示在视网膜下注射以使用视蛋白启动子在mir-708支架中驱动人视experimental immunology(d.m.weir和c.c.blackwell编，1996)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；pcr：the polymerase chain reaction，(mullis等编，1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan等编，1991)；short protocols in molecular biology(ausubel等编，j.wiley and sons，2002)；immunobiology(c.a.janeway等，2004)；antibodies(p.finch，1997)；antibodies：a practical approach(d.catty编，irl press，1988-1989)；monoclonal antibodies：a practical approach(p.shepherd和c.dean编，oxford university press，2000)；using antibodies：a laboratory manual(e.harlow和d.lane，cold spring harbor laboratory press，1999)；the antibodies(m.zanetti和j.d.capra编，harwood academic publishers，1995)；和cancer：principles and practice of oncology(v.t.devita等编，j.b.lippincott company，2011)中。67.ii.定义[0068]“载体”，如用于本文，指重组质粒或病毒，其包含在体外或在体内递送至宿主细胞的核酸。[0069]术语“多核苷酸”或“核酸”如用于本文指任何长度的核苷酸(或者是核糖核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括，但不限于，单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、经化学或生物修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。所述多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基团(如通常可见于rna或dna中)，或经修饰或取代的糖或磷酸基团。或者，所述多核苷酸的主链可包含合成亚基如氨基磷酸酯的聚合物，并因此可以是寡聚脱氧核糖核苷胺基磷酸酯(oligodeoxynucleoside phosphoramidate)(p-nh2)或混合型氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物.此外，双链多核苷酸可以获得自化学合成的单链多核苷酸产物，或者通过合成互补链并在合适条件下将链退火，或者通过使用dna聚合酶以合适的引物从头(de novo)合成互补链.[0070]术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，用于指氨基酸残基的聚合物，并且不限制最小长度。这样的氨基酸残基的聚合物可以含有天然的或非天然的氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白质及其片段二者均涵盖在该定义内。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等.另外，就本发明而言，“多肽”涉及包括对天然序列进行修饰如缺失、添加和取代(通常在性质上是保守的)的蛋白质，只要所述蛋白质保留了预期的活性.这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是意外的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或因pcr扩增而产生的错误。[0071]“重组病毒载体”指包含一个或多个异源序列(即，非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组aav载体的情况下，所述重组核酸的侧翼有至少一个、优选两个反向末端重复序列(itr).[0072]“重组aav载体(raav载体)”指包含一个或多个异源序列(即非aav来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列的侧翼有至少一个，优选两个，aav反向末端重复序列(itr)。当存在于已经用合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)并表达aav rep和cap基因产物(即aav rep和cap蛋白)的宿主细胞中时，这种aav载体可以被复制并包装在感染性病毒颗粒中。当将raav载体纳入更大的多核苷酸中(例如，染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒)时，那么所述raav载体可以称作“原-载体(pro-vector)”，其可以在aav包装功能和合适的辅助功能存在下通过复制和被衣壳包装而被“拯救”。raav载体可以是多种形式中的任何一种，所述形式包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合的、封装在脂质粒内的，和最优选被衣壳包装(encapsidate)在病毒颗粒特别是aav颗粒中的。raav载体可以包装在aav病毒衣壳中以生成“重组腺相关病毒颗粒(raav颗粒)”。[0073]“异源”意指衍生自与跟其进行比较的其余实体或者其所插入或并入其中的其余实体在基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术引入不同细胞类型中的多核苷酸是异源多核苷酸(并且，在表达时，能够编码异源多肽)。类似地，并入病毒载体中的细胞序列(例如，基因或其部分)相对于载体是异源核苷酸序列。[0074]术语“转基因”指引入细胞中并且能够转录成rna并且任选地在适当条件下转译和/或表达的多核苷酸。在多个方面中，其赋予其被引入的细胞预期的性质，或者以其他方式产生预期的治疗或诊断结果。在另一方面，其可以转录成介导rna干扰的分子，如sirna。[0075]术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等同物”或“基因组拷贝”如在涉及病毒滴度时使用，指含有重组aav dna基因组的病毒体(virion)的数目，无关乎感染力或功能性。特定载体制备物中的基因组颗粒数能够通过例如本文实施例中或例如clark等(1999)hum.gene ther.，10：1031-1039；veldwijk等(2002)mol.ther.，6：272-278中描述的流程来测量。[0076]术语“感染单元(iu)”、“感染颗粒”或“复制单元”，如在涉及病毒滴度时使用，指感染性且有复制能力的重组aav载体颗粒的数目，如通过感染中心测定(infectious center assay)，也称作复制中心测定(replication center assay)，所测量的，如例如mclaughlin等(1988)j.virol.，62：1963-1973中所述。[0077]术语“转导单元(tu)”如在涉及病毒滴度时使用，指导致功能性转基因产物产生的传染性重组aav载体颗粒的数目，如在功能性测定(例如描述于本文实施例或例如xiao等(1997)exp.neurobiol.，144：113-124；或fisher等(1996)j.virol.，70：520-532(lfu测定)中)所测量的。[0078]“反向末端重复”或“itr”序列是本领域中被充分理解的术语，并且指病毒基因组末端存在的方向相反的相对较短的序列。[0079]“aav反向末端重复(itr)”序列是本领域中充分理解的术语，是一种大约145个核苷酸的序列，其存在于天然单链aav基因组的两个末端。itr最外侧的125个核苷酸可以以两种可选的方向中的任何一种存在，导致不同aav基因组之间以及单个aav基因组的两端之间的异质性。所述最外侧的125个核苷酸还含有自我互补的几个较短区域(指名为a、a′、b、b′、c、c′和d区)，使得在itr的这个区域内链内部的碱基配对得以发生。[0080]“末端解析序列(terminal resolution sequence)”或“trs”是aav itr的d区中在病毒dna复制过程中被aav rep蛋白切割的序列。突变的末端解析序列难以受到aav rep蛋白的切割.[0081]用于aav的“辅助病毒”指使得aav(其为缺陷型细小病毒(defective parvovirus))得以通过宿主细胞复制并且包装的病毒。已经鉴定了多种这样的辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒，如牛痘。腺病毒涵盖多个不同的亚组，尽管亚组c的腺病毒5型(ad5)最常使用.多种人、非人哺乳动物和鸟类来源的腺病毒是已知的，并且可从保存机构如atcc获得.疱疹病毒科(herpes family)的病毒也可从保存机构如atcc获得，包括例如单纯疱疹病毒(herpes simplex viruses(hsv))、eb病毒(epstein-barr viruse(ebv))、巨细胞病毒(cytomegaloviruses(cmv))和伪狂犬病病毒(pseudorabies viruses(prv)).[0082]相对于参照多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在对齐所述序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与所述参照多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。为了测定百分比氨基酸或核酸序列同一性的比对可以多种方式实现，这些方式属本领域的技术，例如，使用公开可用的电脑软件程序，例如，描述于current protocols in molecular biology(ausubel等编，1987)，增补30，7.7.18节，表7.7.1中的，并且包括blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。优选的比对程序是align plus(scientific and educational software，pennsylvania)。本领域技术人员能够确定适当的参数用于测量比对，包括在所比较序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，给定氨基酸序列a与或相对于给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可以任选地换而言之叫做与或相对于给定氨基酸序列b具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下计算：100乘以分数x/y，其中x是由序列比对程序在该程序对a和b的比对中计为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中y是b中的氨基酸残基总数。将会理解的是，在氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不等的情况下，a与b的％氨基酸序列同一性会不等于b与a的％氨基酸序列同一性。就本文而言，给定核酸序列c与、同或相对于给定核酸序列d的％核酸序列同一性(或者可以任选地换而言之叫做与、同或相对于给定核酸序列d具有或包含特定％核酸序列同一性的给定核酸序列c)如下计算：100乘以分数w/z，其中w是由序列比对程序在该程序对c和d的比对中计为相同匹配的核苷酸数，并且其中z是d中的核苷酸总数。将会理解的是，在核酸序列c的长度与核酸序列d的长度不等的情况下，c与d的％核酸序列同一性会不等于d与c的％核酸序列同一性。[0083]“分离的”分子(例如，核酸或蛋白质)或细胞意指其已经鉴定并且与其天然环境中的成分分离和/或从中回收。[0084]“有效量”是足以实现有益的或预期的结果的量，所述结果包括临床结果(例如，症状的缓解，实现临床终点，等等)。有效量可以作为一次或多次给药来施用。就疾病状态而言，有效量是足以使疾病缓解、稳定或延迟其发生的量。[0085]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养的动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)，兔，以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。[0086]如用于本文，“治疗/处理”是用于获得有益的或预期的临床结果的手段。就本发明而言，有益的或预期的临床结果包括，但不限于，症状的缓解，疾病程度的削弱，稳定(例如，不恶化)的疾病状态，预防疾病的扩散(例如，转移)，延迟或减缓疾病进程，缓解或减轻疾病状态，和缓和(无论是部分或是全部)，无论这些是可检测的或是不可检测的。“治疗/处理”还可意指与不接受治疗/处理的话所预期的生存期相比得到延长的生存期。[0087]“色素性视网膜炎(rp)”指以进行性失明为特征的一类各种疾病.症状通常起源于视网膜的变性或异常，其可能包括感光细胞功能的丧失。[0088]“视紫红质”指在视网膜的视杆细胞中发挥感光功能的g蛋白偶联受体家族成员。视色素视紫红质含有与其辅因子视黄醛(cofactor retinal)可逆地结合的多肽视蛋白。光引起视黄醛从11-顺式异构化为全-反式形式。这继而引起多肽中的构象变化，导致g蛋白活化。通过将光的存在转化为生化反应，视紫红质使得视觉感知成为可能。其功能是暗视觉(即，弱光中的无色视觉)所需，并且其也被认为是感光细胞生存力所需。[0089]如用于本文，“视紫红质”可指完整的视觉色素，包括视黄醇，或仅仅是分子的氨基酸成分或序列。视紫红质还可称作opn2、opsin-2或rp4。视紫红质蛋白的实例可包括但不限于人、小鼠、狗和猫视紫红质，例如，ncbi参考序列np_000530、np_663358、np_001008277和np_001009242.视紫红质基因的实例可包括但不限于人、小鼠、狗和猫视紫红质基因，例如，genbank entrez gene id6010(rho，即rp4、opn2和csnbad1)、genbank entrez gene id 212541(rho，即ops、rp4、opn2和noerg1)、genbank entrez gene id 493763和genbank entrez gene id 493762。术语视紫红质如用于本文还包括视紫红质包括突变、截短、缺失和/或插入的功能等同物(例如，视紫红质变体)，只要该功能等同物保持了至少一部分野生型视紫红质缓解色素性视网膜炎症状的活性。[0090]如用于本文“难以(refractory)”指对调节的抗性。例如，难以受到mir-708的抑制的视紫红质基因基本上或完全抵抗mir-708的抑制。[0091]“视蛋白启动子”指源自视蛋白基因(例如，小鼠视蛋白)的多核苷酸序列，其特异性驱动在视杆细胞(例如，视杆细胞)中的表达。如用于本文，“视蛋白启动子”可指完整启动子序列或足以驱动视杆细胞特异性表达(rod-specific expression)的启动子序列片段，例如quiambao，a.b.等(1997)vis.neurosci.14(4)：617-25和le，y.z.等(2006)mol.vis.12：389-98中描述的序列。在一些实施方案中，视蛋白启动子含有编码400bp cmv增强子的676bp片段，其在视蛋白启动子序列部分的上游(-500bp-+15bp)。此外，包括65bp nrl序列；这一序列编码神经视网膜碱性拉链因子(视杆细胞特异性转录因子).[0092]“视紫红质激酶(rk)启动子”指源自视紫红质激酶基因(例如，人rk，由genbank entrez gene id 6011代表)的多核苷酸序列，其特异性驱动在视杆细胞和视锥细胞中以及视网膜细胞系如weri rb-1中的表达。如用于本文，“视紫红质激酶启动子”指完整启动子序列或足以驱动光感受器特异性表达(photoreceptor-specific expression)的启动子序列片段，例如khani，s.c.，等(2007)invest.ophthalmol.vis.sci.48(9)：3954-61和young，j.e.，等(2003)invest.ophthalmol.vis.sci.44(9)：4076-85中描述的序列.在一些实施方案中，所述rk启动子跨越相对于转录起始位点而言从-112至+180的位置。[0093]“mir-708”指包含如图4所示的茎和环序列的微rna(mirna)多核苷酸序列。mir-708多核苷酸的实例可包括但不限于人、小鼠、狗和猫mir-708，例如，如genbank entrez gene ids 100126333、735284和100885899所代表.mirnas是小的非编码rna分子，其调节含有由该mirna识别的靶位点的基因的表达(例如，通过下调基因转录物)(bartel，d.p.(2004)cell 116(2)：281-97)。mir-708已知受到chop诱导并且可能参与调节视紫红质表达(behrman，s.等(2011)j.cell biol.192(6)：919-27)。如用于本文，“mir-708”可指经加工的mir-708多核苷酸或加工途径中的任何中间体，例如，pri-mirna或pre-mirna。如用于本文，“mir-708”可指转录生成mir-708 rna的dna序列，或rna序列本身.[0094]本文提及“约/大约”某个值或参数包括(和记载)涉及该值或参数本身的实施方案.例如，提及“约x”的记载包括记载“x”.[0095]如用于本文，冠词“一个”、“一种”和“所述/该”的单数形式包括对复数的提及，除非另行说明。[0096]应理解的是本文描述的发明的各个方面和实施方案包括“包含”、“其组成为”和/或“其组成基本上为”各个方面和实施方案。[0097]iii.色素性视网膜炎及其实验模型[0098]如上所述，色素性视网膜炎(rp)指一类退行性眼病，其能够引起进行性失明，包括夜间视觉丧失、周边视野损失和完全失明。在美国，rp的发病率被认为在大约每4000人中有一人。rp通常是遗传的，并且体染色体显性rp、体染色体隐性rp和x连锁rp病症已有记载。已将超过50种不同基因中的突变与rp关联，包括光传导级联、视黄醛循环(retinal cycle)和剪接因子中牵涉的组分，以及在视紫红质自身中超过100种不同的突变。在许多情况中，与rp相关的突变导致视锥细胞(感光细胞)功能的丧失和/或细胞死亡。这种丧失导致暗视觉的下降并可能表达为夜盲或周边视觉的下降。视杆细胞死亡也与后续的视锥细胞死亡相关，引起高敏锐度视觉的丧失，与视杆细胞死亡一起引起失明。[0099]已经建立了多种基于细胞和动物的模型用于检查rp的细胞学基础以及用于测试实验性治疗。一种用于rp的基于细胞的模型是培养的人视网膜色素上皮(rpe)细胞(adamowicz，m.，等(2012)adv.exp.med.biol.723：573-9)。这种模型可以用于表达rp中牵涉的突变体蛋白并测试这些突变对蛋白质功能的作用或突变体蛋白对细胞功能和/或生存力的作用。例如，可以使用任何合适的启动子(例如，cmv)表达人野生型和突变型视紫红质。不希望受限于理论，认为视蛋白多肽的错误折叠导致er驻留和压力、对未折叠蛋白质反应(upr)的诱导和增加的细胞死亡。这种模型可以用于检查任何rp相关突变，例如视紫红质突变如p23h的作用。[0100]基于动物的rp模型可包括小鼠，该小鼠携带已知或疑似引起小鼠中rp的突变，或与在人中发现的那些突变直系同源的突变.在一些实施方案中，小鼠模型可以包括经工程化而在感光细胞中表达视紫红质(例如突变的人或小鼠形式)的小鼠。小鼠模型的实例包括视紫红质p347s小鼠(li，t.等(1996)proc.natl.acad.sci.93(24)：14176-81)、rho-/-小鼠(humphries，m.m.等(1997)nat.genet.15(2)：216-9)和表达p23h突变视紫红质的小鼠(“p23h小鼠”)(olsson，j.e.等(1992)neuron 9(5)：815-30)。在p23h小鼠中，可以将突变型人视紫红质插入小鼠种系。可以使用本领域中已知的任何在感光细胞中表达的启动子(例如，小鼠视蛋白或人rk启动子)。在一些实施方案中，视紫红质可以使用aav载体表达。[0101]也可以使用其他用于rp的动物模型。除了小鼠模型之外，还可以使用大鼠、狗、猪、蛙(tam，b.m.和moritz，o.l.(2006)invest.ophthalmol.vis.sci.47(8)：3234-41)和非人灵长类模型。[0102]iv.治疗色素性视网膜炎的方法[0103]在一些方面，本发明提供用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎的方法和组合物，包括将有效量的raav病毒颗粒施用至所述哺乳动物(例如，至视网膜)，所述raav病毒颗粒包含编码mir-708的载体。所述方法可用于治疗患有rp的人，以改善与rp有关的病理状态(pathologies)和视觉损伤.在一些实施方案中，本发明包括施用有效量的raav病毒颗粒，所述raav病毒颗粒包含含有编码视紫红质的核酸(例如，正常的或野生型视紫红质)的载体.在一些实施方案中，所述mir-708作用于抑制与rp相关的突变的视紫红质的活性rp。在一些实施方案中，所述正常的或野生型视紫红质作用于为眼补充有功能的视紫红质。在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含aav血清型5衣壳(aav5衣壳)，和aav 2或aav 5反向末端重复中任一者。在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含aav血清型5酪氨酸突变衣壳，和aav 2或aav 5反向末端重复中任一者。[0104]在一些方面，本发明提供用于缓解rp症状的方法和组合物，包括将有效量的raav病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述raav病毒颗粒包含编码mir-708的载体。在其他方面，本发明提供用于缓解rp症状的方法和组合物，包括将有效量的raav病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述raav病毒颗粒包含编码mir-708和视紫红质的载体。在一些实施方案中，所述rp的症状包括，但不限于，失明、夜盲、周边视觉下降和高敏锐度视觉丧失。在一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎包括减少或预防与色素性视网膜炎相关的症状，包括但不限于预防视网膜变性的方法，用于阻滞rp进展的方法，提高感光细胞功能的方法，用于增加感光细胞等。rp的症状和/或病理状态包括但不限于视野损失(loss of sight)、夜间视觉丧失、周边视野损失、erg功能丧失；视觉敏锐度和对比敏感度(contrast sensitivity)损失；视觉引导的行为丧失，视杆细胞功能丧失，视杆细胞死亡，暗视觉下降，视网膜细胞变化减少(感光细胞结构或功能的丧失；外核层(onl)变薄或变厚；外网层(opl)变薄或变厚；杆状和锥状外段的瓦解和之后的丧失；杆状和锥状内段变短；双极细胞树突的回缩；视网膜内层包括内核层、内网层、神经节细胞层和神经纤维层的变薄或变厚；视蛋白错误定位；神经丝的过度表达；等等。在一些实施方案中，本发明提供预防视杆细胞功能退化和视杆细胞死亡和视锥细胞功能退化和视锥细胞死亡的方法。[0105]在一些方面，本发明提供预防或延迟rp进展的方法.体染色体显性的rp是一种能够被基因分型的遗传病。rp的发作和进展可以通过光学相干断层成像术(optical coherence tomography(oct))来确定，其允许对外网层(opl)异常进行检查。[0106]用于测定rp症状缓解的手段是本领域已知的。例如，测量视野(例如，goldmann视野)，测定视网膜电图(erg)，眼底照相，光学相干断层成像术和萤光素血管造影(fluorescein angiography)。视觉唤起行为上的改善也可用于确定rp症状的缓解；例如，做出“我能发现下落的物品”，“我能在烛光晚餐中看到面孔”，“我能看到我衬衫上的条纹”，“我能看到夜晚的星星”，“我能阅读普通的书，并且可以坐在教室前排”，“现在我能踢足球，而且不需要有人在旁边帮我找到球”，“我能自己在我家周围骑自行车”，“我实现了我的梦想：我看到我女儿打出了全垒打”，以及“什么时候能给我的另一只眼睛进行注射？”的陈述。[0107]在本发明的一些方面，将所述方法和组合物用于治疗患有rp的人。rp可以按照体染色体显性、体染色体隐性或x连锁的方式遗传。x连锁的rp可以是隐性的，主要影响男性，或者可以是显性的，既影响男性也影响女性.rp可由编码视紫红质蛋白的rho基因中的突变引起。在本发明的一些实施方案中，将所述方法用于治疗在rho基因和/或在视紫红质蛋白中具有突变的人。在本发明的一些实施方案中，视紫红质蛋白中的突变是p23h突变(视紫红质蛋白氨基酸残基23处的脯氨酸被组氨酸取代)。在其他实施方案中，所述视紫红质蛋白中的突变是t58r、p347l、或p347s，或残基i255的缺失.与色素性视网膜炎相关的突变由mcwilliam，p等，(1989)genomics 5：619-622；dryja，tp等，(1990)nature 343：364-266；farrar，gj等，(1990)genomics 8：35-40；farrar，gj等，(2002)embo j.21：857-864提供；将其以参考方式全部并入本文。[0108]mir-708是一种chop调节的微rna，其调节视紫红质表达(behrman，s.等(2011)j.cell biol.192(6)：919-27)。mir-708是位于chop诱导型基因odz4(tenurin-4)内部的内含子型微rna。chop在er应激期间调节mir-708表达。在视紫红质基因的3’utr中存在推定的mir-708序列，其是高度保守的(参见behrman等的图4，同前)。[0109]在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有rp的人的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有体染色体显性的rp的人的方法.在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有与视紫红质基因中的突变相关的rp的人的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有rp的人的方法，其通过施用有效量的编码mir-708的aav载体以抑制突变型视紫红质的活性。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有rp的哺乳动物(例如，狗或猫)的方法。在一些实施方案中，所述mir-708核酸可包括但不限于由genbank entrez gene ids 100126333、735284或100885899代表的核酸。[0110]在本发明的一些实施方案中，对突变型视紫红质的抑制通过递送有效量的编码野生型视紫红质或与野生型视紫红质具有实质上相同活性的视紫红质的aav载体来补充。在一些实施方案中，所述视紫红质是人视紫红质.在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有rp的人的方法，其通过施用有效量的编码mir-708的载体以抑制突变型视紫红质的活性和有效量的编码具有野生型活性的人视紫红质的载体。在一些实施方案中，所述编码mir-708的aav载体和编码人视紫红质的aav载体是相同的aav载体。在一些实施方案中，所述编码mir-708的aav载体和编码人视紫红质的aav载体是不同的aav载体。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸可以包括但不限于由ncbi参考序列np_000530、np_663358、np_001008277和np_001009242鉴定并提供的核酸。[0111]在一些方面，本发明提供用于治疗细胞中内质网(er)应激的方法，其包括向哺乳动物施用包含raav载体的raav病毒颗粒，所述raav载体包含编码mir-708的核酸。在一些实施方案中，所述细胞是眼细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞是感光细胞。在更进一步的实施方案中，所述细胞是视杆细胞。在一些实施方案中，所述方法包括减少er应激的一种或多种细胞标记物。在进一步的实施方案中，所述一种或多种er应激的细胞标记物是剪接的xbp-1、chop或grp78。在一些实施方案中，所述包含编码mir-708的核酸的raav载体进一步包含编码视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗细胞中内质网(er)应激的方法，其包括向哺乳动物施用包含编码mir-708的核酸的第一raav载体和包含含有编码视紫红质的核酸之第二raav载体的第二raav病毒颗粒。[0112]在一些方面，本发明提供向患有rp的哺乳动物递送mir-708或mir-708和视紫红质的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的视网膜施用有效量的raav病毒颗粒，所述raav病毒颗粒包含编码mir-708和/或视紫红质的载体。所述施用将转基因产物递送至感光细胞，其中mir-708和/或视紫红质介导对所述感光细胞和周围的感光细胞的有益作用。在一些实施方案中，aav病毒颗粒向视网膜的递送是经由将病毒颗粒注射至视网膜的视网膜下间隙来进行。在一些实施方案中，aav颗粒向视网膜的递送是通过玻璃体内递送来进行，条件是所述aav颗粒能够渗透至眼后并转导(transduce)感光细胞.在一些实施方案中，所述aav颗粒在视网膜的视网膜下间隙中的一个或多个位置施用。[0113]在一些实施方案中，向视网膜施用有效量的包含编码mir-708和/或视紫红质的载体的raav病毒颗粒转导位于施用位置处或附近的感光细胞。在一些实施方案中，超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％中任一者的感光细胞被转导。在一些实施方案中，约5％至约100％、约10％至约50％、约10％至约30％、约25％至约75％、约25％至约50％或约30％至约50％的感光细胞被转导。鉴定受到表达mir-708和/或视紫红质的aav转导的感光细胞的方法是本领域已知的；例如，免疫组织化学或使用标记物物，如增强型绿色萤光蛋白，可用于检测mir-708和/或视紫红质的表达.[0114]在本发明的一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物的视网膜(例如，视网膜下间隙)施用有效量的包含编码mir708和/或视紫红质的载体的aav病毒颗粒用于治疗患有rp的哺乳动物，例如，人.在一些实施方案中，将组合物注射至一处或多处视网膜下间隙以允许mir-708和/或视紫红质在感光细胞中表达。在一些实施方案中，将组合物注射至视网膜的视网膜下间隙中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个任一项的位置。[0115]在一些实施方案中，将raav病毒颗粒同时或连续施用至超过一个位置.在一些实施方案中，raav病毒颗粒的多次注射之间不超过1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时或24小时。[0116]在一些实施方案中，将编码mir-708的第一raav病毒颗粒和编码视紫红质的第二raav病毒颗粒同时或连续施用至一个或多个位置。在一些实施方案中，raav病毒颗粒的多次注射之间不超过1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时或24小时。在一些实施方案中，所述编码mir-708的第一raav病毒颗粒的施用在所述编码视紫红质的第二raav病毒颗粒的施用之前。在一些实施方案中，所述编码mir-708的第一raav病毒颗粒的施用在所述编码视紫红质的第二raav病毒颗粒的施用之后。[0117]在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有rp的人的方法，其通过施用有效量的包含编码mir-708的aav载体的药物组合物，以抑制突变型视紫红质的活性。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有rp的人的方法，其通过施用有效量的包含编码mir-708的aav载体的药物组合物以抑制突变型视紫红质的活性和有效量的包含编码视紫红质的aav载体的药物组合物以为感光细胞补充野生型视紫红质活性。在一些实施方案中，所述包含编码mir-708的aav载体的药物组合物和所述包含编码人视紫红质的aav载体的药物组合物是相同的药物组合物。在一些实施方案中，所述包含编码mir-708的aav载体的药物组合物和所述包含编码人视紫红质的aav载体的药物组合物是不同的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。[0118]在本发明的一些实施方案中，注射至视网膜的视网膜下间隙或玻璃体内注射的组合物的体积超过约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1ml或其间的任何量中的任一者。[0119]本发明的组合物(例如，包含编码mir-708和/或视紫红质的载体的aav病毒颗粒)可单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用用于治疗rp.顺序施用之间的间隔可以以至少(或任选地少于)数分钟、数小时或数天为单位。[0120]v.表达构建体[0121]在一些实施方案中，转基因(例如，mirna 708和/或视紫红质)与启动子可操作地连接。例示性启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)即刻早期启动子、rsv ltr、momlv ltr、磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子、猿猴病毒40(sv40)启动子和ck6启动子、运甲状腺素蛋白(transthyretin)启动子(ttr)、tk启动子、四环素反应性启动子(tre)、hbv启动子、haat启动子、lsp启动子、嵌合肝特异性启动子(lsps)、e2f启动子、端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(cag启动子；niwa等，gene，1991，108(2)：193-9)和延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子(kim等，gene，1990，91(2)：217-23和guo等，gene ther.，1996，3(9)：802-10)。在一些实施方案中，所述启动子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子或巨细胞病毒增强子连接鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。所述启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。在一些实施方案中，本发明提供包含与cba启动子可操作连接的编码mir-708的核酸的aav载体。在一些实施方案中，本发明提供包含与cba启动子可操作连接的编码视紫红质的核酸(例如，人视紫红质)的aav载体。在一些实施方案中，本发明提供包含与cba启动子可操作连接的编码mir-708的核酸且编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的aav载体。[0122]在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞中表达转基因。在多个实施方案中，所述启动子是视紫红质激酶(rk)启动子；例如，人rk启动子。在一些实施方案中，所述启动子是视蛋白启动子；例如，人视蛋白启动子或小鼠视蛋白启动子。[0123]在一些实施方案中，本发明提供包含与rk启动子可操作连接的编码mir-708的核酸的aav载体。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至rk启动子的编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的aav载体。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至rk启动子的编码mir-708和视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的aav载体。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸在编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码mir-708的核酸在编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，本发明提供包含与第一rk启动子可操作连接的编码mir-708的核酸和与第二rk启动子可操作连接的编码视紫红质的核酸的aav载体.在一些实施方案中，所述可操作连接至第一rk启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至第二rk启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述可操作连接至第一rk启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至第二rk启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述mir-708包含seq id no：1的序列。在一些实施方案中，所述mir-708包含与seq id no：1的序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含seq id no：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与seq id no：2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从aav载体的表达难以受到mir-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点.在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、插入等)，从而使其难以受到mir-708的抑制。[0124]在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码mir-708的核酸的aav载体。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的aav载体.在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码mir-708的核酸和编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的aav载体。在一些实施方案中，所述编码mir-708的核酸在编码视紫红质的核酸的5’.在其他实施方案中，所述编码mir-708的核酸在编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至第一视蛋白启动子的编码mir-708的核酸和可操作连接至第二视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的aav载体.在一些实施方案中，所述可操作连接至第一视蛋白启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至第二视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述可操作连接至第一视蛋白启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至第二视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述mir-708包含seq id no：1的序列。在一些实施方案中，所述mir-708包含seq id no：1的序列。在一些实施方案中，所述mir-708包含与seq id no：1的序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含seq id no：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与seq id no：2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从aav载体的表达难以受到mir-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、插入等)，从而使其难以受到mir-708的抑制。[0125]在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至rk启动子的编码mir-708的核酸和可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的aav载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至rk启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的5’.在一些实施方案中，所述可操作连接至rk启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的3’.在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码mir-708的核酸和可操作连接至rk启动子的编码视紫红质的核酸的aav载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至视蛋白启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至rk启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在一些实施方案中，所述可操作连接至视蛋白启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至rk启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述mir-708包含seq id no：1的序列。在一些实施方案中，所述mir-708包含seq id no：1的序列。在一些实施方案中，所述mir-708包含与seq id no：1的序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列.在一些实施方案中，所述视紫红质包含seq id no：2的氨基酸序列.在一些实施方案中，所述视紫红质包含与seq id no：2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从aav载体的表达难以受到mir-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、插入等)，从而使其难以受到mir-708的抑制。[0126]在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至cba启动子的编码mir-708的核酸和可操作连接至rk启动子的编码视紫红质的核酸的aav载体.在一些实施方案中，所述可操作连接至cba启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至rk启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在一些实施方案中，所述可操作连接至cba启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至rk启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至rk启动子的编码mir-708的核酸和可操作连接至cba启动子的编码视紫红质的核酸的aav载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至rk启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至cba启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在一些实施方案中，所述可操作连接至rk启动子的编码mir-708的核酸在可操作连接至cba启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述mir-708包含seq id no：1的序列。在一些实施方案中，所述mir-708包含seq id no：1的序列。在一些实施方案中，所述mir-708包含与seq id no：1的序列至少约80％、85％、90％或95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含seq id no：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与seq id no：2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从aav载体的表达难以受到mir-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’utr中的mir-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、插入等)，从而使其难以受到mir-708的抑制。[0127]在一些实施方案中，编码mir-708的核酸包含内源mir-708支架。在一些实施方案中，所述mir-708支架由seq id no：14提供.在一些实施方案中，编码mir-708的核酸包含异源mirna支架。在一些实施方案中，异源mirna支架的使用是用于调节mirna表达；例如，以增加mirna表达或减少mirna表达。在一些实施方案中，编码mir-708的核酸包含内源mir-155支架。在一些实施方案中，所述mir-155支架由seq id no：14提供。[0128]重组病毒载体[0129]本发明涉及重组病毒基因组的使用，用于将本文描述的编码mir-708 mirna和/或视紫红质蛋白的一种或多种核酸序列引入用于包装至aav病毒颗粒中。所述重组病毒基因组可包括确立mir-708 mirna和/或视紫红质蛋白表达的任何元素，例如，启动子，mir-708 mirna和/或视紫红质转基因，itr，核糖体结合元件，终止子，增强子，选择标记物物，内含子，多聚a信号和/或复制起点。[0130]vi.病毒颗粒和用于产生病毒颗粒的方法[0131]raav病毒颗粒[0132]本发明提供使用raav颗粒治疗色素性视网膜炎的方法并提供包含raav颗粒的组合物。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是重组aav颗粒，其包含的核酸包含本文描述的编码mir-708 mirna和/或视紫红质蛋白的序列，侧翼为一个或两个itr。所述核酸被衣壳包装在aav颗粒中。所述aav颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述核酸包含感兴趣的编码序列(例如，编码mir-708 mirna和/或视紫红质蛋白的核酸)，其是按照转录的方向可操作连接的组分，调控序列(包括转录起始和终止序列)，由此形成表达盒.在一些实施方案中，编码mir-708的核酸嵌入在内含子中。所述表达盒的5′和3′端侧翼有至少一个功能性aav itr序列。“功能性aav itr序列”的意思是所述itr序列按照预期发挥拯救、复制和包装aav病毒体的功能。参见davidson等，pnas，2000，97(7)3428-32；passini等，j.virol.，2003，77(12)：7034-40；和pechan等，gene ther.，2009，16：10-16，将其整体以参考方式并入本文。为了实施本发明的一些方面，所述重组载体至少包含对于衣壳包装和用于由raav进行感染的物理结构来说至关重要的全部aav序列。用于本发明载体中的aav itr不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如kotin，hum.gene ther.，1994，5：793-801中所述)，并且可以通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变，或者所述aav itr可以源自数种aav血清型中的任何一种。目前已知超过40种aav血清型，并且将不断鉴定新的血清型和现有血清型的变体。参见gao等，pnas，2002，99(18)：11854-6；gao等，pnas，2003，100(10)：6081-6；和bossis等，j.virol.，2003，77(12)：6799-810。任何aav血清型的使用均被认为在本发明的范围之内。在一些实施方案中，raav载体是源自aav血清型的载体，所述aav血清型包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav衣壳血清型itr或类似物。在一些实施方案中，aav中的核酸包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav衣壳血清型itr或类似物。在一些实施方案中，aav中的核酸还编码如本文所述的mir-708、视紫红质，或mir-708和视紫红质。例如，aav中的核酸可包含本文考虑的任意aav血清型的至少一个itr，并且还可编码包含seq id no：1的核酸的mir-708和/或编码包含seq id no：2的氨基酸序列的人视紫红质的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：aav itr，填充片段(stuffer fragment)(例如，seq id no：11)，嵌合内含子(例如，seq id no：10)，mir-708，牛生长激素多聚腺苷酸化序列(bovine growth hormone polyadenylation sequence)，填充片段，和aav itr。在一些实施方案中，aav中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：aav itr，rk启动子，β球蛋白内含子，嵌入β球蛋白内含子中的mir-708，人视紫红质，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，和aav itr。在一些实施方案中，aav中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：aav itr，填充片段(例如，seq id no：11)，rk启动子，嵌合内含子(例如，seq id no：10)，人视紫红质，β-球蛋白内含子，嵌入β-球蛋白内含子的mir-708，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，填充片段，和aav itr。在一些实施方案中，aav中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：aav itr，填充片段(例如，seq id no：11)，rk启动子，嵌合内含子(例如，seq id no：10)，mir-708，小鼠视蛋白启动子，人视紫红质，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，和aavitr。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：5的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：5的核酸至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：6的核酸.在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：6至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：7的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：7至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：8的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：8至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：9的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：9至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸.在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：24的核酸.在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：24至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：25的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：2580％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：26的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：26至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含seq id no：27的核酸。在一些实施方案中，aav中的核酸包含与seq id no：27至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在进一步的实施方案中，所述raav颗粒包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav2/2-7m8、aav dj、aav2 n587a、aav2 e548a、aav2 n708a、aav v708k、山羊aav、aav1/aav2嵌合型、牛aav、小鼠aav衣壳raav2/hbov1血清型衣壳的衣壳蛋白，或这些衣壳蛋白的突变型。在一些实施方案中，突变型衣壳蛋白保有形成aav衣壳的能力。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav5酪氨酸突变型衣壳(zhong l.等，(2008)proc natl acad sci u s a 105(22)：7827-7832。在进一步的实施方案中，所述raav颗粒包含进化枝a-f(clades a-f)的aav血清型的衣壳蛋白(gao，等，j.virol.2004，78(12)：6381)。在一些实施方案中，aav中的核酸包括选自由seq id nos：5-8组成的组的核酸序列，并且侧翼有至少一个aav2 itr。在一些实施方案中，aav中的核酸包括与选自由seq id nos：5-9组成的组的核酸至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列，并且侧翼有至少一个aav2 itr.[0133]将不同aav血清型用于优化特定靶细胞的转导或用于靶向特定组织内的具体细胞类型(例如，患病组织).raav颗粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，在一些实施方案中，raav颗粒可包含aav5衣壳蛋白和至少一种aav2 itr或其可包含aav2衣壳蛋白和至少一种aav5 itr。在其他实施方案中，raav颗粒可包含aav5酪氨酸突变型衣壳蛋白和至少一种aav2 itr。在又另一个实例中，raav颗粒可包含来自aav5和aav2二者的衣壳蛋白，并且进一步包含至少一种aav2 itr。本文提供用于产生raav颗粒的aav血清型的任何组合，正如每种组合已经在本文明确说明一样。在一些实施方案中，本发明提供raav颗粒，其包含aav5衣壳蛋白和编码mir-708 rna和/或视紫红质转基因的核酸，其侧翼有至少一个aav2 itr。[0134]自我互补的aav病毒基因组[0135]在一些方面，本发明提供包含重组自我互补基因组(recombinant self-complementing genome)的病毒颗粒。具有自我互补基因组的aav病毒颗粒和使用自我互补aav基因组的方法记载于美国专利nos.6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；以及wang z.等，(2003)gene ther 10：2105-2111，将其每一篇整体以参考方式并入本文。包含自我互补基因组的raav会借助于其部分互补序列(例如，补充转基因的编码和非编码链)将快速形成双链dna分子。在一些实施方案中，本发明提供包含aav基因组的aav病毒颗粒，其中所述raav基因组包含第一异源多核苷酸序列(例如，mir-708和/或视紫红质编码链)和第二异源多核苷酸序列(例如，mir-708的反义链和/或视紫红质非编码或反义链)，其中所述第一异源多核苷酸序列可以与所述第二多核苷酸序列在其长度的大部分或全部上形成链内碱基配对。在一些实施方案中，所述第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过辅助链内碱基配对的序列连接；例如，发夹dna结构。发夹结构是本领域已知的，例如在sirna分子中。在一些实施方案中，所述第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列系经由突变型itr(例如，右侧itr)连接。在一些实施方案中，所述itr包括多核苷酸序列5’‑cactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccacgcccgggctitgcccgggcg-3’(seq id no：20)。所述突变型itr包含d区的缺失，所述d区包含末端解析序列.这样的结果是，在复制aav病毒基因组时，rep蛋白不会在突变型itr处切割病毒基因组，并且如此以5′至3′顺序包含以下各项的重组病毒基因组会被包装至病毒衣壳中：aav itr，包括调节序列的第一异源多核苷酸序列，突变型aav itr，与所述第一异源多核苷酸方向相反的第二异源多核苷酸和第三aav itr。在一些实施方案中，本发明提供包含重组病毒基因组的aav病毒颗粒，所述重组病毒基因组包含功能性aav2 itr，编码mir-708 rna和/或视紫红质转基因的第一多核苷酸序列，包含d区缺失并且缺乏功能性末端解析序列的突变型aav2 itr，包含与所述第一多核苷酸序列的编码mir-708 rna和/或视紫红质的序列互补的序列的第二多核苷酸序列和功能性aav2 itr。[0136]aav颗粒的产生[0137]raav颗粒可以使用本领域已知的方法产生.参见，例如，美国专利号6,566,118；6,989,264；和6,995,006。在本发明的实践中，用于产生raav颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞还可以是包装细胞，其中aav rep和cap基因稳定保持在所述宿主细胞中，或是生产者细胞，其中稳定保有aav载体基因组。示例性包装和生产细胞源自293、a549或hela细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制aav载体。[0138]在一些方面，提供用于产生如本文公开的任何raav颗粒的方法，包括(a)在产生raav颗粒的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)一种或多种aav包装基因，其中每种所述aav包装基因编码aav复制和/或衣壳包装蛋白(encapsidation protein)；(ii)包含编码如本文所述的mir-708 rna和/或任何视紫红质转基因的核酸的raav原载体(pro-veetor)，其侧翼有至少一个aav itr，和(iii)aav辅助功能；和(b)回收由宿主细胞产生的raav颗粒.在一些实施方案中，核酸编码seq id no：1的mir-708 rna和/或编码视紫红质的转基因；例如，具有seq id no：2的氨基酸的视紫红质。在一些实施方案中，所述至少一个aav itr选自下组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型itr或类似物。在一些实施方案中，所述衣壳包装蛋白选自下组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6(例如，野生型aav6衣壳，或变体aav6衣壳，如shh10，如美国核准前公开案2012/0164106中所述)、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9(例如，野生型aav9衣壳，或修饰型aav9衣壳，如美国核准前公开案2013/0323226)、aav10、aavrh10、aav11、aav12、酪氨酸衣壳突变型、肝素结合衣壳突变型(heparin binding capsid mutant)、aav2r471a衣壳、aavaav2/2-7m8衣壳、aav dj衣壳(例如，aav-dj/8衣壳、aav-dj/9衣壳或美国核准前公开案2012/0066783中描述的任何其他衣壳)、aav2 n587a衣壳、aav2 e548a衣壳、aav2 n708a衣壳、aav v708k衣壳、山羊aav衣壳、aav1/aav2嵌合衣壳、牛aav衣壳、小鼠aav衣壳、raav2/hbov1衣壳、美国专利号8,283,151或国际公开案号wo/2003/042397中描述的aav衣壳，或其突变型。在一些实施方案中，衣壳包装蛋白是aav5酪氨酸突变型衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，所述raav颗粒包含来自进化枝a-f的aav血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav5衣壳和包含aav2 itr、突变型aav2 itr和编码mir-708和/或视紫红质的核酸的重组基因组。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav5酪氨酸突变型衣壳和包含aav2 itr、突变型aav2 itr和编码mir-708和/或视紫红质的核酸的重组基因组。在进一步的实施方案中，所述raav颗粒是经纯化的.术语“纯化的”如用于本文包括不含至少一些其他成分的raav颗粒的制备物，所述其他成分可能也存在于所述raav颗粒天然存在之处或所述raav颗粒最初从中制备之处。因此，例如，分离的raav颗粒可使用纯化技术制备以使其从来源混合物(如培养裂解液或生产培养物上清液)富集。富集可以以多种方式测量，例如通过溶液中存在的dna酶抗性颗粒(drp)或基因组拷贝(gc)的比例，或者通过感染力，或者其可以相对于来源混合物中的次要的、潜在干扰性物质来测量，如污染物，包括生产培养物污染物或加工污染物(in-process contaminant)，包括辅助病毒，培养基成分，等等。[0139]本文还提供包含本发明的raav颗粒和药物上可接受载剂的药物组合物，所述raav颗粒包含编码mir-708的转基因和/或视紫红质转基因。在一些实施方案中，所述组合物包含含有编码mir-708的转基因的raav颗粒和包含视紫红质转基因的raav颗粒。在一些实施方案中，所述组合物包含含有编码mir-708的转基因和视紫红质转基因的raav颗粒。所述药物组合物可适用于本文描述的任何施用模式。本文所述的包含编码mir-708 rna的核酸和/或视紫红质转基因的raav的药物组合物可导入至眼部；例如，通过视网膜下施用或玻璃体内施用。[0140]在一些实施方案中，包含本文所述的raav和药物上可接受载剂的药物组合物适合于向人施用。这些载体是本领域中熟知的(参见，例如，remington′s pharmaceutical sciences，第15版，第1035-1038和1570-1580页).在一些实施方案中，包含本文所述的raav和药物上可接受载剂的药物组合物适用于眼部注射。这些药物上可接受载剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液和含水葡萄糖(aqueous dextrose)、聚乙二醇(peg)和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。所述药物组合物可进一步包含额外的成分，例如防腐剂、缓冲液、张度剂(tonicity agents)、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿剂或澄清剂、增粘剂等。本文所述的药物组合物可以包装成单一单位剂量或包装成多剂量形式。所述组合物通常配制为无菌且基本上等渗的溶液。[0141]vii.制品和试制盒[0142]还提供在本文所述的方法中使用的试剂盒或制品。在多个方面中，所述试剂盒包含在合适的包装中的本文所述的组合物(例如，包含编码mir-708 rna的核酸和/或视紫红质转基因的raav颗粒)。用于本文所述的组合物(如眼部组合物)的合适包装是本领域已知的，并且包括，例如，小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿(ampule)、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的mylar或塑料袋)，等等。这些制品可以进一步灭菌和/或密封。[0143]本发明还提供包含本文所述的组合物的试剂盒，并且可进一步包含关于使用所述组合物的方法(如本文所述的使用)的说明。本文描述的试剂盒可进一步包括从商业和用户立场来看理想的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有关于实施本文所述任何方法的说明的包装插页。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有编码mir-708 rna的转基因和/或视紫红质转基因的raav用于眼内递送至少1×109基因组拷贝至如本文所述的灵长类，适合于眼内注射的药物上可接受载剂，和如下的一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有关于实施眼部注射的说明的包装插页。在一些实施方案中，所述试剂盒包含关于使用本文所述的raav颗粒治疗色素性视网膜炎的说明。在一些实施方案中，所述试剂盒包含关于使用本文所述的raav颗粒降低细胞中er应激的说明。在一些实施方案中，所述试剂盒包含关于根据本文所述的任一方法使用本文所述的raav颗粒的说明。实施例[0144]参考以下实施例会更充分地理解本发明。然而，不应将它们理解为对本发明范围的限制。应理解的是此处记载的实施例和实施方案仅出于示例性目的，并且本领域技术人员会得到提示在其启发下进行多种修改或变化，并且这些修改或变化包括在本技术的宗旨和范围以及所附权利要求范围之内.[0145]实施例1：色素性视网膜炎细胞模型的开发[0146]用于rho相关体染色体遗传rp的治疗策略会同时敲低突变和野生型视紫红质并缓解er应激。这可以通过共同递送会抑制视紫红质等位基因的微rna(mir)并任选地共同递送难以通过外源递送的mir敲低的野生型视紫红质序列来实现。受chop调节的mir，mir-708，调节视紫红质表达(behrman，s.，等(2011)j.cell biol.192(6)：919-27)。mir-708是位于chop-诱导型基因odz4(tenurin-4)之内的内含子mir。在er应激期间chop调节mir-708表达，并且在视紫红质的3’utr中存在推定的mir-708序列。[0147]本文描述了使用aav载体递送外源mir-708的方法，所述外源mir-708通过两种等位基因中存在的3’utr mir-708靶序列靶向野生型和突变视紫红质二者。在多个实施方案中，野生型视紫红质取代序列也被共同递送.这种取代视紫红质序列可经工程化以具有减少的与mir-708的结合(例如，核苷酸取代、缺失或添加至3’utr)，并因此会难以通过外源mir-708敲低.在多个实施方案中，取代视紫红质序列缺乏3’utr mir-708靶序列.简而言之，所述aav载体会敲低引起er应激的视紫红质的表达(并因此有感光细胞死亡)，并任选地补充难以受到mir-708诱导的敲低的野生型或密码子优化的视紫红质基因的表达，因此重建正常表达和视紫红质功能。[0148]方法[0149]细胞培养[0150]使用来自invitrogen的t-rex四环素诱导系统将hek-293细胞经工程化以表达人或小鼠视紫红质p23h。将6孔板中融合的细胞用4μg mir-708(pcdna)载体或对照mirna载体使用lipofectamine 2000(invitrogen)按照生产商的说明转染.转染后48小时，将培养基用含有2μm四环素的培养基替代.将细胞温育额外的24小时，并将培养基从每个孔去除。[0151]western印迹[0152]将细胞在含有1mm pmsf的400μl ripa缓冲液(thermo scientific)中裂解，并多次通过25g注射器。将裂解液在14,000rpm离心10分钟。在整个过程中将细胞保持在4℃.将30μl上清液装载至4-12％bis/tris凝胶上并在mops缓冲液(invitrogen)中进行sds-page。然后将蛋白质使用来自invitrogen的i-blot系统转移至硝酸纤维素膜。将膜在室温在含有0.05％tween-20(pbs-t)和0.1％i-block(invitrogen)的pbs中封闭1小时.将膜在含有1μg/ml抗视紫红质mab 1d4(abcam)的pbs-t中在4℃温育过夜。在pbs-t中清洗几次之后，将膜在含有1∶1000稀释的抗小鼠igg hrp偶联ab(r&d systems)的第二抗体溶液中在室温温育1小时。将膜在pbs-t中清洗几次，并使用ecl试剂(thermo scientific)显影。m视紫红质蛋白水平使用image-j软件定量。在含有0.1m甘氨酸ph 2的pbs中将膜的蛋白质剥离，然后在pbs-t中漂洗几次。然后在室温在含有1∶20,000稀释的抗gapdh pab(sigma)的pbs-t中探查膜的hgapdh 2小时。在pbs-t中清洗几次之后，将第二抗体(抗兔igg-hrp，r&d systems)在pbs-t以1∶1000中稀释，并在室温温育1小时。将膜清洗几次，并使用ecl试剂(thermo scientific)显影。然后使用image j软件将m视紫红质蛋白质水平标准化至hgapdh蛋白质水平。[0153]hek-293细胞中内源mir-708的敲低[0154]将(上述)表达小鼠或人视紫红质的hek-293细胞用100pmol pre-mir-708、抗mir-708或对照mirna(ambion)使用用于以sirna分子转染的lipofectamine 2000方案(invitrogen)进行转染。在转染后48小时，将培养基用含2um四环素的培养基替代以诱导视紫红质表达。24小时之后，将每个孔分成2个样品。一个使用上述蛋白质印迹方案探查m视紫红质和hgapdh，并从另一个提取rna用于对视紫红质和mir-708 rna表达的(life technologies)分析。使用qiagen的mirneasy试剂盒，根据生产商的说明，从细胞提取总rna(包括小rna)，包括对样品的dna酶处理。使用qiagen的quantitect reverse transcription(quantitect反转录)系统从总rna合成cdna。将cdna添加至m视紫红质、hchop(ddit3)、hbip(hspa5)或hgapdh基因表达测定(life technologies)。将基因表达相对于hgapdh使用δδct方法标准化。将mir-708表达使用mir-708表达测定(life technologies)定量。将mir-708表达相对于内源mir-16表达使用δδct方法呈现。[0155]weri rb-1细胞中视紫红质激酶启动子驱动的mir-708表达[0156]将mir-708序列在从pcdna 6.2 gw载体(block-it系统，invitrogen)切下之后次克隆至载体prk-mvm中视紫红质激酶(rk)启动子的下游，所述载体prk-mvm含有天然hrk启动子和mvm内含子序列.将weri rb-1细胞(atcc)用2μg prk-mir-708或prk-mir-对照载体使用fugene-hd(promega)根据生产商的说明转染。在转染后48小时，收集细胞，并使用mirneasy试剂盒方案(qiagen)提取总rna(包括小rnas)。使用mir-708基因表达测定如之前所述(life technologies)定量每个样品中的mir-708。为了定量表达mir-708的weri rb-1细胞中的m视紫红质敲低，将细胞用各2μg prk-mir-708(或对照)和psport6 m视紫红质p23h使用fugene-hd根据生产商的说明(promega)共转染.如所述的提取rna，并如上所述使用δδct方法相对于hgapdh rna水平定量m视紫红质rna水平。[0157]从注射aav载体的小鼠视网膜提取rna[0158]使用mirneasy试剂盒根据生产商的说明(qiagen)从小鼠视网膜提取rna。将各个小鼠视网膜在qiazol lysis buffer(qiazol裂解缓冲液)中使用1mm氧化锆/二氧化硅珠(biospec)均质化10分钟。在均质化之后，根据生产商的说明提取rna。使用qstar microrna定量系统(origene)定量每个视网膜中的mir-708水平。使用第一链cdna合成试剂盒(origene)合成cdna，接着使用mir-708特异性引物和mir-708拷贝标准品(origene)进行mir-708特异性扩增和定量。为了定量经注射的小鼠眼内的视紫红质水平，使用特异性引物(life technologies)扩增m视紫红质，并相对于视紫红质cdna标准品定量.使用δδct方法相对于gapdh表达定量分析rdcvf水平.[0159]视紫红质抑制/替代载体[0160]通过从pcdna载体切下并进行平端连接至prk-mcs中将h视紫红质cdna(没有侧翼utr序列)克隆至prk载体中。合成(biobasic)的cdna含有h视紫红质激酶启动子序列和hβ-球蛋白内含子，带有位于内含子的剪接受体/供体位点之间的hmir-708序列插入(取自genbank/ncbi的序列)。将该序列从puc57载体次克隆，连接至pcdna h视紫红质载体中，并重命名为prk-mir-708 hrho/wt。如上所述测定经转染的weri rb-1细胞中的mirna-708和h视紫红质蛋白质水平.[0161]定量p23h m视紫红质-转染的weri rb-1细胞中的xbp-1剪接[0162]将hweri rb-1细胞用编码非糖基化的p23h突变的m视紫红质的pcdna载体和prk-mir-708载体共转染。使用定点pcr诱变(agilent technologies)突变这种p23h视紫红质cdna以将两个天冬酰胺密码子(在位置2和5)变成丙氨酸。按照描述用每种载体2μg转染细胞并温育72小时。如先前所述从细胞收集总rna。使用high capacity cdna合成试剂盒(invitrogen)合成cdna。使用对于xbp-1特异性的引物和high fidelity pcr mastermix(高保真pcr主混合物)(roche)评价xbp-1剪接.在2％琼脂糖凝胶上分析扩增的序列，并使用image-j软件定量剪接的(～280nt)相对于未剪接的(～300nt)xbp-1转录物的相对量。[0163]其他方法[0164]用于免疫萤光的方法、带有和不带有内切糖苷酶h处理的蛋白质印迹、upr标记物表达和tunel染色表达野生型或p23h突变视紫红质的细胞如adamowicz，m.等(2012)adv.exp.med.biol.723：573-9中所述进行.[0165]结果[0166]用编码人野生型(wt)或人p23h突变视紫红质(与rp连锁的突变)的基因瞬时转染人视网膜色素上皮(rpe)细胞。通过共聚焦免疫萤光显微镜使用抗视紫红质抗体研究视紫红质的定位。在野生型蛋白质的情况下，大部分蛋白质经加工至细胞膜(图1a)，说明正常的生物发生。相对而言，突变的p23h显示了内质网(er)驻留的绕核(perinuclear)/网状(reticular)分布特征，其中几乎没有在细胞表面的表达(图1b)。这些结果证明，p23h突变视紫红质不能正确地运输至细胞膜，反而驻留在er中。[0167]通过对来自瞬时表达野生型或p23h突变体蛋白的rpe细胞的洗涤剂可溶性提取物的sds-page免疫印迹分析评估了视紫红质的聚集(图2a)。野生型视紫红质主要作为弥散条带迁移至在～40kda的分子量处。这种类型对应于单体、成熟的含n-联聚糖的视紫红质。p23h突变视紫红质的迁移力显著区别于野生型视紫红质，其中大部分p23h作为更高分子量的二聚体和寡聚体迁移(图2a)。p23h还对内切糖苷酶h敏感-注意到用内切糖苷酶h的处理影响p23h视紫红质的迁移，但不影响野生型，如图2b中所示。内切糖苷酶h特异性针对尚未成熟至er之外的蛋白质中典型的核心糖基化、高甘露糖n联寡糖结构。[0168]综合起来，这些数据提示在rpe细胞野生型中，视紫红质能够折叠并成熟至er之itr质粒[0178]认为er中突变型视紫红质蛋白的累积促成rp中引起感光细胞死亡的er应激。前述实施例证明了mir-708表达能够调节视紫红质的整体水平。构建了基于腺相关病毒(aav)的载体，用于mir-708在视网膜的感光细胞中的特异性表达，以测定降低总视紫红质水平(包括野生型和突变形式)是否可不依赖于视紫红质突变来缓解er应激。[0179]图8描绘设计用于在视网膜感光细胞中特异性表达mir-708的aav反向末端重复(itr)质粒。mir-708表达由视紫红质激酶启动子(prk)驱动，其在视杆细胞中特异性地表达。在这种载体中，mir-708从图4中所示的mir-155支架表达。[0180]接下来，在培养的细胞中验证这种aav itr质粒。将weri或rpe细胞用图8中描述的前病毒质粒(pre-viral plasmid)转染，并且通过分析定量mir-708水平.图9a显示用prk驱动的mir-708质粒转染的weri细胞与用表达mir-乱序(对照)的质粒转染的weri细胞相比在mir-708水平上具有超过2000倍的增加。相对来说，rpe细胞，其中rk启动子不显著表达，没有显示mir-708水平的显著增加(图9a)。[0181]mir-708在调节视紫红质表达中的功能通过将prk-mir-708质粒(或mir-对照质粒)和具有含3’mir708靶序列的p23h小鼠视紫红质基因的质粒共转染至weri细胞中而得到了确认。图9b显示与mir-对照相比，在mir-708存在下p23h m视紫红质mrna减少。这些结果证明使用aav itr载体表达mir-708有效降低了感光细胞中视紫红质的表达。[0182]实施例4：使用mir-708 aav5载体敲低小鼠视网膜中的视紫红质[0183]为了检验aav载体是否能够在体内用于降低视网膜中视紫红质的表达，将图8中描述的prk-mir-708质粒包装至aav5衣壳中以生成aav5-rk mir-708。另外，生成aav5 mir-对照载体。野生型c57bl小鼠在对侧眼中接受了视网膜下注射的1x108vgs的aav5-rk mir-708或aav5 mir-对照.在注射后1个月，对小鼠进行麻醉，提取了神经视网膜并快速冷冻用于对基因表达进行qpcr分析。[0184]图10a显示用表达mir-708的aav5载体注射过的小鼠眼与注射aav5 mir-对照载体的小鼠眼相比具有降低的视紫红质表达。相对而言，另一视杆细胞特异性基因(视杆细胞来源的视锥细胞活力因子(rod derived cone viability factor(rdcvf)))的表达未受影响(图10b)。图10c确认注射了aav5mir708载体的眼与接受aav5mir对照的眼相比显示出mir-708拷贝数的显著增加。这些结果提示，在视杆细胞(rod photoreceptor)中表达mir-708的基于aav的载体有效降低体内内源视紫红质的表达。[0185]为了证明视紫红质敲低的功能相关性，通过视网膜电图(erg)分析了用aav5 mir-708或aav5 mir-对照处理的小鼠眼以评估视网膜功能。接受aav5 mir-708载体的眼显示降低的暗视反应，正如若视紫红质水平减少时的情况所预期(图11a)。暗视erg反应是对视杆细胞功能的评估，并且这种测量能够与视紫红质水平相关联。然而，相同动物中视锥细胞功能，如通过明视erg来评估，在aav5 mir-708递送之后没有变化(图11b)，确认mir-708对视杆细胞具有生物学效应而不影响视锥细胞(while sparing the cone cells)。这些数据证明aav5 mir-708递送导致仅限于视杆靶细胞的生物学作用。[0186]实施例5：构建具有嵌入内含子的mir-708表达盒的h视紫红质抑制/替代载体[0187]mir-708在正常情况下由odz4基因中的第一内含子在体内表达。因此，基于mir-708的序列及其内源支架/侧翼序列设计新的构建体。将mir-708序列嵌入合成内含子并克隆至光感受器特异性启动子视紫红质激酶(rk)的下游，但在h视紫红质cdna的上游。将内源mir-708序列包括其侧翼调节和加工序列克隆至h视紫红质cdna序列上游但在rk启动子下游的β-球蛋白内含子中。由此，mir-708序列相对于视紫红质编码序列系位于5’。[0188]图12提供了这种5’抑制/替代载体的示意图。通过rk启动子控制h视紫红质(缺乏3’utr mir708靶序列)。将包括内源支架(例如，包括任何drosha/dicer识别基序)的内源mir-708序列嵌入β-球蛋白内含子之内.将h视紫红质cdna(无3’mir-708 utr靶序列)并入在剪接连接位点(splice junction site)的下游。将mir-708嵌入在β-球蛋白之内，其位于rk启动子的下游，因此mir-708在β-球蛋白内含子序列的剪接之后得到加工。另外，生成含有对照mir的具有相似结构的载体。[0189]使用图12描述的载体或具有对照mirna的载体转染weri细胞.使用weri细胞是因为它们(如果有的话)表达很少的内源mir-708，并且它们对于rk启动子是可允许的。将weri细胞用编码p23h m视紫红质(具有3’utr mir-708序列)的cdna共转染。在经转染的细胞中同时检查了视紫红质敲低(rna水平)以及upr基因chop和bip的水平。[0190]图13显示用m视紫红质(p23h)和mir-708载体共转染的细胞与用视紫红质和对照mirna载体共转染的细胞相比具有降低的m视紫红质水平.另外，与对照相比upr基因chop和bip也在mir-708转染的细胞中被下调。此数据提示使用其中内含子表达mir708的内源mir708支架提供一种可供选择的支持mir708加工和表达的支架。[0191]实施例6：比较不同的mir-708支架[0192]较低的mir-708表达水平可能有益于降低临床使用情况中任何潜在的mirna脱靶效应(off-target effects).因此，测试不同mir支架在weri人成视网膜细胞瘤细胞系中的表达强度。[0193]图14描绘用cba驱动的mir-708、图4中显示的使用mir-155支架的rk驱动的mir708或图12中显示的rk内含子嵌入的mir-708h视紫红质载体转染的weri细胞中的定量mir-708水平。rk内含子系统中的mir-708表达不如cba驱动系统中那样稳固(robust)。然而，mir-708表达仍足以在背景之上，并且比使用mir-155支架的prkmir708低大约5倍.注意到h视紫红质由内含子嵌入载体共表达，在cba或rkrk mir-155支架载体中则否.[0194]接下来，比较表达mir-708内含子嵌入的、抑制/替代载体或mir-对照载体的weri细胞中的h视紫红质mrna水平。图15显示用mir-708内含子嵌入的、抑制/替代载体转染的weri细胞与用对照载体转染的细胞相比具有相似的h视紫红质水平。这些结果表明缺乏3’utr mir-708靶序列的h视紫红质由所述抑制/替代载体的表达难以受到mir-708表达的抑制.两种细胞均显示比未经转染的weri细胞高的h视紫红质之表达。[0195]实施例7：通过mir-708抑制/替代载体敲低突变型视紫红质降低了er应激的标记物物[0196]检查了mir-708抑制/替代载体降低表达突变型视紫红质的细胞中er应激的能力。用图12中描述的抑制替代载体转染了表达非糖基化的、p23h突变视紫红质(n2k/n15k/p23h)(带有或不带有3’utr mir708靶序列)的weri细胞。收获细胞并提取rna以测量x-框(box)结合蛋白1(xbp-1)剪接.xbp-1是在对er应激基因的调节中重要的转录因子，其剪接是细胞er应激/upr的已知标记物物；正在经历upr的细胞显示出剪接的xbp-1水平升高。[0197]如图16中所示，当用mir-708抑制/替代载体转染时，表达带有3’utr靶序列的突变型视紫红质的细胞具有降低的xbp-1剪接。相对来说，表达缺乏3’utr mir-708靶序列的突变型p23h视紫红质的细胞与用mir-对照序列转染的细胞相比具有水平相当的xbp-1剪接。这些结果证明使用mir-708抑制/替代载体敲低突变型视紫红质有效降低er应激。[0198]实施例8：置于视紫红质3’utr中的β-球蛋白内含子支架中的mir-708的表达增加视紫红质和mir-708的表达[0199]为了检验mir-708支架的位置是否影响其表达，构建了载体，其中将mir-708序列(包括其侧翼调节/加工序列)克隆至视紫红质cdna下游的β-球蛋白内含子序列中，即在3’utr之内。图17显示了这种3’抑制/替代载体的示意图，其与图12中所示的载体类似，除了mir-708人β-球蛋白内含子支架位于视紫红质cdna的3’utr中，而不是5’utr。[0200]为了确定mir-708人β-球蛋白内含子支架在载体中的位置是否影响了mir-708或h视紫红质由所述载体的表达，用图12的5’utr载体和图17的3’utr载体转染weri细胞。图18显示这些细胞中h视紫红质和mir-708的表达。发现mir-708支架在3’utr中的载体比使用5’utr构型的载体产生更高水平的h视紫红质和mir-708 rna二者。[0201]实施例9：在视网膜变性的p23h小鼠模型中评估所述抑制/替代载体[0202]在视网膜变性的p23h小鼠模型中评估抑制/替代构建体。在这种模型中，在视杆细胞中表达的突变型p23h蛋白诱导了er应激/upr，引起凋亡和最终的视杆细胞死亡(lee，e.s.等(2007)febs lett.581(22)：4325-32)。在视杆细胞死亡之后，出现视锥细胞的非细胞自主性死亡。[0203]用表达mir-708和难以被mir708敲低的人视紫红质基因(因为其缺乏mir-708靶序列)的抑制/替代aav载体治疗p23h小鼠。抑制/替代载体导致wt和p23h小鼠视紫红质二者的敲低，但是替代视紫红质基因补偿了视紫红质wt水平上的降低。因此，所述载体提供必要的视杆细胞视紫红质以维持视杆细胞功能和完整性。[0204]还测试另一种备选抑制/替代构建体设计。如图19中所示，这种备选载体驱动mir-708从rk启动子的表达并且使用小鼠视蛋白启动子共表达h视紫红质(难以被mir-708敲低)。[0205]这些抑制/替代载体还如上所述在p23h小鼠模型中进行了测试，在所述p23h小鼠模型中内源人视紫红质包含单一拷贝功能丧失的等位基因(例如，该小鼠就人视紫红质敲除等位基因而言是杂合的)。这种杂合小鼠模型可以使用标准小鼠遗传技术由mrho-/-小鼠和上述p23h模型构建.不希望受限于理论，认为这种mrho+/-p23h小鼠模型(含有一个拷贝突变型人视紫红质p23h等位基因和一个拷贝野生型小鼠基因)可模拟人adrp基因型，在人adrp基因型中患者具有相等拷贝的突变型和野生型视紫红质等位基因。[0206]实施例10：评估其他抑制/替代载体[0207]克隆了数种载体，其从单一载体表达mir-708(或对照mirna序列)和h视紫红质二者。这些载体彼此的区别在于mirna序列的侧翼序列或者源自mir-155(得自invitrogen“block-it”系统)或者源自内源mir-7085’和3’侧翼序列。将mirna序列嵌入在视紫红质激酶启动子下游且在h视紫红质orf上游的hβ-球蛋白内含子中。目的是检测来自每种构建体的表达和mirna加工是否相似.另一对载体在h视紫红质orf下游含有该mirna序列(对照或mir-708)，也嵌入在β-球蛋白内含子中。在本实验中仅测试含有位于h视紫红质orf下游的mir-708内源侧翼5’和3’序列的载体，在其中β-球蛋白内含子位于h视紫红质orf上游的载体中测试了内源mir-708和mir-155两种侧翼序列。用每种构建体转染weri细胞，并且测定mir-708表达和h视紫红质表达二者.[0208]图20中的结果表明mir-155侧翼序列与内源mir-708侧翼序列相比产生了更好的mir-708表达(或mirna加工).在用含有mir-155侧翼序列的载体转染的那些细胞中mir-708表达与mir-708侧翼序列相比高约10倍.无论所述序列相对于h视紫红质orf位于上游或下游，含有mir-708侧翼序列的载体具有较低的mir-708表达。h视紫红质表达不受mir-708过度表达的影响，因为无论载体中共表达的mirna为何，其表达水平大致相等。未在含有对照mirna序列的载体中检测到mir-708表达，如预期的。[0209]实施例11：评估其他具有突变的mir-708靶序列的抑制/替代载体[0210]如上所述，已经在数种哺乳动物视紫红质基因的3’utr中发现对应于推定的mir-708靶位点的共有序列(behrman，s.等(2011)j.cell biol.192(6)：919-27).本实施例证明具有突变mir-708靶序列的视紫红质能够用于抑制/替代载体中。[0211]构建的raav载体包含编码mir-708的核酸和人视紫红质的基因。通过核酸取代、缺失或插入来使人视紫红质基因于mir-708靶序列突变(seq id no：19)，以减少或防止mir-708进行识别。在一些实施例中，整个mir-708靶序列缺失。在一些实施例中，mir-708的减少和防止(reduction or prevention by mir-708)参考mir-708对包含mir-708靶序列的野生型视紫红质3’utr的识别来测量。[0212]为了测试通过mir-708抑制体染色体显性视紫红质并同时表达野生型视紫红质，用表达mir-708和人视紫红质的质粒(带有(cba-mir-708-hrho-3’utr-)或不带有(cba-mir-708-hrho-3’utr+)突变的mir-708靶序列)转染表达编码3’utr mir-708靶序列的p23h突变型m视紫红质基因的hek-293细胞。还使用实施例2中描述的mir-对照。72小时之后，收集细胞，并使用蛋白质印迹分析mp23h视紫红质和人视紫红质蛋白表达。在用cba-mir-708-hrho-3’utr-或cba-mir-708-hrho-3’utr+转染的细胞中p23h m视紫红质的蛋白表达与用cba-mir-对照载体转染的细胞相比降低说明mir-708活性。人视紫红质在用cba-mir-708-hrho-3’utr-、而非cba-mir-708-hrho-3’utr+转染的细胞中的表达表明由cba-mir-708-hrho-3’utr-编码的视紫红质难以受到mir-708的抑制。[0213]实施例12：aav介导的对内源视紫红质和人视紫红质在小鼠视网膜中的表达的抑制[0214]基于上述实验，实施了进一步的实验在完整眼中检验视紫红质抑制/替代策略。本实施例证明了使用mir-708支架构建的抑制/替代aav载体在小鼠视网膜中的效力。[0215]构建了具有如下载体的aav5衣壳，所述载体包含视杆细胞特异性视蛋白启动子、mir-708支架(例如，mir-708内源支架/侧翼序列)和人视紫红质替代基因.在这种载体的一个版本中，插入mir-708序列(例如，与mir-708靶序列结合的mir-708序列)以驱动表达mir708支架背景下的mir-708和人视紫红质替代基因(aavsopsmir708708hrho).在这种载体的另一个版本中，生成的对照载体包含mir对照序列(aav5opsmir对照708hrho)。在两种载体中，替代性人视紫红质基因均难以受到mir-708敲低，因为其缺乏mir-708靶序列。两种载体均视网膜下注射至野生型小鼠的视网膜中。对于每只小鼠，未用药的对侧眼是未经注射的，并且将在每个经注射的视网膜中的表达标准化为相较于未经注射的对侧视网膜的表达倍数。注射后三周，收获视网膜并测定mir-708水平(图21a)、小鼠视紫红质mrna水平(图21b)和人视紫红质(图21c)。[0216]图21a显示与未用药的对侧眼相比，在注射aav5opsmir708708hrho载体后小鼠视网膜中mir-708水平的增加。在接受aav5opsmir708708hrho的眼中测量到了小鼠视紫红质的显著降低，而在接受对照载体aav5opsmir对照708hrho的眼中没有测量到小鼠视紫红质的降低(图21b)。此外，与对侧未经注射的未用药眼相比，两种载体均将人视紫红质水平升高高达100倍(图21c)。这些数据证明aav5opsmir708708hrho载体在体内是有效的.[0217]总的来说，优化的抑制/替代载体aav5opsmir708708hrho通过mir-708实现小鼠视紫红质的敲低(内源小鼠视紫红质具有3’utr靶序列)，同时实现替代人视紫红质的表达，其难以受到mir708敲低(人视紫红质替代基因缺乏3’utr mir708靶序列)。这些结果证明了抑制/替代策略在完整哺乳动物眼中的效力。[0218]实施例13：在人细胞中验证候选载体[0219]接下来测定基于aav5的候选载体在人细胞(hela)中促进mir-708和人视紫红质表达的能力。[0220]测试了两种不同的启动子：视紫红质激酶(grk1)和视蛋白启动子。上文描述了视紫红质激酶启动子。视蛋白启动子(示于seq id no：22)含有编码400bp cmv增强子的676bp片段，其在视蛋白启动子的上游(-500bp-+15bp)。此外，包括65bp nrl序列；这一序列编码神经视网膜碱性拉链因子(视杆细胞特异性转录因子)。启动子构建体下游是杂合内含子序列，其来自cba外显子1和小鼠细小病毒(mvm)-称作mvm内含子序列(示于seq id no：23).这种启动子构建体的示意图示于图22。[0221]使用了两种不同的支架：mir-155支架或mir-708支架。二者均嵌入β-球蛋白内含子中。总共测试4种候选载体：aav5grk1mir708_155hrho(aav5载体，具有视紫红质激酶启动子驱动表达mir-155支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质；seq id no：24)，aav5grk1mir708_708hrho(aav5载体，具有视紫红质激酶启动子驱动表达mir-708支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质；seq id no：25)，aav5opsmir708_155hrho(aav5载体，具有视蛋白启动子驱动表达mir-155支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质；seq id no：26)，和aav5opsmir708_708hrho(aav5载体，具有视蛋白启动子驱动表达mir-708支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质；seq id no：27)。图23a显示嵌入在β-球蛋白内含子中的mir-708序列。mir-708和mir-155支架分别示于图23b和23c。[0222]将4种候选aav5载体中的每一种用于感染hela细胞(使用adts149辅助病毒)，并测量mir-708和人视紫红质的水平。如图24中所示，如与驱动从视蛋白或视紫红质激酶启动子表达对照mir的载体相比(分别为ops mir-对照和rk mir-对照)，所有四种载体导致了mir-708和人视紫红质在人细胞中的体内表达。这些结果证明，成功地验证几种载体可用于在人细胞中的抑制/替代策略(例如上述那些)。[0223]序列[0224]mir-708核苷酸序列[0225][0226]人视紫红质氨基酸序列[0227][0228]人视紫红质cdna-utr缺失的[0229][0230][0231]人视紫红质cdna-包括3’utr[0232][0233][0234]仅rk-mir708[0235][0236]rk-mir-708-op-视紫红质[0237][0238][0239][0240]rk-内含子-视紫红质-mir-708.[0241][0242][0243]rk-mir-708-内含子hrho wt[0244][0245]rk-内含子-mir-708-op-hrho wt[0246][0247][0248]嵌合内含子[0249][0250]填充序列(stuffer sequence)[0251][0252][0253]pcba-h视紫红质-mir708(mir-155支架)[0254][0255][0256][0257][0258]mir155支架[0259][0260]内源mir708支架[0261][0262]prk-h视紫红质-mir-708(mir708内源支架中的mir708，其位于人视紫红质的3’utr中)[0263][0264][0265][0266]β-球蛋白内含子序列[0267][0268]mir155支架中的mir708序列[0269][0270]天然支架中的mir708序列[0271][0272]来自3’utr的人视紫红质mir-708靶[0273][0274]突变的aav itr[0275][0276]野生型itr序列[0277][0278]视蛋白启动子[0279][0280]mvm内含子[0281][0282][0283]aav5grk1mir708_155hrho(aav5载体，其具有视紫红质启动子驱动表达mir155支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质)[0284][0285]aav5grk1mir708_708hrho(aav5载体，其具有视紫红质启动子驱动表达mir-708支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质)[0286][0287][0288]aav50psmir708_155hrho(aav5载体，其具有视蛋白启动子驱动表达mir-155支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质)[0289][0290][0291]aav50psmir708_708hrho(aav5载体，其具有视蛋白启动子驱动表达mir-708支架中的mir-708和去掉mir-708靶序列的人视紫红质)[0292][0293][0294]含视锥视杆同源框的转录因子[0295][0296]cmv增强子[0297][0298]神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子[0299]









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