组织工程化椎间盘

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术组织工程化椎间盘1.相关申请的交叉引用2.本技术要求于2019年11月20日提交的美国临时申请第62/938,078号的权益，其通过引用整体并入本文。3.关于联邦资助研究的声明4.本发明是在美国退伍军人事务部颁发的补助金ik2rx001476、i01rx002274、ik1rx002445和i21rx003289下由政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。背景技术：：：5.背部和颈部疼痛在现代社会中普遍存在，每年约有一半的成年人受到影响，约有三分之二的成年人在他们生活中的某个时刻受到影响。在全球范围内，背部和颈部疼痛是失能寿命损失年的四大因素中的两大因素，而对这些病状的治疗增加了医疗保健支出，但没有证据表明患者健康状况有所改善。尽管背部疼痛的原因是多方面的，并且仍未得到充分地了解，但椎间盘退变常常与轴向脊柱疼痛和神经源性四肢疼痛相关联。椎间盘退变的特征在于一系列细胞、组成和结构变化，包括髓核(np)中蛋白聚糖含量的损失、细胞死亡、纤维环(af)的解体和椎间盘高度塌陷；这些变化在一起最终会损害椎间盘的力学功能。脊柱融合术可以在患有衰弱性轴向颈部或背部疼痛和椎间盘严重退变的患者上进行；当需要去除椎间盘以恢复椎间盘间隙高度(对神经孔间接减压)或进入使椎管变窄的椎间盘-骨赘复合物时，通常也会进行融合术。脊柱融合术不会恢复原生椎间盘结构或力学功能，因为它会固定退行性运动节段；由于整个脊柱运动学的改变，这可能促成相邻运动节段的退变。在很大程度上由于相邻节段退变这一公认的临床问题，椎间盘切除术后保持椎间盘运动学或使用力学关节成形术装置对椎间盘进行减压已一跃成为融合手术的替代方案，其目标是保持运动的同时恢复椎间盘高度。然而，这些装置的广泛采用一直进展缓慢，部分原因是担心下陷、磨损颗粒的产生和翻修手术的难度。6.考虑到与椎间盘退变相关联的疼痛和失能的社会和经济负担，以及目前可用的手术治疗的局限性，非常需要晚期椎间盘退变的新疗法。组织工程给予了巨大的希望-用组织工程化复合椎间盘置换退行性椎间盘有恢复原生椎间盘结构、生物学和力学功能的潜能。迄今为止，已经产生了许多复合工程化椎间盘，通常涉及细胞接种的水凝胶(作为np区域的类似物)在接种细胞的取向或多孔支架内(作为af区域的类似物)的组合。多种此类复合椎间盘已在体外进行了表征，尽管很少有研究在体内评价这些构建体。了解工程化椎间盘在体内特别是在临床相关长度尺度的大型动物模型中的长期整合和力学功能将是将这些工程化椎间盘技术转化为人体临床试验的重要前提。技术实现要素：7.本发明公开了工程化椎间盘植入物，其包含工程化椎间盘，其中工程化椎间盘包含髓核区域和纤维环区域；和两个终板，其中终板包含多孔聚合物泡沫，并且其中终板包含通道。8.本发明公开了治疗椎间盘退变的方法，其包含将所公开的工程化椎间盘植入物中的一个或多个工程化椎间盘植入物植入对其有需要的受试者，其中工程化椎间盘植入物的终板连接到受试者的椎骨。9.所公开的方法和组成物的额外优点将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中了解，或者可以通过所公开的方法和组成物的实践来获悉。所公开的方法和组成物的优点将通过所附权利要求书中特别指出的元素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。附图说明10.并入本说明书并构成本说明书一部分的附图说明了所公开的方法和组成物的几个实施例，并且与描述一起用于解释所公开的方法和组成物的原理。11.图1示出了工程化椎间盘植入物的组件：1)np水凝胶2)层状pcl支架3)pcl泡沫终板。12.图2a和图2b是通道和龙骨融入终板的设计(a)和加速骨整合的羟基磷灰石(ha)涂层(b)。13.图3a-3j示出了如通过(a-c)mrit2映射、(d)对胶原(红色)和蛋白聚糖(蓝色)的染色组织学以及(e-g)区域蛋白聚糖和(h-j)胶原含量的生化测量所测量的工程化椎间盘植入物组成物的实例。14.图4a-4f示出了大鼠尾模型中工程化椎间盘植入物压缩(a-c)和拉伸(d-f)力学特性的实例。15.图5a-5d示出了在体内植入山羊颈椎长达8周之后工程化椎间盘植入物压缩(a-c)力学特性和组织学外观(d)的实例。尺度＝2mm。16.图6a和图6b示出了大鼠和山羊模型的edaps制造和细胞接种的示意图。(a)为了制造适合大鼠尾椎间盘间隙大小的edaps，纳米纤维、对齐的分层pcl和peo支架被静电纺丝，以30°角切割成条带，并围绕心轴滚动以产生af区域。然后af支架接种牛af细胞，并且uv可固化透明质酸水凝胶接种牛np细胞。培养2周后，将af区域和np区域与pcl泡沫终板结合形成edaps。(b)为了制造适合山羊颈椎间盘间隙大小的edaps，纳米纤维对齐的pcl支架以30°角切割成条带，并接种山羊msc。山羊msc也被接种在琼脂糖水凝胶内以形成np区域。msc接种的pcl条带培养1周，然后使用定制模具以相反的纤维角度同心滚动条带以产生edaps的af区域。再培养一周后，af区域和np区域与pcl泡沫终板结合形成edaps。17.图7a-7j示出了大鼠尾体内植入后的edaps结构和组成。(a)在4.7t上获得的每个治疗组的第一回波的代表性原始mr图像(上)和原生椎间盘和edaps植入物在10周和20周的平均t2图(下)(尺度＝2mm)。edaps(b)np和(c)aft2值的量化，柱表示显著性(p《0.01)。与原生大鼠尾椎间盘间隙(尺度＝500μm)相比，通过10周和20周植入物的(d)阿尔新蓝(蛋白聚糖)和天狼猩红(胶原)染色的组织学切片，进一步评估edaps生化含量。(e)edaps的np、(f)af和(g)pcl终板区域中gag含量的量化。(h)edaps(p＝0.01，20w对植入前)的np(p＝0.01，20w对植入前)、(i)af(p＝0.04，20w对植入前)和(j)pcl终板区域中胶原含量的量化。定量数据示为带有标准偏差的平均值(对于mri数据，n＝5-10/组，对于生化数据，n＝3-4/whitney检验，n＝3-13/组)。(d)与原生山羊颈椎运动节段相比，在植入前后山羊edaps压缩试验的代表性应力-应变曲线。(e)与原生山羊颈部运动节段和edaps植入前相比，edaps植入运动节段的趾模量和线性模量的量化(p＝0.02，植入前对8w趾模量)。(f)与原生运动节段和edaps植入前相比，8周edaps植入物中的过渡和最大应变的量化(p＝0.04、8w对植入前过渡应变；p＝0.03、8w对植入前最大应变)。定量数据示为带有标准偏差的平均值。通过kruskal-wallis和dunn的多重比较检验评估组间力学特性的显著差异(n＝3-4/组)。26.图16a-16e示出了edaps向大型动物模型的转化。所制造的适合山羊颈椎间盘间隙大小并接种骨髓源性同种异体msc的edaps的照片。(a)c2-c3椎间盘间隙通过前路显露，并且在牵张下去除原生椎间盘和部分相邻终板。(b)16mm直径×9mm高度的edaps，预成熟长达13周，被放置在准备好的椎间盘间隙内，并且(c)释放牵张力。(d)运动节段用颈椎固定板固定。(e)所有动物都从手术中恢复，没有并发症，并保留了完整的颈椎功能。27.图17a-17d示出了edaps在山羊颈椎间盘置换物模型中的四周体内性能。(a)植入前(预培养13周后)，对edaps的切片进行阿尔新蓝(蛋白聚糖)和天狼猩红(胶原)染色。(b)植入后4周，阿尔新蓝和天狼猩红染色的矢状组织学切片。示出了最佳和最差的代表性edaps。尺度＝1mm。(c)pcl终板内有组织的胶原沉积的shg成像，尺度＝200μm。(d)edaps的np区域和af区域中胶原ii、聚集蛋白聚糖和胶原i的dapi染色(尺度＝50μm)和免疫组织化学(尺度＝250μm)。28.图18示出了来自所有动物的山羊edaps植入物的组织学外观。所有四周edaps植入山羊(n＝4)的矢状阿尔新蓝和天狼猩红染色组织学切片。尺度＝1mm。29.图19a和图19b示出了山羊edaps的苏木精和伊红染色。在山羊颈椎间盘间隙(a)中植入4周后，edaps的苏木精和伊红染色表明细胞在af区域和np区域内保留，以及细胞大量渗入到pcl终板中。尺度＝50μm。(b)中性粒细胞渗入(箭头)到af外缘指示轻度炎症反应。尺度＝1mm(顶)和100μm(底)。30.图20示出了山羊edaps在体内4周后的免疫组织化学。与原生椎间盘相比，4周edaps植入物中胶原ii、聚集蛋白聚糖和胶原i的免疫组织化学。尺度＝250μm。31.图21示出了山羊颈椎体内8周后edaps的矢状μct切片。来自8周山羊edaps植入物的μct扫描的正中矢状切片。请注意，通过包括氧化锆纳米粒子使pcl终板不透射线。尺度＝5mm。32.图22a和图22b示出了(a)碱性磷酸酶活性和(b)ha涂覆或仅pcl的泡沫的vonkossa染色，这些泡沫接种骨髓源性msc并在基础或成骨培养基中培养5周。与所有其他组相比，*＝p《0.05。尺度＝1mm。33.图23示出了用mallory-heidenhain三色染色剂(粉红色染料＝矿化胶原，蓝色＝未矿化胶原，左尺度＝1mm，右尺度＝100μm)染色的骨钙素(尺度＝1mm)的免疫组织化学，以及植入大鼠尾椎10周的无细胞pcl和ha涂覆的泡沫的μct(尺度＝1mm)。34.图24a和图24b示出了植入山羊颈椎30周的edaps的(a)t2加权正中矢状mri和(b)阿尔新蓝和天狼猩红染色的组织学(尺度＝1mm)。edaps用刚性板固定5周，之后进行第2次手术以去除板固定。在植入的剩余25周内，允许动物不受限制地运动。具体实施方式35.所公开的方法和组成物可以通过参考以下具体实施例的详细描述和其中包括的实例以及附图及其先前和随后的描述来更容易地理解。36.应当理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组成物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定试剂，因此可能会有所不同。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。37.本发明公开了可以用于所公开的方法和组成物的产品、可以与所公开的方法和组成物的产品结合使用、可以用于制备所公开的方法和组成物的产品或者是所公开的方法和组成物的产品的材料、组成物和组件。这些和其他材料在本文中公开，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些混合物的每一种不同的单独和集体组合和排列的具体参考，但每一种都在本文中被具体设想和描述。因此，如果公开了一类分子a、b和c以及一类分子d、e和f并且公开了组合分子a-d的实例，那么即使没有单独列举每一个，每一个都被单独和集体设想。因此，在该实例中，a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f的组合中的每一个组合都被具体设想并且应当被认为从a、b和c；d、e和f；和示例性组合a-d的公开内容中公开。同样，这些组合的任何子集或组合也被具体设想和公开。因此，例如，a-e、b-f和c-e的子组被具体设想并且应当被认为从a、b和c；d、e和f；和示例性组合a-d的公开内容中公开。该概念适用于本技术的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组成物的方法中的步骤。因此，如果有可以执行的多种额外步骤，则应当理解，这些额外步骤中的每一个步骤都可以通过所公开方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行，并且每个这样的组合都被具体设想并且应当视为被公开的。38.a.定义39.应当理解，所公开的方法和组成物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能会变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，其将仅由所附权利要求书限制。40.必须注意，如在本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，“通道”的指代包括多个此类通道，“工程化椎间盘”的指代是一个或多个工程化椎间盘和其本领域技术人员已知的等同物等的指代。41.如本文所用的“受试者”指脊椎动物。术语“受试者”包括驯养动物(例如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)。在一个方面，受试者是哺乳动物。在另一方面，受试者是人。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人、儿童、青少年和新生儿受试者，无论是男性还是女性，都将被涵盖。[0042]“治疗”是指将本发明的工程化椎间盘植入物中的一个或多个工程化椎间盘植入物施用于或植入到对发生椎间盘退变的易感性增加或有椎间盘退变的受试者，诸如人或其他哺乳动物，以防止或延迟疾病或病状的影响恶化，或部分或完全逆转疾病(例如退变)的影响。[0043]“预防”是指使对发生椎间盘退变的易感性增加的受试者将发生椎间盘退变的可能性最小化。[0044]“可选(optional或optionally)”是指随后描述的事件、情况或材料可能会或可能不会发生或存在，并且描述包括事件、情况或材料发生或存在的例子和其不发生或不存在的例子。[0045]范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另有明确说明，否则还具体设想并认为公开了从一个特定值和/或至另一个特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应当理解，特定值形成另一个具体设想的实施例，除非上下文另有明确说明，否则该实施例应当视为被公开的。将进一步理解，除非上下文另有明确说明，否则每个范围的端点相对于另一端点，以及独立于另一端点都是显著的。最后，应当理解，除非上下文另有明确说明，否则包含在明确公开范围内的所有单个值和值的子范围也被具体设想并且应当视为被公开的。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施例中的一些或全部实施例，上述内容都适用。[0046]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组成物所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或试验中可以使用类似于或等效于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但特别有用的方法、装置和材料如所描述的那样。本文中所引述的出版物以及引述它们所针对的材料在此通过引用具体并入。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公开。不承认任何引用文件构成现有技术。对参考文献的讨论说明了作者的主张，申请人保留对引述文件的准确性和相关性提出质疑的权利。应当清楚地理解，尽管本文引用了许多出版物，但此类引用并不构成承认这些文件中的任何文件构成本领域公知常识的一部分。[0047]在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包含”和其变体，诸如“包含(comprising和comprises)”，是指“包括但不限于”，并且不旨在排除，例如，其他添加剂、组件、整数或步骤。特别地，在表述为包含一个或多个步骤或操作的方法中，具体设想每个步骤包含所列出的内容(除非该步骤包括限制性术语，诸如“由……组成”)，这意味着每个步骤不旨在排除，例如未在步骤中列出的其他添加剂、组件、整数或步骤。[0048]b.工程化椎间盘植入物[0049]本发明公开了工程化椎间盘植入物。在一些方面，工程化是指非天然存在的椎间盘植入物。[0050]本发明公开了工程化椎间盘植入物，其包含工程化椎间盘，其中工程化椎间盘包含髓核区域和纤维环区域；和两个终板，其中终板包含多孔聚合物泡沫，并且其中终板包含通道。[0051]在一些方面，工程化椎间盘植入物可以进一步包含蛋白聚糖和胶原。蛋白聚糖和胶原可以是合成的或天然的。在一些方面，蛋白聚糖和胶原由工程化椎间盘内存在的活细胞产生。[0052]在一些方面，从一个终板的顶面到第二个终板的底面测量的工程化椎间盘植入物的深度可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm或20mm。[0053]1.工程化椎间盘[0054]本发明公开了包含髓核区域和纤维环区域的工程化椎间盘。[0055]i.髓核区域[0056]髓核是椎间盘的内核区域。本质上和如本文所公开的，髓核区域由凝胶状材料构成。[0057]在一些方面，髓核区域包含顶面、底面和在顶面和底面之间延伸并限定髓核区域的周边的侧边缘。[0058]在一些方面，髓核的周边被纤维环区域周向地包围。因此，髓核区域是内核区域，纤维环区域包围其周边，但不在顶面和底面上。[0059]在一些方面，髓核区域包含水凝胶。在一些方面，水凝胶可以是但不限于透明质酸或琼脂糖水凝胶。[0060]在一些方面，水凝胶包含活细胞。在一些方面，活细胞是间充质干细胞或原生椎间盘细胞或其组合。在一些方面，原生椎间盘细胞可以是原生髓核细胞。在一些方面，活细胞在添加到水凝胶之前已进行培养。在一些方面，髓核区域已进行培养。[0061]ii.纤维环区域[0062]纤维环是椎间盘的外部。纤维环包围髓核区域。纤维环可以包含防止髓核的凝胶状材料从椎间盘漏出的纤维的层或薄片。[0063]在一些方面，纤维环区域包含顶面、底面、内侧边缘和限定纤维环区域的周边的外侧边缘，其中内侧边缘和外侧边缘在顶面和底面之间延伸。在一些方面，内侧边缘可以与髓核区域接触。[0064]在一些方面，纤维环区域包含聚合物，诸如但不限于聚(ε-己内酯)(pcl)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚乳酸、聚dl-丙交酯或聚对二氧环己酮。在一些方面，纤维环区域进一步包含聚环氧乙烷(peo)。因此，例如，纤维环可以是pcl和peo的混合物。[0065]在一些方面，纤维环区域包含纳米纤维聚合物的一个或多个薄片。例如，纤维环区域可以包含纳米纤维pcl的一个或多个薄片。在一些方面，纳米纤维聚合物(例如pcl)的薄片可以对齐以形成层状结构。[0066]在一些方面，纤维环区域包含活细胞。在一些方面，活细胞是间充质干细胞或原生椎间盘细胞。在一些方面，原生椎间盘细胞是原生纤维环细胞。[0067]在一些方面，髓核区域中的细胞和纤维环区域中的细胞来自相同的来源。在一些方面，髓核区域中的细胞和纤维环区域中的细胞来自不同的来源。在一些方面，髓核区域或纤维环区域或两者的细胞先前已进行培养。在一些方面，纤维环区域已进行培养。在一些方面，工程化椎间盘植入物已进行培养。[0068]在一些方面，同心缠绕并接种纤维环细胞或间充质干细胞。每层内的纳米纤维与植入物的长轴成30度角取向，并在每个连续层中交替方向(+/-30度)。根据植入物的大小，可能有5-20层，并且层厚范围为200-300微米。[0069]2.终板[0070]本发明公开了包含多孔聚合物泡沫和通道的终板。在一些方面，终板可以视为修改的终板，因为它们不是天然存在的。[0071]在一些方面，所公开的终板可以具有骨界面侧和椎间盘界面侧。骨界面侧可以与骨相互作用，诸如椎骨。椎间盘界面侧可以与椎间盘相互作用。在一些方面，所公开的终板可以具有在终板的骨界面侧和椎间盘界面侧之间延伸的外围侧边缘。[0072]在一些方面，第一终板的椎间盘界面侧连接到髓核区域和纤维环区域的顶面，并且其中第二终板的椎间盘界面侧连接到髓核区域和纤维环区域的底面。[0073]在一些方面，每个终板的厚度小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm、小于1mm。厚度可以从骨界面侧直接到终板到椎间盘界面侧进行测量。[0074]在一些方面，两个终板中的至少一个终板进一步包含一种或多种血管促进剂。在一些方面，一种或多种血管促进剂可以是但不限于血管内皮生长因子、去铁胺、尼莫地平或邻苯二甲酰亚胺新血管形成因子(pnf-1)。[0075]i.聚合物泡沫[0076]在一些方面，多孔聚合物泡沫是pcl。在一些方面，多孔聚合物泡沫可以是但不限于聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚乳酸、聚dl-丙交酯或聚对二氧环己酮。[0077]ii.羟基磷灰石[0078]本发明公开了工程化椎间盘植入物，其包含工程化椎间盘，其中工程化椎间盘包含髓核区域和纤维环区域；和两个终板，其中终板包含多孔聚合物泡沫，并且其中终板包含通道并且其中终板进一步包含羟基磷灰石。[0079]在一些方面，羟基磷灰石可以涂覆在终板的表面上。在一些方面，羟基磷灰石存在于整个终板中。在一些方面，羟基磷灰石可以在表面上并贯穿终板。[0080]iii.主体和突起[0081]在一些方面，两个终板中的至少一个终板包含主体；和从主体向外延伸的骨界面侧上的突起。突起可以是各种形状和大小。在一些方面，突起可以是但不限于圆形、矩形或三角形。在一些方面，突起可以是沿终板的两个轴线的终板直径的30-75％。在一些方面，突起可以高达终板的骨界面侧的80％。[0082]在一些方面，主体的一部分位于突起的正下方。[0083]在一些方面，突起相对于横轴放置在终板的中央。[0084]iv.通道[0085]在一些方面，所公开的终板中的一个或多个终板包含通道。在一些方面，通道被工程化。例如，通道不是天然存在的。[0086]在一些方面，每个终板的通道包含多个相对于横轴间隔的通道。在一些方面，每个终板的多个通道可以彼此平行或基本上平行，并且其中每个终板的多个通道与横轴垂直或基本上垂直。[0087]在一些方面，每个终板都具有一定厚度，并且其中终板的每个通道的深度小于终板的厚度。在一些方面，每个通道的深度可以从终板的骨界面侧向终板的椎间盘界面侧进行测量。[0088]在一些方面，每个终板的通道相对于横轴均匀地间隔。在一些方面，每个终板的连续通道以0.5mm至5mm范围内的距离间隔。[0089]在一些方面，终板的每个通道具有与终板的外围侧边缘间隔的相对端。[0090]在一些方面，在终板的每个通道的最大深度处，每个通道与终板的椎间盘界面侧等距或基本上等距间隔。在一些方面，在终板的每个通道的最大深度处，至少一个通道与终板的椎间盘界面侧不等距间隔。[0091]在一些方面，突起与主体配合以限定终板的至少一个通道。在一些方面，主体单独限定了终板的多个通道。在一些方面，由突起和主体限定的至少一个通道的深度大于单独由主体限定的通道的深度。在一些方面，由突起和主体限定的每个通道的深度范围为0.5mm至3.5mm，其中单独由主体限定的每个通道的深度范围为0.5mm至1.5mm。[0092]在一些方面，通道仅存在于终板的主体中。在一些方面，通道仅存在于终板的突起中。在一些方面，通道存在于主体和终板的突起中。[0093]c.治疗椎间盘退变的方法[0094]本发明公开了治疗椎间盘退变的方法，其包含将所公开的工程化椎间盘植入物中的一个或多个工程化椎间盘植入物植入对其有需要的受试者，其中工程化椎间盘植入物的终板连接到受试者的椎骨。[0095]本发明公开了用于治疗椎间盘退变的工程化椎间盘植入物，其中工程化椎间盘植入物是本文公开的工程化椎间盘植入物中的一个或多个工程化椎间盘植入物，其中工程化椎间盘植入物的终板连接到患有椎间盘退变的受试者的椎骨。[0096]本发明公开了用于治疗椎间盘退变的工程化椎间盘植入物，其中工程化椎间盘植入物包含工程化椎间盘，其中工程化椎间盘包含髓核区域和纤维环区域；和两个终板，其中终板包含多孔聚合物泡沫，并且其中终板包含通道。在一些方面，根据权利要求1所述的工程化椎间盘植入物，其中终板进一步包含羟基磷灰石。在一些方面，工程化椎间盘植入物的两个终板中的至少一个终板包含：主体；和从主体向外延伸的骨界面侧上的突起。[0097]在一些方面，工程化椎间盘植入物可以在植入患者之前进行培养。在一些方面，工程化椎间盘植入物中的活细胞在植入患者之前已进行培养。在一些方面，工程化椎间盘植入物可以在植入患者之前在存在tgf-β3的情况下进行培养。在一些方面，培养导致工程化椎间盘植入物中的细胞分化。细胞的分化可以导致工程化椎间盘植入物具有与天然椎间盘相似的特性。在一些方面，通过培养获得的特性可以包括但不限于保持细胞活力、胶原(i型和ii型)和蛋白聚糖基质在髓核区域和纤维环区域内的累积、纤维环区域和髓核区域的整合，以及压缩力学特性向原生水平的成熟。[0098]在一些方面，所公开的方法可以进一步包含在植入工程化椎间盘植入物之前去除退变的椎间盘。[0099]在一些方面，所公开的方法可以进一步包含在植入工程化椎间盘植入物之前去除椎骨的一部分。在一些方面，其中可以去除一部分的椎骨是植入工程化椎间盘植入物的正上方或正下方的椎骨。在一些方面，去除椎骨的一部分包含刮削或钻入椎骨。在一些方面，去除椎骨的一部分可以允许血液和骨细胞整合到工程化椎间盘植入物中。[0100]在一些方面，工程化椎间盘植入物中的细胞可以是获自受试者的细胞。例如，细胞可以获自受试者，沉积在或施用于支架，诸如工程化椎间盘或其一部分，用于产生工程化椎间盘植入物。在一些方面，培养包含细胞的支架以允许细胞在将工程化椎间盘植入受试者之前分化。在一些方面，从其获得细胞的受试者与植入工程化椎间盘植入物的受试者相同。在一些方面，从其获得细胞的受试者与植入工程化椎间盘植入物的受试者不同。[0101]在一些方面，终板可以通过骨界面侧连接到椎骨。在一些方面，第一终板连接到其上方的椎骨，并且第二终板连接到其下方的椎骨。终板到椎骨的连接可以经由多种机构，例如，放置螺钉，有或无额外硬件(包括板或支撑)。在一些方面，硬件可以由金属或生物可吸收聚合物制成。在一些方面，可生物降解的聚合物可以包括但不限于聚(α-羟基酸)类-诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-共-乙交酯)。在一些方面，终板与椎骨整合。在一些方面，在终板连接到椎骨之前和期间，执行终板与脊椎动物的适当对齐。本领域技术人员将理解适当对齐。在一些方面，适当对齐可以意味着一旦连接了工程化椎间盘植入物，植入物顶部和植入物下方的椎骨以相似的方式与健康脊柱对齐。[0102]在一些方面，受试者的细胞渗入工程化椎间盘植入物中。受试者的细胞渗入工程化椎间盘植入物可导致工程化椎间盘植入物的终板中有活细胞。[0103]在一些方面，终板包含胶原。在一些方面，终板血管化。血管化可以从血液和从周围骨骼和组织渗入的细胞中发生。[0104]d.套件[0105]上述材料以及其他材料可以以任何合适的组合包装在一起，作为用于执行或帮助执行所公开的方法的套件。如果给定套件中的套件组件被设计并适用于在所公开的方法中一起使用，则它是有用的。例如，本发明公开了包含工程化椎间盘植入物的一种或多种组件的套件。本发明公开了包含所公开的髓核区域中的一个或多个髓核区域、所公开的纤维环区域中的一个或多个纤维环区域、所公开的工程化椎间盘中的一个或多个工程化椎间盘、所公开的终板中的一个终板和/或细胞的套件。[0106]实例[0107]a.实例1[0108]1.背景技术：：[0109]文献中已描述了各种组织工程化椎间盘，其工程化子组件模拟原生椎间盘的内髓核(np，富含水和蛋白聚糖)和外纤维环(af，层状胶原结构)子结构。除了我们的设计之外，唯一在体内进行过评价的其他工程化椎间盘构建体由用于np区域的细胞接种的藻酸盐水凝胶和用于af区域的胶原凝胶构成，该胶原凝胶已被在其中接种的细胞压实并沿圆周对齐。所公开的发明与现有技术的不同之处在于它利用用于更紧密地重现原生组织的af区域的层状结构。还包括连接到np组件和af组件的生物材料界面，其促进与原生骨骼的整合。[0110]2.说明[0111]本文公开了一种终板修改的椎间盘状角层结构(edaps)，通篇也称为工程化椎间盘植入物，其由四种组件构成：(图1)水凝胶：接种细胞(间充质干细胞或原生椎间盘细胞)的水凝胶包含工程化椎间盘的髓核区域。对齐的纳米纤维层状聚(ε-己内酯)：椎间盘的纤维环区域用对齐的电纺聚(ε-己内酯)(pcl)的薄片制造。将纳米纤维的薄片切割成条带，使得纤维在每个条带中以30°角取向。条带接种细胞(间充质干细胞或原生椎间盘细胞)，然后耦合以在连续层中实现相反的±30°纤维取向，并缠绕在圆形模具中以产生层状结构。然后将细胞接种的水凝胶放置在环结构的中心以产生复合af-np结构。多孔聚(ε-己内酯)泡沫：两种多孔pcl泡沫通过盐浸工艺制造，并在培养期间连接到af-np复合材料的两侧。这些“终板”区域被设计成在体内植入之后与相邻的骨相结合，并为发生整合提供界面。泡沫也可以含有通道并且可以用羟基磷灰石改性以促进骨整合(图2)。含有血管促进剂的微球可以在与原生骨相结合的泡沫边缘处掺入。[0112]edaps可以在多个长度尺度上制造，包括适合人颈椎间盘间隙大小的edaps。在这个大尺寸尺度下，将接种细胞的edaps在含有tgf-β3的化学限定培养基中预培养17周，以让植入物的力学特性随着细胞在支架内沉积富含蛋白聚糖和胶原的基质而成熟。[0113]edaps的性能已在小型(大鼠尾)和大型(山羊颈椎)动物模型中进行了体内评价。在大鼠尾椎间盘置换物模型中体内植入之后，mri、组织学和生物化学数据表明，edaps组成和水化在体内20周内是稳定的，以及edaps重现了原生椎间盘组成和结构的许多标志(图3)。从植入10周至20周观察到终板-椎体界面成熟的迹象。在10周至20周的组织学样品中，af区域和终板区域的细胞渗入增加是明显的，而细胞在同一时间段内仍留在np内。鉴于工程化终板在植入时是无细胞的，这指示来自相邻组织的原生细胞能够随着时间的推移迁移到终板的开放多孔结构中并产生基质。[0114]随着体内植入持续时间的增加，也观察到edaps压缩力学特性的显著成熟(图4a-c)，最终在大多数方面匹配原生运动节段值。与植入前值相比，edaps趾区域模量在20周后显著增加，并且在10周或20周时与原生椎间盘趾区域模量没有差异。椎间盘中的趾区域力学很大程度上取决于np的功能，指示np区域在体内植入后继续成熟，有助于整体椎间盘功能。体内植入对线性区域模量没有显著影响，尽管与植入前水平相比有增加的趋势，并且植入的edaps在10周或20周时的线性区域压缩模量与原生椎间盘没有差异。edaps的线性区域响应最初由包含edaps的af区域的pcl支配；这样，即使在植入之前，原生线性区域力学也在一定程度上得以重现。edaps与原生组织的整合强度也在大鼠尾模型中通过拉伸-断裂试验进行评估(图4d-f)。从植入10周至20周，拉伸趾区域模量和线性区域模量明显增加。在20周edaps植入运动节段中，趾和线性区域拉伸模量在原生大鼠尾的范围内。在体内20周后，edaps的断裂应力和应变分别为原生值的46.6％和50.1％。[0115]接下来，在更临床相关的模型中评价edaps的体内性能，且选择山羊颈椎是由于其半直立性质，以及椎间盘高度和面积与人颈椎的相似性。在山羊颈椎中植入预培养的edaps后(图5)，在体内4周后edaps组成和结构保持在或高于植入前水平。在体内8周后，与4周相比，pcl终板和纤维环内的胶原基质沉积增加伴随np区域内的蛋白聚糖染色略有减少。shg图像也揭示了有组织的胶原在最初的无细胞pcl终板内沉积，导致edaps在4周时与椎体开始整合，8周后进一步成熟。压缩力学试验显示，edaps的力学特性在体内8周后从植入前值来看显著成熟。虽然edaps植入运动节段的趾和线性区域模量趋于高于原生山羊颈椎间盘模量，但过渡和最大应变在8周时从植入前水平来看显著降低，并且与原生颈椎运动节段没有显著差异。[0116]b.实例2[0117]1.引言[0118]为了解决工程化椎间盘的当前问题，开发了由三个不同组件构成的终板修改的椎间盘状角层结构(edaps)，也称为工程化椎间盘植入物，以模拟原生脊柱运动节段的分层结构。np区域由细胞接种的透明质酸或琼脂糖水凝胶形成，而af区域由对齐的纳米纤维聚(ε-己内酯)(pcl)的细胞接种的同心层构成。选择水凝胶用于np区域以重现原生np的高度水化状态，而选择pcl用于af区域是由于其缓慢的降解速度、强大的力学特性以及其通过静电纺丝制造成复制纤维环的纤维构造的有序结构的能力。af区域和np区域与两个无细胞多孔pcl泡沫作为终板(ep)类似物相结合，以产生edaps构建体。这些edaps先前已在短期研究中在大鼠尾椎间盘置换物模型中进行了评价，终板修改的构建体胜过那些不带终板的构建体。本文中，edaps的长期体内整合和力学特性在大鼠尾椎中得以证实。这些工程化椎间盘在体内功能成熟的同时保持了组成和结构，在20周时达到接近原生拉伸和压缩力学特性。为了进一步推进组织工程化椎间盘置换物的临床转化，人大小的edaps被成功植入大型动物(山羊)模型的颈椎。[0119]2.结果[0120]i.edaps结构和组成在体内得以保持。[0121]为了确定组织工程化椎间盘是否可以通过长期植入来重现原生椎间盘的结构和功能，将edaps植入小动物椎间盘置换物模型中长达20周。制造适合大鼠尾椎大小的edaps(直径：4-5mm，高度：5-6mm)，接种透明质酸水凝胶内的牛np细胞和分层pcl/聚(环氧乙烷)(peo)支架内的牛af细胞，并与两个无细胞pcl泡沫终板结合(图6)。edaps在含有tgf-β3的化学限定培养基中体外培养5周，然后植入无胸腺大鼠尾椎间盘间隙10周(n＝5)或20周(n＝9)，进行外固定以固定运动节段并确保edaps保留。[0122]磁共振成像(mri)，尤其是t2加权mri，是一种常用于评估椎间盘健康的临床工具。椎间盘的定量t2映射也表明np中的t2弛豫时间与椎间盘水化、蛋白聚糖含量和力学呈正相关。植入的edaps的t2映射(图7a)表明，在体内植入10或20周后，np中的t2弛豫时间保持在原生值(图7b)。然而，edapsaft2值在20周时显著高于(p《0.01)原生af(图7c)。相反，终板t2值在10周和20周时从植入前值来看降低，指示该区域有新的基质沉积(图8)。总体而言，该mri数据指示edaps通过长期植入在np和af内保持其生化组成和水化。[0123]mri结果通过组织学和定量生化得到证实。edaps植入运动节段的阿尔新蓝和天狼猩红染色切片在10周至20周内显示np中强烈且持久的蛋白聚糖染色和af中增加的胶原沉积-重现了原生椎间盘的基质分布(图7d)。随着植入时间的延长，也观察到工程化终板与原生椎体整合增加的迹象。在原生椎间盘中，ii型胶原和硫酸软骨素主要分布在np区域内，但在富含i型胶原的af中少量表达。这种基质分布对椎间盘的力学特性至关重要-富含蛋白聚糖和高度水化的np中产生的静水压力使af处于拉伸状态，从而使椎间盘能够承受压缩负荷。免疫组织化学(图9、图10)揭示了在植入10周和20周后edaps内基质分布的相似模式，在np区域内对ii型胶原和硫酸软骨素的染色强烈。ii型胶原和硫酸软骨素染色在af区域中较低，但在pcl泡沫终板存在，并从10周至20周增加。在10周和20周两个时间点，i型胶原均匀分布在整个edaps中。[0124]根据组织学发现，np、af和终板糖胺聚糖(gag)含量在植入后20周内保持在植入前值(图7e-g)。np、af和终板胶原含量在体内20周后从植入前值看显著增加(分别为p＝0.01、0.04和0.01)(图7h-j)。np和afgag及胶原含量通常在原生大鼠尾np和af的范围内，但afgag含量除外，在两个时间点均保持低于原生值。[0125]这些mri、组织学和生物化学数据表明edaps的组成和水化在体内20周内是稳定的，以及edaps重现了原生椎间盘组成和结构的许多标志。从植入10周至20周观察到终板-椎体界面成熟的迹象。在10周至20周的组织学样品中，af区域和终板区域的细胞渗入增加明显，而细胞在同一时间段内仍保留在np内(图11、图12)。鉴于工程化终板在植入时是无细胞的，这指示来自相邻组织的原生细胞能够随着时间的推移迁移到终板的开放多孔结构中并产生基质。[0126]ii.edaps力学特性在体内接近原生值。[0127]为了阐明观察到的edaps在体内的整合和成熟如何影响脊柱力学特性，对edaps植入运动节段的压缩和拉伸特性进行了量化。在体内10周和20周后，对椎骨-edaps-椎骨运动节段进行分离并在生理负荷(20个循环压缩，从0至-3n，从0至0.25mpa)下进行压缩力学试验。这种负荷状态代表对工程化椎间盘施加0.5倍于人体体重的应力，这是迄今为止对工程化椎间盘植入的任何体内研究所考虑的最苛刻的力学试验设置，比先前用于表征组织工程化椎间盘植入大鼠尾椎后的力学性能的方式高16倍。从这些试验中，比较了edaps植入运动节段与原生大鼠尾运动节段的压缩力学特性，以及体外培养(植入前)5周后edaps构建体的特性。[0128]随着体内植入持续时间的增加，观察到edaps压缩力学特性的显著成熟，最终在大多数方面匹配原生运动节段值(图13a)。与植入前值相比，20周后edaps趾区模量显著增加(p＝0.01)，并且在10或20周时与原生椎间盘趾区模量没有差异(图13b)。椎间盘中的趾区域力学很大程度上取决于np的功能，这表明np区域在体内植入后继续成熟，有助于整体椎间盘功能。体内植入对线性区域模量没有显著影响，尽管与植入前水平相比有增加的趋势，并且植入的edaps在10周或20周时在线性区域压缩模量方面与原生椎间盘没有差异(图13b)。edaps的线性区域响应最初由包含edaps的af区域的pcl支配；这样，即使在植入之前，原生线性区域力学也在一定程度上得以重现。从组织学来看，很明显edapsaf内的pcl在体内持续存在超过20周(图7d)，因而在那个时间点可能仍有助于线性区域力学，因为新组织在该区域中沉积并累积。edaps构建体在植入之前处于未成熟状态，基质水平低，构建体的过渡和最大应变最初是超生理的。然而，在体内10或20周后，过渡应变和最大应变均显著降低(p《0.01)至原生值，指示构建体的组成成熟和与原生组织的整合(图13c)。总体而言，这些结果表明edaps在长期植入后重现了原生运动节段的力学功能，并且可以承受脊柱运动节段的苛刻的负荷环境。[0129]宏观压缩试验提供了有关edaps整体力学功能的信息；因此，椎间盘区域本身(位于终板之间的组织)的功能无法通过该方法确定。随着工程化终板与原生椎体整合，并随着时间的推移重塑成骨，工程化椎间盘(daps)区域将越来越多地负责运动节段的功能。为了解析daps的力学特性，独立于终板，在体内20周后，使用显微计算机断层扫描(μct)耦合压缩试验进行力学评估。对于20周的植入组，通过包含氧化锆纳米颗粒使终板不透射线，从而允许对椎间盘/daps边界进行μct显示。在宏观压缩试验后，在施加代表0.5倍体重的3n压缩负荷前后，对椎骨-edaps-椎骨运动节段和原生大鼠尾运动节段进行μct扫描(图13d)。根据压缩前和压缩后的三维μct呈现图，量化了不透射线的pcl终板之间的工程化椎间盘(daps)的高度和椎体终板之间的原生椎间盘的高度。这种分析能够计算整个椎间盘本身的应变。轴向椎间盘高度的空间图(图13e)揭示了压缩后椎间盘高度在原生椎间盘和daps上的相似分布，尽管初始daps高度大于原生值。在生理压缩下daps内的压缩应变趋于(p＝0.11)高于原生椎间盘(图13f)。这指示，尽管edaps整体的宏观特性重现了在动态设定下测量时原生运动节段的宏观特性，但在平衡测量时，20周植入物的椎间盘区域仍存在一些力学机能不全。这可能是由于与原生椎间盘相比，edapsgag含量不足，特别是在af区域。[0130]iii.edaps在功能上与原生组织整合。[0131]组织学、生化含量和宏观力学指示edaps在植入后与原生组织逐渐整合。这种整合的程度通过二次谐波产生(shg)成像进一步评估，该成像提供组织内有组织的胶原的显示。工程化终板内的shg信号从10周至20周显著增加(图14a)。shg也表明，随着植入后时间的增加，edaps在af终板和终板-椎体界面处日益稳固的整合。如通过mallory-heidenhain染色的组织学切片(图14b)观察到的，在20周时，工程化终板中的矿化胶原和稀疏的血管化明显，其中骨基质染成深灰色，未矿化胶原染成浅灰色，并且红细胞用箭头示出。[0132]这种逐渐整合导致拉伸力学特性的明显变化，这从植入10周至20周有所改善(图14c)。在基于压缩宏观和微观ct的力学试验后，对edaps植入物周围的软组织进行完全释放。在10周时，将运动节段从周围软组织中释放出来的行为导致三个样品中有一个断裂。相反，20周组中的所有样品在周向组织释放后保持完整。当这些20周的edaps植入运动节段进行拉伸断裂试验时，所有样品中的af/np-pcl终板连接处均发生断裂。在原生大鼠尾中，生长板处发生拉伸断裂。从植入10周至20周，拉伸趾区域模量和线性区域模量明显增加。在20周edaps植入运动节段中，趾区域和线性区域的拉伸模量(图14d-e)在原生大鼠尾的范围内。在体内20周后，edaps的断裂应力和应变(图14f-g)分别为原生值的46.6％和50.1％。以前没有报道过体内植入后组织化工程化椎间盘断裂的拉伸特性。在对植入大鼠尾椎间盘间隙的组织工程化椎间盘进行无损拉伸试验(±3％施加的拉伸应变)期间，本研究中所达到的拉伸应力(实施拉伸至断裂)比先前报告的(675kpa对15kpa)高45倍。[0133]iv.edaps在植入大型动物模型后在组成和功能上均成熟。[0134]大鼠尾椎间盘置换物模型的结果是有希望的，但大鼠尾椎间盘只有人腰椎或颈椎间盘大小的一小部分，而且与人脊柱相比，大鼠尾椎的解剖结构和力学负荷环境也不同。因此，edaps的临床转化需要在几何形状和力学功能与人脊柱相当的大型动物模型中在大小和评价上扩大构建体。考虑到金属和塑料人工全椎间盘植入物已经在这个位置使用并取得了一些成功，人颈椎可能是组织工程化全椎间盘置换物的第一个临床目标，并且与腰椎相比，它具有更小的尺寸和不那么苛刻的力学负荷环境。山羊颈椎被选为接下来评价edaps性能的大型动物模型。山羊是脊柱研究常用的大型动物模型，并且山羊颈椎具有与人颈椎相似的半直立身材和椎间盘尺寸的益处。已表明将daps放大到临床相关的大小尺度的可行性，并且说明了在体外培养期间，适合山羊颈椎间盘间隙大小的daps在组成和功能上均成熟，尽管速度比较小的daps慢。[0135]为了在这种情况下评价edaps，使用用于np区域的琼脂糖水凝胶和用于af区域的对齐的pcl的同心层，结合无细胞pcl泡沫终板，制造大小适合植入山羊颈椎(高度：9mm，直径：16mm)的构建体(图15)。为了在大型动物研究中使用更具转化相关性的细胞来源，将edaps接种同种异体山羊骨髓源性间充质干细胞(msc)，并在植入之前培养13-15周。暴露7只雄性大体格山羊的c2-c3椎间盘间隙，并使用人类颈椎手术中常用的工具，在牵张下去除原生椎间盘和部分相邻椎骨和软骨终板。将edaps放置在抽空的间隙内，释放牵张力(使edaps处于压缩状态)，并用颈前板固定间隙(图16a-d)。使用钢板固定，因为先前的工作表明在没有固定的情况下，比格犬颈椎中的工程化椎间盘保留问题。所有山羊从手术过程中恢复，没有并发症(图16e)，并保持完整的颈椎功能。植入四周后，四只动物执行安乐死，并收集颈椎供组织学分析。[0136]在体内4周后，阿尔新蓝和天狼猩红染色的正中矢状组织学切片表明，山羊颈椎间盘间隙内保留了edaps结构，以及与植入前值相比，基质分布和含量保持或略有改善(图17a-b、图18)。组织学和shg图像也表明终板区域与原生组织发生整合。shg信号存在于pcl泡沫内，并且与来自相邻椎体和edaps的af区域的信号邻接，指示在最初的无细胞pcl泡沫终板内有新的有组织的胶原基质沉积(图17c)。另外，edaps的np区域和af区域的细胞结构在4周的植入期内得以保持，并且有内源性细胞渗入到pcl泡沫终板中的迹象。(图17d、图19)。胶原ii、聚集蛋白聚糖和胶原i的免疫组织化学表明edaps的基质组成通常重现了原生椎间盘的特征，其中富含胶原ii和聚集蛋白聚糖的np和af主要由胶原i构成(图17d、图20)。苏木精和伊红染色揭示，四只动物中有三只出现中性粒细胞渗入到edapsaf的外层，指示局部轻度炎症反应，可能是由于同种异体细胞来源(图19)。然而，这仅限于植入物的最外部区域，并且动物在研究期间没有表现出感染、植入物排斥或功能障碍的临床症状。[0137]其余三只动物在植入8周后执行安乐死，并通过定量mri和压缩力学试验对edaps植入物和原生山羊颈椎运动节段进行了分析。植入8周后edaps的t2加权mri表明与植入前值相比，体内edaps结构的保持和np区域和af区域的信号强度增加(图15a-b)。edaps植入物的定量t2映射表明，植入8周后的npt2值显著低于(p＝0.04)原生t2值，但在原生健康山羊颈椎间盘的范围内(图15c)。为了在植入8周后评估edaps的功能，在去除前固定板后对椎骨-edaps-椎骨运动节段进行分离，并在生理负荷下进行压缩试验。施加于edaps的应力与施加于普通人颈椎间盘间隙的应力相当(20个压缩周期，0至25n，0至0.084mpa)。先前没有报道过大型动物模型中组织工程化椎间盘在体内的力学功能。[0138]edaps压缩力学特性从它们的植入前值来看增加，并且匹配或超过相邻的原生颈椎间盘的力学特性(图15d)。与植入前值(图15e)相比，edaps植入运动节段的趾区域模量显著增加(p＝0.02)，而过渡应变和最大应变在体内8周后从植入前值来看显著降低(分别为p＝0.04和p＝0.03)(图15f)。在体内8周后，edaps模量和应变与原生颈椎间盘没有显著差异。如通过μct成像所证明的，植入物力学特性的这种成熟可能是由于edaps与原生组织的逐渐整合(图21)。[0139]先前的研究开创了将组织工程化椎间盘从大鼠尾到比格犬颈椎转化的先河。然而，比格犬的颈椎间盘间隙还不到人类颈椎间盘间隙大小的一半。先前在比格犬脊柱中的研究在4周时发现了有希望的结果；然而，随着持续时间的延长，蛋白聚糖含量和椎间盘高度的损失明显，并且没有报道植入之后的力学特性。本文中，建立了山羊颈椎间盘置换物模型，该模型与人类颈椎具有相似的尺寸，并且结果表明将edaps转化为这种大型动物模型的可行性。edaps组成、水化和细胞结构在体内得以保持，并且有edaps与原生椎体整合的迹象。植入8周后，edaps植入物的力学功能与原生椎间盘力学功能相似，并且从植入前值来看表现出显著成熟。[0140]3.讨论[0141]全椎间盘组织工程有望成为终末期椎间盘退变和相关联脊柱病变需要手术干预的患者的治疗策略。在体内植入后，成功组织工程化椎间盘置换物将会恢复原生椎间盘间隙高度，与相邻椎体整合，在生理负荷下重现椎间盘的力学功能，并保留活细胞群，以保持与原生、健康的椎间盘相似的基质组成和分布。为了向临床转化迈进，可以使用几何、解剖学和力学与人类脊柱相似的大型动物模型对组织工程化椎间盘进行评价。用于人类临床应用的椎间盘组织工程具有长度尺度的额外挑战，颈椎椎间盘高度为5mm，腰椎椎间盘高度为11mm。椎间盘的独特之处也在于它是体内最大的无血管结构，导致营养环境低下，这也将对大尺度组织工程化构建体提出挑战。[0142]鉴于这些挑战，迄今为止，该领域的大部分工作仅限于小尺寸尺度(高度：2-3mm，直径：4-10mm)的组织工程化椎间盘的体外表征。此外，很少有研究评估脊柱内体内的全组织工程化椎间盘，并且在进行时，研究仅限于小动物模型。为了推进组织工程化全椎间盘置换物的临床转化，开发了带和不带终板的组织工程化椎间盘(daps和edaps)，并且这些构建体在体外以多种尺寸尺度(高达人颈椎间盘大小)进行评价，并在在小动物模型中进行了短期体内评价。在这项研究中，在大鼠尾椎间盘置换物模型中，对edaps的组成和力学功能进行长达20周的体内评价，并在大型动物模型中，对适合人类颈椎大小的edaps另外进行长达8周的评价。[0143]这项研究的结果表明，随着时间的推移，edaps在大鼠尾中在体内组分上成熟，在20周时达到与原生椎间盘相似的力学特性。edaps在功能上与相邻椎体整合，在拉伸状态下产生强大的力学特性。组织工程化椎间盘在体内的功能整合先前尚未得到证实，但这是临床转化的关键基准。由于原生椎间盘的功能在本质上主要是力学性的，由此脊柱上的压缩负荷通过np内的静水压力得到支持，从而使af胶原纤维处于拉伸状态，原生椎间盘与相邻椎体的界面对于适当的力学功能至关重要，并且对于体内植入后在组织工程化构建体中重现必不可少。在edaps中，拉伸力学特性的改善伴随着edaps界面的日益成熟，特别是pcl终板-椎体连接处，其中渗入的宿主细胞在终板内沉积胶原，随着时间的推移，这些胶原开始矿化并血管化。[0144]以这些大鼠尾中的结果为基础，这项技术被转化为更大的长度尺度，其将会直接适用于人颈椎，并展示在山羊颈椎中带edaps的成功全椎间盘置换物。daps可以用骨髓源性msc成功制造，与af细胞和np细胞相比，骨髓源性msc是一种更临床相关的椎间盘组织工程细胞来源。山羊颈椎是一种特别有吸引力的临床前模型，因为它的半直立身材和椎间盘间隙的高度和宽度与人类颈椎相似。适合山羊颈椎间盘大小的edaps使用与山羊模型相同的手术入路和器械可以用于人的全椎间盘置换物。该植入的结果说明，4周后，这些大尺度edaps内的基质分布要么得以保持，要么有所改善，有edaps与相邻椎体整合的迹象。mri结果指示，在山羊颈椎体内，8周时的组成从植入前值来看得以保持或有所改善，并且edaps植入运动节段的压缩力学特性匹配或超过原生山羊颈椎间盘的压缩力学特性。尽管制造存在差异(msc对原生椎间盘细胞以及琼脂糖对透明质酸水凝胶)，但迄今为止，山羊脊柱中edaps体内的成熟轨迹与我们在大鼠模型中的发现相似，包括力学特性的逐渐成熟、pcl终板的初期整合以及在早期时间点所保持的组成。[0145]4.材料和方法[0146]i.研究设计。[0147]本研究的目的是阐明带终板的组织工程化椎间盘(edaps)在植入小型(大鼠尾椎)和大型(山羊颈椎)动物模型后的体内成熟和力学特性。edaps可以在组成上成熟，随着时间的推移与原生组织在功能上整合，并在这些模型中重现原生椎间盘力学功能。对于小动物研究，将edaps植入雄性无胸腺大鼠的尾椎间盘间隙，外固定10周(n＝5)或20周(n＝9)。运动节段采集后，所有样本均进行mrit2映射。然后将样品随机指定用于组织学(10周：n＝2、20周：n＝2)、宏观尺度力学试验(10周：n＝4、20周：n＝6)、微尺度力学试验(20周：n＝4)和生物化学(10周：n＝3，20周：n＝4)。对于大型动物研究，将edaps植入雄性大体格山羊的颈椎间盘间隙，内固定4(n＝4)或8周(n＝3)。在4周时，对所有植入的运动节段进行组织学处理。在8周时，所有植入的edaps运动节段都进行了定量mrit2映射和压缩力学试验。对于小型和大型动物研究，使用相邻的、原生健康椎间盘作为对照。数据未设盲，并且本研究未排除任何数据。[0148]ii.统计分析[0149]在prism(格拉夫派得软件公司(graphpadsoftwareinc.))中进行统计分析，显著性定义为p《0.05。所有数据均示为平均值±标准偏差。假设数据是非正态分布的，因为样品量太小而无法检验正态性(shapiro-wilk正态性检验)。使用kruskal-wallis检验与dunn多重比较检验来评估植入大鼠尾椎间盘10周和20周的edaps与原生值或植入前值相比在mrit2值、gag和胶原含量以及拉伸和压缩力学特性方面的差异。使用kruskal-wallis检验与dunn多重比较检验来评估山羊edaps植入物在植入8周前后与原生山羊颈椎间盘相比在压缩力学特性方面的差异。使用双尾mann-whitney检验来评估20周edaps植入运动节段和原生椎间盘之间在通过μct压缩试验测量的应变方面的统计差异，以及8周山羊edaps植入物与原生山羊椎间盘相比在npt2值方面的差异。[0150]iii.细胞分离及扩增。[0151]如前所述，从尾椎间盘(约3岁和处死后约2小时，jbs索德顿公司(jbssoudertoninc.))分离牛af和np细胞。如前所述，从大体格山羊(约3岁)的髂嵴骨髓抽吸物中分离同种异体山羊msc。牛椎间盘细胞和山羊msc在由高葡萄糖杜氏改良伊格尔培养基(dmem，gibco，英杰生命科学(invitrogenlifesciences))、10％胎牛血清(fbs，gibco)和1％青霉素/链霉素/两性霉素b(penicillin/streptomycin/fungizone)(psf，gibco)组成的基础培养基中扩增至第2代。[0152]iv.用于大鼠尾椎植入的edaps制造和体外培养。[0153]如前所述制造适合大鼠尾椎大小的edaps(高度：2mm，直径：4-5mm)。edaps的af区域用电纺聚(ε-己内酯)(pcl)的同心层制造，其中每层内的纳米纤维的取向以与edaps长轴成±30°的角度交替，以匹配原生af的结构。聚(环氧乙烷)(peo)的中间层包括在pcl层之间，随后在支架水化和灭菌时被溶解掉。af支架涂覆有20μg/ml的纤连蛋白(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich))，牛af细胞接种在af区域的顶侧和底侧(每侧1×106个细胞)，渗透到af层之间。daps的np区域用甲基丙烯酸化透明质酸(meha)水凝胶制造。将牛np细胞(2000万个细胞/ml)悬浮在溶解于0.05％光引发剂(艳佳固2959，汽巴嘉基)中的1％w/vmeha中。meha水凝胶在两块玻璃板之间进行紫外线固化10分钟，然后穿孔以产生直径为2mm并且高度为1.5mm的凝胶。pcl泡沫终板通过盐浸制造，并穿孔以形成直径为4mm并且高度为1.5mm的无细胞构建体，其孔径约为100μm。在用于20周植入组的edaps的分组中，将氧化锆纳米颗粒掺入pcl泡沫中以使其不透射线。[0154]细胞接种之后，edaps的af区域和np区域在化学限定的培养基(cm+)中分别培养2周，该培养基由补充有1％psf、40ng/ml地塞米松(西格玛奥德里奇)、50μg/ml抗坏血酸2-磷酸盐(西格玛奥德里奇)、40μg/mll-脯氨酸(西格玛奥德里奇)、100μg/ml丙酮酸钠(康宁生命科学(corninglifesciences))、0.1％胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸(its预混通用培养补充剂)；康宁)、1.25mg/ml牛血清白蛋白(西格玛奥德里奇)、5.35μg/ml亚油酸(西格玛奥德里奇)和10ng/mltgf-β3(安迪生物(r&dsystems))组成。每周更换培养基三次。两周后，将edaps的af区域和np区域结合，通过将两根31g针穿过构建体的高度，将两个无细胞pcl泡沫终板置于af区域的任一侧。edaps在植入之前在cm+中再培养3周(总共预培养5周)。在植入之前针被去除。[0155]v.用于山羊颈椎植入的edaps制造和体外培养。[0156]如前所述，为了制造适合山羊颈椎间盘间隙大小的edaps，将宽6mm、长150mm的电纺、对齐的pcl条带切割成与纤维方向成30°角的条带，并以每侧300万个细胞的密度直接接种山羊骨髓间充质干细胞。msc接种的条带在cm+中培养1周，之后通过将4个条带分层以实现相反的纤维方向(±30°)，以及使用定制模具包裹以形成外径为16mm的同心层状构建体来组装af区域。af区域在定轨摇床上在cm+中再培养一周。如前所述，通过将山羊msc接种到2％琼脂糖水凝胶中产生np区域。琼脂糖被用于山羊edaps，因为它很难在山羊edaps所需的厚度下对透明质酸水凝胶进行紫外线固化。将np水凝胶穿孔以产生直径为8mm并且高度为6mm的构建体，其在cm+中培养2周。通过盐浸制造无细胞多孔pcl并穿孔以产生高度为1.5mm并且直径为16mm的终板。培养2周后，af区域和np区域与上述pcl终板结合形成edaps。在植入山羊颈椎之前，将edaps在20mlcm+培养基中在定轨摇床上培养13-15周，培养基每周更换3次。图6描绘了大鼠和山羊模型的edaps制造和细胞接种的示意图。[0157]vi.edaps体内植入。[0158]如前所述，在预培养5周后，将edaps植入无胸腺大鼠(foxn1rnu退役种鼠，envigo)的大鼠尾椎间盘间隙。两根克氏针穿过c8和c9椎体，允许放置旨在固定植入水平的刚性外固定器。去除原生椎间盘，并使用高速磨钻对邻近椎间盘的椎体进行部分椎体切除术(每个终板去除约1-2mm骨)。然后将edaps放入开口中，皮肤用缝合线缝合，在剩余的研究中，大鼠恢复正常的笼内活动。植入10周(n＝5)或20周(n＝9)后对动物执行安乐死以进行分析。原生大鼠尾运动节段(c6-c7水平)获自edaps植入物上方的水平，并用作对照组(n＝10)。[0159]为了在山羊颈椎间盘间隙植入edaps，雄性大体格山羊(约3岁，thomasd.morris公司)在全身麻醉下被置于背卧位。c2-c3椎间盘间隙在切开之前通过成像定位。在c2-c3间隙上方颈椎左侧做一个横向切口，并通过触诊脊椎的咽后间隙向颈动脉鞘内侧进行解剖。以骨膜下的方式解剖脊柱前部的软组织和肌肉，以暴露椎间隙的横向范围以及相邻的三分之一的颅骨椎体和尾椎体。手术暴露完成后，去除原生椎间盘和相邻椎体软骨终板的部分；使用caspar颈椎牵张器系统对椎间隙实施牵张，以进入间隙的背侧(后侧)三分之一。椎间盘切除术和终板切除术(每个终板去除约1-2mm骨)使用直角刮匙、咬骨钳和高速磨钻的组合进行。使用抽吸和无菌盐水冲洗来清除终板切除产生的骨碎片间隙和血液。edaps被放置在准备好的且牵张的间隙中。在edaps放置之后，通过放置腹侧cslp锁定板(depuysynthes)释放牵张力并固定植入的运动节段。通过正交透视确认植入物位置，然后分层缝合切口。从麻醉中恢复后，动物回到由12×12英尺小隔间组成的标准舍随意运动。用数字x线摄影和计算机断层扫描监测动物的术后恢复情况。每两周获得站立、清醒动物的背腹和侧视图，以监测植入物状况。植入4周(n＝4)或8周(n＝3)后对动物执行安乐死以进行分析。[0160]vii.mri扫描和分析。[0161]使用4.7t扫描仪(玛格内斯科学有限公司(magnexscientificlimited))和定制的17mm直径螺管线圈对edaps植入大鼠尾运动节段和对照大鼠尾运动节段进行mri扫描。使用多回波多自旋序列获取一系列图像以用于定量t2成像(0.5mm切片厚度，117μm平面分辨率，16个回波，tr/te＝2,000/11.13ms)。如前所述，使用自定义matlab代码产生每个实验组的平均t2图。对于edaps植入山羊颈椎，使用3t扫描仪(西门子magnetomtriotim)获得t2加权(5mm切片厚度，0.5mm平面分辨率，tr/te＝4,540/123ms)正中矢状图像。也获得了一系列用于t2映射的颈椎图像(6个回波，te＝13ms，5mm切片厚度，0.5mm平面分辨率)。[0162]viii.力学试验和分析。[0163]椎骨-edaps-椎骨运动节段和原生运动节段通过小心去除尾部皮肤以及清除与软组织edaps相邻的椎体(相邻肌肉和肌腱保持完整)而准备用于压缩试验。墨点被放置在紧邻edaps远端和近端的椎骨上，作为试验期间光学位移跟踪的基准标记。为了确定压缩力学特性，将运动节段封装在定制夹具中的低熔点铟铸造合金(麦克马斯特-卡尔(mcmaster-carr))中，并在室温下，在磷酸盐缓冲盐水(pbs)浴中以0.05hz(英斯特朗(instron)5948)的频率接受试验方案，该试验方案由20个从0至-3n(0至-0.25mpa)压缩循环组成。如前所述，在matlab中从第20次压缩循环计算力学特性(趾和线性区域模量、过渡和最大应变)，并将其相对于从mr图像测量的椎间盘面积和高度归一化。在体外培养5周(植入前)的edaps的压缩力学特性也以类似的方式进行量化。在宏观压缩试验后，对来自20周植入组的运动节段进行如下所述的μct扫描和压缩试验。[0164]压缩试验后，对edaps周围的肌肉和肌腱进行完整的圆周解剖。然后以0.025毫米/秒的速度对edaps植入运动节段和原生运动节段进行拉伸试验至断裂。matlab中拉伸曲线的双线性拟合用于量化趾和线性拉伸模量以及断裂应力和应变。[0165]对于在山羊颈椎间盘间隙中植入8周的edaps，分离椎体-edaps-椎体或原生颈椎间盘运动节段，并用手锯去除后侧和侧向骨元件。将颅骨椎体和尾椎体封装在低熔点合金中，样本在pbs浴中接受压缩试验方案(英斯特朗5948)，该压缩试验方案由20个从0至-25n(0至0.084mpa)的压缩循环组成。对matlab中的压缩曲线进行双线性拟合，以量化edaps和原生山羊颈椎间盘的趾和线性区域模量、过渡和最大应变。适合山羊颈椎大小并培养15周的edaps以类似的方式进行压缩力学试验，以确定植入之前edaps的力学特性。[0166]ix.μct试验和分析。[0167]对20周的原生大鼠尾运动节段和edaps植入运动节段进行μct压缩试验。运动节段用pbs浸泡的纱布包裹，并且在将椎体近端和远端部分封装在石蜡中后放置在scanco医疗压缩/拉伸装置内，以稳定装置内的运动节段。在施加3n压缩负荷前后，使用scanco医疗μct50以10μm分辨率对运动节段进行扫描。如前所述，使用自定义matlab代码在压缩前后对原生椎间盘或edaps的椎间盘部分(不包括不透射线的pcl泡沫终板)的高度进行量化。应变按椎间盘高度随压缩的变化除以原始椎间盘高度进行计算。[0168]x.edaps组成和结构的评价。[0169]力学试验后，将edaps从运动节段中解剖出来，手动分离成af、np和ep部分，并且分别在60℃下在蛋白酶k中消化过夜。使用二甲基亚甲基蓝(dmmb)染料结合分析法测定每个区域的gag含量，并通过邻羟基脯氨酸(ohp)的对二氨基苯甲醛/氯胺-t分析法对胶原含量进行定量。将gag和胶原含量相对于样品湿重归一化，并与体外培养5周(植入前)的edaps的生化含量进行比较。[0170]edaps植入大鼠尾运动节段(n＝2-3/时间点)、edaps植入山羊颈部运动节段(n＝4)和原生大鼠尾运动节段以及山羊颈运动节段通过石蜡固定、脱钙(formical-2000，(迪高化工公司(decalchemicalcorporation)，纽约州托尔曼(tallman,ny))并加工。10μm切片用阿尔新蓝(糖胺聚糖)和天狼猩红(胶原)染色。对于大鼠edaps，对胶原ii(dshb，ii-ii6b3)和硫酸软骨素(dshb，9ba12)和胶原i(密理博(millipore)，ab749p)进行免疫组织化学法。对于山羊edap，对胶原ii(dshb，ii-ii6b3)、聚集蛋白聚糖(密理博，abt1373)和胶原i(密理博，ab749p)进行免疫组织化学法。对于每种抗体，来自每个实验组的切片同时染色。再水化的切片在室温下在蛋白酶k(丹科(dako))中连续孵育5分钟，在3％过氧化氢中孵育10分钟，在马血清中孵育30分钟(vectastainabc通用试剂盒，载体实验室(vectorlaboratories))，并在4℃下在一抗中孵育过夜。使用vectastainabc通用hrp试剂盒(pk-6200，载体实验室)和3,3'-二氨基联苯胺(密理博)实现二次显示。[0171]xi.二次谐波产生成像。[0172]石蜡包埋的10μmedaps和原生椎间盘切片固定在载玻片上，用citrisolv清除，并在用封片剂固定和封片之前进行再水化。在尼康(nikon)a1r共聚焦显微镜上观察切片的胶原二次谐波产生，该共聚焦显微镜配备有设置为880nm的spectaphysicsdeepseeinsight可调谐激光器。0.4μm厚度的z堆栈在截面深度上被捕获，并呈现为平均强度投影。[0173]c.实例3增强组织工程化全椎间盘置换物的整合的多孔聚己内酯的羟基磷灰石涂层[0174]形成脊柱椎间盘和相邻椎体之间的界面的是终板，其由薄薄一层透明软骨和相邻层的皮质骨组成。随着年龄的增长或受伤后，椎间盘和相邻终板的退变通常会发生并且经常与背部疼痛相关联。显著需要开发新的治疗策略以解决椎间盘和椎体终板两者的问题。为此，已经开发出带终板(终板修改的椎间盘状角层结构，edaps)组织工程化全椎间盘置换物，用于治疗严重的晚期椎间盘和终板退变。与组织工程化全椎间盘的其他设计相比，edaps的多孔聚合物终板类似物提供了界面，通过该界面可以将工程化椎间盘与原生椎体整合。然而，即使在大型动物模型中植入30周后，仍然没有观察到该界面的强烈矿化。本研究的目的是通过包含羟基磷灰石(ha)涂层来优化终板区域的设计，以改善体内植入之后edaps的整合。[0175]支架制造和ha涂层：多孔聚(ε-己内酯)(pcl)泡沫通过盐浸法制造，以产生直径为4mm、厚度为1.5mm的构建体。为了使pcl泡沫涂覆ha，泡沫通过梯度乙醇进行水化，接着在2mnaoh和模拟体液(sbf)中连续浸泡过夜。[0176]体外研究：在细胞接种之前，仅pcl的泡沫和ha涂覆的pcl泡沫通过乙醇梯度进行水化和灭菌，并用纤连蛋白涂覆过夜。p2牛骨髓源性间充质干细胞(msc)以3,333个细胞/mm2的密度接种在每个泡沫的顶面和底面。msc接种的泡沫在基础或成骨培养基(n＝4/组)中培养5周。在培养期结束时，对构建体存活率(mtt分析)和碱性磷酸酶活性(alp，西格玛奥德里奇(sigmaaldrich)试剂盒)进行量化。额外样品(n＝3/组)在矢状平面上冷冻切片，并使用冯库萨(vonkossa)染色试剂盒(艾博抗(abcam)对钙沉积物进行染色。[0177]体内研究：对于ha涂层的体内评估，制造了直径为4mm并且厚度为5mm的pcl泡沫，以模拟edaps构建体的尺寸。在外科手术中，用无细胞pcl泡沫(n＝2)或ha涂覆的pcl泡沫(n＝3)植入五只无胸腺大鼠的尾椎间盘间隙，并使用外固定器。简而言之，去除原生c8-c9尾椎间盘间隙，并使用高速磨钻对相邻椎体进行部分椎体切除术，使得构建体可以与椎体的骨髓并置。10周后，对动物执行安乐死并采集椎体-pcl泡沫-椎体运动节段供分析。运动节段固定在福尔马林中，并以10μm的分辨率进行μct扫描，以显示体内植入之后pcl泡沫内的三维组织分布。然后将样品脱钙并处理用于石蜡组织学。用mallory-heidenhain三色染色剂对组织切片进行染色，以区分未矿化胶原(浅灰色)和矿化胶原(深灰色)，并对骨钙素执行免疫组织化学法(ihc)。组间的显著差异(p《0.05)通过tukey事后检验的方差分析进行评估。vivointegrationandfunctionofanengineeredcell-seededdisc-likeangleplystructure(daps)fortotaldiscarthroplasty)”，《科学报告(sci.rep.)》7,15765(2017)。[0197]15.s.e.gullbrand、b.g.ashinsky、e.d.bonnevie、d.h.kim、j.b.engiles、l.j.smith、d.m.elliott、t.p.schaer、h.e.smith、r.l.mauck，“植入的组织工程化椎间盘的长期力学功能和整合(long-termmechanicalfunctionandintegrationofanimplantedtissue-engineeredintervertebraldisc)”，《科学·转化医学(sci.transl.med.)》10,eaau0670(2018)。[0198]1.r.a.deyo、s.k.mirza、b.i.martin，“背痛患病率和就诊率：美国国家调查估计(martin,backpainprevalenceandvisitrates:estimatesfromu.s.nationalsurveys)”，2002，《脊柱》(宾夕法尼亚州费城1976)。31,2724-2727(2006)。[0199]2.c.j.l.murray、t.vos、r.lozano，“1990-2010年21个地区291种疾病和伤害的失能调整寿命年(daly)：2010年全球疾病负担研究的系统分析。(disability-adjustedlifeyears(dalys)for291diseasesandinjuriesin21regions,1990-2010:asystematicanalysisfortheglobalburdenofdiseasestudy2010.)”，《柳叶刀(lancet)》380,2197–223(2012)。[0200]3.b.martin、r.a.deyo、s.mirza、j.turner、b.comstock、w.hollingworth、s.sullivan，“有背部和颈部问题的成年人的支出和健康状况(expendituresandhealthstatusamongadultswithbackandneckproblems)”，《美国医学会杂志(jama)》299,656-664(2008)。[0201]4.“美国骨科医师学会和美国骨和关节十年(americanacademyoforthopaedicsurgeonsandtheunitedstatesboneandjointdecade)”，“美国肌肉骨骼疾病的负担(theburdenofmusculoskeletaldiseasesintheunitedstates)”(美国骨科医师学会，伊利诺伊州罗斯蒙特(rosemont,il)，2008)。[0202]5.j.p.g.urban、s.roberts，“椎间盘退变(degenerationoftheintervertebraldisc)”，《关节炎研究与疗法(arthritisres.ther.)》5,120-130(2003)。[0203]6.m.haefeli、f.kalberer、d.saegesser、a.g.nerlich、n.boos、g.paesold，“人腰椎间盘宏观退变过程(thecourseofmacroscopicdegenerationinthehumanlumbarintervertebraldisc.)”，《脊柱》(宾夕法尼亚州费城1976)。31,1522-1531(2006)。[0204]7.g.ghiselli、j.c.wang、n.n.bhatia、w.k.hsu、e.g.dawson，“腰椎相邻节段退变。(adjacentsegmentdegenerationinthelumbarspine.)”，《美国骨与关节外科杂志(j.bonejointsurg.am.)》86-a,1497-503(2004)。[0205]8.b.j.c.freeman、j.davenport，“腰椎的全椎间盘置换术：文献的系统回顾(totaldiscreplacementinthelumbarspine:asystematicreviewoftheliterature)”，《欧洲脊柱杂志(eur.spinej.)》15(2006),doi:10.1007/s00586-006-0186-9。[0206]9.w.jacobs、a.tuschel、m.dekleuver、w.peul、a.verbout、c.oner，“慢性腰部疼痛的全椎间盘置换术(totaldiscreplacementforchroniclow-backpain)”，《科克伦系统综述数据库(cochranedatabasesyst.rev.)》38,24-36(2010)。[0207]10.a.j.buckland、j.f.baker、r.p.roach、j.m.spivak，“颈椎间盘置换术-颈前路椎间盘切除术和融合术的新兴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