信使RNA的组合物、方法和用途与流程

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术信使rna的组合物、方法和用途1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2019年10月21日提交的美国临时申请序列号62/923,711、2019年11月13日提交的美国临时申请序列号62/934,842和2020年9月28日提交的美国临时申请序列号63/084,422的优先权，该临时申请中的每一者的公开内容据此以引用的方式整体并入。3.以引用方式并入序列表4.本技术包含以ascii格式电子提交的序列表，并且据此以引用的方式整体并入。创建于2020年10月20日的所述ascii副本命名为mrt-2120wo_st25.txt，并且大小为20kb。在此不增加新的内容。背景技术：5.细胞蛋白质的降解是细胞功能正常维持所必需的，包括增殖、分化和细胞死亡。蛋白水解的不可逆性质使其非常适合用作控制单向过程的调节开关。该原理在细胞周期的控制中是显而易见的，其中dna复制的开始、染色体分离和有丝分裂的退出由关键调节蛋白的破坏触发。6.翻译后调节蛋白质的主要途径之一是泛素依赖性蛋白水解。选择性降解的第一步是将一个或多个泛素分子连接到蛋白质底物上。泛素化通过泛素激活酶(e1)、泛素结合酶(e2)和泛素蛋白连接酶(e3)的活性发生，这些酶起依次催化泛素与底物蛋白的赖氨酸残基的附接的作用(参见ciechanover a.等人,bioessays,22:442–451(2000))。e3蛋白连接酶通过直接结合底物而赋予泛素化反应特异性。7.许多疾病和病症是由蛋白质的异常表达引起的。因此，靶向用于降解的此类异常表达的蛋白质是解决多种疾病或病症的有前景的治疗方法。然而，迄今为止，利用细胞自身系统进行选择性蛋白质降解仅限于有限数量的靶蛋白，对于这些靶蛋白，已知小分子或肽以高特异性结合这些蛋白质以使选择性蛋白质降解可行。通常，此类蛋白质或肽与连接酶结合分子(例如，另一种小分子或肽)连接。然而，将此类小分子或基于肽的构建体有效递送至其细胞内靶蛋白是困难的，并且严重限制了可递送的构建体的大小。因此，本领域需要提供用于选择性蛋白质降解的改进方法和组合物。技术实现要素：8.本发明提供了用于选择性降解目标靶蛋白的基于mrna的组合物和方法。具体而言，本文所述的组合物和方法提供了尤其编码泛素途径部分和导致靶蛋白降解的结合蛋白的mrna的有效体内递送。在一些方面，本文所述的组合物和方法提供了尤其编码至少两种结合肽(结合泛素途径部分的第一结合肽和结合靶蛋白的第二结合肽)的mrna的有效体内递送，其中与靶蛋白的结合导致靶蛋白的选择性降解。本文所述的基于mrna的组合物和方法相对于选择性靶降解的其他组合物和方法(例如sirna)具有若干优点。这种优点包括，例如，快速靶向用于降解的目标蛋白，瞬时降解作用，以及易于递送本文所述的组合物。其他优点包括基于其翻译后修饰状态靶向用于降解的所需蛋白的能力。9.在一方面，本发明尤其提供了一种信使rna(mrna)，所述信使rna编码泛素途径部分和结合靶蛋白的结合肽，其中所述mrna包封在脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，泛素途径部分和结合肽产生融合蛋白。例如，在一些实施方案中，编码泛素途径部分和结合靶蛋白的结合肽的mrna产生融合肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含内部核糖体进入位点(ires)。在一些实施方案中，提供了至少两种mrna，其中第一mrna编码泛素途径部分，并且第二mrna编码结合靶蛋白的结合肽。10.在一些实施方案中，泛素途径部分是e3-泛素连接酶、e3连接酶接头或能够诱导泛素-蛋白酶体途径的蛋白质或肽。11.在一些实施方案中，结合肽特异性识别并结合用于降解的靶蛋白。12.在一些实施方案中，编码泛素途径部分和结合靶蛋白的结合肽的mrna以浓度依赖性方式降解靶蛋白。13.在一些实施方案中，泛素途径部分和结合肽被接头分开。14.在一些实施方案中，泛素途径部分是泛素途径蛋白。15.在一些实施方案中，接头是gs接头。例如，在一些实施方案中，gs接头包含以下：(gs)x，其中x＝1-15。在一些实施方案中，gs接头包含以下：(gys)x；x＝1-15，y＝1-10。16.在一些实施方案中，泛素途径部分和结合肽未被接头分开。17.在一些实施方案中，泛素途径部分是e3衔接蛋白。18.在一些实施方案中，e3衔接蛋白经工程改造以用结合肽替代其底物识别结构域。19.在一些实施方案中，e3衔接蛋白选自spop、chip、crbn、vhl、xiap、mdm2、小脑蛋白和ciap。因此，在一些实施方案中，e3衔接蛋白是spop。在一些实施方案中，e3衔接蛋白是chip。在一些实施方案中，e3衔接蛋白是vhl。在一些实施方案中，e3衔接蛋白是xiap。在一些实施方案中，e3衔接蛋白是mdm2。在一些实施方案中，e3衔接蛋白是小脑蛋白。在一些实施方案中，e3衔接蛋白是ciap。20.在一些实施方案中，泛素途径部分是特异性结合e3衔接蛋白或e3连接酶的抗体。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是spop、chip、crbn、vhl、xiap、mdm2或ciap。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是spop。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是chip。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是crbn。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是vhl。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是xiap。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是mdm2。在一些实施方案中，特异性结合e3衔接蛋白的抗体是ciap。21.在一些实施方案中，结合肽是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，结合肽是特异性结合靶蛋白的抗体或抗体片段。22.在一些实施方案中，结合肽是与靶蛋白结合或与靶蛋白形成复合物的蛋白质。在一些实施方案中，与目标靶蛋白结合或与目标靶蛋白形成复合物的蛋白质对于靶细胞是内源性的。在一些实施方案中，靶蛋白在靶细胞中异常表达。在一些实施方案中，靶蛋白是胞内蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是核蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是酶。在一些实施方案中，靶蛋白是参与细胞信号传导的蛋白质。在一些实施方案中，靶蛋白是参与细胞分裂的蛋白质。在一些实施方案中，靶蛋白是参与代谢的蛋白质。在一些实施方案中，靶蛋白是参与炎症反应的蛋白质。23.在一方面，本发明尤其提供了一种信使rna(mrna)，所述信使rna编码至少两种结合肽，其中第一结合肽结合泛素途径部分并且第二结合肽结合靶蛋白，并且其中所述mrna包封在脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，单个mrna编码至少两种结合肽，其中第一结合肽结合泛素途径部分并且第二结合肽结合靶蛋白，并且其中所述mrna包封在脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，提供了至少两种mrna，包括编码第一结合肽的第一mrna和编码第二结合肽的第二mrna。在一些实施方案中，第一mrna和第二mrna包封在单独的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，第一和第二mrna包封在单个脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，由第一mrna和第二mrna编码的结合肽彼此结合，产生结合的融合样部分。24.在一些实施方案中，第一结合肽和第二结合肽被接头分开。25.在一些实施方案中，接头是gs接头。26.在一些实施方案中，第一结合肽和第二结合肽未被接头分开。27.在一些实施方案中，泛素途径部分是泛素途径蛋白。28.在一些实施方案中，泛素途径部分是e3衔接蛋白。29.在一些实施方案中，e3衔接蛋白选自spop、chip、crbn、vhl、xiap、mdm2和ciap。30.在一些实施方案中，第一结合肽是抗体或抗体片段。31.在一些实施方案中，第二结合肽是抗体或抗体片段。32.在一些实施方案中，抗体或抗体片段是纳米抗体、fab、fab′、fab′2、f(ab′)2、fd、fv、feb、scfv或smip。在一些实施方案中，抗体或抗体片段结合e3连接酶衔接蛋白。在一些实施方案中，抗体或抗体片段结合spop、chip、crbn、vhl、xiap、mdm2、小脑蛋白和/或ciap。因此，在一些实施方案中，构建体编码结合spop的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，构建体编码结合chip的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，构建体编码结合crbn的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，构建体编码结合vhl的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，构建体编码结合xiap的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，构建体编码结合mdm2的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，构建体编码结合小脑蛋白的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，构建体编码结合ciap的抗体或抗体片段。33.在一些实施方案中，mrna还编码信号肽。34.在一些实施方案中，信号肽是核定位序列。35.在一些实施方案中，信号肽是内质网(er)信号序列。36.在一些实施方案中，信号肽是内质网(er)保留序列。37.在一些实施方案中，信号肽是细胞分泌序列。38.在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种peg修饰的脂质。39.在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质选自由以下各项组成的组：ckk-e12、of-02、c12-200、mc3、dlindma、dlinkc2dma、ice(基于咪唑)、hgt5000、hgt5001、hgt4003、dodac、ddab、dmrie、dospa、dogs、dodap、dodma和dmdma、dodac、dlendma、dmrie、clindma、cplindma、dmoba、docarbdap、dlindap、dlincarbdap、dlincdap、klin-k-dma、dlin-k-xtc2-dma、3-(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)-6-(4-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)丁基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标23)、3-(5-(双(2-羟基十二烷基)氨基)戊-2-基)-6-(5-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)戊-2-基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标24)以及它们的组合。40.在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质包括ckk-e12。41.在一些实施方案中，所述靶蛋白包含所述靶蛋白的磷酸化形式、所述靶蛋白的非磷酸化形式、所述靶蛋白的脂化形式、所述靶蛋白的非脂化形式、所述靶蛋白的前肽形式、所述靶蛋白的糖基化形式、所述靶蛋白的未糖基化形式、所述靶蛋白的氧化形式、所述靶蛋白的未氧化形式、所述靶蛋白的羰基化形式、所述靶蛋白的非羰基化形式、所述靶蛋白的甲酰化形式、所述靶蛋白的非甲酰化形式、所述靶蛋白的酰化形式、所述靶蛋白的非酰化形式、所述靶蛋白的烷基化形式、所述靶蛋白的非烷基化形式、所述靶蛋白的磺化形式、所述靶蛋白的非磺化形式、所述靶蛋白的s-亚硝基化形式、所述靶蛋白的非s-亚硝基化形式、所述靶蛋白的谷胱甘肽加成形式、所述靶蛋白的非谷胱甘肽加成形式、所述靶蛋白的腺苷酸化形式、所述靶蛋白的非腺苷酸化形式，或所述蛋白的atp或adp结合形式。42.在一些实施方案中，靶蛋白与受体结合。43.在一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述任一项实施方案的mrna。44.在一方面，提供了一种诱导蛋白质降解的方法，所述方法包括施用如本文所述任一项实施方案中所述的mrna。45.在一些实施方案中，mrna经静脉内、皮内、皮下、鞘内、口服或通过吸入或雾化施用。46.在一方面，提供了一种细胞，所述细胞包含如本文所述任一项实施方案中所述的mrna。47.在一方面，一种治疗患有与异常蛋白质表达相关的疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述有需要的受试者施用如本文所述的mrna，其中施用所述mrna导致所述异常表达的蛋白质的选择性降解。48.在一些实施方案中，疾病或病症是基于朊病毒的疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是多囊性肾病。在一些实施方案中，疾病或病症是佩梅病(pelizaeus-mezbacher disease)。在一些实施方案中，疾病或病症是炎性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。附图说明49.这些附图用于说明的目的，而非限制。50.图1a是包含编码vhhgfp4、e3连接酶和flag标签的序列的mrna构建体的示意图。任选地，构建体包含编码er信号肽、er保留信号和/或如“^”所示的接头的序列。图1b示出mrna构建体亚细胞定位和构建体a和e的设计。51.图2a是未处理的表达gfp的hela细胞的图像。gfp如左上图所示，核dna染色在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在左下图中示出。右下图是合并图像。图2b是gfp和flag信号的合并图像。52.图3a是用mrna构建体a(如图1a和图1b所描绘)转染24小时后表达gfp的hela细胞的图像。gfp在左上图中示出，核dna在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在左下图中示出。右下图中呈现合并的图像。图3b是gfp和flag信号的放大的合并图像。箭头指示在含有载体构建体的细胞(即，具有spop e3-泛素连接酶的细胞)中显示gfp信号降低或缺失的示例性细胞。53.图4a是用mrna构建体c转染24小时后表达gfp的hela细胞的图像，该mrna构建体c含有er信号肽和er保留信号(图1a和图1b中所示)。gfp在左上图中示出，dna在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在左下图中示出。右下图中呈现合并图像。图4b是gfp和flag信号的放大的合并图像。虚线箭头指示用载体转染(如flag免疫染色所示)并且gfp存在量减少的示例性细胞。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。54.图5a是用mrna构建体d(如图1a和图1b所示)转染24小时后表达gfp的hela细胞的图像。gfp在左上图中示出，核dna在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在左下图中示出。右下图中呈现合并图像。图5b是gfp和flag信号的放大的合并图像。虚线箭头指示表达gfp和e3-泛素连接酶两者的示例性细胞。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。55.图6a是用mrna构建体e转染24小时后表达gfp的hela细胞的图像。gfp在左上图中示出，核dna在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在右下图中示出。右下图中呈现合并图像。图6b是gfp和flag信号的放大的合并图像。虚线箭头指示表达gfp和e3-泛素连接酶两者的示例性细胞。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。56.图7a是用mrna构建体f(如图1a和图1b所述)转染24小时后表达gfp的hela细胞的图像。gfp在左上图中示出，核dna在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在左下图中示出。图7b是gfp和flag信号的放大的合并图像。虚线箭头指示表达gfp和e3-泛素连接酶两者的示例性细胞。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。57.图8a是转染6小时后hek293细胞的一系列图像。在左上图中，未处理的hek293细胞(如表2中所述的样品1)仅示出核dna的信号。在右上图(样品2)中，示出被gfp mrna转染的细胞，其示出核dna和gfp的信号。在左下图(样品3)中，示出被构建体a(如图1a和图1b所述)转染的细胞，其示出对核dna和flag的染色，表明e3-泛素连接酶定位为核斑点。在右下图(样品4)中，示出被构建体e(如图1a和图1b所述)转染的细胞，其示出核dna和flag的信号，表明e3-泛素连接酶在细胞质中的定位。图8b是转染24小时后hek293细胞的一系列图像。在左上图中，未处理的hek293细胞(如表2中所述的样品7)仅示出核dna的信号。在右上图(样品8)中，示出被gfp mrna转染的细胞，其示出核dna和gfp的信号。在左下图(样品9)中，示出被构建体a(如图1a和图1b所述)转染的细胞，其示出核dna和flag的信号，表明e3-泛素连接酶定位为核斑点。在右下图(样品10)中，示出被构建体e(如图1a和图1b所述)转染的细胞，其示出核dna和flag的信号，表明e3-泛素连接酶在细胞质中的定位。58.图9a是用构建体a和gfp mrna(如表2中所示的样品5)转染6小时后hek293细胞的一系列图像。gfp信号在左图中示出。右图示出gfp和flag信号的合并图像。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。图9b是用构建体a和gfp mrna(如表2中所示的样品11)转染24小时后hek293细胞的一系列图像。gfp信号在左图中示出。右图示出gfp和flag信号的合并图像。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。59.图10a是用构建体e和gfp mrna(如表2中所示的样品6)转染6小时后hek293细胞的一系列图像。gfp信号在左图中示出。右图示出gfp和flag信号的合并图像。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。图10b是用构建体e和gfp mrna(如表2中所示的样品12)转染24小时后hek293细胞的一系列图像。gfp信号在左图中示出。右图示出gfp和flag信号的合并图像。实线箭头指示表达e3-泛素连接酶的示例性细胞，gfp信号降低或缺失。60.图11是用构建体a转染24小时后h2b标记的表达gfp的hela细胞的一系列图像。指示核dna的dapi信号在左上图中示出，gfp在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在左下图中示出。右下图是gfp和flag信号的合并图像。61.图12是用构建体e转染24小时后h2b标记的表达gfp的hela细胞的一系列图像。指示核dna的dapi信号在左上图中示出，gfp在右上图中示出，并且指示e3-泛素连接酶表达的flag在左下图中示出。右下图是gfp和flag信号的合并图像。62.图13a-d描绘示出构建体e的剂量-反应效应的一系列图表和蛋白质印迹。图13a示出描绘由构建体e编码的e3-泛素连接酶对gfp蛋白水解的剂量-反应效应的示例性图表。不内源性表达gfp的hela细胞用不同浓度的gfp mrna和构建体e共转染。elisa用于测定共转染后24小时gfp的浓度。图13b示出用构建体e和gfp mrna处理后，hela细胞中经由elisa的gfp的敲低百分比。图13c描绘flag蛋白质印迹。图13d描绘gfp蛋白质印迹和示出gfp表达以浓度依赖性方式降低的图表。63.图14是描绘由构建体e编码的e3-泛素连接酶诱导的gfp降解的时程研究的示例性图表。不内源性表达gfp的hela细胞用gfp mrna和构建体e共转染。elisa用于测定转染后0至34小时的不同时间点的gfp浓度。64.图15是描绘由构建体a编码的e3-泛素连接酶诱导的gfp降解的时程研究的示例性图表。用构建体a转染在核中稳定表达h2b-gfp的hela细胞。elisa用于测定转染后0至72小时的不同时间点的gfp浓度。65.图16是描绘体外无细胞翻译系统的研究设计的示例性示意图。由hela细胞制备细胞质提取物。除了编码e3-泛素连接酶的mrna之外，还用编码靶蛋白(例如gfp或a1at)或重组蛋白的mrna补充含有功能性翻译系统的细胞质提取物。在不同的时间点，取样以通过elisa、蛋白质印迹或qpcr来定量靶蛋白的量。66.图17a是描绘在无细胞翻译系统(cfts)中由构建体e编码的e3-泛素连接酶诱导的gfp降解的时程研究的示例性图表。用gfp mrna(5pmol)和构建体e以不同的gfp mrna:构建体e的比例补充细胞质提取物。作为阴性对照，一个样品仅用gfp mrna补充，另一个样品不用任何mrna补充。在不同时间点通过elisa定量gfp蛋白的量。图17b是示出在无细胞翻译系统(cfts)中由构建体e编码的e3-泛素连接酶诱导的重组gfp降解的时程研究的图表。图17c是包含e3连接酶小脑蛋白的构建体g的示意图。图17d是示出在无细胞翻译系统(cfts)中使用构建体g的抗gfp浓度反应的图表。图17e是示出与2x或6x浓度的构建体g接触1小时、2小时和3小时的gfp百分比的图表。图17f是示出包括e3连接酶小脑蛋白的各种bioprotac设计的示意图。bioprotac设计包括编码抗pnpla3 scfv的构建体m和包含pnpla3蛋白结合剂abhd5的构建体n。图17g是示出从elisa测定获得的数据的图表，其示出pnpla3的量随着bioprotac构建体m浓度的增加而浓度依赖性降低。67.图18a是包含编码vhhgfp4、spop e3-连接酶和flag标签的序列的mrna构建体的示意图。spop e3-连接酶含有核定位信号(nls)。在vhhgfp4和spop之间引入不同的接头长度，以检查接头长度对gfp蛋白水解的影响。图18b是描绘在无细胞翻译系统中由具有不同接头长度的构建体a(构建体a1-a5；表4)编码的e3-泛素连接酶诱导的gfp降解的时程研究的示例性图表。用gfp mrna和构建体a的变体补充细胞质提取物。作为阴性对照，样品仅用gfp mrna补充。在不同时间点通过elisa定量gfp蛋白的量。68.图19是包含编码特异性靶向a1at的scfv4b12、e3连接酶(hvhl或chip)和flag标签的序列的mrna构建体的示意图。任选地，构建体包含编码er信号肽、er保留信号和/或如“^”所示的接头的序列。69.图20a是描绘由构建体e编码的e3-泛素连接酶对a1at蛋白水解的剂量-反应效应的示例性图表。不内源性表达a1at的hela细胞用不同浓度的a1at质粒和图19所示的构建体共转染。elisa用于测定共转染后24小时a1at的浓度。图20b是描绘在体外无细胞翻译系统中由构建体e编码的e3-泛素连接酶对a1at蛋白水解的剂量-反应效应的示例性图表。用4pmol的a1at mrna和图19所示的构建体以不同的a1at mrna:构建体的比例补充细胞质提取物。作为阴性对照，样品仅用a1at mrna补充。在不同时间点通过elisa定量a1at蛋白的量。70.图21a和b描绘示出构建体g的剂量反应效应的示意图、图表和蛋白质印迹。图21a示出构建体g的示意图和示出用构建体g bioprotac rna和gfp mrna处理后hela细胞中gfp敲低百分比的图表。图21b示出来自使用构建体g的研究的gfp蛋白质印迹及其相关图示。图21c示出用不同比例的构建体g和gfp rna(1:1、4:1；和10:1)转染的hela细胞的facs图。图21d是示出在有或没有蛋白酶体抑制剂mg132的情况下，在构建体g和gfp rna的1:1比例条件下gfp表达的柱状图。71.图22a是示出在有或没有5um蛋白质组抑制剂mg-132的情况下用构建体g bioprotac rna处理的hela细胞的gfp elisa结果的图表。图22b描绘在有和没有蛋白酶体抑制剂mg-132的情况下的gfp蛋白质印迹。图22b还示出对应于gfp蛋白质印迹结果的图表。72.图23a是示出各种bioprotac设计，包括双特异性抗小脑蛋白bioprotac的设计的示意图。图23b是说明在e3连接酶复合物中bioprotac与小脑蛋白(crbn)结合的示意图。图23c是示出用不同浓度的gfp rna和bioprtoac rna共转染的hela细胞中敲低百分比的图表。73.图24a是示出用于评估体内施用的bioprotac的表达持续时间的各种bioprotac的设计的示意图。图24b是示出在施用后6小时和24小时肝脏gfp表达(μg gfp/mg蛋白)的图表。74.定义75.为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。以下术语和其他术语的其他定义阐述在整个说明书中。76.protac：protac，一种蛋白水解靶向嵌合体，是由两个活性结构域和任选的能够去除特定不需要的蛋白质的接头构成的杂功能小分子。protac不是作为常规的酶抑制剂，而是通过诱导选择性细胞内蛋白水解来起作用。protac通常由两个共价连接的蛋白质结合分子组成：一个能够接合e3泛素连接酶，并且另一个结合旨在降解的靶蛋白。e3连接酶向靶蛋白的募集导致泛素化和随后蛋白酶体对靶蛋白的降解。protac仅需要以高选择性结合它们的靶标，而不是抑制靶蛋白的酶活性。protac技术可应用于使用各种e3连接酶的药物发现，包括例如spop、chip、pvhl、mdm2、β-trcp1、小脑蛋白和c-iap1。77.动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆物。在本发明中，所述转基因动物、基因工程动物和/或克隆物不是人类。78.大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中另外显而易见(除非此数字将超过可能值的100％)，否则术语“大约”或“约”是指处于所陈述参考值任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的一系列值。79.递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mrna的递送涵盖其中将mrna递送至靶组织并且编码的蛋白质在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将mrna递送至靶组织并且编码的蛋白质表达且分泌到患者的循环系统(例如血清)内，并且全身分布且被其他组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。80.包封：如本文所用，术语“包封”或语法等同形式是指将单独的mrna分子限制在纳米颗粒内的过程。81.表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指mrna翻译成多肽、多个多肽组装成完整蛋白质(例如，酶)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如，酶)的翻译后修饰。在本专利申请中，术语“表达”和“产生”以及语法等价物可互换使用。82.半衰期：如本文所用，术语“半衰期”是诸如核酸或蛋白质的浓度或活性的数量下降到在一段时间的开始时所测量的值的一半所需的时间。83.改进、增加或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同项表示相对于基线测量值，诸如在本文所述治疗开始之前同一个体的测量值，或在没有本文所述治疗的情况下对照受试者(或多个对照受试者)的测量值的值。“对照受试者”是患有与所治受试者相同形式的疾病，其年龄与所治受试者大约相同的受试者。84.体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。85.体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。86.局部分布或递送：如本文使用的，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等价物指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mrna编码的蛋白质(例如酶)在细胞内或伴随有限分泌被翻译且表达，其避免进入患者的循环系统。87.信使rna(mrna)：如本文所用，术语“信使rna(mrna)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用，mrna涵盖经修饰的和未经修饰的rna二者。mrna可以含有一个或多个编码和非编码区。mrna可以从天然来源纯化，使用重组表达系统来产生和任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，mrna可以包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则mrna序列的显示方向为5’至3’。在一些实施方案中，mrna是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；插入型碱基；经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-n-亚磷酰胺键)。88.患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如出于实验目的、诊断目的、预防目的、美容目的和/或治疗目的向其施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人。人包括产前和产后形式。89.药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指与合理的受益/风险比相称在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的物质。90.受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，该患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有或易患有疾病或病症，但是可以显示出或可以不显示出该疾病或病症的症状。91.基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或特性的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。92.全身分布或递送：如本文所用，术语“全身分布”、“全身递送”或语法等同形式是指影响整个身体或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统(例如血流)完成。与“局部分布或递送”的定义形成对比。93.靶细胞：如本文所用，术语“靶细胞”是指受待治疗的疾病影响的任何细胞。在一些实施方案中，靶细胞展示疾病相关病理学、症状或特征。94.靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。95.治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当施用于患有疾病、障碍和/或病症或对疾病、障碍和/或病症敏感的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟该疾病、障碍和/或病症的症状发作的量。本领域的普通技术人员将认识到，通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来施用治疗有效量。96.治疗：如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指用于使特定疾病、病状和/或病况的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病关联的病理的风险，可以向未表现出疾病体征和/或仅表现出疾病早期体征的受试者施用治疗。具体实施方式97.本发明提供了用于选择性降解目标靶蛋白的基于mrna的组合物和方法。本文所述的mrna组合物编码与目标结合肽偶联(直接或经由接头间接)的泛素途径部分。在泛素途径部分和结合肽表达时，结合蛋白结合到目标蛋白，并且泛素途径部分引起目标蛋白的泛素化和选择性降解。因此，本文所述的mrna的用途之一是选择性快速降解目标靶蛋白。98.在特定的实施方案中，提供了基于mrna的protac组合物。还提供了使用编码与对靶蛋白具特异性的结合蛋白融合的泛素靶向部分的mrna治疗与靶蛋白的异常表达相关的疾病的方法。本文描述了此类组合物，并且在一些实施方案中，通过脂质纳米颗粒递送系统将mrna递送至有需要的受试者。99.在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。100.编码泛素途径部分和结合蛋白的mrna101.根据本发明，泛素途径部分可以是识别并结合泛素途径蛋白的任何合适的结构。一般而言，泛素途径蛋白可以是能够催化或导致催化泛素或泛素样修饰多肽(例如nedd8、apg12或isg15/ucrp)转移至另一种蛋白(目标蛋白)的任何实体或复合物。在一个实施方案中，泛素途径蛋白是泛素蛋白连接酶或e3衔接蛋白或e3-泛素连接酶。存在至少600种由人类基因组编码的e3连接酶(参见lim等人,biorxiv预印本，“bioprotacs as versatile modulators of intracellular therapeutic targets:application to proliferating cell nuclear antigen(pcna)”，dx.doi.org/10.1101/728071，其内容以引用的方式整体并入本文)。任何可用的e3连接酶或衔接蛋白都可用于本文所述的发明。在这些e3连接酶中，最常用的连接酶包括例如crbn、vhl、mdm2和ciap。在一些实施方案中，本发明的mrna编码选自spop、chip、crbn、vhl、mdm2或ciap的e3连接酶。102.在一些方面，提供了编码至少两种结合肽的mrna，其中第一结合肽结合泛素途径部分并且第二结合肽结合靶蛋白，并且其中所述mrna包封在脂质纳米颗粒内。103.在另一个实施方案中，泛素途径部分可以是参与泛素样途径的蛋白质或泛素样途径的组分，其转移泛素样修饰多肽，例如sumo、nedd8、apg12或isg15/ucrp。泛素样途径的组分通常是泛素途径的同源物。例如，sumo的泛素样途径可包括泛素蛋白活化酶或e1蛋白、泛素蛋白结合酶或e2蛋白和泛素连接酶或e3蛋白的同源物。104.泛素途径蛋白可以组织特异性或受调节的方式表达。例如，vacm-1受体(又名cul-5)和f-box蛋白nfb42以组织特异性方式表达。在一个实施方案中，泛素途径蛋白可以是基于ring或基于hect的泛素连接酶。105.根据本发明的一个实施方案，本发明的泛素途径部分可以是泛素途径蛋白的任何合适的配体，例如泛素蛋白连接酶或e3衔接蛋白或其同源物。在另一个实施方案中，本发明的泛素途径部分可以是任何泛素途径蛋白结合肽、泛素途径蛋白的配体的结构域或区域。在另一个实施方案中，本发明的泛素途径蛋白结合部分可以受调节的方式识别并结合泛素途径蛋白。106.在一些实施方案中，e3衔接蛋白可以其天然形式使用。在一些实施方案中，e3衔接蛋白可经工程改造以用结合肽替代其底物识别结构域。在一些实施方案中，e3衔接蛋白可选自spop、chip、crbn、vhl、xiap、mdm2和ciap。在一个实施方案中，e3衔接蛋白是spop。在另一个实例中，e3衔接蛋白是vhl。107.根据本发明，靶向部分或结合肽是识别并结合靶蛋白的任何结构。例如，结合肽可以是与靶蛋白结合或与靶蛋白形成复合物的内源蛋白。另选地，结合肽可以是特异性结合靶蛋白的抗体或抗体片段。靶蛋白可以是人们希望调节其水平或活性的任何蛋白，例如，通过泛素依赖性蛋白水解或通过泛素或泛素样修饰多肽与对蛋白活性或结构重要的赖氨酸残基的附接来改变活性。通常，靶蛋白在靶细胞中异常表达。例如，靶蛋白可以是参与细胞周期(例如，细胞周期蛋白依赖性激酶)、信号转导(例如，受体酪氨酸激酶或gtp酶等)、细胞分化、细胞去分化、细胞生长、细胞因子或其他生物修饰物的产生、调节蛋白或功能蛋白(例如，转录因子)的产生、促炎信号传导或葡萄糖调节途径的蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白可以是未知被泛素化或未知为任何泛素途径蛋白的底物的蛋白。108.在另一个实施方案中，靶蛋白是疾病相关蛋白，例如，其功能或活性的变化导致疾病的蛋白，或其功能被认为对疾病状态的传播重要的蛋白。靶蛋白可以是稳定的或不稳定的，例如雄激素受体、雌激素受体、myc、细胞周期蛋白b、ras或细胞周期蛋白e。109.在一些实施方案中，靶蛋白是a1at。在一些实施方案中，靶蛋白是pnpla3。在一些实施方案中，靶蛋白是形成聚集体的蛋白质。在一些实施方案中，靶蛋白是tau。在一些实施方案中，靶蛋白是β-淀粉样蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是α-突触核蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是朊病毒。在一些实施方案中，靶蛋白是tdp-43、融合肉瘤蛋白、胱抑素c、notch3、gfap、plp、seipin、甲状腺素运载蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、淀粉样蛋白a、iapp、载脂蛋白、凝溶胶蛋白、溶菌酶、纤维蛋白原、胰岛素或血红蛋白。110.靶蛋白的选择性降解111.本文所述的组合物和方法可用于选择性靶向目标蛋白(“靶蛋白”)以进行降解。靶蛋白的选择性靶向包括具有特定类型的翻译后修饰的蛋白的选择性靶向。112.例如，在一些实施方案中，当靶蛋白被磷酸化时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，当靶蛋白未磷酸化时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，靶蛋白的脂化形式。113.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非脂化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。114.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的前肽形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。115.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的糖基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。116.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的未糖基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。117.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的氧化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解，118.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的未氧化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。119.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的羰基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。120.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非羰基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解，121.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的甲酰化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。122.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非甲酰化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。123.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的酰化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。124.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非酰化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。125.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的烷基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解，126.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非烷基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。127.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的磺化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解，128.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非磺化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。129.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的s-亚硝基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。130.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非s-亚硝基化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。131.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的谷胱甘肽加成形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。132.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非谷胱甘肽加成形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。133.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的腺苷酸化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。134.在一些实施方案中，当靶蛋白是靶蛋白的非腺苷酸化形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。135.在一些实施方案中，当靶蛋白是该蛋白的atp或adp结合形式时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。136.在一些实施方案中，当靶蛋白具有一个或多个翻译后修饰时，本文所述的组合物和方法用于靶向蛋白质以进行降解。例如，靶蛋白可具有一种或多种以下翻译后修饰：乙酰化、酰胺化、脱酰胺化、异戊烯化(例如法尼基化或香叶基化)、甲酰化、糖基化、羟基化、甲基化、豆蔻酰化、磷酸化、唾液酸化、多唾液酸化、sumo基化、nedd基化、核糖基化、硫酸化或其任意组合。137.在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于选择性降解与另一种蛋白结合的靶蛋白。例如，本文所述的组合物和方法可用于选择性降解与受体结合的靶蛋白。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于选择性降解未与受体结合的靶蛋白。138.在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于选择性降解具有长半衰期的靶蛋白。许多此类长半衰期蛋白质是本领域已知的，并且包括例如细胞结构蛋白质。139.结合肽140.根据本发明，结合肽或靶向部分是识别并结合靶蛋白或目标蛋白(poi)的任何结构，例如在目标靶细胞中异常表达的蛋白质(例如，胞内蛋白)。这可以是例如配体、抗体或抗体片段。根据本发明，泛素途径蛋白部分例如通过任何合适的方式与目标靶向部分或结合肽共价偶联。在一些实施方案中，本发明的组合物包括编码嵌合融合蛋白的mrna，该嵌合融合蛋白包含与靶向目标蛋白(例如，抗体)的结合蛋白融合的泛素途径部分(例如，e3衔接蛋白或e3连接酶)。在其他实施方案中，本发明的组合物包括编码嵌合融合蛋白的mrna，该嵌合融合蛋白包含与靶向目标蛋白(例如，抗体)的结合蛋白融合的泛素途径部分(例如，特异性结合e3衔接蛋白或e3连接酶的抗体)。在嵌合融合蛋白表达时，结合蛋白结合到目标蛋白，并且泛素途径部分引起目标蛋白的泛素化和选择性降解。141.在一些实施方案中，结合肽可以是分子文库的成员。分子文库可以是任何分子集合，包括但不限于组合文库、小分子文库、受体文库和配体文库。142.结合肽可以是肽、抗体或抗体模拟物，其允许结合到多种多样的靶蛋白，例如在目标靶细胞中异常表达的蛋白(例如，胞内蛋白)。在一些实施方案中，结合蛋白是抗体、抗体片段或抗体结构域。143.在特定的实施方案中，结合肽可以是特异性结合目标靶蛋白的内源蛋白或其片段。例如，内源蛋白或其片段可与目标靶蛋白形成复合物。因此，本发明的组合物包括编码嵌合融合蛋白的mrna，该嵌合融合蛋白包含与特异性结合目标靶蛋白或与其形成复合物的内源蛋白融合的泛素途径部分(例如，e3衔接蛋白或e3连接酶，诸如内源e3衔接蛋白或e3连接酶)。在特定的实施方案中，mrna编码包含内源泛素途径部分的嵌合融合蛋白，该内源泛素途径部分经工程改造以用与目标靶蛋白结合或与目标靶蛋白形成复合物的内源蛋白替代其底物识别结构域。包含在人体内内源性表达的组分或由其组成的此类融合蛋白(即，在人体内正常表达的肽或蛋白质)可能是特别有利的，因为如果该融合蛋白编码对人体是外源性的肽或蛋白质(即，在人体内不正常表达并且因此如果在目标靶细胞中表达则可引发免疫反应的肽或蛋白质)，则它们不太可能引发可能遇到的任何免疫原性反应。144.在其他实施方案中，结合蛋白可以是特异性结合目标靶蛋白的抗体，例如在目标靶细胞中异常表达的蛋白(例如，胞内蛋白)。抗体在特异性结合目标蛋白中的多功能性和抗体形式的多样性使得它们在本发明的融合蛋白中的应用特别有吸引力。此外，已知多种针对疾病机制中涉及的靶蛋白的高度特异性抗体，使得对目标靶蛋白具有特定特异性的融合蛋白的产生相对简单并且便宜。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物包括编码嵌合融合蛋白的mrna，该嵌合融合蛋白包含与特异性结合目标靶蛋白的抗体融合的泛素途径部分(例如，e3衔接蛋白或e3连接酶)。145.在一些实施方案中，抗体是单结构域抗体(sdab)，例如纳米抗体、fab、fab′、fab′2、f(ab′)2、fd、fv、feb、scfv或smip。因此，在一些实施方案中，抗体是单结构域抗体(sdab)，例如纳米抗体。在一些实施方案中，抗体是fab。在一些实施方案中，抗体是fab′。在一些实施方案中，抗体是fab′2。在一些实施方案中，抗体是fab′2。在一些实施方案中，抗体是fd。在一些实施方案中，抗体是fv。在一些实施方案中，抗体是feb。在一些实施方案中，抗体是scfv。在一些实施方案中，抗体是smip。146.如本领域所公认的，纳米抗体是具有单个单体可变抗体结构域的单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，纳米抗体可以是vhh片段或vnar片段。纳米抗体，纳米抗体可以是抗gfp纳米抗体，vhhgfp4。特异性结合目标靶蛋白的sdab特别适用于本发明的组合物，因为它们的尺寸相对较小，并且因此可更容易扩散到亚细胞位置。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物包括编码嵌合融合蛋白的mrna，该嵌合融合蛋白包含与特异性结合目标靶蛋白的sdab融合的泛素途径部分(例如，e3衔接蛋白或e3连接酶)。在其他实施方案中，本发明的组合物包括编码嵌合融合蛋白的mrna，该嵌合融合蛋白包含特异性结合e3衔接蛋白的sdab或与特异性结合目标靶蛋白的sdab融合的e3连接酶。147.靶蛋白可以是人们希望调节其水平或活性的任何蛋白，例如，通过泛素依赖性蛋白水解或通过泛素或泛素样修饰多肽与对蛋白活性或结构重要的赖氨酸残基的附接来改变活性。例如，靶蛋白可以是参与细胞周期、信号转导、细胞分化、细胞去分化、细胞生长、细胞因子或其他生物修饰物的产生、调节蛋白或功能蛋白的产生、促炎信号传导或葡萄糖调节途径的蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白可以是未知被泛素化或未知为任何泛素途径蛋白的底物的蛋白。148.在另一个实施方案中，靶蛋白可以是疾病相关蛋白，例如，其功能或活性的变化导致疾病的蛋白，或其功能被认为对疾病状态的传播重要的蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白可以是稳定的或不稳定的，例如g蛋白偶联受体(gpcr)、雄激素受体、雌激素受体、myc、细胞周期蛋白b、ras或细胞周期蛋白e。149.在一些实施方案中，靶蛋白可包括细胞周期蛋白a/cdk2、prb、麦芽糖结合蛋白(mbp)、β-半乳糖苷酶和gfp标记的蛋白。150.泛素途径部分和结合肽偶联151.在本发明的一些实施方案中，mrna编码直接与结合蛋白融合的泛素途径部分。泛素途径部分可以是形成泛素连接酶复合物的一部分的内源蛋白，诸如e3衔接蛋白或e3连接酶。因此，在一些实施方案中，mrna编码与目标结合蛋白融合的e3接头或e3连接酶。在一个典型的实施方案中，mrna编码e3连接酶，其中内源底物识别结构域已经被去除并且其与结合蛋白(例如，特异性结合目标靶蛋白的抗体)融合。合适的e3连接酶包括但不限于spop、chip、crbn、vhl、xiap、mdm2和ciap。使用形成泛素连接酶复合物的一部分的内源蛋白作为泛素途径部分是特别有吸引力的，因为它可将泛素连接酶复合物的其他组分募集到目标靶蛋白以实现选择性降解。此外，使用内源蛋白具有额外的优点，即可避免诱导不希望的免疫反应。152.另选地，泛素途径部分可以是与形成泛素连接酶复合物的一部分的内源蛋白结合的外源蛋白。例如，泛素途径部分可以是特异性结合e3衔接蛋白或e3连接酶的抗体。在特定的实施方案中，抗体特异性结合e3连接酶，例如选自由以下各项组成的组的e3连接酶：spop、chip、crbn、vhl、xiap、mdm2和ciap。因此，在一些实施方案中，mrna编码针对与目标结合蛋白融合的e3衔接子或e3连接酶的抗体(例如，特异性结合目标靶蛋白的抗体)。在一个具体的实施方案中，mrna编码针对与目标结合蛋白融合的e3连接酶的抗体(例如，特异性结合目标靶蛋白的抗体)。使用特异性结合e3衔接蛋白或e3连接酶的抗体可能是有利的，因为在人体内表达的泛素连接酶和衔接蛋白的多样性。可简单地通过替换由mrna编码的抗体序列来修饰现有的构建体以靶向不同的连接酶复合物，例如，仅在表达由抗体靶向的泛素连接酶的某些细胞中实现目标靶蛋白的选择性降解。153.在一些实施方案中，mrna编码在不存在接头的情况下与结合蛋白融合的泛素途径部分。154.在一些实施方案中，mrna编码例如通过任何合适的方式与结合肽共价偶联的泛素途径部分。例如，泛素途径部分，例如e3连接酶诸如spop e3连接酶，或针对e3连接酶的抗体，与目标结合肽偶联。在一些实施方案中，本发明的组合物可以是由mrna表达系统编码的嵌合融合蛋白。在另一个实施方案中，泛素途径部分通过接头，例如具有泛素途径部分以及结合肽的结合结构域的接头与结合肽共价偶联。可使用本领域已知的任何合适的接头。(参见例如chen等人,adv drug deliv rev.2013年10月15日；65(10):1357-1369，其内容以引用的方式并入本文)。155.在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是刚性接头。在一些实施方案中，接头是螺旋接头。在一些实施方案中，合适的刚性接头是富含脯氨酸的。在一些实施方案中，合适的刚性接头包括papap。在一些实施方案中，刚性接头是papap。在一些实施方案中，合适的螺旋接头是刚性螺旋接头。156.在一些实施方案中，接头是gs接头。各种gs接头是已知的和本领域。例如，在一些实施方案中，接头包含(ggs)n，其中n为1至10，诸如1至5，例如1至3，诸如ggs(ggs)n，其中n为0至10。在一些实施方案中，接头包含序列(ggggs)n，其中n为1至10或n为1至5，诸如1至3。在其他实施方案中，接头包含(gggggs)n，其中n为1至4，诸如1至3。接头可包括上述任一种的组合，诸如可组合2、3、4或5个gs、ggs、ggggs和/或gggggs接头的重复序列。在一些实施方案中，接头的长度为2-30个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。157.接头可以是天然存在的、合成的或两者的组合。特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、丙氨酸(ala)和苏氨酸(thr)的氨基酸残基。例如，接头可包含至少75％(基于肽接头中存在的残基总数计算)，诸如至少80％、至少85％或至少90％的选自gly、ser、ala和thr的氨基酸残基。接头也可仅由gly、ser、ala和/或thr残基组成。在一些实施方案中，接头包含1-25个甘氨酸残基、5-20个甘氨酸残基、5-15个甘氨酸残基或8-12个甘氨酸残基。在一些方面，合适的肽接头通常包含至少50％甘氨酸残基，诸如至少75％甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸和丝氨酸残基。158.在又一个实施方案中，泛素途径部分可在存在信号因子，例如胞内代谢物、调节蛋白等的存在或水平时与结合肽非共价偶联。例如，当泛素途径部分和结合肽同时螯合胞内代谢物时，它们可以偶联。159.在另一个实施方案中，泛素途径部分可包括第一偶联部分并且结合肽可包括第二偶联部分，使得第一和第二偶联部分在体外或体内存在信号因子或酶活性的情况下彼此偶联或结合(例如，由癌细胞产生的激酶对第一偶联部分的磷酸化使其能够结合第二偶联部分)。160.另选地，在一些实施方案中，泛素途径部分和结合肽可以不被接头分开，相反它们可以是单个部分的一部分。161.不同泛素途径部分和结合肽的组合可用于进行靶泛素化。此类靶泛素化可用于调节蛋白水平或活性，因此为疾病病状提供治疗性治疗。这产生了用于选择性降解目标蛋白的替代方法。162.可在体外或体内施用本发明的一种或多种mrna以使靶蛋白泛素化。mrna编码的蛋白质的此类泛素化导致目标蛋白的选择性降解。163.在一个实施方案中，本发明的两种或更多种mrna编码相同的结合肽，但与两种或更多种不同的泛素途径部分偶联，所述泛素途径部分施用于细胞以使靶蛋白泛素化，例如以期望的速率或程度使靶蛋白泛素化。例如，在一些实施方案中，组合物包含两种mrna，其中两种编码靶向相同目标蛋白的结合肽，但其中的每一种与不同的泛素途径部分偶联(例如，一种mrna编码chip e3连接酶，而另一种mrna编码spop e3连接酶)。164.在另一个实施方案中，本发明的两种或更多种mrna编码相同的泛素途径部分，但编码与不同靶蛋白结合的不同结合肽。在另一个实施方案中，对编码泛素靶向部分和结合蛋白的mrna进行工程改造以在细胞内或细胞外的特定位置表达。这例如通过对mrna进行工程改造以编码信号肽，诸如核定位信号、内质网信号(er信号)和内质网保留信号(er保留信号)或细胞分泌信号来实现。以这种方式，目标蛋白可在细胞的不同区室以及细胞外的位置被靶向降解。165.细胞递送部分166.在一些实施方案中，本发明的mrna可任选地编码细胞递送部分。细胞递送部分是促进组合物递送或促进组合物转导至细胞中的任何结构。例如，在一些实施方案中，并且如下文更详细描述的，本发明的mrna包封在脂质纳米颗粒内。在一个实施方案中，细胞递送部分衍生自病毒蛋白或肽，例如tat肽。在另一个实施方案中，细胞递送部分是能够穿透细胞膜的疏水性化合物。另选地，使用对细胞膜穿透更敏感的泛素途径蛋白结合部分来增强组合物的细胞膜转导。167.信号肽168.在一些实施方案中，本发明的mrna可任选地编码信号肽，该信号肽可使结合肽靶向存在于细胞内或细胞外的不同位置的目标蛋白。在一些实施方案中，信号肽可以是核定位序列、内质网(er)信号序列、内质网(er)保留序列或细胞分泌序列中的一种或多种。在一些实施方案中，e3连接酶蛋白天然含有nls序列。在一些实施方案中，nls在n-末端与e3连接酶蛋白融合。在一些实施方案中，nls在c-末端与e3连接酶蛋白融合。169.核定位信号或序列(nls)是‘标记’通过核转运导入细胞核的蛋白质的氨基酸序列。通常，该信号通常由一个或多个暴露于蛋白质表面上的带正电荷的赖氨酸或精氨酸的短序列构成。例如，在一些实施方案中，本文所述的编码蛋白质的mrna构建体包含可促进核蛋白的泛素化的nls，并且从而靶向细胞核内的蛋白质以进行降解。本发明中使用的核定位信号没有特别的限制，只要它具有将信号序列所附着的物质易位到细胞核中的能力。本领域已知的各种nls适用于本文所述的本发明。在一些实施方案中，核定位信号可以是sv40 vp1、sv40大t抗原或丁型肝炎病毒δ抗原，或含有“pkkkrkv”的序列，其是在sv40大t抗原的核定位信号内具有核易位活性的最小单位。170.在一些实施方案中，信号肽可以是er信号序列。er信号序列可以是将蛋白质导向细胞的er膜的氨基酸序列。包含er信号序列的mrna构建体促进内质网中蛋白质的泛素化，并且从而靶向er内部或与er相关的蛋白质。171.在一些实施方案中，信号肽可以是内质网(er)保留序列。er保留序列可以是‘标记’待保留在内质网中的蛋白质的氨基酸序列。具有er保留信号序列的mrna构建体促进内质网中蛋白质的泛素化，并且从而连续调节er内靶蛋白的水平。172.单体er信号序列是一种多肽，其中该多肽的至少一部分能够充当内质网(er)布线信号和/或内质网保留信号。er布线信号的功能是将多肽导向er，而保留信号的功能是将多肽保留在er中或防止er定位的多肽分泌。173.用作er信号或er保留序列的各种表位是本领域已知的，并且包括例如血凝素(ha)、flag和myc等。174.在一些实施方案中，信号肽可以是细胞分泌序列。具有细胞分泌序列的mrna构建体促进位于细胞外的蛋白质的泛素化。175.分泌蛋白的实例在下文讨论并且包括在细胞与细胞信号传导中起重要作用的蛋白。此类蛋白质包括跨膜受体和细胞表面标记、细胞外基质分子、细胞因子、激素、生长和分化因子、神经肽、血管扩张剂、离子通道、转运蛋白/泵和蛋白酶。(见alberts,b.等人，(1994)molecular biology of the cell,garland publishing,new york n.y.，第557-560页，第582-592页)。176.示例性mrna可编码嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白从n-末端开始包含er信号序列、靶向目标蛋白的结合蛋白(例如，抗体)、泛素途径部分(例如，e3衔接蛋白、e3连接酶，或特异性结合e3衔接蛋白或e3连接酶的抗体)和er保留序列。在其他实施方案中，示例性mrna编码嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白从n-末端开始包含靶向目标蛋白的结合蛋白(例如，抗体)、泛素途径部分(例如，e3衔接蛋白、e3连接酶，或特异性结合e3衔接蛋白或e3连接酶的抗体)和nls。177.mrna组合物的施用178.在一些实施方案中，本文所述的mrna组合物用于治疗疾病。以蛋白质或肽的异常表达(例如，过表达)为特征的任何类型的疾病可通过本文所述的mrna组合物来治疗。与蛋白质或肽的异常表达或过表达相关或由其引起的疾病(包括其症状)是本领域已知的，并且包括例如基于朊病毒的疾病、多囊性肾病、佩梅病、炎性疾病和癌症。在一些实施方案中，疾病可与蛋白质中的一个或多个突变或蛋白质的错误折叠/聚集相关。例如，本文所述的mrna组合物可用于治疗与靶蛋白的异常表达相关或由其引起的疾病或病症的方法中。靶蛋白可以是酶，参与细胞信号传导、细胞分裂或代谢的蛋白质，或参与炎症反应的蛋白质。因此，在一些实施方案中，本文所述的mrna组合物可用于治疗癌症、代谢性疾病或炎性疾病的方法中。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的mrna组合物在制造用于治疗与靶蛋白的异常表达相关或由其引起的疾病或病症的药物中的用途。根据本发明的组合物和方法可与其他疗法组合用于降解目标蛋白质。179.本文所述的mrna组合物可导致目标靶蛋白的快速靶向和降解。在一些实施方案中，本文所述的mrna组合物在向有需要的受试者施用后约48小时、40小时、36小时、32小时、28小时、24小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时或少于4小时内导致目标蛋白质的靶向降解。因此，在一些实施方案中，mrna组合物在向有需要的受试者施用后约24小时内导致目标蛋白的靶向降解。在一些实施方案中，mrna组合物在向有需要的受试者施用后约20小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约19小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约18小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约17小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约16小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约16小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约15小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约14小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约13小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约12小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约11小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约10小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约9小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约8小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约7小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约6小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约5小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后约4小时内导致目标蛋白的靶向降解。mrna组合物在向有需要的受试者施用后少于4小时导致目标蛋白的靶向降解。180.可用于治疗性治疗的本发明的mrna组合物可单独施用，在具有合适的药物载体的组合物中施用，或与其他治疗剂组合施用。待施用的组合物的有效量可根据具体情况来确定。181.本发明的组合物可以医学上可接受的任何方式施用，这可取决于所治疗的疾病病状或损伤。可能的施用途径包括注射，通过肠胃外途径诸如血管内、静脉内、硬膜内或其他途径，以及口服、鼻内、眼内、直肠、局部或肺部，例如通过吸入或通过雾化。182.在一些实施方案中，与整个治疗期的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与5天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与7天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与10天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与15天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与20天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与25天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与30天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与35天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与40天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。在一些实施方案中，与45天的对照相比，施用组合物导致异常表达的蛋白质的水平降低。183.剂量和施用间隔184.如本文所用，术语“治疗有效量”主要基于本发明组合物中所含mrna的总量。通常，治疗有效量足以对受试者实现有意义的益处。例如，治疗有效量可为足以实现所需疗效和/或预防效果的量。通常，施用于有需要的受试者的治疗剂(例如，编码蛋白质或肽的mrna)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的状况、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够容易地根据这些和其他相关因素确定适当剂量。另外，可任选地采用客观和主观测定来确定最佳剂量范围。185.考虑到受试者的临床状况、施用部位和方法(例如，局部和全身，包括瘤内、静脉内和通过注射)，施用的排程、受试者的年龄、性别、体重和与本领域普通技术的临床医生相关的其他因素，包含mrna的递送媒介物可以根据目前医学实践施用和给药。用于本文目的的“有效量”可以通过实验临床研究、药理学、临床和医学领域的普通技术人员已知的相关考虑来确定。186.在一些实施方案中，所述方法包括注射单剂量。在一些实施方案中，所述方法包括周期性注射多剂量。187.本发明提供的方法考虑单次和多次施用治疗有效量的本文所述的组合物。该组合物可根据受试者病状的性质、严重性和程度以规则的间隔施用。在一些实施方案中，本发明的组合物的治疗有效量可以以规则的间隔定期施用，例如，每天一次、每周两次、每四天一次、每周一次、每10天一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每月两次、每30天一次、每28天一次或连续。188.在一些实施方案中，提供的脂质体和/或组合物被调配成使其适合于其中包含的mrna的延长释放。此类延长释放的组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一些实施方案中，本发明的组合物每天施用于受试者两次。在一些实施方案中，组合物每天施用于受试者两次。在一些实施方案中，组合物每天施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每隔一天施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每周施用于受试者两次。在一些实施方案中，组合物每周施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每7天施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每10天施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每14天施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每28天施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每30天施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每两周施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每三周施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每四周施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每月施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每月施用于受试者两次。在一些实施方案中，组合物每六周施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每八周施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每隔一月施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每三个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每四个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每六个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每八个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每九个月施用于受试者一次。在一些实施方案中，组合物每年施用于受试者一次。还考虑了配制用于贮存施用(例如肌肉内、皮下、玻璃体内)的组合物和脂质体，以在长时间内递送或释放mrna。优选地，所采用的延长释放手段与对mrna进行的修饰组合，以增强稳定性。189.治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的疫苗，治疗有效量和施用间隔(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可以变化，例如，取决于给药途径，取决于与其他药剂的组合。此外，任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用具体组合物的活性；所用具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所用具体蛋白质的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；和医学领域众所周知的类似因素。190.在一些实施方案中，初始剂量和后续一个或多个剂量在量上相同。在一些实施方案中，初始剂量和后续一个或多个剂量在量上不同。在一些实施方案中，初始剂量大于后续一个或多个剂量。在一些实施方案中，初始剂量小于后续一个或多个剂量。在一些实施方案中，所述多剂量中的每剂包含相同剂量的mrna。在一些实施方案中，所述多剂量中的每剂包含不同剂量的mrna。191.本发明的组合物192.在一方面，本发明涉及通过施用包含一种或多种编码包封在脂质纳米颗粒内的蛋白质或肽的mrna的组合物来选择性降解异常表达或过度表达的蛋白质的方法。在一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含一种或多种各自编码泛素途径部分、结合肽和任选的信号肽的mrna，其中一种或多种mrna包封在脂质纳米颗粒内。193.mrna的合成194.在一些实施方案中，一种或多种mrna编码泛素途径部分、结合肽和任选的信号肽。195.在一些实施方案中，一种或多种mrna是密码子优化的。在一些实施方案中，mrna编码的蛋白质或肽是野生型的。在一些实施方案中，mrna编码的蛋白质或肽包含突变或修饰。196.可以根据多种已知方法中的任一种合成根据本发明的mrna。例如，可以经由体外转录(ivt)来合成根据本发明的mrna。简而言之，ivt通常使用线性或环状dna模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含dtt和镁离子的缓冲系统以及适当的rna聚合酶(例如，t3、t7或sp6 rna聚合酶)，dna酶i，焦磷酸酶和/或rna酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而改变。197.表a.示例性核苷酸序列198.[0199][0200]nls＝下划线；接头＝粗体；[0201]表b.示例性氨基酸序列[0202][0203]nls＝下划线；接头＝粗体；[0204]可以根据多种已知方法中的任一种合成根据本发明的mrna。例如，可以经由体外转录(ivt)来合成根据本发明的mrna。简而言之，ivt通常使用线性或环状dna模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含dtt和镁离子的缓冲系统以及适当的rna聚合酶(例如，t3、t7或sp6 rna聚合酶)，dna酶i，焦磷酸酶和/或rna酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而改变。[0205]mrna的示例性构建体设计[0206]构建体设计：[0207]x-mrna编码区-y[0208]5′和3′utr序列：[0209]x(5′utr序列)＝[0210]ggacagaucgccuggagacgccauccacgcuguuuugaccuccauagaagacaccgggaccgauccagccuccgcggccgggaacggugcauuggaacgcggauuccccgugccaagagugacucaccguccuugacacg(seq id no:11)[0211]y(3′utr序列)＝[0212]cggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcaucaagcu(seq id no:12)[0213]或[0214]ggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcaucaaagcu(seq id no:13)[0215]本发明可以用于递送各种长度的mrna。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度等于或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的体外合成的mrna。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度在约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-15kb范围内的体外合成的mrna。[0216]在一些实施方案中，为了制备根据本发明的mrna，将dna模板体外转录。合适的dna模板通常具有用于体外转录的启动子，例如t3、t7或sp6启动子，随后是期望mrna的期望核苷酸序列和终止信号。[0217]使用sp6 rna聚合酶的mrna合成[0218]在一些实施方案中，mrna使用sp6 rna聚合酶来产生。sp6 rna聚合酶是对sp6启动子序列具有高度序列特异性的dna依赖性rna聚合酶。sp6聚合酶催化在启动子下游的单链dna或双链dna上的rna的5'→3'体外合成；它将天然核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸和/或标记的核糖核苷酸掺入聚合的转录物中。此类标记的核糖核苷酸的实例包括生物素、荧光素、地高辛、氨基烯丙基和同位素标记的核苷酸。[0219]噬菌体sp6 rna聚合酶的序列最初被描述(genbank:y00105.1)为具有以下氨基酸序列：mqdlhaiqlqleeemfnggirrfeadqqrqiaagsesdtawnrrllseliapmaegiqaykeeyegkkgrapralaflqcvenevaayitmkvvmdmlntdatlqaiamsvaeriedqvrfskleghaakyfekvkkslkasrtksyrhahnvavvaeksvaekdadfdrweawpketqlqigttlleilegsvfyngepvfmramrtyggktiyylqtsesvgqwisafkehvaqlspayapcvipprpwrtpfnggfhtekvasrirlvkgnrehvrkltqkqmpkvykainalqntqwqinkdvlavieevirldlgygvpsfkplidkenkpanpvpvefqhlrgrelkemlspeqwqqfinwkgecarlytaetkrgsksaavvrmvgqarkysafesiyfvyamdsrsrvyvqsstlspqsndlgkallrftegrpvngvealkwfcinganlwgwdkktfdvrvsnvldeefqdmcrdiaadpltftqwakadapyeflawcfeyaqyldlvdegradefrthlpvhqdgscsgiqhysamlrdevgakavnlkpsdapqdiygavaqvvikknalymdaddattftsgsvtlsgtelramasawdsigitrsltkkpvmtlpygstrltcresvidyivdleekeaqkavaegrtankvhpfeddrqdyltpgaaynymtaliwpsisevvkapivamkmirqlarfaakrneglmytlptgfileqkimatemlrvrtclmgdikmslqvetdivdeaammgaaapnfvhghdashliltvcelvdkgvtsiavihdsfgthadntltlrvalkgqmvamyidgnalqklleehevrwmvdtgievpeqgefdlneimdseyvfa(seq id no:14)。[0220]适用于本发明的sp6 rna聚合酶可以是具有与噬菌体sp6 rna聚合酶基本上相同的聚合酶活性的任何酶。因此，在一些实施方案中，适用于本发明的sp6 rna聚合酶可以从seq id no:14修饰。例如，合适的sp6rna聚合酶可以包含一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。在一些实施方案中，合适的sp6 rna聚合酶具有与seq id no:14约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％、70％、65％或60％相同或同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，合适的sp6 rna聚合酶可以是(从n-末端、c-末端或内部)截短的蛋白质，但保留聚合酶活性。在一些实施方案中，合适的sp6 rna聚合酶是融合蛋白。[0221]适用于本发明的sp6 rna聚合酶可以是商购获得产品，例如来自aldevron、ambion、new england biolabs(neb)、promega和roche。sp6可以根据如本文所述的seq id no:14或seq id no:14的变体的氨基酸序列从商业来源或非商业来源订购和/或定制设计。sp6可以是标准保真聚合酶或可以是经修饰以促进rna聚合酶活性的高保真/高效/高容量的，例如sp6 rna聚合酶基因中的突变或sp6 rna聚合酶本身的翻译后修饰。此类修饰的sp6的实例包括来自ambion的sp6 rna聚合酶-plustm、来自neb的hiscribe sp6以及来自promega的ribomaxtm和系统。[0222]在一些实施方案中，合适的sp6 rna聚合酶是融合蛋白。例如，sp6rna聚合酶可以包括一个或多个促进酶的分离、纯化或溶解度的标签。合适的标签可以位于n-末端、c-末端和/或内部。合适标签的非限制性实例包括钙调蛋白结合蛋白(cbp)；肝片吸虫8-kda抗原(fh8)；flag标签肽；谷胱甘肽-s-转移酶(gst)；组氨酸标签(例如六组氨酸标签(his6))；麦芽糖结合蛋白(mbp)；n-利用物质(nusa)；小泛素相关调节剂(sumo)融合标签；链霉亲和素结合肽(strep)；串联亲和纯化(tap)；和硫氧还蛋白(trxa)。在本发明中可以使用其他标签。这些和其他融合标签已经有所描述，例如，costa等人frontiers in microbiology 5(2014):63和pct/us16/57044，它们的内容以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，his标签位于sp6的n-末端。[0223]sp6启动子[0224]任何可以被sp6 rna聚合酶识别的启动子都可以用于本发明。通常，sp6启动子包含5′atttaggtgacactatag-3′(seq id no:15)。已发现和/或创建了sp6启动子的变体以优化sp6与其启动子的识别和/或结合。非限制性变体包括但不限于：5′‑atttaggggacactatagaagag-3′；5′‑atttaggggacactatagaagg-3′；5′‑atttaggggacactatagaaggg-3′；5′‑atttaggtgacactatagaa-3′；5′‑atttaggtgacactatagaaga-3′；5′‑atttaggtgacactatagaagag-3′；5′‑atttaggtgacactatagaagg-3′；5′‑atttaggtgacactatagaaggg-3′；5′‑atttaggtgacactatagaagng-3′；和5′‑catacgatttaggtgacactatag-3′(seq id no:16至seq id no:25)。[0225]此外，本发明合适的sp6启动子可以与seq id no:15至seq id no:25中的任一个约95％、90％、85％、80％、75％或70％相同或同源。此外，可用于本发明的sp6启动子可以包括本文所述的任何启动子序列的一个或多个另外的核苷酸5'和/或3'。[0226]dna模板[0227]通常，dna模板是完全双链，或者是大部分具有双链sp6启动子序列的单链。[0228]线性化质粒dna(通过一种或多种限制性酶线性化)、线性化基因组dna片段(通过限制性酶和/或物理方法)、pcr产物和/或合成dna寡核苷酸可用作sp6体外转录的模板，前提是它们含有位于待转录的dna序列的上游(并且方向正确)的双链sp6启动子。[0229]在一些实施方案中，线性化dna模板具有平端。[0230]在一些实施方案中，可以优化待转录的dna序列以促进更有效的转录和/或翻译。例如，dna序列可以针对顺式调节元件(例如，tata盒、终止信号和蛋白质结合位点)、人工重组位点、chi位点、cpg二核苷酸内容物、负cpg岛、gc内容物、聚合酶滑移位点和/或与转录相关的其他元件而优化；dna序列可以针对隐蔽剪接位点、mrna二级结构、mrna的稳定自由能、重复序列、rna不稳定性基序和/或与mrna加工和稳定性相关的其他元件而优化；dna序列可以针对密码子使用偏倚、密码子适应性、内部chi位点、核糖体结合位点(例如，ires)、过早多聚a位点、shine-dalgarno(sd)序列和/或与翻译相关的其他元件而优化；以及/或者dna序列可以针对密码子背景、密码子-反密码子相互作用、翻译暂停位点和/或与蛋白质折叠相关的其他元件而优化。本领域已知的优化方法可用于本发明，例如thermofisher和optimumgenetm的geneoptimizer，其在us 20110081708中有所描述，其内容以引用的方式整体并入本文。[0231]在一些实施方案中，dna模板包括5'和/或3'非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mrna的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以在约50和500个核苷酸之间。[0232]在一些实施方案中，3’非翻译区包括一个或多个聚腺苷酸化信号，影响mrna在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点，或一个或多个mirna结合位点。在一些实施方案中，3’非翻译区的长度可以在50和500个核苷酸之间或更长。[0233]示例性3'和/或5'utr序列可以来源于稳定的mrna分子(例如，珠蛋白、肌动蛋白、gapdh、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)以增加正义mrna分子的稳定性。例如，5’utr序列可以包括cmv立即早期1(ie1)基因的部分序列或其片段，以提高核酸酶抗性和/或提高多核苷酸的半衰期。还考虑了在多核苷酸(例如，mrna)的3’末端或非翻译区包含编码人类生长激素(hgh)或其片段的序列，以进一步稳定该多核苷酸。通常，这些修饰相对于其未修饰的对应物改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如半衰期)，并且包括例如为改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性而进行的修饰。[0234]大规模mrna合成[0235]本发明涉及野生型或密码子优化的mrna的大规模产生。在一些实施方案中，根据本发明的方法以单批次合成至少100mg、150mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1000kg或更多的mrna。如本文所用，术语“批次”是指一次合成的数量或量的mrna，例如，根据单一制造环境产生。批次可以指在一个反应中合成的mrna的量，该反应通过单等分的酶和/或单等分的dna模板发生，用于在一组条件下连续合成。在单批次中合成的mrna不包括在不同时间合成的mrna，它们组合起来以达到所需的量。通常，反应混合物包含sp6 rna聚合酶、线性dna模板和rna聚合酶反应缓冲液(可以包含核糖核苷酸或可以需要添加核糖核苷酸)。[0236]根据本发明，每克(g)产生的mrna通常使用1-100mg sp6聚合酶。在一些实施方案中，每克产生的mrna使用约1-90mg、1-80mg、1-60mg、1-50mg、1-40mg、10-100mg、10-80mg、10-60mg、10-50mg sp6聚合酶。在一些实施方案中，约5-20mg的sp6聚合酶用于产生约1克mrna。在一些实施方案中，约0.5至2克sp6聚合酶用于产生约100克mrna。在一些实施方案中，约5至20克sp6聚合酶用于约1千克mrna。在一些实施方案中，至少5mg sp6聚合酶用于产生至少1克mrna。在一些实施方案中，至少500mg sp6聚合酶用于产生至少100克mrna。在一些实施方案中，至少5克sp6聚合酶用于产生至少1千克mrna。在一些实施方案中，约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg质粒dna用于产生每克mrna。在一些实施方案中，约10-30mg质粒dna用于产生约1克mrna。在一些实施方案中，约1至3克质粒dna用于产生约100克mrna。在一些实施方案中，约10至30克质粒dna用于约1千克mrna。在一些实施方案中，至少10mg质粒dna用于产生至少1克mrna。在一些实施方案中，至少1克质粒dna用于产生至少100克mrna。在一些实施方案中，至少10克质粒dna用于产生至少1千克mrna。[0237]在一些实施方案中，sp6 rna聚合酶在反应混合物中的浓度可以为约1至100nm、1至90nm、1至80nm、1至70nm、1至60nm、1至50nm、1至40nm、1至30nm、1至20nm或约1至10nm。在某些实施方案中，sp6 rna聚合酶的浓度为约10至50nm、20至50nm或30至50nm。可以使用浓度为100至10000个单位/毫升的sp6 rna聚合酶，例如，可以使用浓度为100至9000个单位/毫升、100至8000个单位/毫升、100至7000个单位/毫升、100至6000个单位/毫升、100至5000个单位/毫升、100至1000个单位/毫升、200至2000个单位/毫升、500至1000个单位/毫升、500至2000个单位/毫升、500至3000个单位/毫升、500至4000个单位/毫升、500至5000个单位/毫升、500至6000个单位/毫升、1000至7500个单位/毫升和2500至5000个单位/毫升。[0238]每种核糖核苷酸(例如，atp、utp、gtp和ctp)在反应混合物中的浓度在约0.1mm和约10mm之间，例如，在约1mm和约10mm之间，在约2mm和约10mm之间，在约3mm和约10mm之间，在约1mm和约8mm之间，在约1mm和约6mm之间，在约3mm和约10mm之间，在约3mm和约8mm之间，在约3mm和约6mm之间，在约4mm和约5mm之间。在一些实施方案中，每种核糖核苷酸在反应混合物中为约5mm。在一些实施方案中，反应中使用的rntp(例如，atp、gtp、ctp和utp的组合)的总浓度范围在1mm和40mm之间。在一些实施方案中，反应中使用的rntp(例如，atp、gtp、ctp和utp的组合)的总浓度范围在1mm和30mm之间，或在1mm和28mm之间，或在1mm和25mm之间，或在1mm和20mm之间。在一些实施方案中，总rntp浓度小于30mm。在一些实施方案中，总rntp浓度小于25mm。在一些实施方案中，总rntp浓度小于20mm。在一些实施方案中，总rntp浓度小于15mm。在一些实施方案中，总rntp浓度小于10mm。[0239]rna聚合酶反应缓冲液通常包括盐/缓冲剂，例如tris、hepes、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、氯化钠和氯化镁。[0240]反应混合物的ph可以在约6至8.5、6.5至8.0、7.0至7.5之间，并且在一些实施方案中，ph为7.5。[0241]将线性或线性化dna模板(例如，如上所述以及以足以提供所期望的量的rna的量/浓度)、rna聚合酶反应缓冲液和sp6 rna聚合酶组合以形成反应混合物。反应混合物在约37℃和约42℃之间温育三十分钟至六小时，例如约六十至约九十分钟。[0242]在一些实施方案中，在合适的rna聚合酶反应缓冲液(最终反应混合物ph为约7.5)中的约5mm ntp、约0.05mg/ml sp6聚合酶和约0.1mg/ml dna模板在约37℃至约42℃下温育六十至九十分钟。[0243]在一些实施方案中，反应混合物包含具有sp6聚合酶特异性启动子、sp6 rna聚合酶、rna酶抑制剂、焦磷酸酶、29mm ntp、10mm dtt和反应缓冲液的线性化双链dna模板(当在10x时为800mm hepes、20mm亚精胺、250mm mgcl2 ph7.7)和足够量(qs)以达到所需的反应体积的无rna酶水；然后将该反应混合物在37℃下温育60分钟。然后通过添加dna酶i和dna酶i缓冲液(当在10x时为100mm tris-hcl、5mm mgcl2和25mm cacl2 ph7.6)来淬灭聚合酶反应，以促进用于纯化的制剂中的双链dna模板的消化。该实施方案已经被证明足以产生100克mrna。[0244]在一些实施方案中，反应混合物包含浓度范围为1-10mm的ntp、浓度范围为0.01-0.5mg/ml的dna模板和浓度范围为0.01-0.1mg/ml的sp6rna聚合酶，例如，反应混合物包含浓度为5mm的ntp、浓度为0.1mg/ml的dna模板和浓度为0.05mg/ml的sp6 rna聚合酶。[0245]核苷酸[0246]根据本发明，各种天然存在的或经修饰的核苷可用于产生mrna。在一些实施方案中，mrna是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷(例如，n-1-甲基-假尿苷)、2-硫尿核苷和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；插入型碱基；经修饰的糖(例如，2’‑氟核糖、核糖、2’‑脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5-n-亚磷酰胺键)。[0247]在一些实施方案中，mrna包含一种或多种非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可以包括，例如，5-甲基胞苷(“5mc”)、假尿苷(“u”)和/或2-硫代尿苷(“2su”)。参见，例如，美国专利号8,278,036或wo2011012316关于此类残基及其掺入mrna的讨论。mrna可以是rna，其被定义为其中25％的u残基是2-硫代-尿苷且25％的c残基是5-甲基胞苷。关于使用rna的教导公开于美国专利公开us20120195936和国际公开wo2011012316中，这两个专利据此以引用的方式整体并入。非标准核苷酸残基的存在可使得mrna比具有相同序列但仅含有标准残基的对照mrna更稳定和/或免疫原性更小。在另外的实施方案中，mrna可以包含一个或多个选自以下的非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶，以及这些修饰和其他核碱基修饰的组合。一些实施方案可以另外包括对呋喃糖环或核碱基的另外的修饰。另外的修饰可以包括，例如，糖修饰或取代(例如，2'-o-烷基修饰、锁核酸(lna)中的一者或多者)。在一些实施方案中，rna可与另外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(pna)复合或杂交。在糖修饰是2'-o-烷基修饰的一些实施方案中，这种修饰可以包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-o-甲基修饰、2'-o-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在一些实施方案中，这些修饰中的任一者可以存在于0-100％的核苷酸中——例如，多于0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成核苷酸单独或组合。[0248]合成后加工[0249]通常，可以在合成后添加5'帽和/或3'尾。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。“尾”的存在用于保护mrna免受核酸外切酶降解。[0250]通常按如下方式添加5’帽：首先，rna末端磷酸酶从5’核苷酸除去一个末端磷酸基团，剩下两个末端磷酸酯；然后通过鸟苷酸转移酶将三磷酸鸟苷(gtp)添加到末端磷酸酯中，产生5’5’5三磷酸酯键；并且然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7g(5')ppp(5’)a,g(5')ppp(5')a和g(5')ppp(5')g。另外的帽结构在2017年2月27日提交的公开的美国申请号us 2016/0032356和美国临时申请号62/464,327中有所描述，这些专利申请以引用的方式并入本文。[0251]通常，尾结构包括poly(a)和/或poly(c)尾。mrna的3'末端的多聚-a或多聚-c尾通常包含分别地至少50个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950个腺苷或胞嘧啶核苷酸、或至少1kb腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，多聚a或多聚c尾可以为约10至800个腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如，约10至200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约50至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约100至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约150至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约200至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约250至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约300至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约350至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约400至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约450至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约500至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至100个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约20至70个腺苷或胞嘧啶核苷酸、或约20至60个腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些实施方案中，尾结构包括具有本文所述的各种长度的多聚(a)和多聚(c)尾的组合。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的腺苷核苷酸。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的胞嘧啶核苷酸。[0252]如本文所述，5'帽和/或3'尾的添加有助于检测体外合成过程中产生的无效转录物，因为没有加帽和/或加尾，那些过早无效的mrna转录物的大小可能太小而无法被检测到。因此，在一些实施方案中，在测试mrna的纯度(例如，存在于mrna中的无效转录物的水平)之前，将5'帽和/或3'尾添加至合成的mrna。在一些实施方案中，在如本文所述纯化mrna之前将5'帽和/或3'尾添加至合成的mrna。在其他实施方案中，在如本文所述纯化mrna之后将5'帽和/或3'尾添加至合成的mrna。[0253]根据本发明合成的mrna无需进一步纯化即可使用。具体而言，根据本发明合成的mrna可以在不存在除去短聚体的步骤的情况下使用。在一些实施方案中，可以进一步纯化根据本发明合成的mrna。可以使用各种方法来纯化根据本发明合成的mrna。例如，可以使用离心、过滤和/或色谱法来进行mrna的纯化。在一些实施方案中，合成的mrna通过乙醇沉淀或过滤或色谱、或者凝胶纯化或任何其他合适的方式来纯化。在一些实施方案中，mrna通过hplc纯化。在一些实施方案中，mrna在本领域的技术人员熟知的标准苯酚:氯仿:异戊醇溶液中提取。在一些实施方案中，mrna使用切向流过滤来纯化。合适的纯化方法包括在us2016/0040154、us 2015/0376220、2018年2月27日提交的标题为“methods for purification of messenger rna(用于信使rna纯化的方法)”的pct申请pct/us18/19954和2018年2月27日提交的标题为“methods for purification of messenger rna(用于信使rna纯化的方法)”的pct/us18/19978中描述的那些，所有这些专利申请均以引用的方式并入本文并且可以用于实践本发明。[0254]在一些实施方案中，mrna在加帽和加尾之前纯化。在一些实施方案中，mrna在加帽和加尾之后纯化。在一些实施方案中，mrna在加帽和加尾之前和之后纯化。[0255]在一些实施方案中，mrna在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过离心纯化。[0256]在一些实施方案中，mrna在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过过滤纯化。[0257]在一些实施方案中，mrna在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过切向流过滤(tff)纯化。[0258]在一些实施方案中，mrna在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过色谱纯化。[0259]mrna的表征[0260]可以使用本领域可用的任何方法来检测和定量mrna的全长或无效转录物。在一些实施方案中，合成的mrna分子使用印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、hplc、银染、光谱、紫外(uv)或uplc或者它们的组合来检测。本领域已知的其他检测方法包括在本发明中。在一些实施方案中，合成的mrna分子使用紫外吸收光谱来检测，通过毛细管电泳来分离。在一些实施方案中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之前，首先通过乙二醛染料使mrna变性。在一些实施方案中，在加帽或加尾之前表征合成的mrna。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后表征合成的mrna。[0261]在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的mrna包含少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％的除全长mrna之外的杂质。杂质包括ivt污染物，例如蛋白质、酶、游离核苷酸和/或短聚体(shortmer)。[0262]在一些实施方案中，根据本发明产生的mrna基本上不含短聚体或无效转录物。具体而言，根据本发明产生的mrna包含通过毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳检测不到水平的短聚体或无效转录物。如本文所用，术语“短聚体”或“异常终止转录物”是指小于全长的任何转录物。在一些实施方案中，“短聚体”或“异常终止转录物”为小于100个核苷酸的长度，小于90个、小于80个、小于70个、小于60个、小于50个、小于40个、小于30个、小于20个或小于10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，在添加5'-帽和/或3'-聚a尾巴之后，检测或定量短聚体。[0263]递送媒介物[0264]根据本发明，如本文所述的编码蛋白质或肽(例如，蛋白质或肽的全长、片段或部分)的mrna可以作为裸rna(未包装)或通过递送媒介物递送。如本文中所用，术语“递送媒介物”、“转运媒介物”、“纳米颗粒”或语法等同形式可互换使用。[0265]递送媒介物可以与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定试剂组合配制，或者在药物组合物中配制，在所述药物组合物中所述递送媒介物与合适的赋形剂混合。用于配制和施用药物的技术可在"remington's pharmaceutical sciences,"mack publishing co.,easton,pa.，最新版本中找到。特定的递送媒介物根据其促进将核酸转染至靶细胞的能力来选择。[0266]在一些实施方案中，包含一种或多种mrna的递送媒介物通过静脉内、瘤内、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、硬膜外、鞘内或肺部递送(例如，包括雾化)来施用。在一些实施方案中，mrna在施用递送媒介物的组织中表达。肺部递送和雾化的其他教导在申请人2017年11月10日提交的标题为“novel ice-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mrna(用于mrna递送的新型基于冰的脂质纳米颗粒制剂)”的相关国际申请pct/us17/61100和美国临时申请ussn 62/507,061中有所描述，这些申请中的每个均以引用的方式整体并入。[0267]在一些实施方案中，编码蛋白质或肽的mrna可以通过单一递送媒介物来递送。在一些实施方案中，编码蛋白质或肽的mrna可以通过一种或多种递送媒介物来递送，每种递送媒介物具有不同的组合物。在一些实施方案中，一种或多种mrna被包封于相同的脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，所述一种或多种mrna被包封于单独的脂质纳米颗粒内。[0268]根据各种实施方案，合适的递送媒介物包括但不限于基于聚合物的载体，例如聚乙烯亚胺(pei)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、天然和合成衍生的外来体两者、天然的、合成和半合成板层体、纳米颗粒、磷酸钙-硅酸盐纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(d-精氨酸)、溶胶-凝胶、纳米树枝状聚合物、淀粉基递送系统、胶束、乳液、类脂质体(noisome)、多结构域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚缀合物)、干粉制剂、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适体、肽和其他载体标签。还考虑使用生物纳米胶囊和其他病毒衣壳蛋白组装件作为合适的转移媒介物。(hum.gene ther.2008年9月；19(9):887-95)。[0269]脂质体递送媒介物[0270]在一些实施方案中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒。如本文所用，脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒，通常被表征为具有内部水空间的微观囊泡，该内部水空间通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，诸如包含空间上分开的亲水性和疏水性结构域的合成或天然来源的脂质(lasic,trends biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性物质(例如，聚合物囊泡、类脂质体等)形成。在本发明的上下文中，脂质体递送媒介物通常用于将所需的mrna转运至靶细胞或组织。在一些实施方案中，纳米颗粒递送媒介物是脂质体。在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种peg修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质体包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质。[0271]阳离子脂质[0272]如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选定ph诸如生理ph下具有净正电荷的多种脂质物质中的任何一种。[0273]用于本发明的组合物和方法的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2010/144740中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：[0274][0275]及其药学上可接受的盐。[0276]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2013/149140中所述的可电离阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式之一的阳离子脂质：[0277][0278]或其药学上可接受的盐，其中r1和r2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的不同饱和或不饱和的c1-c20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的c6-c20酰基；其中l1和l2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的c1-c30烷基、任选地取代的不同不饱和的c1-c30烯基和任选地取代的c1-c30炔基；其中m和o各自独立地选自由以下项组成的组：零和任何正整数(例如，其中m为三)；并且其中n为零或任何正整数(例如，其中n为一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-l-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(“hgt5000”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：[0279][0280]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-l-胺(“hgt5001”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：[0281][0282]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(“hgt5002”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：[0283][0284]及其药学上可接受的盐。[0285]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开wo 2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0286][0287]及其药学上可接受的盐。[0288]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2016/118725中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0289][0290]及其药学上可接受的盐。[0291]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2016/118724中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0292][0293]及其药学上可接受的盐。[0294]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括具有通式14,25-二-十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。[0295]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2013/063468和wo 2016/205691中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0296][0297]或其药学上可接受的盐，其中rl的每个实例独立地是任选地取代的c6-c40烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0298][0299]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0300][0301]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0302][0303]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0304][0305]及其药学上可接受的盐。[0306]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2015/184256中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0307][0308]或其药学上可接受的盐，其中每个x独立地是o或s；每个y独立地是o或s；每个m独立地为0至20；每个n独立为1至6；每个ra独立地是氢、任选地取代的c1-50烷基、任选地取代的c2-50烯基、任选地取代的c2-50炔基、任选地取代的c3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的c6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个rb独立地是氢、任选地取代的c1-50烷基、任选地取代的c2-50烯基、任选地取代的c2-50炔基、任选地取代的c3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的c6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“靶标23”：[0309][0310](靶标23)[0311]及其药学上可接受的盐。[0312]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2016/004202中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0313][0314][0315]或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0316][0317]或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0318][0319]或其药学上可接受的盐。[0320]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所述的阳离子脂质，该临时专利申请以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0321][0322]或其药学上可接受的盐，其中每个r1和r2独立地是h或c1-c6脂族；每个m独立地为具有1至4的值的整数；每个a独立地是共价键或亚芳基；每个l1独立地是酯、硫酯、二硫键或酸酐基团；每个l2独立地是c2-c10脂族；每个x1独立地是h或oh；并且每个r3独立地是c6-c20脂族。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0323][0324](化合物1)[0325]或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0326][0327](化合物2)[0328]或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0329][0330](化合物3)[0331]或其药学上可接受的盐。[0332]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如j.mcclellan,m.c.king,cell 2010,141,210-217和whitehead等人，nature communications(2014)5:4277中所述的阳离子脂质，这些文献以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0333][0334]及其药学上可接受的盐。[0335]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2015/199952中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0336][0337]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0338][0339]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0340][0341]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0342][0343]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0344][0345]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0346][0347]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0348][0349]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0350][0351]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0352][0353]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0354][0355]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0356][0357]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0358][0359]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0360][0361]及其药学上可接受的盐。[0362]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2017/004143中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0363][0364]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0365][0366]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0367][0368]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0369][0370]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0371][0372]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0373][0374]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0375][0376]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0377][0378]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0379][0380]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0381][0382]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0383][0384]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0385][0386]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0387][0388]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0389][0390]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0391][0392]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0393][0394]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0395][0396]及其药学上可接受的盐。[0397]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2017/075531中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0398][0399]或其药学上可接受的盐，其中l1或l2中的一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-；并且l1或l2中的另一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或直接键；g1和g2各自独立地是未取代的c1-c12亚烷基或c1-c12亚烯基；g3是c1-c24亚烷基、c1-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；ra是h或c1-c12烷基；r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或-nr5 c(＝o)r4；r4是c1-c12烷基；r5是h或c1-c6烷基；并且x为0、1或2。[0400]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2017/117528中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0401][0402]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0403][0404]及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0405][0406]及其药学上可接受的盐。[0407]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2017/049245中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有下式之一的化合物：[0408][0409][0410]及其药学上可接受的盐。对于这四个通式中的任一者，r4独立地选自-(ch2)nq和-(ch2)nchqr；q选自由以下项组成的组：-or、-oh、-o(ch2)nn(r)2、-oc(o)r、-cx3、-cn、-n(r)c(o)r、-n(h)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(h)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(h)c(o)n(r)2、-n(h)c(o)n(h)(r)、-n(r)c(s)n(r)2、-n(h)c(s)n(r)2、-n(h)c(s)n(h)(r)和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0411][0412]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0413][0414]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0415][0416]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0417][0418]及其药学上可接受的盐。[0419]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2017/173054和wo 2015/095340中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0420][0421]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0422][0423]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0424][0425]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：[0426][0427]及其药学上可接受的盐。[0428]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo 2012/170889中所述的可切割阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：[0429][0430]其中r1选自由以下项组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选地取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，诸如二甲基氨基)和吡啶基；其中r2选自由以下两个通式之一组成的组：[0431][0432]并且其中r3和r4各自独立地选自由以下项组成的组：任选地取代的不同饱和或不饱和的c6-c20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的c6-c20酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4001”：[0433][0434]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4002”：[0435][0436]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4003”：[0437][0438]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4004”：[0439][0440]及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4005”：[0441][0442]及其药学上可接受的盐。[0443]用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如2018年5月16日提交的美国临时申请号62/672,194中所述的可切割阳离子脂质，该临时申请以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为美国临时申请号62/672,194中所述的通式中的任一者或者结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)以及(22)-(237)中的任一者。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(i')的结构的阳离子脂质，[0444][0445]其中：[0446]rx独立地为-h、-l1-r1或–l5a-l5b-b’；[0447]l1、l2和l3中的每个独立地为共价键、-c(o)-、-c(o)o-、-c(o)s-或-c(o)nrl-；[0448]每个l4a和l5a独立地为-c(o)-、-c(o)o-或-c(o)nrl-；[0449]每个l4b和l5b独立地为c1-c20亚烷基、c2-c20亚烯基或c2-c20亚炔基；[0450]每个b和b’为nr4r5或5元至10元含氮的杂芳基；[0451]每个r1、r2和r3独立地为c6-c30烷基、c6-c30烯基或c6-c30炔基；[0452]每个r4和r5独立地为氢、c1-c10烷基；c2-c10烯基；或c2-c10炔基；并且[0453]每个rl独立地为氢、c1-c20烷基、c2-c20烯基或c2-c20炔基。[0454]在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为62/672,194的化合物(139)，所述化合物具有以下化合物结构：[0455][0456](“18:1碳尾核糖脂质”)。[0457]在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、n-[l-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(“dotma”)。(feigner等人，proc.nat'l acad.sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，该专利以引用方式并入本文)。适用于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(“dogs”)；2,3-二油烯基氧基-n-[2-(精胺-羧胺)乙基]-n,n-二甲基-l-丙铵(“dospa”)(behr等人，proc.nat'l acad.sci.86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“dodap”)；l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“dotap”)。[0458]适用于本发明的组合物和方法的附加的示例性阳离子脂质还包括：l,2-二硬脂酰氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dsdma”)；1,2-二油烯基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dodma”)；1,2-二亚油基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dlindma”)；l,2-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dlendma”)；n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(“dodac”)；n,n-二硬脂酰基-n,n-二甲基溴化铵(“ddab”)；n-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(“dmrie”)；3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-l-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“clindma”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基l-l-(顺式,顺式-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(“cplindma”)；n,n-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“dmoba”)；1,2-n,n'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“docarbdap”)；2,3-二亚油酰氧基-n,n-二甲基丙基胺(“dlindap”)；l,2-n,n'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“dlincarbdap”)；l,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“dlincdap”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环(“dlin-k-dma”)；2-((8-[(3p)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-n,n-二甲基-3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-clindma”)；(2r)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-n,n-二甲基-3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-clindma(2r)”)；(2s)-2-((8-[(3p)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-n,fsl-二甲基3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-clindma(2s)”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(“dlin-k-xtc2-dma”)；和2-(2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,l 2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊环-4-基)-n,n-二甲基乙胺(“dlin-kc2-dma”)(参见wo 2010/042877，该专利以引用方式并入本文；semple等人，nature biotech.28:172-176(2010))。(heyes,j.,等人.,j controlled release 107:276-287(2005)；morrissey,dv.,等人.,nat.biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开wo 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。[0459]在一些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油基1-4-二甲基氨基乙基1-[1,3]-二氧戊环(“xtc”)；(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3ah-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“alny-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-n1,n16-二-十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“nc98-5”)。[0460]在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以mol％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。[0461]非阳离子/辅助脂质[0462]在一些实施方案中，提供的脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文使用的，短语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文使用的，短语“阴离子脂质”指在选择的ph，例如生理ph下携带净负电荷的许多脂质物质中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(pope)、4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-甲酸二油酰-磷脂酰乙醇胺(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(sope)、或它们的混合物。[0463]在一些实施方案中，此类非阳离子脂质可以单独使用，但是优选地与其他脂质(例如，阳离子脂质)组合使用。在一些实施方案中，非阳离子脂质可以占脂质体中存在的总脂peg2k；c12-200、dope、胆固醇和dmg-peg2k；hgt4003、dope、胆固醇和dmg-peg2k；ice、dope、胆固醇和dmg-peg2k；或者ice、dope和dmg-peg2k。[0472]在多个实施方案中，阳离子脂质(例如，ckk-e12、c12-200、ice和/或hgt4003)以摩尔比计占脂质体的约30％-60％(例如，约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，ckk-e12、c12-200、ice和/或hgt4003)的百分比以摩尔比计等于或大于脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。[0473]在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率可以分别地在约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与peg修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:20:10。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与peg修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:25:5。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与peg修饰的脂质的比率分别地为大约40:32:25:3。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与peg修饰的脂质的比率为大约50:25:20:5。[0474]不同的脂质组分的比率[0475]在脂质纳米颗粒包含三种且不超过三种不同脂质组分的实施方案中，总脂质含量的比率(即脂质组分(1):脂质组分(2):脂质组分(3)的比率)可以表示为x:y:z，其中[0476](y+z)＝100-x。[0477]在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”中的每个表示脂质的三种不同组分的摩尔百分比，并且该比率是摩尔比。[0478]在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”中的每个表示脂质的三种不同组分的重量百分比，并且该比率是重量比。[0479]在一些实施方案中，由变量“x”表示的脂质组分(1)是基于甾醇的阳离子脂质。[0480]在一些实施方案中，由变量“y”表示的脂质组分(2)是辅助脂质。[0481]在一些实施方案中，由变量“z”表示的脂质组分(3)是peg脂质。[0482]在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。[0483]在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。[0484]在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。[0485]在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。[0486]在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。[0487]在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。[0488]在一些实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，peg脂质)的摩尔百分比的变量“z”不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，peg脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，peg脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至10％。[0489]在一些实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，peg脂质)的重量百分比的变量“z”不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，peg脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，peg脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至10％。[0490]对于具有三种且仅三种不同脂质组分的组合物，变量“x”、“y”和“z”可以是任何组合，只要这三个变量的总和为总脂质含量的100％即可。[0491]包封mrna的脂质体的形成[0492]用于本发明的组合物中的脂质体转移媒介物可通过本领域目前已知的各种技术制备。用于所提供的组合物中的脂质体可通过本领域目前已知的各种技术制备。例如，多层囊泡(mlv)可根据常规技术制备，例如通过将脂质溶解在合适的溶剂中，将所选择的脂质沉积在合适的器皿或容器的内壁上，然后蒸发溶剂以在容器的内部上留下薄膜或喷雾干燥。然后可用涡旋运动将水相添加至器皿中，这导致mlv的形成。然后可通过多层囊泡的均质化、超声处理或挤出来形成单层囊泡(ulv)。另外，可通过清洁剂去除技术形成单层囊泡。[0493]在某些实施方案中，提供的组合物包含脂质体，其中mrna在脂质体的两个表面上结合且包封在相同脂质体内。例如，在本发明的组合物的制备过程中，阳离子脂质体可通过静电相互作用与mrna结合。例如，在本发明的组合物的制备过程中，阳离子脂质体可通过静电相互作用与mrna结合。[0494]在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包含包封在脂质体中的mrna。在一些实施方案中，一种或多种mrna物质可包封在相同的脂质体中。在一些实施方案中，一种或多种mrna物质可包封在不同的脂质体中。在一些实施方案中，mrna被包封在一种或多种脂质体中，这些脂质体在其脂质组成、脂质组分的摩尔比、大小、电荷(ζ电位)、靶向配体和/或它们的组合方面不同。在一些实施方案中，一种或多种脂质体可具有基于固醇的阳离子脂质、中性脂质、peg修饰的脂质和/或它们的组合的不同组成。在一些实施方案中，一种或多种脂质体可具有不同摩尔比的用于产生脂质体的基于胆固醇的阳离子脂质、中性脂质和peg修饰的脂质。[0495]将所需mrna掺入脂质体内的过程经常称为“加载”。示例性方法描述于lasic等人，febs lett.,312:255-258,1992中，该文献以引用方式并入本文。并有脂质体的核酸可完全或部分地位于脂质体的内部空间中、脂质体的双层膜内、或与脂质体膜的外表面结合。将核酸掺入脂质体内在本文中也称为“包封”，其中核酸完全包含在脂质体的内部空间内。将mrna并入转移媒剂(例如脂质体)中的目的经常是保护核酸免受环境侵害，所述环境可能含有降解核酸的酶或化学物质和/或促使核酸快速排泄的系统或受体。因此，在一些实施方案中，合适的递送媒剂能够增强其中包含的mrna的稳定性和/或促进mrna递送至靶细胞或组织。[0496]根据本发明的合适的脂质体可以各种尺寸制备。在一些实施方案中，提供的脂质体可制备得小于先前已知的包封mrna的脂质体。在一些实施方案中，脂质体的尺寸减小与更有效的mrna递送相关。适当脂质体尺寸的选择可考虑到靶细胞或组织的位点，以及在一定程度上制备脂质体所用于的应用。[0497]在一些实施方案中，选择合适大小的脂质体以促进由mrna编码的多肽的全身分布。在一些实施方案中，可能期望限制mrna对某些细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，脂质体的大小可设定为使得其尺寸小于肝脏中衬里肝血窦的内皮层的开窗；在这种情况下，脂质体可容易地穿透这种内皮开窗以到达靶肝细胞。[0498]或者或另外，脂质体的大小可设定为使得脂质体的尺寸具有足够的直径，以限制或明确地避免分布到某些细胞或组织内。[0499]所属领域已知的各种替代方法可用于测定脂质体群体的大小。一种此类的大小测定方法在美国专利第4,737,323号中描述，所述专利以引用的方式并入本文。通过浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生渐进的大小减小，降至直径小于约0.05微米的小ulv。均质化是依赖于剪切能将大脂质体断裂成较小脂质体的另一种方法。在典型的均质化程序中，mlv通过标准乳液均质器再循环，直到观察到选择的脂质体大小，通常在约0.1至0.5微米之间。脂质体的大小可通过准电光散射(qels)进行测定，如以引用的方式并入本文的bloomfield,ann.rev.biophys.bioeng.,10:421-150(1981)中所述。平均脂质体直径可通过所形成的脂质体的超声处理来减小。间歇性超声处理循环可与qels评价交替，以指导有效的脂质体合成。[0500]实施例[0501]尽管已经根据某些实施方案具体描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明的化合物，而不旨在对其进行限制。[0502]实施例1.构建体设计[0503]本实施例中提供了用于底物特异性e3-泛素连接酶的mrna构建体及其变体的示例性方法和设计。[0504]用于底物特异性e3-泛素连接酶的mrna构建体的基本设计包括1)编码底物结合结构域的序列和2)编码e3泛素连接酶的片段或全长的序列。任选地，构建体还可包含编码内质网(er)信号肽、核定位信号(nls)和/或er保留信号的序列。[0505]在该研究中，选择绿色荧光蛋白(gfp)作为靶底物。如图1a所示制备各种mrna构建体。vhhgfp4，一种特异性识别gfp的纳米抗体，被用作底物结合结构域。在每个构建体中，vhhgfp4在具有或不具有柔性接头(如图1a中的^所示)的情况下与e3连接酶(δspop、hvhl或δchip)融合。每个构建体用flag标记，这使得能够用抗flag cy3染料进行可视化。构建体c和e还包含编码er信号肽和er保留信号的序列。每个构建体的成分如表1所示。可对上述构建体进行任意数量的变化。例如，可修饰接头，可使用多于一种的e3连接酶，或者可引入编码e2泛素结合酶的序列。另外，可考虑底物结合结构域、e3连接酶、er信号肽和er保留信号的不同组合。[0506]构建体设计允许对目标蛋白进行特异性亚细胞靶向。例如，在一些亚细胞区室中降解靶蛋白可能是有毒的。为了避免毒性，可使用本文提供的mrna构建体将目标蛋白的靶向限制于特定的亚细胞区室。此外，使用亚细胞靶向信号优于其他治疗策略，诸如使用小分子。使用本文所述的构建体的示例性亚细胞定位如图1b所示。如图1b所示，使用构建体a提供了protac的精确核定位，而使用构建体e提供了protac的细胞质定位。[0507]表1.mrna构建体成分[0508][0509][0510]实施例2.用于底物特异性e3-泛素连接酶蛋白水解的mrna的体外表达和功效[0511]该实施例说明了编码底物特异性e3-泛素连接酶的mrna的成功体外转染、表达和功效。[0512]通过构建体a、c、d、e和f的mrna转染表达gfp的hela细胞。转染24小时后，对未处理和转染的细胞进行染色并使用显微镜成像。[0513]如图2a所示，通过免疫荧光使表达的gfp蛋白和dna可视化。在未处理的细胞中，未观察到抗flag cy3的信号。图2b中示出未处理细胞的gfp和flag信号的放大合并图像。[0514]如图3a-7b所示，用表1中所示的各种mrna构建体转染的细胞成功地表达底物特异性e3-泛素连接酶。值得注意的是，如合并图像(图3b、图4b、图5b、图6b和图7b)所示，表达的e3-泛素连接酶与gfp共定位，表明表达的e3-连接酶能够结合它们的靶标gfp。[0515]用不包含er信号肽或er保留信号的构建体a mrna转染的细胞表现出核相关斑点(图3b)。不希望受理论束缚，这证实由构建体a编码的gfp特异性e3-泛素连接酶与转染细胞中的gfp结合，并且由于缺乏er保留信号肽而将gfp易位到细胞核中。[0516]用包括er信号肽和er保留信号的构建体c或e mrna转染的细胞分别在图4b和图6b中示出。有趣的是，在这些显示表达gfp和e3-泛素连接酶两者的转染细胞(虚线箭头)中，gfp被隔离在细胞核外。[0517]图7b中示出用不包含er信号或er保留信号肽的构建体f mrna转染的细胞。值得注意的是，在显示gfp和e3-泛素连接酶的表达和共定位的细胞中，“孔”在细胞核中可见，证实了由泛素降解途径介导的gfp降解(参见图7b中的蓝色箭头)。[0518]总的来说，该实施例表明，用各种mrna构建体转染的细胞成功地表达gfp特异性e3-泛素连接酶。反过来，这些表达的gfp特异性e3-泛素连接酶结合gfp并诱导选择性蛋白水解。[0519]实施例3.用于底物特异性e3-泛素连接酶蛋白水解的mrna的表达和功效的时程研究[0520]该实施例说明了在转染后6和24小时编码底物特异性e3-泛素连接酶的mrna的成功表达和功效。[0521]由构建体a或e的mrna或单独的gfp mrna转染hek293细胞。另外，用gfp mrna和mrna构建体a或e共转染hek293细胞。在转染后6或24小时对细胞进行染色，并且使用显微镜以40x放大率进行成像。研究设计如表2所示。[0522]表2.hek193细胞中诱导的选择性蛋白水解的研究设计[0523][0524]如图8a所示，与转染后6小时未处理的样品1相比，每种mrna的单构建体转染(表2中的样品2-4)导致gfp或e3连接酶的中度表达。对于样品2，转染的gfp均匀地存在于整个细胞中。对于样品2，用含有nls但不含er信号肽或er保留信号的构建体a转染，表明表达的e3连接酶以斑点形式定位于细胞核。对于样品4，用包含er信号肽和er保留信号的构建体e转染，表明表达的e3连接酶保留在细胞质中。[0525]如图8b所示，每个构建体在转染后24小时后表现出增加的表达(样品8-10)。表达蛋白的定位与转染后6小时样品中观察到的情况类似。[0526]接下来，通过gfp mrna与构建体a或e共转染hek293细胞，如表2中的样品5、6、11和12所示，并且在转染后6或24小时成像。[0527]当通过gfp mrna单独转染细胞时，gfp在整个细胞中表达，如图8a和图8b所示(样品2和8)。然而，当通过gfp mrna和含有nls的构建体a共转染细胞时，表达的gfp被隔离到细胞核中，表明表达的e3连接酶能够结合gfp并移动到细胞核中(图9a和图9b)。另外，“孔”在细胞核中可见，表明由泛素降解途径介导的gfp降解。[0528]如图10a和图10b所示，用gfp mrna和构建体e转染的细胞(样品6和12)表明，在转染后6和24小时，在表达e3连接酶的区域中细胞质gfp信号降低，而核gfp信号保持不变。这表明由构建体e表达的e3连接酶降解细胞质gfp。在转染后24小时，核gfp似乎略有减少，表明e3连接酶可能在移出细胞核之前降解gfp，从而减少细胞核。[0529]总的来说，该实施例表明由转染的mrna表达的e3连接酶成功地结合gfp并诱导选择性蛋白水解。该实施例进一步证实，本发明的e3-泛素连接酶诱导的蛋白水解可以对亚细胞区室具有特异性。[0530]实施例4.e3-泛素连接酶诱导的细胞核gfp蛋白水解的体外功效[0531]该实施例说明了表达的e3-泛素连接酶能够结合其细胞核中的靶底物并诱导蛋白水解。[0532]通过构建体a或e转染已经用组蛋白h2b标签修饰的稳定表达gfp的hela细胞系。组蛋白h2b是形成核小体的四种主要组蛋白中的一种，并且因此，h2b标记的gfp仅定位于细胞核中。另外，h2b标签也被认为轻微改变gfp的构象，潜在地使其更容易被多泛素化或蛋白酶体降解。[0533]转染后24小时对转染的细胞进行染色，并且使用显微镜以40x放大率进行成像。图11示出用构建体a和h2b标记的gfp mrna转染的细胞的图像。如右上图所示，由于h2b标签，gfp仅定位于细胞核。另外，由构建体a编码的e3连接酶定位于核斑点中，如前面和左下图所示。有趣的是，如图11的右下图所示，e3连接酶未揭示与gfp的任何共定位，表明h2b标记的gfp在细胞核中被有效降解。[0534]图12示出用构建体e和h2b标记的gfp mrna转染的细胞的染色图像。类似于图11，其示出gfp定位于细胞核。由于构建体e含有er信号肽和er保留信号，由转染的mrna编码的e3连接酶定位于细胞质中，如图12的左下图所示。与图11相反，右下图的合并图像示出核gfp清楚地存在于表达e3连接酶的细胞中(图12，右下图)。由于h2b标记的gfp被限制于细胞核内，gfp不能被e3连接酶诱导的蛋白水解途径降解。[0535]实施例5.e3-泛素连接酶诱导的gfp蛋白水解的浓度依赖性反应[0536]该实施例说明由表达的e3-泛素连接酶诱导的蛋白水解是浓度依赖性的。[0537]不内源性表达gfp的hela细胞系用1μg的gfp mrna和不同浓度的构建体e共转染。共转染的细胞在转染后24小时染色并成像。对gfp的量进行定量并绘制成图，如图13a-b、d所示。图13c是flag蛋白质印迹，其示出构建体e以浓度依赖性方式降低gfp表达。图13d是gfp蛋白质印迹，其示出构建体e以浓度依赖性方式降低gfp表达。总的来说，结果表明由构建体e mrna编码的e3-泛素连接酶以浓度依赖性方式有效地诱导gfp的降解。[0538]对另一种e3-泛素连接酶进行测试，并且示出以浓度依赖性方式提供靶向蛋白水解。该泛素结构，构建体g，包含e3连接酶小脑蛋白、er信号、er保留序列和vhhgfp。该研究的数据表明，构建体g以浓度依赖性方式降低gfp表达(图21a-b)。研究设计如上一段所述。使用构建体g产生额外的数据，其示出构建体g对gfp表达的浓度依赖性反应。这些数据显示在图21c中，该图示出暴露于1:1、4:1和10:1的构建体g:gfp rna比率的hela细胞的流式细胞术图。这些数据在图21d中显示为柱状图。总的来说，这些数据表明，随着构建体g比率的增加，gfp的量呈浓度依赖性减少。具体来说，数据表明在用5μm mg132阻断的10:1的构建体g:gfp rna时，gfp平均荧光强度(mfi)下降46％。[0539]实施例6.e3-泛素连接酶诱导的gfp蛋白水解的时程研究[0540]本实施例研究了由施用的mrna编码的e3-泛素连接酶诱导的gfp的时程降解。[0541]不内源性表达gfp的hela细胞系用gfp mrna和构建体e共转染。在不同的时间点测量共转染细胞中gfp的量，直到转染后34小时。作为阴性对照，还测量了单独用gfp mrna转染的不内源性表达gfp的hela细胞系的gfp浓度。[0542]不同时间点gfp的量绘制在图14中。与仅用gfp mrna转染的细胞中的gfp水平相比，用gfp mrna和编码e3-泛素连接酶的构建体e共转染的细胞中的gfp水平在所有时间点都显著降低。结果还表明，由施用的mrna编码的e3-泛素连接酶在转染后6小时就有效(可检测到gfp表达时)，并且该作用甚至在转染后34小时后仍持续。[0543]接下来，通过构建体a转染已经用组蛋白h2b标签修饰的稳定表达gfp的hela细胞系。构建体a具有细胞核定位信号，因此诱导细胞核中e3-泛素连接酶的表达。在不同的时间点测量转染细胞中gfp的量，直到转染后72小时。作为阴性对照，还测量了未用构建体a转染的组成型表达h2b-gfp的hela细胞系的gfp浓度。[0544]不同时间点gfp的量绘制在图15中。与阴性对照相比，转染后10小时前gfp水平没有显著变化。在24和48小时时间点，与阴性对照相比，观察到gfp浓度明显降低。[0545]实施例7.无细胞系统中e3-泛素连接酶诱导的gfp蛋白水解的体外功效[0546]该实施例研究了体外翻译系统(无细胞系统)中e3-泛素连接酶诱导的gfp蛋白水解。研究设计描绘于图16中。简而言之，根据本领域已知的方法制备hela细胞的细胞质提取物。向含有功能性翻译系统的细胞质提取物中添加e3-连接酶mrna和靶mrna或蛋白。mrna或gfp的量通过elisa、蛋白质印迹或qpcr来定量。[0547]检查在体外无细胞系统中由施用的编码e3-泛素连接酶的mrna诱导的gfp降解功效。向细胞质提取物中添加不同比例的各种成分，如表3所示。[0548]表3.gfp mrna的体外翻译系统[0549][0550][0551]如图17所示，仅含有gfp mrna的样品(样品1)产生显著高量的gfp蛋白，而没有添加任何mrna的样品(样品6)含有不可检测量的gfp。用不同量的构建体e补充的样品2-4示出gfp的剂量依赖性减少，说明由构建体e编码的e3-泛素连接酶成功地诱导gfp蛋白水解。为了检查gfp和/或e3-泛素连接酶的翻译是否有限制，添加编码靶向非gfp的e3-泛素连接酶的mrna(样品5)。结果显示，与样品5相比，样品4中的gfp之间没有显著差异，证实gfp和/或e3-泛素连接酶的产生不受翻译效率的限制。图17b提供了显示在无细胞翻译系统(cfts)中使用构建体e降解重组gfp的数据。该研究的数据表明，在cfts中30分钟后观察到bioprotac活性。[0552]无细胞翻译系统(cfts)也用于使用e3-连接酶小脑蛋白，构建体g评估抗gfp bioprotac(图17c-e)。图17c是显示构建体g和包含gfp rna的构建体的示意图。这些cfts研究表明对构建体g的抗gfp浓度反应(图17d)，以及在三小时的时程评估中抗gfp的逐渐减少(图17e)。总rna/样品为3.5pmol。数据表明即使在0.2当量下使用构建体e也能显著敲低gfp。[0553]使用包含小脑蛋白和抗-pnpla3 scfv抗体(构建体或abhd5)的bioprotac e3连接酶进行另一项cfts研究(图17f)。abhd5是pnpla3蛋白结合剂。图17f是显示包含e3连接酶bioprotac的小脑蛋白并且还显示pnpla3-gfp融合的示意图。对于这些研究，pnpla3-gfp融合构建体和/或构建体m或n用于cfts系统。数据表明pnpla3-gfp的量随构建体m或n的量增加而浓度依赖性减少(图17g)。这些数据表明，使用基于小脑蛋白的e3连接酶以浓度依赖性方式减少靶蛋白的存在。[0554]实施例8.接头长度对e3-泛素连接酶诱导的gfp蛋白水解的影响[0555]该实施例说明vhhgfp4(底物结合结构域)和δspop(泛素途径部分)之间的接头长度不会显著影响e3-泛素连接酶诱导的gfp蛋白水解。[0556]如图18a和表4所示，制备在vhhgfp4纳米抗体和δspop e3连接酶之间具有不同接头长度的构建体。[0557]表4.具有不同接头长度的构建体a的变体[0558][0559][0560]除了gfp mrna之外，用表4所示的各种构建体补充实施例7中所述的细胞质提取物。在不同的时间点，通过elisa定量gfp的量并且作图，如图18b所示。结果表明vhhgfp4纳米抗体和δspop e3连接酶之间的接头长度不显著影响gfp降解效率。所有具有不同接头长度的构建体都能够有效降低样品中gfp的量。似乎合理的是，由施用的构建体诱导的降解如此强，以至于在该特定实验中没有观察到不同接头长度的差异效果。[0561]实施例9.e3-泛素连接酶诱导的a1at蛋白水解的浓度依赖性反应[0562]该实施例说明了表达的e3-泛素连接酶能够结合其靶标a1at并诱导蛋白水解。[0563]如图19所示制备各种mrna构建体。scfv4b12，一种特异性识别a1at的单链可变片段，被用作底物结合结构域。在每个构建体中，scfv4b12用柔性接头(如图19中的^所示)与e3连接酶(hvhl，或δchip)融合。每个构建体用flag标记，这使得能够用抗flag cy3染料进行可视化。构建体h、j和k还包含编码er信号肽和er保留信号的序列。可对上述构建体进行任意数量的变化。例如，可修饰接头，可使用多于一种的e3连接酶，或者可引入编码e2泛素结合酶的序列。另外，可考虑底物结合结构域、e3连接酶、er信号肽和er保留信号的不同组合。[0564]进行体外实验以检查由转染的mrna编码的e3-泛素连接酶对a1at蛋白的蛋白水解的剂量-反应功效。细胞用不同浓度的1μg/1x106个细胞的a1at质粒和构建体g-k中的一者的共转染(图19)。[0565]如图20a所示，由构建体g-k编码的e3-泛素连接酶能够以浓度依赖性方式诱导a1at的降解。在该特定实施例中，当mrna构建体以至少1:1(构建体mrna:a1at质粒)的比率添加时，观察到a1at的降解。[0566]接下来，使用体外无细胞翻译系统来研究由转染的mrna编码的e3-泛素连接酶对a1at蛋白的蛋白水解的剂量-反应功效。如图19所示，用4pmol的a1at mrna和构建体k以不同比率补充细胞质提取物。如图20b所示，仅含有a1at mrna的样品产生大量的a1at。当用不同量的构建体k补充样品时，观察到a1at的剂量依赖性减少，说明由构建体k编码的e3-泛素连接酶成功地诱导a1at蛋白水解。[0567]实施例10：由蛋白酶体驱动bioprotac介导的降解[0568]该实施例表明bioprotac介导的降解是由蛋白酶体驱动的。对于这些研究，构建体g用作代表性mrna构建体。为了辨别蛋白酶体在bioprotac介导的降解中的作用，对hela细胞施用含有或不含有5μm蛋白酶体抑制剂mg-132的构建体g。获得细胞分离物并进行gfp elisa。这些研究的结果表明，在用mg-132处理的所有细胞中，gfp增加。这些数据表明，构建体g导致gfp的显著蛋白酶体依赖性降解(图22a和22b)。[0569]实例11：用于靶向降解的不同e3连接酶bioprotac设计的比较[0570]在该实施例中，比较了各种e3连接酶设计对靶蛋白的敲低。测试的bioprotac的设计包括构建体e和两种双特异性抗小脑蛋白bioprotac(双特异性rna a和双特异性rna b)(图23a和图23b)。图23b是显示双特异性bioprotac与小脑蛋白结合的示意图。[0571]对于这些研究，用gfp rna和图23a所示的一种bioprotac设计共转染hela细胞。这些研究的数据表明，所有测试的bioprotac设计都导致特异性gfp敲低。这些数据还表明，构建体e在减少靶蛋白存在方面优于每种抗小脑蛋白(双特异性)bioprotac(图23c)。[0572]实例12：小鼠中对gfp bioprotac作用的表达持续时间研究[0573]该实施例中描述的研究的目的是测定小鼠中施用的bioprotac的表达持续时间。该研究中使用的bioprotac如图24a所示。对于这些研究，通过尾静脉注射gfp rna和/或图24a所示的一种bioproact对6-8周龄的cd-1小鼠进行给药。然后在给药后6小时和24小时评估肝脏gfp表达。这些研究的数据表明，在bioprotac治疗组中没有统计学上的显著差异。数据表明，在施用构建体g的小鼠中存在肝脏gfp表达降低的趋势(图24b)。[0574]等效物[0575]本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如以下权利要求书中所述。









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