来自双歧杆菌的脂磷壁酸的用途的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于食品、饲料和制药行业。本发明尤其涉及来自双歧杆菌的脂磷壁酸(lta)，该脂磷壁酸具有减肥活性，因此可用于以下应用领域的开发：食品和饮料、动物饲料(包括宠物食品)、营养补充剂、婴儿营养、化妆品(包括营养学)、医疗食品以及医药和兽医应用等。背景技术：2.据世界卫生组织(world health organization)统计，在2016年，全球13％的人口(超过19亿人)超重，其中超过6.5亿成年人肥胖。尽管对这一问题的临床和流行病学知识有所提高，但工业化国家和发展中国家的肥胖和超重患病率显著增加。肥胖和超重是一种代谢和营养紊乱，对健康有严重影响，超重是肥胖的一种程度。肥胖是公认的高血压、缺血性心脏病、脑卒中、2型糖尿病和某些癌症等各种慢性病/疾病发病率的高危因素，这些疾病是西方世界发展中国家发病率和死亡率的重要原因。3.在与超重和肥胖的斗争中，食品行业引入了新的配料，以帮助消费者保持适当的体重。在研究和新产品开发领域，一种选择是添加某些成分，通过减少脂肪吸收或形成，或通过增加脂肪分解刺激脂肪动员，或通过提高脂肪氧化率，抑制能量作为脂肪的积累。4.另一种对预防或治疗超重和肥胖起积极作用的策略是通过诱导饱腹感、激活食欲的代谢调节或通过使身体更难从摄入的食品中吸收脂肪、调节肠道吸收某些类型脂肪的能力来控制和/或降低食欲。5.此外，肠道微生物群和益生菌已被证明对健康有积极影响，即肥胖。研究表明，肠道微生物群是调节体重和肥胖相关疾病/障碍的一个因素。乳酸菌(lab)和双歧杆菌属是成人胃肠道的正常菌群。几项研究(ep1945235、ep2898061、ep2129386、ep3048165)已经表明，从上述属中选择的菌株，通常称为益生菌，可以有效调节和控制人类代谢和肥胖，尽管对这些生物效应背后的确切机制知之甚少。6.lta是两亲性大分子，是革兰氏阳性细菌细菌细胞壁的主要成分，通过脂质部分锚定在细胞膜上。传统的lta聚合物结构由聚磷酸甘油酯(grop)主链形成，与糖脂结构或锚定结合。多元醇磷酸酯主链可被单糖(如葡萄糖或半乳糖)和胺(如丙氨酸或葡萄糖胺)取代。经典lta被划分为主要类别(i、ii、iii、iv)，可基于它们的化学结构进行区分。目前已知，在厚壁菌门的不同物种中自然发现lta i结构，包括但不限于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和链球菌。有益物种，如乳酸杆菌、乳球菌或明串珠菌，也显示i型lta结构，具有单个grop重复单元。[shiraishi et al.,2016,bioscience of microbiota,food and health,vol 35(4)147-161；scheewind&missiakas 2014,j.bacteriology,196(6)1133-1142]。[0007]目前已知一些微生物可产生非典型脂磷壁酸，通常称为脂多糖或细胞表面糖脂。这些非传统lta被归类为v型lta，并且代表附着在脂质上的多糖，而不是重复的磷酸二酯连接单元。v型lta包括巨嗜两性粒细胞，如脂多糖、gro-p-脂葡糖半乳糖呋喃和琥珀酰脂甘露聚糖。(schneewind o.and missiakas d.,j bacteriol,196(6),1133-42 mar 2014)。[0008]双歧杆菌lta包括在v型lta组中，并且通常被描述为由带有单体甘油磷酸酯侧链的葡萄糖-半乳聚糖链形成的脂多糖，通过半乳糖基糖脂连接到细胞膜。大分子双亲分子最可能的常见结构描述如下：[0009][0010]其中grop是甘油磷酸酯，m是半乳呋喃聚糖的重复单位数并且n是葡聚糖的重复单元数(hiroyoshi iwasaki,yoshio araki,eiji ito,masato nagaoka and teruo yokokura,j.bacteriology 1990,845-852)。[0011]一些研究报告了脂磷壁酸(lta)用于治疗和/或预防人类疾病和/或综合征的用途。美国专利申请us2014323430a1报道优选来自枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸和细菌内毒素的组合物用于治疗或预防代谢紊乱和/或细菌感染以提高反刍动物的牛奶能量效率的用途。此外，该文件还提到治疗或预防与腹部肥胖、血液中胆固醇和葡萄糖水平改变相关的人类代谢紊乱的可能性、以及治疗和预防细菌感染的可能性。[0012]美国专利申请us2012190634a1报道来自乳酸杆菌中的lta和作为抗炎剂的衍生糖脂用于治疗或预防炎症过程(如糖尿病)的用途，因为它们在抑制炎症细胞因子的产生方面具有功能。[0013]美国专利申请us2004147010a1中报道lta形式的乳酸菌的类似用途，即lta用于调节革兰氏阴性菌诱导的免疫反应、从而防止或减少所述革兰氏阴性菌诱导的炎症过程的用途。[0014]最后，国际专利申请wo9623896a1报道从链球菌分离的lta用于治疗癌症和治疗或预防高血胆固醇的用途。[0015]尽管为寻找对超重和肥胖症具有有益作用的益生菌做出了一些努力，但在该领域仍然需要找到具有减肥活性的改良化合物和组合物，用于治疗和/或预防这些疾病和相关代谢紊乱。[0016]发明概述[0017]本发明涉及从双歧杆菌获得的脂磷壁酸(lta)及其作为减肥剂的效果。[0018]发明人观察到，当双歧杆菌在作为碳源的过量糖(如葡萄糖)中生长时，即在培养的所有阶段，即滞后阶段、指数阶段和稳定阶段，葡萄糖不是限制性营养素，双歧杆菌在给受试者施用时获得减少体内脂肪沉积的意外能力。可如本说明书的实施例1所示，从这一刻起，发明人开始分析双歧杆菌的不同成分，发现在所述葡萄糖过量的条件下，细胞壁的lta成分令人惊讶地受到影响，lta成分比例/比率的变化，这使双歧杆菌获得所述减少脂肪沉积的能力。接下来，lta结构的分离和深入分析表明，来自在过量葡萄糖中培养的双歧杆菌的lta包含摩尔比丙氨酸/葡萄糖为至少0.5和摩尔比甘油磷酸酯/葡萄糖为至少1.2，这两个比率在从未在过量葡萄糖中培养的双歧杆菌分离的lta中是不同的(参见本说明书的实施例4)。因此，在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌及其分离的lta均显示出降低受试者体内脂肪的能力，并且可以作为药物中的活性化合物用于治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病、以及生产化妆品、食品和饲料产品。[0019]本发明的lta[0020]鉴于上述情况，在一个方面，本发明涉及脂磷壁酸(lta)，以下称为“本发明的lta”，包含摩尔比丙氨酸/葡萄糖为至少0.5和摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为至少1.2。[0021]在本发明的上下文中，术语“脂磷壁酸”或“lta”是指从双歧杆菌属物种中分离出来的脂磷壁酸，该双歧杆菌属物种已在过量葡萄糖中培养，即葡萄糖在培养的所有阶段(滞后期、指数期和稳定期)都不是限制性营养素。培养物中的葡萄糖监测可通过现有技术中广为人知的方法进行。[0022]如现有技术所知，从双歧杆菌中分离的lta具有以下结构[0023][0024]其中[0025]-grop是甘油磷酸酯，[0026]-gal是半乳呋喃聚糖，[0027]-每个x独立地选自氢和丙氨酸(ala)，[0028]-丙氨酸的分子数是m或m-p，m是gal的重复单元数并且p是gal的单元数，其中x是氢，[0029]-glc是葡聚糖，[0030]-m是gal的重复单元数，并且在10到20之间，优选在11到18之间，和[0031]-n是glc的重复单元数，并且在5到20之间，优选在8到12之间。甘油磷酸酯、丙氨酸、半乳呋喃聚糖和葡聚糖的化合物在现有技术中广为人知。[0032]如本文所用，术语“摩尔比”是指包含lta的不同化合物之间的比例，即，它涉及一种物质的摩尔数与另一种物质的摩尔数。在此，本发明的lta包含摩尔比丙氨酸/葡萄糖为至少0.5和摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为至少1.2。这意味着在lta分子中，丙氨酸的摩尔数相对于葡萄糖的摩尔数至少为0.5，并且在lta分子中磷酸甘油酯的摩尔数相对于葡萄糖的摩尔数至少为1.2。用于测量分子中每个组分的摩尔数的方法在现有技术中广为人知，并且它们是本领域技术人员的常规做法。[0033]在本发明的lta的特定实施方案中，所述摩尔比丙氨酸/葡萄糖为至少0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。[0034]在本发明的lta的更特定实施方案中，lta中的丙氨酸为l-丙氨酸、d-丙氨酸、或l-丙氨酸和d-丙氨酸的组合。发明人已经观察到，当lta具有功能性时，即显示出减少身体脂肪的能力，大多数丙氨酸是d-丙氨酸。[0035]在本发明的lta的另外特定实施方案中，所述摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0或12.5。[0036]在本发明的lta的更特定实施方案中，所述摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为12.6。[0037]从过量葡萄糖中培养的双歧杆菌中分离出的lta所遭受的其他结构变化与半乳糖、甘油和磷分子的数量有关。因此，在本发明lta的另一特定实施方案中，半乳糖/葡萄糖的摩尔比至少为0.8，甘油/葡萄糖的摩尔比至少为1.0，和/或磷/葡萄糖的摩尔比至少为5.0、10.0、15.0、20.0或25.0，优选磷/葡萄糖的摩尔比为26.0，更优选26.09。[0038]本发明的lta可从双歧杆菌属或“双歧杆菌”的任何物种中获得。本发明中使用的术语“双歧杆菌”是指双歧杆菌属，一种革兰氏阳性、非能动、常分枝的厌氧细菌。因此，术语“一种双歧杆菌”和“多种双歧杆菌”可以在本说明书中模糊地使用。它们是哺乳动物(包括人类)胃肠道、阴道和口腔中无处不在的居住物。如前所述，一些双歧杆菌被用作益生菌。术语“双歧杆菌”包括但不限于以下种类的细菌：b.actinocoloniiforme、青春双岐杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、b.aquikefiri、b.asteroides、b.biavatii、双歧分支杆菌、b.bohemicum、b.bombi、b.boum、短双歧杆菌、b.callitrichos、链状双歧杆菌、b.choerinum、b.commune、b.coryneforme、b.cuniculi、b.crudilactis、寓齿双歧杆菌、牙双歧杆菌、b.eulemuris、粪双歧杆菌、高卢双歧杆菌、鸡双歧杆菌、狐猴双歧杆菌、印度双歧杆菌、异形双歧杆菌、b.kashiwanohense、b.lemurum、长双歧杆菌、巨大双歧杆菌、b.merycicum、最小双歧杆菌、b.mongoliense、b.moukalabense、b.myosotis、伪链状双歧杆菌、伪长双歧杆菌、嗜冷双歧杆菌、白痢双歧杆菌、罗伊氏双歧杆菌、反刍双歧杆菌、萨吉尼双歧杆菌、b.scardovii、斯泰伦博兴双歧杆菌、斯特科里斯双歧杆菌、圣氏双歧杆菌、亚型双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、b.tissieri和b.tsurumiense。[0039]然而，在本发明的lta的特定实施方案中，lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。[0040]菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145(在本发明中也称为“bpl1”或“bpl0001”)根据《布达佩斯条约》的规定，于2012年5月14日在he colección de cultivos tipo(cect),parc cientific universitat de valencia,c/catedrático agustín escardino,9,46980paterna–valencia,spain保藏。[0041]在本发明的lta的另一特定实施方案中，lta得自长双歧杆菌，优选得自长双歧杆菌cect 7347。[0042]菌株长双歧杆菌cect 7347从三个月以下的健康母乳喂养婴儿的粪便中分离出，并且根据《布达佩斯条约》的规定，由科学调查委员会(csic)[地址：serrano 142,28006马德里，西班牙]于2007年12月20日保藏于作为国际保藏机构(西班牙巴伦西亚)的西班牙典型培养物保藏中心。其注册号为cect 7347。本发明菌株cect 7347的科学分类为：界：细菌科：厚壁菌门；类别：放线菌；目：双歧杆菌，科：双歧杆菌科，属：双歧杆菌，种：长双歧杆菌。保藏人授权申请人(biopolis s.l.)在本专利申请中参考上述保藏生物材料，并无保留地、不可撤销地同意自本专利申请提交之日起，或如果已要求优先权，则自优先权日起，将保藏材料向公众提供。[0043]本发明的lta可经历不同的处理，例如加热或冻干，以灭菌、保存或延长lta的保质期。因此，在特定实施方案中，本发明的lta是热处理或冻干的。[0044]此处使用的术语“热处理”是指通过直接或间接接触空气、流体、受热面或储罐，通过连续或不连续加热进行热处理的产品，包括但不限于热灭菌技术(如高压灭菌和巴氏灭菌)或其他工业处理，包括但不限于挤压、成型或喷雾干燥。[0045]本文所使用的术语“冻干”是指通过升华从含有本发明lat-v的溶液中去除游离水的方法，将溶液进行速冻，然后通过将冰转化为蒸汽的光真空加热去除冰。[0046]如本领域技术人员所理解的，本发明的lta可以与其他成分一起包含在组合物中。因此，在另一方面，本发明涉及包含本发明lta的组合物，以下称为“本发明组合物”。[0047]根据本领域技术人员已知的常规技术，根据本发明的组合物可与赋形剂和/或载体组合调配。因此，在特定实施方案中，本发明组合物还包括赋形剂和/或载体。[0048]术语“赋形剂”系指有助于吸收本发明组合物的任何组分、稳定所述组分或有助于制备组合物的物质，即使其具有稠度或提供使其更令人愉悦的香味。因此，赋形剂可具有保持组分结合在一起的功能，例如淀粉、糖或纤维素、甜味剂功能、着色剂功能、保护活性成分的功能，例如将其与空气和/或湿气隔离、片剂、胶囊或任何其他形式的制剂的填充功能，例如，二元酸磷酸钙，具有促进成分溶解及其在肠道中吸收的崩解功能，不排除本段中未提及的其他类型赋形剂。因此，术语“赋形剂”定义为添加到活性成分或其组合中的任何伽仑形式的材料，以实现其制备和稳定性，修改其感官特性或确定组合物的物理/化学特性及其生物利用度。“赋形剂”应允许组合物化合物的活性，也就是说，使其与所述组分相容。赋形剂的实例为凝集剂、填料、粉碎剂、润滑剂、涂布剂、甜味剂、调味品和着色剂。可接受辅料的非限制性、更具体的示例包括淀粉、糖、木糖醇、山梨醇、磷酸钙、甾体脂肪、滑石、二氧化硅或甘油等。[0049]术语“载体”优选为惰性物质。载体的功能是促进其他化合物的掺入，允许更好的剂量和给药，或使组合物具有一致性和形状。因此，载体是一种用于将本发明组合物的任何组分稀释至确定体积或重量的物质，或甚至在不稀释所述组分的情况下稀释所述组分的物质，能够允许更好的剂量和给药，或使组合物具有稠度和形态。[0050]在另一特定实施方案中，本发明的组合物是药物组合物。在这种情况下，该组合物的赋形剂或载体是“医药上可接受的赋形剂”或“医药上可接受的载体”。这意味着载体或赋形剂应允许药物组合物的化合物(本文为本发明的lta)的活性，也就是说，使其与所述组分相容。当呈现形式为液体时，药学上可接受的载体为稀释剂。同样，如果受试者(例如哺乳动物)能够耐受该组合物的施用，则该组合物(包括其成分)被称为“药理学上可接受”。[0051]药物组合物可通过任何适当的给药途径给药，为此，所述组合物将以所选给药途径的适当药物形式配制。[0052]例如，合适的给药途径可包括仓库给药、透皮给药、口服给药、直肠给药、透粘膜给药或肠道给药；肠外注射，包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、髓内注射，以及鞘内注射、直接脑室注射、腹腔注射、鼻内注射或眼内注射。然而，优选的给药途径是口服给药。[0053]用于肠外给药的药物制剂包括水溶性lta水溶液。此外，本发明的lta可制备为适当的含油注入悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。含水注射悬浮液可能含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。在一些实施方案中，活性成分(例如本发明的lta)可以是粉末形式，以便在使用前与合适的载体(例如无菌无热原(spf)水)混合。作为说明性示例，对于注射，根据本发明的药物组合物可配制为水溶液，例如在生理相容的缓冲液中，例如hanks溶液、ringer溶液或生理盐水缓冲液中。对于口服给药，可通过将lta与本领域公知的药学上可接受的载体组合来容易地配制相应的药物组合物。此类载体能够将本发明的lta配制成片剂、药丸、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，供待治疗患者口服。[0054]可通过添加固体赋形剂、任选研磨所得混合物并在添加合适的助剂(如需要)后处理颗粒混合物来获得口服药物制剂，以获得片剂或药芯。合适的辅料尤其是填料，例如糖，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；淀粉及其衍生物，例如玉米淀粉、糊精和小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、羟丙基淀粉、小麦淀粉、明胶、黄芩胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)；纤维素制剂，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基纤维素；无机化合物，如氯化钠、硼酸、硫酸钙、磷酸钙和沉淀碳酸钙。如果需要，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。[0055]dragee型芯配有合适的涂层。为此，可使用浓缩糖溶液，其可任选包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、油漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加到片剂或dragee涂料中以用于识别或表征本发明剂量的lta的不同组合。[0056]合适的流化剂包括但不限于氧化镁、合成硅酸铝、偏硅酸、氧化镁、含水硅酸、无水硅酸、滑石、硬脂酸镁和高岭土。合适的粘合剂包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯醇、阿拉伯树胶、黄芩胶、海藻酸钠、明胶和面筋。合适的稳定剂包括但不限于蛋白质，如白蛋白、鱼精蛋白、明胶和球蛋白；和氨基酸及其盐。合适的增稠剂包括但不限于蔗糖、甘油、甲基纤维素和羧甲基纤维素。合适的ph调节剂包括但不限于盐酸、氢氧化钠、磷酸盐、柠檬酸盐和碳酸盐。[0057]可经口使用的药物组合物包括但不限于由明胶制成的推合胶囊、以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。推合胶囊可含有lta与填料(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和稳定剂(可选)的混合物。在软胶囊中，lta可溶解或悬浮在适当的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，还可以添加稳定剂。所有口服制剂的剂量应适合此类给药。[0058]对于口腔给药，相应的药物组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。[0059]对于吸入给药，根据本发明使用的药物组合物可以通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以气雾剂喷雾形式从加压包或喷雾器方便地递送。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门以输送计量的量来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒可配制成含有lta和适当的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。[0060]替代药物组合物，在另一特定实施方案中，本发明组合物为营养组合物，在更特定实施方案中包含如上所定义的载体或赋形剂。[0061]在本发明中，术语“营养组合物”是指食品，其无论向食用者提供营养，都会有益地影响身体的一个或多个功能，从而提供更好的健康。在本发明中，所述营养组合物旨在缓解、减少、治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病，优选相关疾病为糖尿病。[0062]在更特定实施方案中，营养组合物是食品。如本文所使用的，术语“食品”和“饲料产品”是等效的，并且可以在本说明书中模糊地使用。食品可以是液体、粉末或固体。食品可供人类或非人类动物食用，包括婴儿营养、饲料和动物食品。食品包括本领域公知的功能性食品。食品的示例包括但不限于饲料、乳制品、蔬菜制品、肉制品、零食、糖果制品(例如但不限于巧克力、糖果和口香糖或泡泡糖)、饲料、饮料、婴儿食品、谷物、油炸食品、工业烘焙产品和饼干。乳制品的示例包括但不限于从发酵乳(例如但不限于酸奶或奶酪)或非发酵乳(例如但不限于冰淇淋、黄油、人造黄油或乳清)中提取的产品。例如，蔬菜产品包括但不限于任何形式的谷物、发酵的谷物(例如大豆酸奶、燕麦酸奶等)或未发酵的谷物以及零食。饮料可以是但不限于非发酵乳。在特定实施方案中，食品产品或食品选自水果或蔬菜汁、冰淇淋、婴儿配方奶粉、牛奶、酸奶、奶酪、发酵乳、奶粉、谷物、烘焙食品、乳制品、肉制品、糖果制品、动物饲料或饲料以及饮料。[0063]在另一特定实施方案中，营养组合物是营养补充剂。[0064]术语“营养补充剂”是“膳食补充剂”、“食品补充剂”、“食物补充剂”或“营养补充物”中任何一个术语的同义词，是指旨在补充由浓缩营养素或其他具有营养或生理效应的物质组成的正常饮食的产品或制剂。在本发明中，当摄入消化道补体时，对个体有营养或生理影响的“物质”是本发明的lta，它是本发明组合物的一部分。营养补充剂可以是单一或组合形式，并以剂型销售，即胶囊、药丸、片剂和其他类似形式、粉末小袋、液体安瓿和滴剂瓶以及设计为单次服用的其他类似形式的液体和粉末。[0065]营养补充剂中可含有多种营养素和其他元素，包括但不限于维生素、矿物质、氨基酸、必需脂肪酸、纤维、酶、植物和植物提取物。由于它们的作用是补充饮食中的营养素供应，因此不应将其用作平衡饮食的替代品，摄入量不应超过医生或营养师明确建议的每日剂量。营养成分也可以是所谓“特殊群体食品”的一部分，即满足特定营养需求的食品。[0066]本发明的组合物(药物组合物或营养组合物)可进一步包含至少一种生物活性化合物，优选用于治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病的生物活性化合物，优选相关疾病为糖尿病。[0067]如本文中使用的，术语“生物活性化合物”是指除本发明lta以外的任何物质，其生物活性与其调节一个或多个代谢过程的能力有关，从而促进受试者更好的健康状况。生物活性化合物可与本发明lta相互作用以改善lta的性质或效果，或可与协助本发明lta治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病(优选糖尿病)的受试者代谢相互作用。[0068]如上所述，由于本发明的lta具有降低脂肪的能力，它可用于治疗和/或预防肥胖、超重或糖尿病等相关疾病。[0069]因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的lta或本发明的组合物，以及它们之前公开的用作药物的所有特定实施方案。[0070]本文中使用的术语“药物”是指适于向人类和非人类受试者施用药物活性化合物的药物组合物。此类药物组合物或药物制剂被定义为包含本发明lta的组合物，其与至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体组合。本发明中使用的药学上可接受的赋形剂和/或载体在现有技术中为本领域专家所知，并已在前面段落中公开。[0071]优选地，以治疗有效剂量施用该药物。治疗有效剂量是指将在所应用组合物中使用的本发明lta的量，以防止、改善或治疗伴随本说明书中提及的疾病或紊乱的症状。给定药物的疗效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序确定，例如ed50(对50％人群有效的治疗剂量)和ld50(对50％人群致命的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指标，并且它可以表示为ld50/ed50之比。[0072]在另一方面，本发明涉及本发明的lta或本发明的组合物，以及它们之前单独或彼此组合公开的所有特定实施方案，用于治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病，优选的是，相关疾病是糖尿病。[0073]本文使用的术语“治疗”是指对患者(优选人类患者)的疾病或医疗状况的治疗，包括：[0074](a)预防疾病或医疗状况的发生，即对患者进行预防性治疗；[0075](b)改善疾病或医疗状况，即导致患者的疾病或医疗状况消退；[0076](c)抑制疾病或医疗状况，即减缓患者疾病或医疗状况的发展；或[0077](d)缓解患者的疾病症状或身体状况。[0078]本文使用的术语“预防”意指抑制肥胖(体重增加)的发生，即在肥胖状况开始之前施用本发明的lta。这意味着使用本发明的lta作为预防药物，从而防止体重增加，或由此预防可能由体重增加引起的疾病。[0079]术语“肥胖”通常指对健康构成风险的异常或过度脂肪积累，即“超重”肥胖水平。成年人肥胖的粗略人口测量是体重指数(bmi)，一个人的体重(公斤)除以他或她的身高(米)的平方。本文采用术语“肥胖”来描述以bmi为特征的状况，优选bmi≥30kg/m2，而本文采用术语“超重”来描述以体重指数(bmi)为特征的状况≥25kg/m2，但小于30kg/m2。对于青少年，“肥胖”是指根据世界卫生组织(who)学龄儿童和青少年生长参考资料，以年龄和性别的两个标准差体重指数为特征的一种状况。因此，术语“肥胖”和“超重”意味着治疗的医学适应症。[0080]就本发明而言，术语“相关或相关疾病/障碍”和“超重和/或肥胖引起的疾病/障碍”包括：糖尿病、代谢综合征、高血压、高血糖、炎症、2型糖尿病、心血管疾病、高胆固醇血症、激素紊乱、不孕症等，并且肥胖或超重是风险因素的疾病或障碍。[0081]在另一方面，本发明涉及一种减少受试者(优选哺乳动物，更优选人类)中脂肪积聚的方法，包括向受试者施用有效量的本发明lta或本发明组合物。[0082]在另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗受试者、优选哺乳动物、更优选人类的肥胖、超重或相关疾病(优选糖尿病)的方法，包括向受试者施用有效量的本发明lta或本发明组合物。[0083]类似地，本发明还涉及本发明的lta在制造药物组合物(或药物)中的用途，该组合物用于减少受试者的脂肪积聚，或用于预防和/或治疗受试者的肥胖、超重或相关疾病，优选地，所述受试者是哺乳动物，更优选人类。[0084]前面段落中针对本发明的lta和本发明的组合物公开的所有特定实施例适用于前面段落中公开的方法或用途。[0085]本发明还包括本发明的lta或本发明的组合物及其所有特定实施例单独或彼此组合的非治疗性用途。因此，在另一方面，本发明涉及本发明的lta或本发明的组合物用于身体脂肪减少的非治疗性用途。与本发明的lta或本发明的组合物相关的特定实施例适用于本发明方面。本发明的lta或本发明的组合物也可用于非肥胖受试者的非治疗性脂肪减少，即bmi《25kg/m2的“正常体重”受试者或上文定义的“超重”受试者，且无任何与肥胖相关的健康影响。此类使用仅用于美容或美容目的(美容用途)，而非基于医疗指示。此外，非肥胖受试者的体脂减少和/或体重维持可能涉及体重减轻和/或维持。该化妆品将对使用该化妆品的受试者产生独特的美容效果，从而减少身体脂肪。术语“美容效果”解释如下。类似地，本发明涉及一种用于体脂减少的非治疗性方法，包括向非肥胖受试者施用本发明的lta或本发明的组合物(包括其所有单独或相互组合的特定实施例)。[0086]在另一方面，本发明涉及本发明或本发明组合物在食品或饲料产品的精制中的用途。术语“食品”和“饲料产品”在此之前已经定义，并且适用于本发明方面。加工食品或饲料产品的过程和方法在现有技术中广为人知。[0087]在另一方面，本发明涉及一种用于获得本发明的lta的方法，以下称为“本发明的方法”，包括以下步骤：[0088](a)在作为碳源的过量糖中培养双歧杆菌，和[0089](b)从细菌的细胞壁分离lta。[0090]在第一步骤中，用于获得本发明lta的方法包括在作为碳源的过量糖中培养双歧杆菌。[0091]在本发明的上下文中，“碳源”是指生物体用作构建其生物量的碳源的分子。在获得本发明lta的方法中，使用的碳源是糖。糖是指所有单糖和双糖的一大类：最简单的碳水化合物。单糖包括葡萄糖、半乳糖和果糖，双糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。因此，在用于获得本发明lta的方法的特定实施方案中，糖选自葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。在更具体的实施方案中，糖是葡萄糖。[0092]进行双歧杆菌培养的条件在现有技术中广为人知。双歧杆菌可使用生长培养基如man、rogosa和sharpe培养基(mrs培养基)，由蛋白胨(1％)、肉提取物(0,8％)、酵母提取物(0,4％)、葡萄糖(2％)、磷酸氢二钾(0,2％)、醋酸钠三水合物(0,5％)、柠檬酸三铵(0,2％)、硫酸镁(0,02％)、七水盐(0005％)组成，并添加1ml/l聚山梨酯(吐温80)。人源双歧杆菌可在36-38℃、ph 6.5-7.0的厌氧条件下培养。[0093]在第二步骤中，用于获得本发明lta的方法包括lta的分离。可以在双歧杆菌生物量生长的任何时候从双歧杆菌中分离lta。因此，可以从滞后阶段结束时以及在培养的所有阶段进行分离。从双歧杆菌生物量中分离lta包括提取和回收lta。[0094]可通过本领域技术人员已知的技术从双歧杆菌中提取和回收lta，并可通过包括血清学在内的常规分析方法实现其检测(huub j.m.op den camp et al.1985.j.gen microbiol.,131(3),661-668)，和生化测定(如钼蓝试验)，以检测磷酸酯和地衣酚-硫酸反应用于己糖定量。[0095]在用于获得本发明lta的方法的特定实施方案中，双歧杆菌为动物双歧杆菌，优选动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选动物双歧杆菌乳酸亚种cect8145。[0096]在另一特定实施方案中，双歧杆菌是长双歧杆菌，优选长双歧杆菌cect 7347。[0097]最后，在另一方面，本发明涉及通过如上所述的本发明方法获得的lta。[0098]来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的lta的医药用途[0099]本发明表明，来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta导致秀丽隐杆线虫中的脂肪减少(参见实施例)。此外本发明证明，来自在作为碳源的过量糖(即在培养的所有阶段，即滞后期、指数期和稳定期，葡萄糖不是限制性营养素)中培养的双歧杆菌的lta的脂肪减少水平惊人地高于从其他菌属(例如乳酸杆菌和芽孢杆菌细菌，参见实施例的表1)获得的lta。此外，实施例还表明，当lta从特定菌株动物双歧杆菌乳酸亚种(cect8145)(在本发明中也称为“bpl1”或“bpl0001”)获得时，导致在本文测试的所有菌株中，脂肪减少水平最高(参见实施例的表1)。[0100]因此，本发明的另一方面涉及一种来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的脂磷壁酸(lta)作为药物的用途，其中lta的结构如下：[0101][0102]其中[0103]-grop是甘油磷酸酯，[0104]-gal是半乳呋喃聚糖，[0105]-每个x独立地选自氢和丙氨酸(ala)，[0106]-丙氨酸的分子数是m或m-p，m是gal的重复单元数并且p是gal的单元数，其中x是氢，[0107]-glc是葡聚糖，[0108]-m是gal的重复单元数，并且在10到20之间，优选在11到18之间，和[0109]-n是glc的重复单元数，并且在5到20之间，优选在8到12之间。[0110]在lta的特定实施方案中，x是丙氨酸。[0111]术语“药物”、“治疗”和“预防”及其特定实施方案已在前面段落中定义，并且适用于本发明的本方面。[0112]如前几段所述，可通过本领域技术人员已知的技术从双歧杆菌中提取和回收lta，并可通过包括血清学在内的常规分析方法实现其检测(j huub j.m.op den camp et al.1985,gen microbiol.,131(3),661-668)和生化测定(如钼蓝试验)，以检测磷酸酯和地衣酚-硫酸反应用于己糖定量[0113]在另一个方面中，本发明涉及一种来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的脂磷壁酸(lta)在用于治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病(优选糖尿病)中的用途，其中lta的结构如下：[0114][0115]其中[0116]-grop是甘油磷酸酯，[0117]-x是丙氨酸(ala)或氢(h)，[0118]-gal是半乳呋喃聚糖，[0119]-每个x独立地选自氢和丙氨酸(ala)，[0120]-丙氨酸的分子数是m或m-p，m是gal的重复单元数并且p是gal的单元数，其中x是氢，[0121]-glc是葡聚糖，[0122]-m是gal的重复单元数，并且在10到20之间，优选在11到18之间，和[0123]-n是glc的重复单元数，并且在5到20之间，优选在8到12之间。[0124]在来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的lta的特定实施方案中，x是丙氨酸。[0125]表述“在作为碳源的过量糖中培养”已在本说明书的开头进行了说明。在特定实施方案中，糖选自葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。在更具体的实施方案中，糖是葡萄糖。[0126]术语“肥胖”、“超重”和“相关疾病”在本说明书之前已经定义，并且其定义适用于本发明的本方面。[0127]来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的lta作为药物的用途和用于治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病(相关疾病优选是糖尿病)中的用途的特定实施方案中：[0128]摩尔比丙氨酸/葡萄糖为至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0，并且摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为至少1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0或12.5，优选摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为12.6；和/或丙氨酸为l-丙氨酸、d-丙氨酸、或l-丙氨酸和d-丙氨酸的组合。[0129]来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta的组成部分比例/比率的其他变化与半乳糖、甘油和磷分子的数量有关。因此，在另一特定实施方案中，半乳糖/葡萄糖的摩尔比至少为0.8，甘油/葡萄糖的摩尔比至少为1.0，和/或磷/葡萄糖的摩尔比至少为5.0、10.0、15.0、20.0或25.0，优选磷/葡萄糖的摩尔比为26.0，更优选26.09。[0130]术语“摩尔比”的含义已在本说明书之前进行了解释。[0131]在来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta作为药物的用途和用于治疗和/或预防肥胖、超重或相关疾病中的用途的更特定实施方案中，lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。[0132]在本发明的另外特定实施方案中，来自在作为碳源的过量糖(优选糖是葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta得自长双歧杆菌，优选长双歧杆菌cect 7347。[0133]菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145和长双歧杆菌cect 7347已在本文前面定义。[0134]在另外优选的实施方案中，来自双歧杆菌的lta经过热处理或冻干。术语“热处理”和“冻干”已在前面定义。[0135]本发明的另一方面涉及一种减少受试者、优选哺乳动物、更优选人类体内脂肪积聚的方法，包括向受试者施用有效量的来自双歧杆菌的lta。在用于减少受试者体内脂肪积聚的方法的优选实施方案中，lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145，和/或在用于减少受试者体内脂肪积聚的方法的另一优选实施方案中，lta经过热处理或冻干。[0136]类似地，在医疗用途范围内，本发明还涉及来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的lta在制备用于减少受试者体内脂肪积聚或用于预防和/或治疗受试者肥胖、超重或相关疾病的药物组合物中的用途，优选地所述受试者为哺乳动物，更优选为人类。[0137]公开的来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的lta的医药用途和包含其的药物组合物适用于前面段落中公开的方法或用途。[0138]来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的lta的非治疗性用途[0139]如上所述，来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta也可用于非肥胖受试者的非治疗性减肥，即bmi《25kg/m2的“正常体重”受试者或上文定义的“超重”受试者，且无任何与肥胖相关的健康影响。此类用途仅用于美容或美容目的(美容用途)，而非基于医疗指示。此外，非肥胖受试者的体脂减少和/或体重维持可能涉及体重减轻和/或维持。[0140]因此，本发明的另一个方面涉及来自在作为碳源的过量糖中培养的双歧杆菌的lta用于减少身体脂肪的非治疗性用途(或美容用途)，其中lta的结构如下：[0141][0142]其中[0143]-grop是甘油磷酸酯，[0144]-x是丙氨酸(ala)或氢(h)，[0145]-gal是半乳呋喃聚糖，[0146]-每个x独立地选自氢和丙氨酸(ala)，[0147]-丙氨酸的分子数是m或m-p，m是gal的重复单元数并且p是gal的单元数，其中x是氢，[0148]-glc是葡聚糖，[0149]-m是gal的重复单元数，并且在10到20之间，优选在11到18之间，和[0150]-n是glc的重复单元数，并且在5到20之间，优选在8到12之间。[0151]在来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta的非治疗性用途的特定实施方案中：[0152]摩尔比丙氨酸/葡萄糖为至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0，并且摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为至少1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0或12.5，优选摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为12.6；和/或[0153]丙氨酸为l-丙氨酸、d-丙氨酸、或l-丙氨酸和d-丙氨酸的组合。[0154]术语“摩尔比”的含义已在本说明书之前进行了解释。[0155]来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta的组成部分比例/比率的其他变化与半乳糖、甘油和磷分子的数量有关。因此，在另一特定实施方案中，半乳糖/葡萄糖的摩尔比至少为0.8，甘油/葡萄糖的摩尔比至少为1.0，和/或磷/葡萄糖的摩尔比至少为5.0、10.0、15.0、20.0或25.0，优选磷/葡萄糖的摩尔比为26.0，更优选26.09。[0156]在来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta的非治疗性用途的单独或与先前特定实施方案组合的另外特定实施方案中，来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。在本发明的另外特定实施方案中，来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta得自长双歧杆菌，优选长双歧杆菌cect 7347。菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145和长双歧杆菌cect 7347已在本文前面定义。[0157]在来自在作为碳源的过量糖(优选糖)中培养的双歧杆菌的lta的非治疗性用途单独或与先前特定实施方案组合的另外特定实施方案中，lta经过热处理或冻干。术语“热处理”和“冻干”已在前面定义。[0158]该化妆品将对使用该化妆品的受试者产生独特的美容效果，从而减少身体脂肪。[0159]本文所使用的术语“美容效果”是指来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta对外观的期望有利影响，其与身体脂肪的损失或维持相关，并且优选增强身体形状和清晰度。需要了解的是，使用来自在作为碳源的过量葡萄糖中培养的双歧杆菌的lta对受试者进行非治疗性美容治疗仅出于美学原因，并且仅在身体脂肪量不会显著增加健康风险的受试者中完成。使用来自在过量葡萄糖中培养的双歧杆菌的lta的非治疗性的、美容性的治疗也可导致体重减轻和/或用于体重控制，以防止(非病理性)体脂积聚和/或体重增加。[0160]另一个方面，本发明涉及来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta在用于食品或饲料产品的精制中的用途，其中lta的结构如下：[0161][0162]其中[0163]-grop是甘油磷酸酯，[0164]-x是丙氨酸(ala)或氢(h)，[0165]-gal是半乳呋喃聚糖，[0166]-每个x独立地选自氢和丙氨酸(ala)，[0167]-丙氨酸的分子数是m或m-p，m是gal的重复单元数并且p是gal的单元数，其中x是氢，[0168]-glc是葡聚糖，[0169]-m是gal的重复单元数，并且在10到20之间，优选在11到18之间，和[0170]-n是glc的重复单元数，并且在5到20之间，优选在8到12之间。[0171]在来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta在用于食品或饲料产品的精制中的用途的特定实施方案中：[0172]摩尔比丙氨酸/葡萄糖为至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0，并且摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为至少1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0或12.5，优选地摩尔比磷酸甘油酯/葡萄糖为12.6；和/或[0173]丙氨酸为l-丙氨酸、d-丙氨酸、或l-丙氨酸和d-丙氨酸的组合。[0174]术语“摩尔比”的含义已在本说明书之前进行了解释。[0175]来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta的组成部分比例/比率的其他变化与半乳糖、甘油和磷分子的数量有关。因此，在另一特定实施方案中，半乳糖/葡萄糖的摩尔比至少为0.8，甘油/葡萄糖的摩尔比至少为1.0，和/或磷/葡萄糖的摩尔比至少为5.0、10.0、15.0、20.0或25.0，优选磷/葡萄糖的摩尔比为26.0，更优选26.09。[0176]“食品”或“饲料产品”这两个术语在前面的段落中有定义。食品或饲料产品的示例包括但不限于功能性食品、益生菌、饮料、共生或合生元、膳食补充剂和/或营养制剂(含有来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta)、和/或包含它们的提取物。原则上，食品不受形式和类型的限制。例如，食品可以是液体、粉末或固体形式。本发明中提及的食品可供人类或非人类动物食用，包括婴儿营养、饲料和宠物食品。本发明的食品包括本领域公知的功能性食品。它们还可以包括不同的营养素、维生素、电解质、香料、着色剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸化剂(所谓的“起泡饮料”)等。[0177]可能含有来自在过量葡萄糖中培养的双歧杆菌的lta的食品的示例包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、糖果、比萨饼、拉面、其他面条、口香糖、乳制品，包括冰淇淋、各种汤、饮料、茶、饮料、牛奶、饲料等。[0178]在来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta在用于食品或饲料产品的精制中的用途单独或与先前特定实施方案组合的另外特定实施方案中，所述食品或饲料产品是营养补充剂。术语“营养补充剂”在本说明中已有定义。[0179]在来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta在用于食品或饲料产品的精制中的用途单独或与先前特定实施方案组合的另外特定实施方案中，lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。在本发明的另外特定实施方案中，来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta得自长双歧杆菌，优选长双歧杆菌cect 7347。菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145和长双歧杆菌cect 7347已在本文前面定义。[0180]在来自在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养的双歧杆菌的lta在用于食品或饲料产品的精制中的用途单独或与先前特定实施方案组合的另外特定实施方案中，lta经过热处理或干燥，包括冻干。术语“热处理”和“冻干”在此之前已定义。[0181]在另一方面，本发明涉及一种从双歧杆菌获得lta的方法，包括以下步骤：[0182](a)在作为碳源的过量糖中培养双歧杆菌，和[0183](b)从细菌的细胞壁分离lta。[0184]术语“碳源”和“糖”及其特定实施方案已经在前面段落中定义并应用于本发明方面。在用于获得本发明lta的方法的特定实施方案中，糖选自葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。在更具体的实施例中，糖是葡萄糖。[0185]进行双歧杆菌培养和从所述双歧杆菌中分离lta的条件在现有技术中广为人知，并且在本说明书中已在前面进行了解释。[0186]在用于获得lta的方法的特定实施方案中，双歧杆菌是动物双歧杆菌，优选动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。在用于获得lta的方法的另一特定实施方案中，双歧杆菌是长双歧杆菌，优选长双歧杆菌cect 7347。菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145和长双歧杆菌cect 7347已在本文前面定义。[0187]在另一方面，本发明涉及通过以下方法获得的lta，所述方法包括：(a)在作为碳源的过量糖(优选葡萄糖)中培养双歧杆菌，和(b)从细菌的细胞壁分离lta。[0188]在另一方面，本发明还包括以下实施方案：[0189]1.来自双歧杆菌的脂磷壁酸(lta)作为药物的用途，其中lta的结构如下：[0190][0191]其中[0192]-grop是甘油磷酸酯，[0193]-m是半乳呋喃聚糖的重复单位数，并且在10到20之间，和[0194]-n是葡聚糖的重复单元数，并且在5到20之间。[0195]2.来自双歧杆菌的lta在用于治疗和/或预防肥胖、超重或糖尿病中的用途，其中lta的结构如下：[0196][0197]其中[0198]-grop是甘油磷酸酯，[0199]-m是半乳呋喃聚糖的重复单位数，并且在10到20之间，和[0200]-n是葡聚糖的重复单元数，并且在5到20之间。[0201]3.根据实施方案1至2中任一个的来自双歧杆菌的lta的用途，其中m在11到18之间并且n在8到12之间。[0202]4.根据实施方案1至3中任一个的来自双歧杆菌的lta的用途，其中lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。[0203]5.根据实施方案1至4中任一个的来自双歧杆菌的lta的用途，其中lta经过热处理或冻干。[0204]6.来自双歧杆菌的lta用于身体脂肪减少的非治疗性用途，其中lta的结构如下：[0205][0206]其中[0207]-grop是甘油磷酸酯，[0208]-m是半乳呋喃聚糖的重复单位数，并且在10到20之间，和[0209]-n是葡聚糖的重复单元数，并且在5到20之间。[0210]7.根据实施方案6的非治疗性用途，其中m在11到18之间并且n在8到12之间。[0211]8.根据实施方案6至7中任一个的非治疗性用途，其中lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。[0212]9.根据实施方案6至8中任一个的非治疗性用途，其中lta经过热处理或冻干。[0213]10.来自双歧杆菌的lta在用于食品或饲料产品的精制中的用途，其中lta的结构如下：[0214][0215]其中[0216]-grop是甘油磷酸酯，[0217]-m是半乳呋喃聚糖的重复单位数，并且在10到20之间，[0218]-n是葡聚糖的重复单元数，并且在5到20之间。[0219]11.根据实施方案10的用途，其中m在11到18之间并且n在8到12之间。[0220]12.根据实施方案10至11中任一个的用途，其中所述食品或饲料产品是营养补充剂。[0221]13.根据实施方案10至12中任一个的用途，其中lta得自动物双歧杆菌，优选得自动物双歧杆菌乳酸亚种，更优选得自菌株动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145。[0222]14.根据实施方案10至13中任一个的用途，其中lta经过热处理或冻干。[0223]除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本发明的实践中，可以使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料。在整个说明书和权利要求中，“包括”一词及其变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组件或步骤。本发明的附加目的、优点和特征对于本领域技术人员来说将在审查说明书后变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来学习。以下示例和附图是作为说明提供的，并不打算限制本发明。[0224]附图简述[0225]图1.动物双歧杆菌乳酸亚种bpl1功能活性依赖细胞被膜成分。a)bpl1细胞的蛋白酶处理。b)使用剂量低于其mic的万古霉素和氨苄西林处理的bpl1细胞。c)培养基(mrs-cys)的葡萄糖限制(15g/l,10g/l)条件。d)通过在标准mrs-cys培养基(20g/l葡萄糖)或低葡萄糖(10g/l)mrs-cys下对600nm处od进行定量获得bpl1菌株的细胞生长曲线。在沿着生长曲线的不同时间评估葡萄糖水平。数据为平均值±sd.并通过两个生物学独立实验进行计算。e)在培养基(mrs cys)果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或半乳糖(10g/l)的限制。f)粘附caco-2上皮细胞。粘附试验中在葡萄糖10g/l(限制)或20g/l(标准)中生长的5x 108cfu/ml处培养bpl1。数据为三个独立实验的平均值±sd.。对于a)、b)、c)，表示细菌喂养线虫(野生型菌株n2)的荧光百分比。尼罗红在青壮年阶段被定量。奥利司他(6μg/ml)用作阳性对照。数据为平均值±sd.并由两个独立的生物学实验计算得出。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001,ns:无显著性。[0226]图2.来自bpl1的粗细胞壁部分发挥减脂活性。制备在标准条件(含20g/l葡萄糖的mrs-cys)和低葡萄糖(10g/l)下生长的细胞的bpl1细胞壁部分。表示细胞壁部分喂养线虫(野生型菌株n2)的荧光百分比。尼罗红在青壮年阶段被定量。奥利司他(6μg/ml)用作阳性对照。数据为平均值±sd.并由两个独立的生物学实验计算得出。**p《0.01；***p《0.001,ns:无显著性。[0227]图3.来自bpl1菌株的脂磷壁酸(lta)显示出减脂活性，并在不同处理下保持这种能力。a)从在标准mrs-cys(20g/l)中的bpl1和在低葡萄糖mrs-cys(10g/l)中生长的bpl1细胞中获得lta部分。b)加热或冻干来自bpl1细胞的lta部分不会影响其功能。c)不同剂量的纯化lta的减肥效果。d)荧光显微镜下野生n2型动物中活体年轻成年秀丽隐杆线虫的脂质含量的尼罗红染色的代表性图像。用bpl1细胞、热处理bpl1细胞(ht-bpl1)或lta喂养线虫。比例尺为250μm。作者使用尼康smz18荧光立体显微镜为本文拍摄的原始图像。e)使用来自bpl1的纯化lta喂食的秀丽隐杆线虫中甘油三酯含量(mm-tg/mg蛋白)的定量。f)从在标准mrs-cys(20g/l)中的bpl1和在低葡萄糖mrs-cys(10g/l)中生长的bpl1细胞中获得纯化lta。包括在葡萄糖过量或限制条件下生长的bpl1细胞。对于a)、b)、c)、f)，表示在细菌和lta喂养的线虫(野生型菌株n2)的荧光百分比。尼罗红在青壮年阶段被定量。奥利司他(6μg/ml)用作阳性对照。数据为平均值±sd.并由两个独立的生物学实验计算得出。**p《0.01；***p《0.001；ns:无显著性。[0228]图4.来自bpl1菌株的脂磷壁酸(lta)需要胰岛素样信号通路(igf-i)以发挥其减肥作用，并在高血糖条件下具有功能活性。a)在突变株daf-2和daf-16菌株中用lta喂养蠕虫；与活的bpl1细胞和热处理的bpl1细胞相同。b)经来自bpl1的lta处理的skn-1转录因子的秀丽隐杆线虫突变体的脂肪含量。c)处理对秀丽隐杆线虫高血糖模型的影响。野生型菌株n2的线虫在高葡萄糖(100mm)中生长。以二甲双胍作为阳性对照。对于a)、b)、c)，lta喂养的线虫(野生型菌株n2、gr1307、daf-16(mgdf50)、cb1370、daf-2(e1370)或lg333 skn-1(zu 135))的荧光百分比。尼罗红染色在青壮年阶段被定量。奥利司他(6μg/ml)用作阳性对照。数据为平均值±sd.并由两个独立的生物学实验计算得出。***p《0.001,ns:无显著性。[0229]图5.来自bpl1的lta具有减肥活性，并且机械破坏提供的lta略为有效。包括活细胞(bpl1)和被panda匀浆器或超声波破坏的细胞，作为阳性对照。ngm为阴性对照，奥利司他是一种减肥药，在试验中用作阳性对照。[0230]图6.得自动物双歧杆菌乳酸亚种bpl1(cect 8145)的lta部分的秀丽隐杆线虫的减肥效果。包括活细胞(bpl1)和热处理细胞(ht-bpl1)作为阳性对照。ngm为阴性对照，奥利司他是一种减肥药，在试验中用作阳性对照。[0231]图7.得自动物双歧杆菌乳酸亚种bpl1(cect 8145)和其他双歧杆菌、乳酸杆菌和杆菌菌株的lta部分的秀丽隐杆线虫的减肥效果。[0232]图8.得自其他双歧杆菌菌株、长双歧杆菌es1和动物双歧杆菌的纯化lta的秀丽隐杆线虫的减肥效果分析。[0233]图9.bpl1-lta的nmr谱。[0234]图10.在不同生长阶段和标准葡萄糖培养基(a)或葡萄糖限制(b)下获得的bpl1细胞的功能评价。***显著性p值《0.001；**显著性p值《0.01；ns:无显著性。[0235]图11.脂磷壁酸(lta)的纯化与表征。(a)bpl1细胞壁材料的正丁醇萃取后疏水相互作用色谱组分的磷酸酯含量的筛选。(b)sdspage和阿尔新蓝/银染色。[0236]图12.maldi-tof质谱。[0237]发明详述[0238]实施例1:来自动物双歧杆菌乳酸亚种cect 8145(bpl1)的脂磷壁酸(lta)减少脂肪沉积[0239]i–材料和方法[0240]秀丽隐杆线虫菌株和维持[0241]秀丽隐杆线虫n2野生型菌株(bristol)和突变菌株gr1307、daf-16(mgdf50)、cb1370、daf-2(e1370)和lg333 skn-1(zu 135)由明尼苏达大学(usa)的caenorhabditis genetic center(cgc)提供。[0242]线虫菌株在20℃下以大肠杆菌菌株op50作为食物源在线虫生长培养基(ngm)平板上常规繁殖。通过在20℃下从妊娠成虫中分离虫卵来同步蠕虫，并在ngm平板上孵化虫卵。在脂肪定量实验中，从卵期到成虫期用不同的化合物喂养蠕虫。葡萄糖替换为20g/l和10g/l的果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或半乳糖，保持其他成分不变(见上述配方)。在37℃下在由gaspaktmez anaerobe container system(bd)产生的厌氧气氛中18小时后，如上所述，在这些葡萄糖条件下培养的细菌在秀丽隐杆线虫减脂试验中进行测试。[0256]抗生素的影响[0257]bpl1也用补充氨苄西林或万古霉素的mrs-cys培养基来培养，使用低于双歧杆菌属mic的剂量。mrs-cys培养基补充0.1μg/ml和0.25μg/ml的每种抗生素，并在37℃下厌氧培养bpl1细胞18小时。生长后，通过离心收集细胞，并用盐水冲洗三次。连续地，通过在含有大肠杆菌op50的ngm琼脂平板顶部添加50μl，浓缩bpl1处理的细胞(od600＝30)在秀丽隐杆线虫减脂试验中进行测试。[0258]酶处理[0259]根据gopal et al.对bpl1细胞进行蛋白酶k处理[gopal,p.k.,et al.2001.int j food microbiol 67,207-216]。用蛋白酶k(p6556，sigma)处理过夜(18小时，37℃厌氧)培养的bpl1。生长后，通过离心收集细胞，并用50mm磷酸盐缓冲液(ph 7)洗涤三次。在50mm磷酸盐缓冲液(ph 7)中制备蛋白酶k储备液(1mg/ml)。然后，将洗涤的培养物与蛋白酶k在37℃下孵育30分钟。孵育后，通过离心回收细胞，并用m9缓冲液(kh2po4 3g/l；na2hpo4；6g/l；nacl 5g/l；1ml 1m mgso4)洗涤三次以停止反应。通过在含有大肠杆菌op50的ngm平板表面上添加50μl的细胞，处理的细胞浓缩(od600＝30)并在秀丽隐杆线虫减脂中进行测试。[0260]caco-2培养物中细胞粘附试验[0261]细胞培养和制备[0262]将caco-2细胞置于dulbecco改良的eagle最低必需培养基dmem中，具有补充10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸溶液的l-谷氨酰胺。为了粘附试验，将caco-2细胞以105细胞/孔的浓度接种在24孔标准组织培养板中。细胞在汇合后维持2周，此时它们被认为是完全分化的(m.pinto,s.r.-l.,et al.1983.biol.chem,323–330)。[0263]粘附试验[0264]将blp1的过夜培养物离心以去除培养基。用pbs缓冲液(nacl 8g/l；kcl 0.2g/l；na2hpo4 1.15g/l；kh2po4 0.2g/l)洗涤细菌颗粒，然后再悬浮在细胞培养基中并检查光密度，得到约1×108、5x108或1x109细胞/ml。然后在标准条件下将细菌细胞与caco-2细胞一起孵育2小时。然后，用pbs通过3倍洗涤去除未附着的bpl1细胞。为了计数附着的细菌细胞，通过移液回收每个孔中的单层。将caco-2细胞和附着的益生菌的混合物接种在mrs-cys琼脂上。为此，制备104至107cfu/ml的系列十进制稀释液。使用mrs-cys肉汤，通过倾注将每个稀释液中的材料接种到petri培养皿中。细菌培养物在37℃厌氧条件下培养48小时。还评估用于粘附试验的储备培养物中的细菌细胞密度。孵育后，对粘附细菌的数量进行量化。基于结果，计算每100个caco-2上皮细胞的粘附细菌数。[0265]秀丽隐杆线虫减脂试验[0266]秀丽隐杆线虫n2野生型菌株(bristol)和突变菌株gr1307、daf-16(mgdf50)、cb1370、daf-2(e1370)和lg333 skn-1(zu 135)由明尼苏达大学(usa)的caenorhabditis genetic center(cgc)提供。采用尼罗红(sigma,st.louis,mo,usa)染色法、然后之前描述的方案(martorell,p.et al.2016 j agric food chem 64,3462-3472)，测量秀丽隐杆线虫的脂肪含量。以0.05μg/ml的最终浓度将染料添加到接种op50的ngm平板表面。试验的阳性对照为含有大肠杆菌op50和奥利司他(6μg/ml)的ngm平板。[0267]同步蠕虫在这些平板中孵育三天，直到达到幼成虫阶段。在此期间之后，将线虫转移到m9缓冲液中，并使用fp-6200system(jasco analytical instrument,easton,md,usa)测量荧光，其中λex＝480nm和λem＝571nm。每个条件进行两个实验，以分析每个条件/处理总共120条线虫。[0268]甘油三酯(tg)定量[0269]使用triglyceride quantification kit(biovision,mountain view,ca,usa)对喂食来自在过量葡萄糖中培养的bpl1的分离lta的线虫的总tg进行定量。年龄同步的蠕虫在已经接种大肠杆菌op50的ngm平板或补充纯化lta(10μg/ml,1μg/ml and 0.1μg/ml)的ngm平板中培养。然后收集幼成虫并用m9缓冲液清洗。蠕虫沉淀后，去除上清液，并向蠕虫颗粒中添加400μl的甘油三酯测定缓冲液。用数字超声仪(branson ultrasonics corp.,danbury,ct,usa)在10％功率下使用4个30秒的脉冲对蠕虫进行超声处理。使用bca protein assay kit(thermo scientific,rockford,il,usa)测量每种情况下的蛋白质含量。样品在90℃下在热混合器(thermofisher)中缓慢加热两次5分钟，以溶解溶液中的所有tg。短暂离心后，按照制造商的说明，使用等分试样(50μl/孔)进行甘油三酯测定。在四个独立的实验中，每个条件包括四种不同的生物复制物。[0270]显微镜分析[0271]用荧光立体显微镜观察不同处理下尼罗红染色的线虫脂滴。用尼罗红(0.05μg/ml)在ngm平板上孵育从卵期到幼年期的蠕虫种群，bpl1、ht-bpl1和lta bpl1的剂量相同，在常规秀丽隐杆线虫减脂试验中进行测试。将年龄同步的蠕虫转移到新的琼脂糖1％(wt/v)平板上，并在配备nis-element图像软件的荧光立体显微镜(nikon-smz18)中测量荧光。每种情况总共分析30条蠕虫。奥利司他(6μg/ml)用作阳性对照。[0272]细胞壁部分[0273]将bpl1过夜培养物(100ml)煮沸10分钟，然后在4℃下离心14000x g8分钟。将造粒的细胞重新悬浮在5％(重量/体积)十二烷基硫酸钠(sds)中并煮沸25分钟。然后通过离心回收细胞，再次悬浮并在4％(wt/vol)sds中煮沸15分钟。不溶性物质在60℃下用蒸馏水冲洗五次。之后，用2mg/ml的链霉蛋白酶(10165921001，罗氏)处理不溶性细胞壁部分，以便在60℃下去除共价连接的蛋白质1小时。通过离心回收细胞壁提取物，并用蒸馏水冲洗一次，然后将不溶性颗粒重新悬浮在400μl的48％(体积/体积)氢氟酸(hf)(339261-100ml，sigma)中，并在2℃下孵育24小时。通过离心回收细胞壁部分，并用50mm tris-hcl(ph 7)缓冲液冲洗一次，然后用冷水冲洗五次以除去缓冲液。最后一次洗涤后，使用冻干micrococcus lysodeikticus(m3770,sigma)的标准曲线测量206nm处的吸收(schaub,r.e.&dillard,j.p.2017.bio protoc 7,doi:10.21769/bioprotoc.2438)，将含有不溶性细胞壁的部分标准化为10mg/ml。最后，将细胞壁部分储存在-20℃下。以27.5μg/ml的剂量在秀丽隐杆线虫减脂试验中评价细胞壁部分。[0274]lta纯化与分析[0275]如前所述，细菌经过丁醇萃取和疏水作用层析(kho,k.,and meredith,t.c.2018,journal of bacteriology 200:e00017-00018)。简而言之，通过在12000xg下离心15分钟，从过夜培养的培养物中回收细菌bpl1细胞，并用50mm ph 4.7的柠檬酸钠洗涤两次。将细菌颗粒悬浮在ph值为4.7的50mm柠檬酸钠中，并在1000bar的pandaplus 2000均质器(gea)中破碎。在12000xg下离心90分钟收集不溶性细胞材料颗粒，悬浮在50mm ph 4.7的柠檬酸钠中，并在37℃下用等体积的1-丁醇萃取45分钟。回收含有lta的水相，冷冻干燥，并溶解在50mm ph 4.7的柠檬酸钠中，并将其加载到疏水相互作用色谱柱((hitrap octyl ff)上。[0276]lta在柠檬酸钠50mm ph 4.7中以15％～65％的1-丙醇线性梯度纯化。如其他地方所述，通过磷酸盐分析测定含有lta的部分(draing,c.,et al.2006,j biol chem 281:455 33849-33859)。收集磷酸盐阳性样本并进行透析(图11a)。[0277]酸水解后，通过gc-q-ms分析纯化的lta。简而言之，lta在1g/l的hcl 2m中溶解，并在100℃下进行酸水解2小时。确定d-葡萄糖、d-半乳糖、甘油和甘油-3-磷酸为其三甲基硅基衍生物(fiehn,o.,et al.2000,anal chem 72:3573-3580)。gc在agilent 7820a气相色谱仪中进行，使用气相色谱柱db5-ms，连接5977b质量检测器，并通过与agilent fiehn gc/ms metabolomics rtl库进行比较进行鉴定。[0278]lta的生化表征[0279]lta分子在巴伦西亚scsie大学的蛋白质组学设施中通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间(maldi-tof)质谱进行表征(该蛋白质组学实验室是proteored prb3成员，由pt17/0019 of the pe i+d+i 2013-2016授权支持并由iscii和erdf资助)。简而言之，将1μl样品和1μl基质溶液(70％acn中10mg/ml chca，0.1％tfa)滴在样品板上。干燥后，使用反射模式下的质量光谱仪(5800maldi-toftof，absciex)分析样品，质量范围为1660-1500m/z，激光强度为6000。[0280]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进一步分析lta。lta的分子量显示在sds-page凝胶中，该凝胶使用阳离子染料alcian blue结合改良银染色进行成像，以增强敏感性(kho and meredith,2018，引自上文)。通过1h核磁共振(nmr)光谱分析lta的结构。简而言之，1h-nmr是在bruker avance iii 700ultrafield光谱仪(bruekr biospin，rheinsetten，germany)上进行的，该光谱仪以700.13mhz的1h频率运行，并配有5mm的tci(cryoprobe)和z梯度。所使用的采集脉冲序列来自bruker topspin 3.6，具有水预饱和和2s循环时间。使用0ppm下的tsp信号参考光谱(图9)。[0281]lta的纯度通过鲎试剂分析法(lonza bioscience,switzerland)测定其内毒素含量来确定，因为该测试对lta不敏感(morath,s.,et al.2001,j exp med 193:393-397)。通过测量260nm和280nm处的紫外线(uv)吸收测定dna和rna污染(nanodrop spectrophotometer,thermo fisher scientific,usa)。通过在alliance 2695 hplc系统(waters corporation，ma，usa)中进行的液相色谱分析，结合折射率检测器(型号2414，waters corporation ma，usa)和离子交换柱(aminex hpx-87h,bio-rad,ca,usa)，测定pg主链n-乙酰壁酸的糖成分。在纯化的lta的酸水解(hcl 2m,100℃,2小时)和三甲基硅衍生后，通过gc-q-ms测定氨基酸鸟氨酸、赖氨酸和丝氨酸(fiehn,o.et al.,2000，引自上文)。gc在气相色谱仪(型号7820a，agilent,ca,usa)中进行，使用气相色谱柱db5-ms，连接5977b质量检测器，并通过与agilent fiehn gc/ms metabolomics rtl库进行比较来鉴定。[0282]对于肽聚糖的酶水解，纯化的lta样品用突变体蛋白酶(sigma)处理(0.04mg/ml 37℃，4小时)。过滤后(amicon ultra-0.5，merck millipore，germany)，使用最终浓度为5mg/ml的硼氢化钠还原可溶性胞壁肽。20分钟后，用磷酸将ph值降低至2-4，停止反应。使用hplc分离片段，并在30℃下进行phenomenex(ca,usa)的反相十八烷基二氧化硅(ods)c18柱洗脱，如下所示：0至100％缓冲液b(50mm磷酸钠ph5.10，15％(v/v)甲醇)的线性梯度，在缓冲液a(50mm磷酸钠ph4.33)中10分钟后120分钟，流速为0.5ml/min。通过监测abs 206nm来检测洗脱化合物(schaub and dillard,2017，引自上文)。[0283]统计分析[0284]结果以平均值±标准偏差表示。采用单因素方差分析(anova)和tukey多重比较后检验对秀丽隐杆线虫脂肪沉积数据进行分析。为了比较不同秀丽隐杆线虫菌株之间的效果，采用了双向anova检验。通过student t检验分析各组间细胞粘附试验的差异。所有统计分析均使用graphpad prism 4软件进行，将统计显著性水平设置为5％。[0285]ii–结果[0286]为了鉴定bpl1益生菌菌株中负责减肥功能活性的分子，我们使用线虫秀丽隐杆线虫作为简单快速的模型来评价由不同细胞组分产生的减肥。这种线虫在皮下和肠道细胞中储存脂质，很容易通过染色(尼罗红)检测。许多参与脂质合成、降解和运输的蛋白质在秀丽隐杆线虫和哺乳动物之间是保守的。[0287]先验上，减脂活性可能存在于细菌细胞和/或培养上清液中。因此，我们首先测试培养基，即饲养野生型菌株n2的年龄同步线虫，并用益生菌bpl1菌株在mrs+cys培养基中过夜培养后获得的上清液喂养。当对这些线虫进行尼罗红染色并随后在荧光光谱仪中进行荧光定量时，未观察到对脂肪减少的影响(数据未显示)。因此，我们可以放弃这种活性是由于生长过程中可分泌或释放的物质引起的。[0288]考虑到细胞的主要成分之一是dna，并且知道益生菌的dna已被证明发挥某些功能活性，我们在秀丽隐杆线虫中测定从bpl1分离的dna。然而，dna并没有显示出减肥效果(数据未显示)。[0289]为了评价bpl1细胞的可溶性或不溶性成分是否是其脂肪减少活性的原因，我们机械破坏从过夜培养中获得的bpl1细胞，并生成通过离心分离的不溶性和可溶性细胞部分。荧光分析揭示，减脂活性主要存在于不溶性部分(数据未显示)。这一结果表明，该化合物更可作为细胞壁、膜表面相关蛋白或表面相关多糖等的一部分存在于细胞被膜中。[0290]为了测试某些与bpl1细胞表面相关的蛋白质是否能起到减肥效果，将bpl1益生菌菌株的整个细胞用蛋白酶k(50μg/ml)处理，然后用作线虫的饲料。这种处理不会影响细胞的功能活性，这表明负责减脂效果的分子不是表面蛋白质，或者至少它不可被这种蛋白酶降解(图1a)。[0291]已经获得bpl1细胞被膜的功能活性的证据，我们设计不同的策略来研究菌株在不同培养基中培养时的功能，这些培养基可以改变细胞被膜的组成。氨苄西林通过抑制转肽酶干扰细胞壁合成。万古霉素是一种糖肽，通过阻断n-乙酰壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖的转糖作用抑制细胞壁合成。因此，我们在亚致死剂量氨苄西林或万古霉素存在下培养bpl1，并评估细胞的功能。在这些条件下，细胞可以生长，但预期会改变细胞被膜的特性。有趣的是，在这些培养条件下获得的细胞在线虫中没有发挥减脂效果(图1b)。该结果表明，细胞被膜的改变会显著影响益生菌的减肥特性，从而强化该化合物是细胞被膜成分的假设。[0292]改变细胞被膜性质的第二个策略是在培养基中使用葡萄糖限制条件，因为葡萄糖是许多被膜成分生物合成的前体。细胞在mrs+cys培养基中培养过夜，并用不同浓度的葡萄糖配制。值得注意的是，在限制葡萄糖条件下培养的bpl1细胞在秀丽隐杆线虫中失去其减肥能力(图1c)。细胞的功能活性明显不同，这取决于葡萄糖的可用性(图1d)。有趣的是，当在所有生长阶段收集到含有20g/l葡萄糖(过量葡萄糖)的bpl1细胞时，这些细胞都具有减脂活性，但含有限制性葡萄糖(10g/l)的bpl1细胞仅在最初的指数期，即葡萄糖主要可用时，才具有减脂效果(图10a y 10b)。这种观察强调，在某些情况下，益生菌的功能性活动可需要特定的环境条件。[0293]此外，d-葡萄糖在mrs-cys培养基中被不同的糖取代，例如果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或半乳糖。结果表明，在所有情况下(10g/l)在糖限制条件下生长的细胞减脂表型均丧失，而在糖含量较高(20g/l)的情况下细胞仍具有功能(图1e)。结果表明，细胞被膜的组成显著依赖于作为底物的大量糖的存在。[0294]考虑到细胞粘附可能是发挥减肥活性的重要特性，我们研究葡萄糖限制是否会改变bpl1细胞粘附肠道的上皮细胞的能力。为了评估该参数，我们使用一种用于表征益生菌粘附潜力的常规分析方法(darfeuille-michaud,a.et al.1990.infect immun 58,893-902)。在标准mrs-cys培养基(含20g/l葡萄糖)中生长的bpl1与含10g/l葡萄糖的菌株相比，对caco-2细胞的粘附性显著增强(p《0.01％)(图1d)。因此，这些结果再次证实来自bpl1的细胞被膜的组成受葡萄糖调节的观点，并且这种调节导致细胞粘附能力的巨大差异。[0295]在这一阶段，我们研究了细胞被膜的哪一部分可与观察到的特性有关。在这个意义上，我们分析了含有肽聚糖(pg)的bpl1细胞壁部分。[0296]为了评估bpl1衍生的pg对秀丽隐杆线虫减脂的潜在活性，我们从在过量葡萄糖(mrs-cys培养基)中和限制葡萄糖浓度下培养的bpl1制备细胞壁部分。我们的结果表明，当细胞壁部分由在葡萄糖限制条件下生长的bpl1细胞制备时，减脂活性不存在，而当细胞在葡萄糖条件下生长时，减脂活性发挥作用(图2)。这一结果指出，细胞壁部分或与此部分一起提取的成分负责减肥。[0297]为了分析有无葡萄糖限制的细胞壁部分之间的差异，我们测定细胞壁部分的氨基酸组成。然而，氨基酸对映体分析显示，两种组分之间仅存在微小差异(数据未显示)，这表明pg的肽组成很可能不是造成这种差异的原因。[0298]相反，当我们用破坏其结构的胞壁酶处理细胞壁部分时，我们没有观察到任何减脂活性的降低(数据未显示)，这表明可能是与细胞壁部分共纯化的成分，而不是pg，可负责该活性。[0299]然后，我们将兴趣集中在脂磷壁酸(lta)，这种脂磷壁酸有时被发现是细胞壁部分中的杂质。lta是一种重要的细胞被膜成分，通过脂质部分锚定在细胞膜上。从生长有或无葡萄糖限制的bpl1细胞中获得lta，并评估bpl1培养基中的葡萄糖限制是否影响lta功能。从含有10g/l和20g/l葡萄糖的mrs-cys中的bpl1培养物中获得lta部分，并评估其在秀丽隐杆线虫中的减脂能力。从生长在葡萄糖培养基中的bpl1细胞中提取的lta是活性的，而从生长在限制性葡萄糖培养基中的bpl1中分离的lta是无功能的(图3a和表1)。[0300]表1:由低剂量葡萄糖(10g/l)培养的bpl1和bpl1获得的lta提供的秀丽隐杆线虫的减脂百分比。ht-bpl1–加热-b.lactis cect 8145。[0301]条件％减脂bpl1(20g/l葡萄糖)31.19ht-bpl126.51bpl1 lta(20g/l葡萄糖)25.60bpl1 lta(10g/l葡萄糖)2.26[0302]此外，在热处理和冻干后评估lta部分的减脂活性，这两种方法都能保持其活性(图3b)。最后，纯化步骤后证明lta的减脂效果(图3c)。还测试更高剂量的lta(20和50μg/ml)，但观察到与10μg/ml相似的减少效果(数据未显示)。图3d显示喂食bpl1细胞、热处理细胞(ht-bpl1)和来自bpl1的lta的线虫体内的脂质储存。由于甘油三酯(tg)是秀丽隐杆线虫体内储存的脂滴的主要成分，并且脂质积累与该线虫中tg含量的增加有关(zhang,j.,et al.2011,j mol biol 411:537-553)，我们进一步量化三种lta有效剂量喂养的线虫中tg的水平。结果表明，喂食lta的动物的总tg含量显著降低(10μg/ml；p《0.01；1和0.1μg/ml；p《0.05)(图3e)。这些结果支持观察到的总脂肪减少，并且与益生菌菌株bpl1(及其热处理形式)的脂肪减少效果一致。[0303]此外，在葡萄糖限制条件下，与标准mrs-cys培养基相比，从在mrs-cys中培养的bpl1细胞中纯化lta，并评估其在秀丽隐杆线虫中的减脂能力。从标准葡萄糖培养基中生长的bpl1细胞中提取的lta是活性的，而从限制性葡萄糖培养基中生长的bpl1细胞中分离的lta是无功能的(图3f)。[0304]已经证明来自bpl1菌株的lta在减脂方面的功效后，接下来我们研究这种功能效应的潜在机制。我们之前曾报道，bpl1细胞的减脂和抗氧化活性依赖于iis途径(martorell,p.et al.2016.j agric food chem 64,3462-3472)。由于iis途径的进化保守性，研究线虫中针对该途径的化合物可有助于阐明其在高等生物和人类中的功能。为了研究iis途径在lta介导的减脂中的作用，对iis途径中的关键调节因子daf-2(胰岛素受体)/daf-16进行了评估。荧光分析表明，daf-16突变(daf-16(mgdf50))消除lta介导的减脂效果(图4a)。bpl1和ht-bpl1细胞也是如此。该结果有力地表明，bpl1诱导的减脂是daf-16依赖性的。daf-2是iis途径中daf-16上游的人类胰岛素受体同系物，与人类一样，胰岛素受体突变会增加脂肪积累，表现出肥胖表型。我们的结果表明，用lta喂养daf-2突变体(daf-2(e1370))蠕虫不会产生脂肪减少表型，表明lta介导的daf-16调节依赖于daf-2，并且因此，lta效应需要胰岛素/igf-i样信号通路(iis)(图4a)。此处，我们观察到bpl1和ht-bpl1的不同反应，这两种反应独立于skn-1，因为在缺乏哺乳动物nrf转录因子直系同源物的秀丽隐杆线虫突变体中仍观察到减脂效果(图4b)。类似地，lta也降低skn-1转录因子突变的秀丽隐杆线虫的脂肪含量(图4b)，表明其功能不需要skn-1。[0305]胰岛素信号通路也参与葡萄糖转运，在葡萄糖稳态和胰岛素敏感性中发挥作用。因此，它是糖尿病(或肥胖相关糖尿病)研究的靶向途径，靶向该途径的化合物成为潜在的治疗药物。在秀丽隐杆线虫中，葡萄糖通过上调igf-i途径(iis)活性或增加活性氧(ros)缩短寿命，因此，据认为，秀丽隐杆线虫是评估葡萄糖毒性和开发更有效糖尿病治疗的良好模型系统。[0306]因此，我们使用高葡萄糖喂养的线虫建立糖尿病模型，并评估lta的疗效。考虑到葡萄糖是甘油三酯(tg)的已知前体，并且tg是线虫中脂滴的主要成分，我们评估葡萄糖(100mm)对线虫脂肪含量的影响。我们的结果表明，喂食高葡萄糖ngm的线虫的脂肪含量增加20％，与其他报告一致(图4c)。用于治疗2型糖尿病的药物二甲双胍(biguanide)被纳入healthcare life sciences,uk)上进行疏水相互作用色谱(hic)。通过线性梯度从起始缓冲液到洗脱缓冲液进行洗脱(60％正丙醇在0.1m醋酸铵中，ph 4.7)。通过钼蓝试验对获得的部分进行评估，以检测收集和冻干的含磷部分(villéger r,et al.2014.antonie van leeuwenhoek.106:693-706)。[0319]ii–结果[0320]如上所述，lta得自动物双歧杆菌乳酸亚种bpl1，并与双歧杆菌属、乳酸杆菌属和芽孢杆菌属的其他菌株进行比较。[0321]将获得的lta添加到线虫培养物(ngm)中。蠕虫在不同条件下喂养，并且总脂肪含量通过尼罗红染色法(荧光染料，与脂滴特异性结合)测量，遵循实施例1中所述的相同方案。[0322]结果表明，在双歧杆菌菌株中，来自动物双歧杆菌乳酸亚种bpl1的lta最为有效(减脂30.79％)，清楚地表明bpl1 lta的活性优于其他双歧杆菌。此外，与得自乳酸杆菌和杆菌菌株的lta相比，得自双歧杆菌菌株的lta具有更高的减肥效果(图7和表2)。[0323]表2:由得自bpl1和其他双歧杆菌、乳酸杆菌和芽孢杆菌菌株获得的lta提供的秀丽隐杆线虫的减脂百分比。[0324]条件％减脂lta-动物双歧杆菌乳酸亚种(cect8145或bpl1)30.79lta-动物双歧杆菌(bpl30)21.05lta-长双歧杆菌(cect 7347或es1)26.71lta-干酪乳杆菌(bpl4)13.75lta-鼠李糖乳杆菌(lgg)14.56lta-l.rhamnosus(bpl15)6,51lta-l.rhamnosus(cncm-i4036)2,85lta-l.rhamnosus(cncm-i4034)3,55lta-枯草芽孢杆菌16816.65lta-b.subtilis cect3515.29lta-b..subtilis bpl839.79[0325]按照之前描述的方案，从其他双歧杆菌菌株中分离和纯化lta。来自长双歧杆菌es1(cect7347)的lta在秀丽隐杆线虫体内的减脂能力进行功能评价。结果表明，es1-lta显著降低线虫的脂肪含量，但程度低于bpl1-lta(图8)。[0326]实施例4:当在作为碳源的过量糖中培养时，降脂lta(来自bpl1)显示出特定的结构特征。[0327]i–材料和方法[0328]来自在过量糖中培养的双歧杆菌的lta的分离[0329]如上述实施例所述，从bpl1获得lta。[0330]lta的分析[0331]根据文献中描述的方法确定从bpl1获得的lta的结构和组成，并显示其含有d-葡萄糖、d-半乳糖、甘油、磷和丙氨酸。[0332]简而言之，在bruker avance iii 700ultrasield光谱仪(bruekr biospin,rheinstetten,germany)上进行1h核磁共振(nmr)实验，以700.13mhz的1h频率运行，并配备带z梯度的5mm tci(cryoprobe)。所使用的采集脉冲序列来自bruker topspin 3.6，具有水预饱和和2s循环时间。使用0ppm下的tsp信号参考光谱。[0333]通过使用agilent 7820a气相色谱系统和5977b质量检测器(使用db5-ms柱)对样品进行酸水解后，确定d-葡萄糖、d-半乳糖、甘油、甘油-p和总丙氨酸为其三甲基硅基衍生物。通过将保留时间和光谱质量与agilent fiehn gc/ms metabolomics rtl库中的保留时间和光谱质量进行比较来进行鉴定。[0334]丙氨酸的l-和d-异构体是在alliance 2695hplc系统中测定的，该系统来自waters，与光电二极管阵列检测器(型号2996，waters)连接。在phenomenex的手性柱chirex 3126(d)-青霉胺中进行分离，并通过保留时间和吸收光谱与d-和l-丙氨酸分析标准进行鉴定[0335]ii-结果[0336]bpl1 lta的不同化学成分的量通过上述技术确定，如本领域技术人员所知。简而言之，在纯化的lta样品中测定半乳糖、甘油、丙氨酸、甘油-p和磷的含量，这些样品来自在过量葡萄糖(bpl1，20g/l葡萄糖)和限制葡萄糖(bpl1，10g/l葡萄糖)条件下生长的bpl1培养物。[0337]如表3所示，在从过量糖中生长的bpl1中纯化的lta样品中，发现甘油和甘油磷酸酯vs葡萄糖、和丙氨酸vs葡萄糖的相对含量惊人地高，并且在秀丽隐杆线虫中发挥减脂效果。[0338]表3.不同生长条件下bpl1 lta的成分分析。[0339][0340]表4.丙氨酸异构体分布[0341][0342]结果如图8所示。[0343]为了验证这一点，我们从在mrs-cys中生长的bpl1菌株过夜培养物中分离纯化lta。lta的分离和纯化通过下列方式：对bpl1细胞裂解物的不溶部分进行丁醇萃取，然后进行疏水交换色谱，如前所述，以获得高质量的lta(morath,et al.,2001(上文引用)；draing,et al.2006(上文引用)；gründling and schneewind,2007,proceedings of the national academy of sciences 104:8478-8483；kho and meredith,2018(上文引用))。通过磷酸酯分析获得单个洗脱峰(图11a)。形成峰的部分被收集并用作纯化的lta。lta的纯度与潜在交叉污染物、细胞壁材料和核酸有关，并且通过特异性分析确定。通过lal测定排除内毒素污染，并且冻干lta中内毒素含量《5eu/mg。通过测量260nm和280nm处的紫外吸收来确定核酸污染。dna/rna占重量比少于1.5％。通过分析突变体蛋白酶处理后衍生的胞壁肽，排除肽聚糖污染，其中未检测到肽聚糖片段的峰值。此外，已知存在于bpl1的pg中的n-乙酰壁酸(murnac)或氨基酸鸟氨酸、赖氨酸和丝氨酸(之前通过bpl1肽聚糖总水解物的1d和2d-tlc测定，数据未显示)，未通过纯化lta总水解物的气相色谱或液相色谱检测到。为了进一步表征纯化的lta，在sds-page后通过alcian蓝/银染色对样品进行染色(图11b)，并使用maldi-tof质谱和核磁共振(图12)进行分析，从而揭示评估分子质量分布在8-10kda范围内的化合物。









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