用于治疗神经退行性疾病的改进的细胞穿透性修饰Parkin重组蛋白及其用途的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术用于治疗神经退行性疾病的改进的细胞穿透性修饰parkin重组蛋白及其用途技术领域1.相关申请的引用2.本技术要求于2020年9月4日提交的美国临时专利申请序列号63/074,697的权益和优先权，通过援引方式将该申请的全部内容并入本文。3.技术领域4.本发明涉及通过再生受损神经元和通过清除不良蛋白聚集体以及脑中累积的受损线粒体而可从根本上治疗退行性脑病(例如帕金森病和阿尔茨海默病)的药物候选物。本发明的技术进步之处在于，现有api制造方法和开发的改变的蛋白质结构和纯化方法，以改进作为用于临床应用目的的药物的api开发方法。背景技术：5.神经退行性疾病及不足的医疗需求6.神经退行性疾病(ndd)是随着身体的结构和功能逐渐退化而发生的疾病，尤其是在脑和脊髓中。神经退行性疾病通过神经递质的失衡引起学习、记忆等的异常失能。可以通过考虑出现的主要症状和受影响的脑区来分类神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)和亨廷顿病(hd)。目前还没有适合的治疗方法可用于神经发生或抑制神经元细胞凋亡。7.帕金森病8.pd是由黑质致密部和纹状体之间的黑质纹状体系统(多巴胺系统)中多巴胺能神经元细胞的选择性丧失引起的退行性疾病。全球患者数量约为1000万，并且数量在增加。由于黑质(sn)中多巴胺的不完全产生，运动神经元皮层刺激减少引起pd。pd被分类为由与伴有运动障碍(如震颤、运动徐缓和僵硬)和非运动障碍(如抑郁、失眠和认知缺损)的临床症状的pd相关的因素引起的家族性pd。这表明pd的病因学是一种多系统疾病，其引起广泛神经系统中的神经细胞的死亡。9.对于由遗传缺陷引起的家族性pd，α-突触核蛋白(park1/4)、lrrk2(park8)、pink1(park6)、parkin(park2)、dj-1(park7)等是众所周知的。此外，家族性pd的遗传因子被认为在散发性pd中发挥非常重要的作用，诸如parkin的pd致病基因在发病的重要阶段占据位置。由于parkin突变导致的e3泛素连接酶功能的丧失抑制多巴胺释放，导致特异性底物的累积或诱导多巴胺能神经元的退变，引起神经元细胞死亡。此外，据报道，parkin在线粒体中具有保护功能，并且表现出减少由应激引起的线粒体肿胀和细胞凋亡的细胞保护作用。异常病理蛋白聚集体的积累通过相应的机制诱导脑神经元的死亡并引起pd：线粒体功能障碍和泛素-蛋白酶体系统(ups)功能障碍。10.根据最近对pd的病理分析，α-突触核蛋白最初在嗅球和肠丛中被诱导，并被转运和易位至延髓和脑桥，然后被传递至pd。之后，α-突触核蛋白易位至中脑，然后至包括边缘皮质的大脑区域，并且还出现与痴呆相关的各种退行性病变。当症状变得严重时，单独的对症药物不能阻止pd的进展。11.目前对pd的治疗仅限于暂时抑制症状，但这不满足患者的安全性和有效性，并且迄今为止不可能改善引起严重副作用的潜在病况。未满足的需求的体量估计为约10.8亿美元，并且有必要开发一种能够从根本上治疗该疾病的新的机制特异性疾病调节药物。目前，诸如抗体治疗剂的生物药物难以穿透血脑屏障(bbb)或难以转移到产生病理性物质的脑神经元的内部。随着pd诊断技术的进步，治疗pd的可能性增加。这将逐渐增加相关的治疗市场。基于新药理学递送技术的治疗剂的开发是竞争性的，并且需要开发能够提供根本治疗的机制特异性疾病调节治疗剂。12.阿尔茨海默氏病13.ad是最常见的痴呆类型，发生于中老年(65岁以上)，占所有痴呆的约60-70％。长期以来一直努力寻找ad的原因，但仍有许多未知因素。ad患者中发现的关键症状是记忆和认知能力的降低。在早期阶段，随着记忆功能的衰退，近期记忆受损，并且出现交流障碍。在疾病期间，通常伴随有诸如焦虑、烦躁不安、抑郁和妄想的心理行为症状，并且认知和神经症状进展非常缓慢。14.在神经细胞中异常扭曲的神经原纤维缠结也是ad的特征。tau蛋白的磷酸化通过生化反应促进神经细胞破坏。然而，神经原纤维缠结不仅在阿尔茨海默氏痴呆患者的脑中发现，而且在正常人中也发现，然而在阿尔茨海默氏痴呆患者的脑中量大。据报道，由神经毒性物质(如寡聚体aβ或神经原纤维缠结)引起的受损线粒体的累积和细胞中ups的过度活化诱导脑神经元细胞死亡。当ups功能障碍发生时，异常的aβ和p-tau蛋白聚集在神经元的细胞质中，并且神经元细胞死亡诱导ad。然而，尚未阐明详细的分子机理。15.2010年，全球痴呆相关市场估计为6040亿美元，占全球gdp的约1％，并且患者数量的增加不仅发生在发达国家，也发生在发展中国家，因此获得痴呆相关疗法是迫切需要解决的问题。特别地，美国的婴儿潮人群将在2011年1月1日开启65岁，并且到202年12月31日，每天将有10000人开启65岁并进入老年人群。在美国，与痴呆相关的医疗和护理费用估计每年大约为2260亿美元，如果当前的趋势继续，则2050年痴呆相关的医疗费用预计达到1.1万亿美元。16.ad占痴呆病因的60％以上，其逐渐恶化认知功能，例如记忆、语言能力、执行功能和运动能力。淀粉样蛋白-β(aβ)和tau蛋白病理标志物在体内积累时不降解。ad痴呆的主要原因是皮质/海马神经元死亡的退行性脑病。各种危险因素(如其它病理状态、遗传异常、年龄和尚未确定的原因)仍然存在。作为ad的病理特征，代表性的淀粉样前体蛋白(app)通过异常代谢产生aβ，并且由于其在水中的溶解度差，其在脑中聚集和累积并形成老年斑。所形成的老年斑具有细胞毒性并促进脑神经元细胞的破坏，并且神经递质受到影响，导致临床痴呆。17.tau蛋白也经历生化反应，在磷酸化期间以异常扭曲的形式形成神经原纤维缠结，并且同时具有神经毒性(细胞毒性)，因此促进脑中神经细胞的破坏。然而，尽管在正常状态下也存在神经原纤维缠结，但神经原纤维缠结在ad患者的脑中的量特别高。据报道，由神经毒性物质(如寡聚体aβ或神经原纤维缠结)引起的受损线粒体的累积和细胞中ups的过度活化诱导脑神经元细胞死亡。当ups功能障碍发生时，异常的aβ和p-tau蛋白在神经元的细胞质中聚集，并且神经元细胞死亡诱导ad。然而，尚未阐明详细的分子机理。因此，有必要根据市场需求开发治疗痴呆的新机制。18.改进的细胞穿透性parkin(icp-parkin)的开发19.parkin是一种在基础研究中已经展示并证实的对神经元细胞死亡具有抗细胞凋亡作用的蛋白质。在pd的动物模型中，据报道，当补充(添加)parkin时，神经元细胞经历再活化并且pd的症状得到治疗。有证据表明，parkin可通过活化失活的多巴胺能神经元细胞而作为pd的根本治疗剂。已知parkin诱导的线粒体自噬吞噬起重要作用，因为已经发现parkin的功能丧失是pd中的病理因素(j.cell biol.2008)。parkin是去除受损线粒体和/或诱导线粒体自噬的e3泛素连接酶(natcommun.，2012)。20.当将parkin或pink1基因从秀丽隐杆线虫pd模型中去除时，线粒体功能障碍和运动功能丧失，并且据报道由表达parkin的pink1缺陷型果蝇中的pink1突变引起的缺陷表型通过parkin的补充得以恢复(nature，2006)。此外，据报道在pd患者的脑中parkin表达存在问题(nat med，2005)。此外，pd的主要发病机制是由于功能障碍而存在于脑中的α-突触核蛋白的积聚，其与另外的线粒体复合物i降解、氧化应激和泛素蛋白酶体抑制联合在一起，导致多巴胺能神经元细胞的逐渐凋亡。parkin突变诱导由e3泛素连接酶活性丧失引起的异常蛋白的累积，多巴胺释放的抑制和多巴胺能神经元细胞的退变，导致神经元细胞死亡。换言之，异常的parkin功能可引起α-突触核蛋白的累积。21.为了使用tsdt平台获得针对靶向pd候选物的优化候选物，通过以下结构筛选方法开发了icp-parkin。22.将随机选择的amtd321序列与增溶结构域(源自黄色粘球菌的蛋白s的sda(184a/a)或源自褐家鼠的细胞色素b的sdb(99a/a))融合得到了his-amtd321-parkin-sda(hm321psa)和his-amtd321-parkin-sdb(hm321psb)。(2)amtd321和sdb组合的融合被确定为基本主链结构。(3)优化amtd筛选方法：通过替换amtd序列，我们比较和分析重组蛋白的溶解度、产率、细胞穿透性和生物活性，以确定最佳amtd(amtd524)。用parkin和增溶结构域b组合的基本结构筛选了10种amtd。在10种类型的amtd中，amtd524具有最佳的溶解度和产率。23.此外，作为验证10种amtd融合parkin重组蛋白的细胞穿透性的结果，所有蛋白都具有细胞穿透性，并且amtd524排名第四。此外，证实amtd524在由6-ohda(一种神经毒素)诱导的细胞毒性环境中具有最佳的细胞保护作用。(4)与其他cpp(tat、polyr、dpv03)的比较证明了amtd融合parkin的优越性。(5)去除his标签并证明等同性。amtd524-parkin-sdb(m524psb)被确定为icp-parkin的先导物。24.在另一种神经毒素(mpp+)诱导的细胞毒性环境中，amtd524具有排名第三的细胞保护作用，在膜联蛋白v实验(在6-ohda诱导的细胞毒性环境中能染色凋亡细胞)中，amtd524具有最佳的细胞保护作用。在此基础上，通过优化先导物结构筛选出amtd524/sdb融合的人parkin重组蛋白。该结构首先被确定为改进的细胞穿透性parkin(icp-parkin)，一种机制特异性的靶向pd的治疗剂。即，icp-parkin是通过将amtd524(avalivvpalap(seq id no.123))结合至具有细胞保护作用的parkin蛋白的功能域而制备的具有高细胞穿透性的重组蛋白。25.参考文献26.1.pct/kr2016/00817427.发明公开内容28.技术问题29.如先前部分所述，现有技术的icp-parkin具有显示神经保护活性和抗pd功效的巨大潜力。然而，为了生产icp-parkin作为开发新型治疗生物制品的药物产品，必须提高生产产率并开发可规模性生产的有效方法。为此，作为现有技术的进步系统，本发明包括：1)改变icp-parkin的结构(即icp-mparkin)以改善蛋白质稳定性，以及2)开发能够大规模生产的蛋白质的适当纯化方法，同时保持现有技术的治疗活性和作用模式。30.技术方案31.本技术提供了icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白。32.根据一个实施方案，所述重组蛋白包含：33.i)修饰的parkin蛋白；以及34.ii)高级大分子转导结构域(amtd)，35.其中所述修饰的parkin蛋白具有seq id no：1的氨基酸序列，所述amtd具有选自seq id no：2-241的氨基酸序列。36.根据一个实施方案，重组蛋白还包含一个或多个增溶结构域(sd)。37.根据一个实施方案，所述重组蛋白由以下结构式中的任一个表示：38.a-b、b-a、a-b-c、a-c-b、b-a-c、b-c-a、c-a-b、c-b-a和a-c-b-c，39.其中a是高级大分子转导结构域(amtd)，b是修饰的parkin蛋白，c是增溶结构域(sd)。40.根据一个实施方案，重组蛋白具有seq id no：243的氨基酸序列。41.根据一个实施方案，sd具有seq id no：242的氨基酸序列。42.根据一个实施方案，重组蛋白用于治疗神经退行性疾病，其中所述神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。43.根据一个实施方案，提供了编码icp-mparkin重组蛋白的多核苷酸序列。44.根据一个实施方案，提供了包含所述多核苷酸序列的重组表达载体。45.根据一个实施方案，提供了用重组表达载体转化的转化体。46.根据一个实施方案，提供了包含作为活性成分的icp-mparkin重组蛋白的组合物。47.根据一个实施方案，提供了用于治疗神经退行性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的icp-mparkin重组蛋白，以及药学上可接受的载体。48.在这方面，神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。49.根据一个实施方案，提供了icp-mparkin重组蛋白作为治疗神经退行性疾病的药物的用途。50.在这方面，神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。51.根据一个实施方案，提供了包含icp-mparkin重组蛋白的药物。52.根据一个实施方案，提供了icp-mparkin重组蛋白在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。53.在这方面，神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。54.根据一个实施方案，提供了治疗个体的神经退行性疾病的方法。55.在这方面，该方法包括给予个体治疗有效量的icp-mparkin重组蛋白。56.根据一个实施方案，提供了制备icp-mparkin重组蛋白的方法。57.在这方面，该方法包括：58.制备包含编码icp-mparkin重组蛋白的多核苷酸序列的重组表达载体；59.用重组表达载体制备转化体；60.培养转化体；以及61.获得通过培养表达的重组蛋白。62.根据一个实施方案，获得重组蛋白包含：63.包涵体清洗；64.进行第一离子交换层析；以及65.进行第二离子交换层析。66.根据一个实施方案，洗涤包括使用ph8洗涤缓冲液的一步法洗涤。67.根据一个实施方案，第一离子交换层析是阳离子交换层析，第二离子交换层析是阴离子交换层析。68.根据一个实施方案，第二离子交换层析包括：69.在8.0ms/cm电导率条件下洗涤，和70.在9.0ms/cm电导率条件下洗脱。71.根据一个实施方案，培养包括补料分批发酵。72.发明有益效果73.通过工艺开发和结构改变，icp-mparkin可以解决现有技术的icp-parkin的几个先前的限制和问题(例如，低稳定性和具有异质性的单体产率以及高成本的sec使用)，因此实现开发出具有icp-parkin的强大治疗潜力的益处的先进药物材料，这已经在同行评议期刊公布中得到证实。icp-mparkin是ubl结构域缺失的icp-parkin的修饰结构，基于其优异的纯度、同质性、稳定性和生物活性，其被选作icp-parkin的最终结构。74.附图简要说明75.图1显示了parkin蛋白的结构和疏水性。76.图2显示了icp-parkin变体的结构筛选。77.图3显示了使用hplc分析的icp-parkin变体的蛋白质分析结果。78.图4显示了一系列具有半胱氨酸至丝氨酸改变的icp-parkin变体的结构。79.图5显示了icp-parkin(现有技术)和icp-mparkin的结构图。80.图6显示了开发改进的方法(ip)以纯化具有更高同质性和纯度的重组蛋白。81.图7描述了通过ib洗涤减少产生的蛋白质的杂质。82.图8显示了改进的洗脱方法以除去重组蛋白杂质。83.图9显示了开发用优化的洗脱方法的一步法ib洗涤和两步法柱纯化以获得更高比例的单体icp-mparkin。84.图10描述了两步法柱纯化方法有效除去杂质。85.图11显示了用于单体icp-mparkin的大规模生产的逐步洗脱的引入。86.图12显示了用于icp-mparkin的临床前和临床开发的蛋白质生产的最终过程。87.图13显示了在相同条件下纯化的icp-parkin和icp-mparkin的层析比较。88.图14显示了icp-mparkin的改进的稳定性。89.图15显示icp-mparkin在37℃下、在48h的跨度和在25℃下、在4天的跨度的稳定性。90.图16显示了icp-mparkin的依赖于浓度的稳定性。91.图17显示了icp-mparkin的特征总结：icp-mparkin具有可应用于临床开发水平的结构稳定性。92.图18显示了补料分批发酵的结果。93.图19显示了依赖于细胞群培养的icp-mparkin的ib产率的比较。94.图20显示了使用由补料分批发酵产生的icp-mparkin细胞群的纯化结果。95.图21显示了icp-mparkin表达的细胞系开发。96.图22显示了cmo的细胞系开发的最终结果集。97.图23显示了通过最终工艺(fp)方法在cmo生产的icp-mparkin。98.图24显示了在cmo和内部(cellivery)生产的icp-mparkin的纯度。99.图25显示了在cmo下生产的icp-mparkin的冷冻/解冻和热稳定性。100.图26显示了在cmo和内部(cellivery)生产的icp-mparkin的可比生物活性的展示。101.图27显示了icp-mparkin是细胞穿透性的。图27显示了icp-parkin和icp-mparkin重组蛋白的可视化细胞穿透性。用与amtd融合的fitc标记的蛋白质(10μm)在37℃下处理c2c12细胞两小时。通过激光扫描共焦显微镜技术将蛋白的细胞穿透性可视化。(a)流式细胞术测定icp-parkin和icp-mparkin重组蛋白的细胞穿透性。在c2c12(b)和a549(c)中对两种parkin重组蛋白的细胞穿透性进行肉眼比较。白条表示未处理的细胞(介质)；黑条线表示用等摩尔浓度的fitc处理的细胞(仅fitc)；蓝条表示用fitc标记的icp-parkin处理的细胞；红条表示用fitc标记的icp-mparkin处理的细胞。通过流式细胞术分析测定细胞穿透性。102.图28显示了icp-mparkin在受损细胞中是细胞穿透性的。图28显示了icp-parkin和icp-mparkin重组蛋白的细胞穿透性的测定。在用6-ohda处理后，在c2c12中肉眼比较两种parkin重组蛋白的细胞穿透性。孵育2小时后，裂解细胞并通过western印迹分析进行分析。103.图29显示了parkin重组蛋白的自泛素化测定的结果。图29显示了具有/不具有atp的情况下，icp-parkin和icp-mparkin的体外自泛素化活性的结果。用抗泛素(fk2)、通过western印迹分析评估自身泛素化。104.图30显示了icp-parkin和icp-mparkin的细胞活力分析的结果。用30μm 6-ohda和10μm icp-parkin或icp-mparkin处理sh-sy5y细胞。孵育24小时后，对细胞进行atp glo测定(a)。注意两种重组蛋白的细胞活力几乎相同。(b)通过光学显微镜监测来自处理的细胞形态的变化105.图31显示了在线粒体损伤条件下icp-mparkin促进线粒体自噬。(a)使sh-sy5y细胞与cccp和icp-parkin/icp-mparkin孵育4小时。在氯喹(自噬抑制剂)处理下，用于检测来自cccp或cccp+icp-mparkin处理的sh-sy5y细胞的裂解物中的lc3b-ii(自噬标志物)的western印迹分析。(b)用于检测线粒体自噬的共焦显微镜图像。106.图32显示了在线粒体损伤条件下icp-mparkin促进线粒体生物发生并抑制ros生成。107.图33显示了icp-mparkin和icp-parkin的可比较moa1的展示。108.图34显示了icp-mparkin抑制砷化钠诱导的细胞死亡和α-突触核蛋白的聚集形式。砷化钠对taggfp2-α-突触核蛋白sh-sy5y细胞具有毒性并诱导聚集的α-突触核蛋白的累积(a、b)。elisa分析显示在第8小时时，icp-mparkin显著降低可溶性级分中的病理性α-突触核蛋白形式，例如寡聚和丝状α-突触核蛋白。109.图35显示了icp-mparkin和icp-parkin的可比较moa2的展示。110.图36显示了与icp-parkin相比，icp-mparkin没有显示体内毒性。每周三次静脉注射icp-parkin和icp-mparkin(60mg/kg)，持续两周。分析小鼠的体重、毛皮状况和行为。111.图37显示了与icp-parkin相比，icp-mparkin没有显示体内毒性。每周三次静脉注射icp-parkin和icp-mparkin(60mg/kg)，持续两周。分析处理小鼠的脾重量与体重的比率。112.图38显示了icp-mparkin在6-ohda诱导的pd动物模型中改善行为和分子缺陷，类似于icp-parkin。图38显示icp-parkin在6-ohda诱导的帕金森病(pd)小鼠模型中的功效。将6-ohda(4μg/头)注射到纹状体的右侧。旋转杆试验。相对行为活性基于稀释剂对照的值作为100％。113.图39显示了icp-mparkin在6-ohda诱导的pd动物模型中改善行为和分子缺陷。a图显示了实验方案的示意图。将6-ohda(4μg/头)注射到纹状体的右侧。在将6-ohda注射到脑右侧的st后，每周三次静脉注射icp-mparkin，持续4周。b图表示旋转杆试验。相对行为活性基于稀释剂对照的值作为100％。114.图40显示了icp-mparkin改善6-ohda诱导的pd动物模型中的行为和分子缺陷。图40显示了酪氨酸羟化酶(th)表达的western印迹分析和用imagej定量的相对th表达的图。l和r分别表示脑的左侧和右侧。115.图41显示了在施用icp-mparkin两周后，改善ad小鼠模型中的认知功能。a图显示在ad模型中icp-mparkin剂量依赖性的两周实验设计。b图显示在ad模型中以剂量依赖性方式施用icp-mparkin显著改善的认知功能116.图42显示了施用icp-mparkin4周后，改善在ad小鼠模型中的认知功能。a图显示在ad模型中icp-mparkin剂量依赖性的四周实验设计。b图显示在ad模型中以低剂量依赖性方式施用icp-mparkin显著改善认知功能。117.图43显示在ad模型的脑中，icp-mparkin清除病理蛋白。(a)代表性的免疫组织化学图像显示通过icp-mparkin和神经保护作用清除淀粉样蛋白-β(aβ)斑块。(b)代表性斑点印迹图像显示可溶部分中病理性aβ斑块形成被icp-mparkin显著减少。(c)斑点印迹图像的定量，显示aβ斑块比率被icp-mparkin显著降低。118.图44显示了icp-mparkin阻断aβ处理的ht22细胞在3&6小时时的相对氧化应激(ros)累积。119.图45显示了lc-ms/ms分析显示icp-mparkin在ad模型中具有高效脑传递。(a)在ad模型的脑中，icp-mparkin的定量比非cp-mparkin的丰度更高。(b)在ad模型中icp-mparkin的最大脑递送率为2.9％。时间点：0.5和1小时。**p＜0.01，数据分别是利用student′s t检验的平均值±s.e.m。120.发明实施方式121.除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的专业人员通常理解的相同的含义。本说明书中引用的所有出版物、专利和其它文献均通过援引的方式整体并入本文。122.另外，除非在整个说明书中特别指出，否则术语“包含”、“包括”或“含有”旨在表示包括任何组分(或构成要素)，而对其没有特别限制，并且不能被解释为排除添加不同的组分(或构成要素)。123.如本文所用，术语“氨基酸”旨在广义上包括d-氨基酸和化学修饰的氨基酸以及天然存在的l α-氨基酸或其残基。例如，氨基酸模拟物和类似物落入氨基酸的范围内。在本文中，模拟物和类似物可包括其功能等同物。124.如本文所用，术语“预防”是指通过施用根据本技术的icp-mparkin重组蛋白而进行的抑制或延迟神经退行性疾病发病的所有动作，并且术语“治疗”是指通过施用icp-mparkin重组蛋白而进行的缓解或有益地改变神经退行性疾病的症状的所有动作。125.如本文所用，术语“施用”是指以任何合适的方式将根据本技术的药物组合物递送至个体。126.如本文所用，术语“个体”是指已经患有神经退行性疾病或处于患神经退行性疾病的风险中的任何动物，包括人。需要治疗神经退行性疾病或其症状的动物的实例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗和猫。127.i.icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白128.1.修饰的parkin129.本技术的一个实施方案提供了包含修饰的parkin的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白。与常规的icp-parkin相比，修饰的parkin在蛋白质中带来了改进的稳定性。130.修饰的parkin可以是由parkin蛋白移除结构域而产生的截短形式。在一个实施方案中，截短形式可以由除去至少一个选自parkin蛋白的ub1、ring0、ring1、ibr和ring2的结构域产生。在一个示例性实施方案中，修饰的parkin可以是缺少ubl结构域的形式。在更示例性的实施方式中，修饰的parkin可具有氨基酸序列qemnatggddprnaaggcerepqsltrvdlsssvlpgdsvglavilhtdsrkdsppagspagrsiynsfyvyckgpcqrvqpgklrvqcstcrqatltltqgpscwddvlipnrmsgecqsphcpgtsaefffkcgahptsdketsvalhliatnsrnitcitctdvrspvlvfqcnsrhvicldcfhlycvtrlndrqfvhdpqlgyslpcvagcpnslikelhhfrilgeeqynryqqygaeecvlqmggvlcprpgcgagllpepdqrkvtceggnglgcgfafcreckeayhegecsavfeasgtttqayrvderaaeqarweaasketikkttkpcprchvpveknggcmhmkcpqpqcrlewcwncgcewnrvcmgdhwfdv(seq id no：1)。然而，修饰的parkin不限于seq id no：1的氨基酸序列，而是包括表现出与该序列相同或相似效果的任何变体。131.2.促进生物活性分子穿过细胞质膜进入细胞的结构域132.本技术提供了包含促进生物活性分子穿过细胞质膜进入细胞的结构域的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白。促进生物活性分子穿过细胞质膜进入细胞的结构域的实例是amtd结构域，但不限于此，并且可包括阳离子、嵌合、疏水性cpp(细胞穿透肽)。133.至于生物活性分子，其实例包括蛋白质、肽、核酸、化合物等。在本技术中，amtd结构域可以意指促进上述mparkin蛋白穿过质膜递送的肽。关于amtd域，可参考韩国专利第10-1971021号，通过援引的方式将其内容整体并入本文。134.在一个实施方案中，amtd结构域可包括选自seqid no：2至241的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，amtd结构域可包括seq id no：123的氨基酸序列。135.[表1][0136]amtd结构域[0137][0138][0139][0140][0141][0142][0143][0144][0145][0146][0147][0148]1.增溶结构域[0149]除了修饰的parkin和amtd结构域之外，本技术提供的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白还可以包含至少一个增溶结构域。在一个实施方案中，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白可包含修饰的parkin、amtd结构域和增溶结构域。在另一个实施方案中，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白可包含修饰的parkin、amtd结构域和增溶结构域。[0150]给定增溶结构域的情况下，本技术的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白具有改善溶解度的优点。在一个实施方案中，增溶结构域包括用于增加生物活性分子的溶解度的肽。在示例性实施方案中，增溶结构域可包括氨基酸序列maeqsdkdvkyytleeiqkhkdskstwlilhhkvydltkfleehpggeevlgeqaggdatenfedvghstdarelsktyiigelhpddrskiakpsetl(seq id no：242)。然而，增溶结构域不限于此，并且可以是已知增加生物活性分子溶解度的任何结构域。[0151]ii.icp(改进的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的具体实例[0152]根据本技术的一个实施方案提供的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白可以由选自a-b、b-a、a-b-c、a-c-b、b-a-c、b-c-a、c-a-b、c-b-a和a-c-b-c的结构式表示。在上述结构式中，a代表amtd结构域，b代表修饰的parkin，c代表增溶结构域。[0153]在一个示例性实施方案中，本技术提供的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白可包括以下氨基酸序列。然而，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的氨基酸序列不限于此，而可以是可能来自第i节icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白中描述的组合的任何序列。[0154][表2][0155]的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的具体实例[0156][0157]此外，本技术不仅提供了icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的氨基酸序列，而且提供了编码其的多核苷酸，携带该多核苷酸的重组表达载体和用该重组表达载体转化的转化体。[0158]iii.icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的用途[0159]1.药物组合物[0160]本技术的一个实施方案提供了包含icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的组合物。本技术的另一个实施方案提供了包含作为活性成分的icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的组合物。在一个实施方案中，组合物可以是用于治疗或预防疾病的药物组合物。[0161]根据本技术的一个实施方案提供的药物组合物可以进一步包含载体。本技术的药物组合物中所含的药学上可接受的载体通常用于制剂配制。载体的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。除了上述成分之外，本技术的药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、着色剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。关于药学上可接受的载体和合适的制剂的细节，可参考remington′s pharmaceutical sciences(第19版，1995)。[0162]根据本技术的药物组合物可以使用本领域通常使用的至少一种稀释剂或赋形剂来配制，例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。[0163]在一个实施方案中，用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、锭剂等。这些固体制剂可通过将至少一种本技术的化合物与一种或多种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)混合来制备。此外，除了简单的赋形剂之外，还可以使用润滑剂，如硬脂酸镁，滑石等。在另一个实施方案中，用于口服给药的液体制剂包括混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆剂等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂，栓剂等。丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射的酯(如油酸乙酯)等可用作非水溶剂和悬浮剂。栓剂的基质可包括witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂酸脂，甘油明胶等。[0164]icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白具有细胞穿透性，并且可以起到保护神经元细胞免受神经毒素的作用。更详细而言，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白促进线粒体损伤病症中的线粒体自噬并抑制病理性α-突触核蛋白的累积。即，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白根据机理在保护神经元细胞中起作用。[0165]因此，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白可以包含在用于预防、治疗或缓解神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物中，或者可以用作药物或用于制备药物。在一个实施方案中，神经元细胞损伤相关疾病可包括神经退行性疾病，实例包括帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化(als)和运动神经元疾病，但不限于此。可以包括已知为神经元细胞损伤相关疾病的任何疾病。[0166]2.治疗方法[0167]在本技术的一个实施方案中，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白可用于治疗疾病。更具体而言，本技术的一个实施方案提供了治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用包含icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的组合物。在本文中，个体可以是指包括人在内的哺乳动物。[0168]根据预定的形式，在本技术的一个实施方案中提供的组合物可以口服或肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部)。给药剂量可由本领域技术人员根据患者的状态和体重，疾病的严重程度，药物的剂型，给药途径和时间等适当确定。[0169]根据本技术的组合物以药学有效量施用。如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可以根据各种因素来确定，包括疾病的类型和严重程度，药物的活性，对药物的敏感性，给药时间，给药途径，排泄率，治疗持续时间，与组合物组合使用的药物，以及医学领域已知的其它因素。本发明的组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用。组合物可以以单剂型或多剂型给药。考虑到所有上述因素，以能够显示最大效果而不引起副作用的最小量施用组合物是重要的，并且该量可以由本领域技术人员容易地确定。[0170]具体而言，根据本技术的化合物的有效量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化。通常，化合物可以0.1至100mg/kg体重的量施用，并且优选每天或每隔一天或每天一至三次以0.5至10mg/kg体重的量施用。剂量可以根据给药途径，肥胖程度，性别，体重，年龄等而增加或减少，因此不以任何方式限制本技术的范围。[0171]在用于治疗疾病的方法的背景下，疾病包括第2部分的所有公开内容。治疗疾病的药物组合物。即，本技术提供了用于治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用包含icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的药物组合物。此外，本发明提供治疗神经细胞损伤相关疾病的方法，所述疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化和运动神经元疾病，所述方法包括向有需要的个体施用包含icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的药物组合物。[0172]iv.icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的制备方法[0173]本技术的一个实施方案提供了icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的制备方法。该方法可以包括以下步骤：[0174]1.制备包含编码icp-mparkin重组蛋白的多核苷酸序列的重组表达载体。[0175]制备方法可以包括制备包含编码icp-mparkin重组蛋白的多核苷酸序列的重组表达载体的步骤。在这方面，icp-mparkin重组蛋白由第i部分icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的公开内容说明。[0176]如本文所用，术语″重组表达载体″是指用于表达重组肽或蛋白的载体。另外，本技术的载体可以用充当宿主细胞的原核细胞或真核细胞构建。本技术的重组表达载体可以是例如噬菌体载体，粘粒载体，yac(酵母人工染色体)载体，质粒等。本技术中使用的载体可以使用本领域已知的各种方法构建。[0177]2.使用重组表达载体制备转化体[0178]制备方法可以包括使用重组表达载体制备转化体的步骤。只要已知其为能够产生重组蛋白的宿主细胞，任何宿主细胞都可用于用重组表达载体转化。宿主细胞的实例包括细菌，酵母，真菌等，但不限于此。在一个实施方案中，可以使用大肠杆菌菌株。在一个示例性实施方案中，可以使用大肠杆菌bl21star(de3)、neb表达菌株。在更示例性的实施方案中，可以使用大肠杆菌neb表达菌株。利用大肠杆菌neb表达菌株，可以获得较高的ib(包涵体)产率。然而，并没有限制，而土壤杆菌属菌株(如土壤杆菌a4)，芽孢杆菌属菌株(如枯草芽孢杆菌)，假单胞菌属菌株和乳杆菌属菌株可用作宿主细胞。本技术不受所述实例限制。[0179]3.培养转化体[0180]制备方法可以包括培养转化体的步骤。在一个实施方案中，培养可以包括分批发酵或补料分批发酵。在一个示例性实施方案中，培养可以包括补料分批发酵，与分批发酵相比，补料分批发酵可以提高重组蛋白的产率。[0181]4.获得通过培养表达的重组蛋白[0182]制备方法可以包括获得通过培养表达的重组蛋白的步骤。获得重组蛋白的步骤可以包括：[0183]1)包涵体洗涤[0184]获得步骤可以包括清洗包含体。在这方面，洗涤可以进行一次或多次。在一个实施方案中，可以进行两轮或多轮洗涤。考虑到蛋白质损失，洗涤可简化为一轮。在示例性实施方案中，洗涤包括使用含有5m尿素和50mmtris的洗涤缓冲液(ph 8)的一步法洗涤，但不限于此。[0185]2)离子交换层析[0186]获得步骤可以包括进行离子交换层析。在一个实施方案中，离子交换层析可以进行两次。在两轮离子交换层析的示例性实施方案中，第一离子交换层析可以是阳离子交换层析，第二离子交换层析可以是阴离子交换层析。当在获得步骤中进行两轮离子交换层析时，icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的制备方法可以省略sec(尺寸排阻层析)。[0187]在一个实施方案中，进行第二离子交换层析的步骤可以包括逐步洗脱。逐步洗脱包括在8.0ms/cm电导率条件下洗涤和在9.0ms/cm电导率条件下洗脱。逐步洗脱使得单体icp-mparkin以高产率获得。[0188]3)额外步骤[0189]除了清洗包涵体和进行离子交换层析之外，获得步骤还可以包括另外的步骤。在一个实施方案中，获得步骤可以包括变性、重折叠和溶解。在示例性实施方式中，获得步骤可以按顺序包括洗涤包涵体、变性、进行第一离子交换层析、进行第二离子交换层析、重折叠和溶解，但不限于此。为了有效获得重组蛋白，可以修改每个步骤。[0190]有效获得icp(改善的细胞穿透性)-mparkin重组蛋白的优选制备方法示于图12。[0191]在下文中，将参考以下实施例进一步详细描述本技术。然而，应当理解，这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。实施例[0192]1.改善的细胞穿透性修饰parkin(icp-mparkin)的开发和技术意义[0193](1)icp-mparkin的结构修饰、筛选以及开发以提高同质性和稳定性[0194]parkin蛋白由几个结构域组成，包括n末端泛素样(ubl)，really interesting new gene(ring)0、1、2，in between ring(ibr)和阻抑物元件(rep)结构域。ring结构域包括锌结合位点，其对于parkin结构形成是重要的。ring1结构域是e2-ub结合位点，ring2结构域是作为e3泛素连接酶的主要活性位点，其含有parkin结构域的酶活性的关键点(图1)。此外，由于parkin蛋白的疏水性相互作用，疏水性致密区可引起parkin蛋白的聚集和不稳定性(图1)。为了基于包括构效关系(sar)和疏水密度在内的基本原理产生更稳定的parkin结构，开发了表达修饰的icp-parkin蛋白的各种结构的克隆，并研究了相应蛋白的诱导和纯化(图2)。[0195]大多数icp-parkin变体在重折叠步骤中聚集并且不能被分析(图2)，并且一些变体(13-15号)在通过hplc分析的纯化后显示出异质种类(图3)。[0196]天然parkin序列中存在的半胱氨酸残基被改变为丝氨酸，以防止分子内和分子间二硫键的形成，从而增加结构稳定性(图4)。[0197]设计并筛选了总共25个变体结构，其中仅1个结构显示出优异的稳定性。剩余24个显示严重的聚集，并且纯化过程必须在柱纯化工作之前停止。来自天然parkin的ubl结构域缺失结构[amtd524-parkin(δubl)-sdb]没有显示聚集(图5)。该修饰的结构被命名为改进的细胞穿透性修饰的parkin(icp-mparkin)，并用于以下实验。总之，仅缺失ubl结构域的变体可作为进步的icp-parkin以高稳定性纯化，icp-parkin的治疗潜力已经在通过使用pd细胞和动物模型的先前研究中证实。[0198]icp-mparkin的序列如下：[0199][0200][0201](2)大规模生产的纯化步骤优化[0202]为了解决这个问题，在通过改变在大肠杆菌系统中变性和重折叠的化学和物理条件的重新优化之后，开发了改进的方法(ip)，其能够生产高纯度的单体重组蛋白(图6)。[0203]工艺条件筛选集中在包括包涵体(ib)洗涤、柱筛选和洗脱方法筛选在内的多种操作。改变用于变性和重折叠过程的ph条件和缓冲剂。与在hic纯化之后进行重折叠的先前方法相比，hic被alex替代并且在重折叠过程之后进行。将重折叠蛋白浓度校正为0.1mg/ml。在aiex之后加入sec纯化。在变性之前额外进行ib洗涤可以提高重组蛋白的纯度(图7)。ib洗涤过程由两步组成：第一步用较低ph缓冲液洗涤，第二步用较低尿素浓度和较高ph缓冲液洗涤。该方法允许减少杂质(图7和8)。[0204]在大规模生产之前，改进方法(ip)需要另外的方法开发。将改进方法(ip)中的aiex和sec的两步柱纯化替换为ciex和aiex，并将梯度洗脱替换为逐步洗脱，以考虑到大规模生产的较大工作体积需要简化洗脱工艺。两步ib洗涤也简化为使用ph8洗涤缓冲液的一步洗涤方法，以减少目标蛋白的损失，同时有效地除去杂质(图9和10)。通过如下的改变洗脱方法纯化单体icp-mparkin：在clex从低到高ph直接洗脱，以及在alex从高到低ph和从低到高nacl的梯度洗脱(图9和10)。[0205]此外，作为对洗脱方法的进一步修改，梯度洗脱方式被替换为逐步洗脱。具体而言，在第二lc的洗脱步骤之前，使用8.0ms/cm电导率条件加入洗涤步骤以洗出杂质。将9.0ms/cm的电导率用于目标洗脱，得到更高产率的单体icp-mparkin(图11)。[0206]因此，开发了这种与大规模生产相容的改进方法，称为最终方法(fp)。使用基于上述优化开发的fp，具有高于90％(～92％)同质性/纯度的icp-mparkin可以在没有sec柱纯化的情况下制备(图12)。[0207]相比之下，icp-mparkin显示显著更高的单体比例(图13)。[0208]通过循环动力学(cd)分析验证了icp-mparkin在37℃下的结构稳定性。与icp-parkin(约600秒)相比，icp-mparkin显示热稳定性，证实在测量期间结构保持1000秒(图14a)。这比icp-mparkin的37℃稳定性增加67％。由于没有测量1000秒后的稳定性，所以相信将有更好的稳定性，并将在以后更新。测得icp-mparkin的tm比icp-parkin的tm高6℃(图14b)。进行扩展实验以进一步证明icp-mparkin的优异稳定性。[0209]与icp-parkin相比，icp-mparkin在37℃显示更稳定(图15)。在37℃下24h后，icp-mparkin显示小于5％的单体比例损失，而icp-parkin损失超过15％。考虑到治疗剂在体内保持稳定直到显示临床效果的必要性，这表明icp-mparkin更适合作为临床治疗剂。[0210]当使用fp纯化时，通过hplc分析显示icp-mparkin的92％的同质性/纯度。此外，当在25℃的室温下储存时，这两种结构在稳定性方面显示出甚至更大的差异。在储存4天后，icp-mparkin显示仅2％的单体纯度损失(图15)。因此，进行hplc分析以测定icp-mparkin在37℃和25℃保持单体的能力。在确认37℃、8小时未发生聚集，认为其在体温下稳定8小时，在室温下(25℃)，认为icp-mparkin可稳定4天并用作蛋白质药物。[0211]当在更高的蛋白质浓度(10μg/μl)下评估稳定性时，与具有增加的更高多聚体比例的icp-parkin相比，icp-mparkin甚至在20μg/μl下保持稳定(图16)。当浓缩icp-parkin时(大于10μg/μl)产率的快速下降相比，这属于优异的稳定性。[0212]总之，通过工艺开发和结构修饰，icp-mparkin可以解决现有技术icp-parkin的几个先前的限制和问题(例如，低稳定性和具有异质性的单体产率以及高成本的sec使用)，因此实现开发为具有icp-parkin的强大治疗潜力的益处的先进药物材料，这已经在同行评议期刊公布中得到证实。icp-mparkin是一种缺失ubl结构域的icp-parkin的修饰结构，当用如下fp制备时(图17)，基于其优异的纯度、同质性、稳定性和生物活性，选择icp-parkin作为icp-parkin的最终结构：[0213]结构优化：ubl缺失(热稳定性，31℃→37℃)[0214]工艺优化(1)：通过改变变性/重折叠条件增加同质性(单体产率，81％→92％)。[0215]工艺优化(2)：通过重新优化ib洗涤/洗脱条件除去杂质。[0216]工艺优化(3)：取代尺寸排阻层析(sec)柱。[0217]工艺优化(4)：在批量生产的整个补料分批发酵中蛋白质产率增加20倍(4→80mg/l)。[0218](3)提高细胞量的补料分批发酵[0219]新开发的icp-mparkin结构稳定，具有治疗功能，但蛋白产率欠缺。为了提高蛋白质的最终产率，使用补料分批发酵代替分批发酵。与分批发酵不同，补料分批发酵使用连续供应的营养物以最大化细胞量和蛋白产率，这导致细胞量收获增加约10倍以用于后续纯化工作(图18)。[0220]补料分批发酵显示出与cellivery以前的发酵方法相比产率增加约20倍。该产率和方法被认为对于技术转移至cgmp认证的cmo是足够的(图19)。此外，作为大肠杆菌的培养方法，优化了补料分批发酵以高产率生产icp-mparkin，用于gmp水平cmo的药物开发。通过该方法细胞量增加20倍。[0221]来自新型补料分批发酵和先前分批发酵的icp-mparkin产物是相同的(图20)。[0222](4)cmo大规模生产icp-mparkin[0223]将celliery开发的fp技术转移到全球cgmp水平的cdmo。在cmo完成大肠杆菌细胞系开发以产生icp-mparkin(图21和22)。组合10种宿主菌株和5种质粒，通过克隆和转化筛选出大肠杆菌细胞系(16种)。在整个高通量筛选中，通过根据载体、诱导系统(例如，iptg、鼠李糖)和添加剂(例如，脯氨酸/葡萄糖)以及培养条件比较表达水平和纯度，选择最佳条件和细胞系。结果，neb表达显示icp-mparkin的最高生产能力(纯度和表达率)。[0224]在表达neb的菌株系统中的ib产率的高度潜力预期为7.4g/l，这远高于通过全规模补料分批发酵的bl21星(de3)菌株(图22)。[0225]通过使用这些细胞系，以15l规模产生icp-mparkin。为了确认蛋白质质量中的位置间差异，通过使用cmo细胞群(nebexpress)和fp方法的icp-mparkin的内部生产显示出与cmo生产的相当的纯度和同质性(图23和24)。[0226]纯化后，通过sds-page、hplc测定蛋白质性质(例如纯度、同质性和稳定性)和活性。在稳定性方面，检查在celliery内部和cmo生产的icp-mparkin的重复冷冻/解冻和热稳定性。结果，icp-mparkin保持了抗物理应激的结构完整性和稳定性，表明在cmo由fp产生的icp-mparkin可以大规模生产，用于临床药物开发。[0227]此外，在cmo产生的icp-mparkin与在celliery生产的icp-mparkin相比具有相似的优异生物活性。[0228]2.发明效果[0229]2-1.icp-mparkin在帕金森病(pd)模型中的功效[0230](1)parkin重组蛋白细胞穿透性[0231]先前已经证明icp-parkin是细胞穿透性的。由于icp-mparkin是通过结构修饰和改进的纯化方法产生的，我们研究了与以前的parkin重组蛋白相比，新的parkin重组蛋白的细胞穿透性。蛋白处理两小时后，在c2c12细胞中评价parkin重组蛋白的细胞穿透性。使用荧光共聚焦激光扫描显微镜监测蛋白细胞内定位，fitc标记的携带amtd的parkin重组蛋白、icp-parkin和icp-mparkin显示相似的细胞穿透性(图27a)。接下来，为了定量细胞穿透性，在1小时fitc孵育之后，在c2c12细胞和a549细胞中进行流式细胞术分析。icp-mparkin的细胞穿透性略好于icp-parkin(图27b和c)。这些结果表明，与icp-parkin相比，icp-mparkin能够在短时间内成功地穿透到细胞中并且具有改善的细胞穿透性。[0232]为了检测受损情况下的细胞穿透性，用模拟帕金森氏病的6-ohda处理细胞，然后与icp-parkin和icp-mparkin孵育两小时。通过western印迹分析分析icp-parkin和icp-mparkin的细胞穿透性。icp-parkin和icp-mparkin都能够在正常和受损条件下渗透到细胞中(图28)。该结果显示icp-mparkin与icp-parkin相比具有相似的细胞穿透性。[0233]parkin重组蛋白的递送。为了观察细胞穿透性，根据制造商的说明书(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)，将parkin重组蛋白缀合至异硫氰酸荧光素(fitc)。在24孔室载玻片中，将c2c12细胞在盖玻片上培养24h，在37℃下用10μm介质(培养基，dmem)、仅fitc、fitc缀合的重组蛋白处理2h，并用冷pbs洗涤三次。在室温下，将处理过的细胞在4％多聚甲醛(pfa，junsei，tokyo，japan)中固定10分钟，用pbs洗涤三次，并用含有用于核染色的dapi(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)的固定培养基(vector laboratory，burlingame，ca，usa)进行固定。通过共焦激光扫描显微镜确定荧光信号的细胞内定位。[0234]为了定量细胞穿透性，在37℃下，用10μm fitc标记的重组蛋白处理c2c12细胞1小时，用冷pbs洗涤三次，在37℃下用蛋白酶k(5μg/ml)处理10分钟以除去细胞表面结合的蛋白。通过流式细胞术(facs calibur；bd，franklin lakes，nj，usa)，使用flowjo分析软件分析这些重组蛋白的细胞穿透性。[0235]对于细胞穿透性的western印迹分析，用6-ohda(30μm)、icp-parkin(10μm)和icp-mparkin(10μm)处理c2c12细胞2小时。孵育后，裂解细胞并通过western印迹分析进行分析。[0236](2)parkin重组蛋白生物学活性[0237]icp-mparkin在atp glo测定中显示与e3泛素连接酶等同的自身泛素化活性和细胞保护活性(图29-30)。此外，icp-mparkin显示同等的双重作用模式(图31-35)：1)通过线粒体自噬和线粒体生物发生的线粒体恢复，2)病理性α-突触核蛋白的积累减少。[0238]对icp-parkin和icp-mparkin评估自身泛素化以确定它们的酶活性。为了分析icp-mparkin作为e3泛素连接酶的生化活性，在试管中进行自身泛素化测定。icp-parkin在体外自身泛素化，如用抗泛素抗体(fk2)所证实的(图29)。与icp-parkin的结果一致，icp-mparkin也能够在存在或不存在atp的情况下自身泛素化。这些结果暗示，即使icp-mparkin不合有ubl结构域，icp-mparkin也是活性e3连接酶，而ci-icp-parkin是无催化活性的，没有e3连接酶泛素活性。[0239]以前，我们提出icp-parkin能以剂量依赖性方式保护神经元细胞免受神经毒素[1-甲基-4-苯基吡啶鎓(mpp+)和6-羟基多巴胺(6-ohda)]的影响。通过在sh-sy5y细胞中使用6-ohda证实icp-mparkin的细胞保护作用(图30)。结果提示，icp-mparkin显著防止细胞毒性。[0240]icp-parkin作为e3泛素连接酶的自身泛素化活性。对icp-parkin和icp-mparkin评估自身泛素化以确定它们的酶活性。为了分析icp-parkin和icp-mparkin作为e3泛素连接酶的生物化学活性，使用自身泛素化测定法(bostonbiochem)，根据制造商的说明书，在试管中测量parkin e3连接酶活性。简言之，将1μg纯化的parkin与0.1μm e1、1μm e2、50μm泛素和10μm mg-atp在37℃下反应1hr，然后用抗泛素抗体(1∶1，enzo life science)进行western印迹。[0241]icp-mparkin的细胞保护作用。通过使用神经毒素6-羟基多巴胺(6-ohda)来证实icp-parkin的细胞保护作用。将人脑肿瘤(sh-sy5y)细胞(韩国细胞系库)培养和铺板，并且在37℃下用30μm的6-ohda和10μm的parkin重组蛋白预处理70％融合的sh-sy5y细胞24h，并且通过celltiter-测定(promega)评估细胞保护性。celltiter-测定提供了一种通过定量存在的atp的量来确定培养物中活细胞的数目的均相方法，atp指示代谢活性细胞的存在。通过celltiter-glo细胞活力测定评价细胞活力，并使用发光板读数器(synergytm h1，biotek instruments)定量。[0242](3)作用模式(moa 1&2)：icp-mparkin使神经元免于受损线粒体(1)和病理性α-突触核蛋白(2)的累积。[0243]parkin参与线粒体自噬，线粒体自噬是去除受损线粒体的自噬过程之一。由化学物质(如cccp)处理诱导的线粒体损伤通过pink1的累积和随后在线粒体上的parkin活化导致一系列的线粒体自噬过程。因此，我们推测icp-mparkin处理可能加速线粒体损伤条件下的线粒体自噬。本研究中的线粒体通量的促进与毒素处理条件下线粒体向溶酶体的定位增加或线粒体自噬增加相关。通过测量位于自噬体膜上的自噬标志物lc3b-ii的水平来分析线粒体自噬通量。[0244]cccp处理逐渐增加lc3b-ii/lc3b-i比率的水平。然而，随着时间的推移，icp-mparkin进一步提高了cccp处理的细胞中lc3b-ii/lc3b-i比率，这与icp-mparkin处理后促进线粒体自噬相一致。icp-parkin还增加了参与线粒体生物发生的基因的表达：过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活物1α(pgc-1α)、线粒体转录因子a(tfam)和核呼吸因子1和核呼吸因子2。此外，icp-parkin也恢复了由cccp降低的细胞活性氧(ros)水平。因此，这些数据表明，icp-mparkin促进线粒体自噬和线粒体生物发生(图31-33)，以替代受损的线粒体。[0245]散发性帕金森氏病与称为路易体(lewy bodies)的结构相关，路易体含有病理性(寡聚、丝状和磷酸化)形式的α-突触核蛋白以及synphilin-1(α-突触核蛋白相互作用蛋白质)和pael-r(路易体中累积的蛋白质之一)。synphilin-1和pael-r是已知的parkin底物；然而，尽管有冲突的报道，α-突触核蛋白似乎不是parkin底物，除了当蛋白质被糖基化时。通过使用经工程化以表达用绿色荧光蛋白标记的α-突触核蛋白(taggfp2-α-突触核蛋白)的sh-sy5y细胞，我们检验了icp-mparkin是否影响由亚砷酸钠(naaso2)诱导的α-突触核蛋白沉积物的水平。我们证实亚砷酸钠提高了寡聚/丝状α-突触核蛋白的水平，并且icp-mparkin降低了寡聚/丝状α-突触核蛋白的聚集水平(图34和35)。[0246]线粒体损伤条件下icp-parkin介导的线粒体自噬。parkin参与线粒体自噬，线粒体自噬是去除受损线粒体的自噬过程之一。由化学物质(如cccp)处理诱导的线粒体损伤通过pink1的累积和随后在线粒体上的parkin活化导致一系列的线粒体自噬过程。为了检查线粒体自噬吞噬通量的促进，通过cccp(10μm)、氯喹(40μm)和icp-mparkin(40μm)处理来分析位于自噬体膜上的自噬标志物lc3b-ii的水平。孵育后，对细胞裂解物进行western印迹分析，以测量lc3b-ii/lc3b-i比率的水平。为了观察线粒体和经历线粒体自噬的线粒体，分别用mm lyso dye(dojindo molecular technologies)和100nm mtphagy dye(dojindo molecular technologies)染色细胞。[0247]线粒体损伤条件下icp-parkin介导的线粒体生物发生。用ribospin(geneall)提取总rna，并使用hyperscripttm第一链合成试剂盒(geneall)从总rna(2μg)合成cdna。将cdna样品用作实时qrt-pcr程序的模板。使用实时pcr(cfx96 touchtm实时pcr检测系统，(bio-rad))分析mrna表达的相对量。根据制造商的说明书，使用ssoadvanced通用试剂(bio-rad)。引物序列如下所述：hrplp0(h36b4)正向(5′‑tgcatcagtaccccattctatca-3′)，反向(5′‑aaggtgtaatccgtctccacaga-3′)；hpgc1α(ppargc1a)正向(5′‑ctcaaagaccccaaaggatg-3′)，反向(5′‑tggaatatggtgatcgggaa-3′)；htfam正向(5′‑agctcagaacccagatgc-3′)，反向(5′‑ccactccgccctataagc-3′)；hnrf1正向(5′‑ggctaccatagaagcacatg-3′)，反向(5′‑gaagaaggcgagtcttcatc-3′)；hnrf2(gabpa)正向(5′‑acatcaatgaaccaataggc-3′)，反向(5′‑ccttggtcaaataaacttcg-3′)。parkin参与线粒体自噬，线粒体自噬是去除受损线粒体的自噬过程之一。化学物质处理引起线粒体损伤。[0248]相对氧化应激(ros)的测量。将sh-sy5y细胞加入到96孔板(4x104细胞/孔)中。48小时后，用ros缓冲液进行洗涤。将25μm的dcfda(细胞活性氧测定试剂盒，abcam，ab113851)在活性氧缓冲液中处理，并在每个孔中以100μl反应45min。然后，在用ros缓冲液洗涤后，将20-80μm cccp和20μm icp-mparkin稀释在ros缓冲液中并在孔中处理。孵育6小时后，使用激发和发射波长分别设为488和535的微板系统检测代表ros水平的dcfda荧光强度。[0249]α-突触核蛋白聚集体在表达taggfp2-α-突触核蛋白的sh-sy5y神经元细胞中降解的体外研究评价。通过稳定转染taggpf2-α-突触核蛋白，建立了一种新的绿色荧光sh-sy5y细胞系。taggfp2-α-突触核蛋白细胞系被稳定地转染，并且其准备用于基于细胞的测定应用中。该稳定转染的细胞系提供稳定水平的α-突触核蛋白表达。该细胞系旨在用作帕金森病研究的″体外″模型。亚砷酸盐是一种普遍存在的环境强有毒金属。砷诱导线粒体膜电位的丧失并诱导活性氧(ros)的产生和脂质过氧化。用icp-mparkin(20μm)和亚砷酸钠(20μm)处理表达taggfp2-α-突触核蛋白的sh-sy5细胞。孵育后，用抗α-突触核蛋白聚集抗体和人α-突触核蛋白gly111-tyr125抗体对细胞裂解物进行elisa分析。[0250](4)icp-parkin和icp-mparkin的体内毒性[0251]为了研究新开发的icp-parkin是否具有体内毒性，测量一般毒性评分。对于这两组小鼠，用60mg/kg的icp-parkin和icp-mparkin处理。各组每周静脉注射3次，持续2周。注射后，分析小鼠的体重、毛皮状况和行为。与icp-mparkin相比，注射icp-parkin的小鼠组表现出毒性评分(图36)。[0252]为了研究新开发的icp-mparkin是否也具有体内毒性，进行脾毒性分析。对于这两组小鼠，用60mg/kg icp-parkin和icp-mparkin处理。各组每周静脉注射3次，持续2周。注射后，分析小鼠的脾重量与体重之比。与icp-mparkin相比，注射icp-parkin的小鼠组显示高脾毒性评分(图37)。这些结果表明，icp-mparkin没有体内毒性。[0253]icp-parkin和icp-mparkin的体内毒性。每周三次静脉注射icp-parkin和icp-mparkin(60mg/kg)，持续两周。分析一般毒性评分(包括小鼠的体重、皮毛状况和行为)和脾重与体重之比。[0254](5)icp-parkin和icp-mparkin的体内功效[0255]在6-羟基多巴胺(6-ohda)诱导的小鼠模型中测试icp-parkin和icp-mparkin的神经保护活性。为了确定icp-parkin和icp-mparkin给药的治疗功效，在6-ohda诱导的pd小鼠模型中进行4周注射方案(图38)。每周三次静脉注射icp-parkin和icp-mparkin，持续4周。旋转杆试验显示来自用icp-parkin和icp-mparkin处理的小鼠的运动功能障碍的相似恢复。[0256]为了确定icp-mparkin给药的治疗效果，在6-ohda诱导的pd小鼠模型中进行4周注射方案。每周三次静脉注射icp-mparkin，持续四周。旋转杆试验显示icp-mparkin处理改善了运动功能障碍(图39和40)。同样，icp-mparkin处理恢复了pd小鼠模型中th表达的水平(90％)。[0257]6-ohda诱导的pd小鼠模型。在几种动物模型中测试icp-parkin的预防和/或恢复pd相关运动症状的能力。在每个模型中，在开始icp-mparkin处理之前，通过阿扑吗啡旋转试验证实运动症状的发作。对动物皮下注射0.1mg/kg阿扑吗啡(新鲜溶解于0.1％抗坏血酸溶液中，并在使用前避光保存在冰上)，并且如果受损害的小鼠的侧偏旋转在20分钟转得快于约60转的速率，则判断为有症状。parkin蛋白静脉内给药(i.v.)在如本文所述的时间和剂量下实施，并且如下所述监测运动功能的变化。通过3∶7的alpaxan：rompun的混合物(bayer)麻醉c57bl/6小鼠(雄性，13周)；置于立体定位仪上并以0.2μl/min的速率将溶解在0.8μl的0.02％抗坏血酸(sigma-aldrich)中的4μg 6-ohda(sigma-aldrich)注射到纹状体中，坐标如下(相对于前庭)：前-后(ap)＝+0.6mm，中-侧(ml)＝-2.2mm，背-腹(dv)＝-3.2mm(自硬脑膜)，以平颅骨位置。对照小鼠仅注射0.02％抗坏血酸溶液。[0258]旋转杆试验。在旋转杆装置上以15rpm预训练小鼠300或720秒，以实现稳定的表现。在300秒的时间内以从4rpm到40rpm的逐渐加速进行测试，并记录每只小鼠能够停留在棒上的时间。每只动物测试3次。[0259]动物研究中酪氨酸羟化酶的western印迹分析。为了分析脑样品中的酪氨酸羟化酶，将分离的脑在含有蛋白酶抑制剂(thermo fisher scientific)的前制备裂解缓冲液(intron biotechnology)中匀浆。通过10％sds-page分离定量的细胞裂解物，并转移到硝酸纤维素膜(bio-rad)上。将膜与抗th(1∶2000；millipore，ab152)和β-肌动蛋白(1∶100,000；sigma-aldrich，a3854)的一抗孵育，随后与二抗孵育。在使用supersignal west dura(thermo fisher scientific)可视化后，用imagej软件定量免疫印迹。[0260]2-2.其他适应症(阿尔茨海默病，ad)：icp-mparkin在ad模型中的功效[0261](1)在原纤维淀粉样蛋白-β(faβ)诱导的ad模型中施用icp-mparkin两周后认知功能改善的功效[0262]通过立体定向手术将4μg的原纤维淀粉样蛋白-β(faβ)注射到脑中来诱导ad小鼠模型。术后2周，通过y型迷宫试验(即认知功能(自发交替)试验)验证是否建立ad小鼠模型。将动物随机分组后，以剂量依赖性方式每周三次静脉内注射(iv)icp-mparkin，共两周。在第3和第4周，通过y型迷宫试验，证实icp-mparkin给药是否改善认知功能(图41a)。结果，当在第4周施用icp-mparkin时，在100mg/kg的icp-mparkin下认知功能改善了122％(图41b)。[0263]动物。该研究在年龄匹配的c57bl/6雄性小鼠(7-8周龄)中进行，小鼠获自daehan bio link(eumseong-gum，韩国)。在严格控制温度(设定点23±2℃)、相对空气湿度(设定点50％)和光照条件(8：00-20：00，开/关灯)的研究所动物室中，以每组5只动物进行饲养。在整个研究中随意提供自来水和标准实验室食物。[0264]原纤维淀粉样蛋白-β(faβ)诱导的ad小鼠模型。将c57bl/6雄性小鼠用7∶3的alfaxan：rompun混合物麻醉，置于立体定位仪上，并通过立体定位手术将4μg的faβ(rpeptide，a1170)注射到脑中，坐标如下(相对于前庭)：前-后(ap)＝-2mm，中-侧(ml)＝0mm，背-腹(dv)＝-3mm(自硬脑膜)，以平颅骨位置。对照小鼠仅注射0.01％抗坏血酸溶液。[0265]行为测试(y型迷宫)。通过y型迷宫试验(认知功能(自发交替)试验)验证建立的ad小鼠模型。y型迷宫装置(臂长：35cm，壁高：9cm)由三个等长的臂组成，臂由白色聚氯乙烯(pvc)制成，中间连接以形成“y”形。该行为学上相关的测试基于啮齿类动物的先天好奇心来探索新的区域，并且对小鼠没有呈现负性或正性增强和非常小的应激。在将小鼠标放入y形迷宫后立即启动视频记录系统。按下播放并记录每只小鼠8分钟的自发行为。一旦完成测试，轻轻地将鼠标放回其笼中，并将笼子放回架中。在每个测试之间用无香味的漂白杀菌擦拭物(70％etoh)彻底清洁迷宫。当小鼠在3个连续臂入口的每一个中进入迷宫的不同臂时，进行自发交替的测量。改变的百分比计算为实际改变次数与最大改变次数的比率。[0266](2)在faβ诱导的ad模型中施用icp-mparkin 4周后认知功能改善的功效[0267]通过立体定向手术将4μg的原纤维淀粉样蛋白-β(faβ)注射到脑中来诱导ad小鼠模型。术后2周，通过y型迷宫试验验证是否建立ad小鼠模型。在将动物随机分组后，以剂量依赖性方式每周三次静脉注射施用icp-parkin，共持续4周。在第3、4、5和6周，通过y型迷宫试验，证实icp-mparkin给药是否改善认知功能(图42a)。当对ad模型施用icp-parkin时，认知功能以时间和剂量依赖性方式改善。此外，当在施用icp-mparkin第6周时，在50mg/kg的icp-mparkin下认知功能提高了105％(图42b)。[0268]动物。该研究在年龄匹配的c57bl/6雄性小鼠(7-8周龄)中进行，小鼠获自daehan bio link(eumseong-gum，韩国)。在严格控制温度(设定点23±2℃)、相对空气湿度(设定点50％)和光照条件(8：00-20：00，开/关灯)的研究所动物室中，以每组5只动物进行饲养。在整个研究中随意提供自来水和标准实验室食物。[0269]原纤维淀粉样蛋白-β(faβ)诱导的ad小鼠模型。将c57bl/6雄性小鼠用7∶3的alfaxan：rompun混合物麻醉，置于立体定位仪上，并通过立体定位手术将4μg的faβ(rpeptide，a1170)注射到脑中，坐标如下(相对于前庭)：前-后(ap)＝-2mm，中-侧(ml)＝0mm，背-腹(dv)＝-3mm(自硬脑膜)，以平颅骨位置。对照小鼠仅注射0.01％抗坏血酸溶液。[0270]行为测试(y型迷宫)。通过y型迷宫试验(认知功能(自发交替)试验)验证建立的ad小鼠模型。y型迷宫装置(臂长：35cm，壁高：9cm)由三个等长的臂组成，臂由白色聚氯乙烯(pvc)制成，中间连接以形成“y”形。该行为学上相关的测试基于啮齿类动物的先天好奇心来探索新的区域，并且对小鼠没有呈现负性或正性增强和非常小的应激。在将小鼠标放入y形迷宫后立即启动视频记录系统。按下播放并记录每只小鼠8分钟的自发行为。一旦完成测试，轻轻地将鼠标放回其笼中，并将笼子放回架中。在每个测试之间用无香味的漂白杀菌擦拭物(70％etoh)彻底清洁迷宫。当小鼠在3个连续臂入口的每一个中进入迷宫的不同臂时，进行自发交替的测量。改变的百分比计算为实际改变次数与最大改变次数的比率。[0271](3)ad模型脑病理性aβ斑块消除[0272]在完成所有小鼠行为实验后，取出脑。甲酚紫染色显示，faβ诱导ad小鼠中脑海马中神经元减少，以及icp-mparkin具有神经保护作用。此外，免疫组织化学染色显示，icp-mparkin从海马清除aβ斑块(图43a)。斑点印迹分析显示，icp-mparkin使ad脑中的aβ斑块减少86％(图43b&c)。[0273]免疫组织化学。用alfaxan：rompun混合物深度麻醉小鼠，并用盐水和4％低聚甲醛(pfa；biosesanc)灌注15至20分钟。将脑用4％pfa在4℃快速固定2小时，用30％蔗糖(daejung)在4℃孵育48小时，用最佳切割温度(oct)化合物(leicabiosystems)进行包埋，并切割冷冻切片(20μm厚度)。通过将切片与配制于pbs的0.3％h2o2(daejung)孵育30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。在pbs中洗涤后，将切片与封闭溶液(配制于pbs中的5％正常山羊血清；vector laboratories，s-1000)孵育60分钟。将切片与小鼠单克隆6e10抗体(1∶250；biolegend，sig-39320)在4℃下孵育18小时，随后与生物素化的山羊抗小鼠免疫球蛋白g(igg；1∶200；vector laboratories，ba-9200)在室温下孵育1小时；随后使用abc试剂盒(vector laboratories，pk-6100)在室温下用抗生物素蛋白-生物素化过氧化物酶复合物处理切片60分钟。然后用作为色原的3，30-二氨基联苯胺(dab过氧化物酶底物试剂盒，vector laboratories)处理切片。使用配备有数字成像系统(dsr12，nikon)的显微镜观察和拍摄稳定安装的载玻片。将脑组织切片连接到载玻片上。用pbs洗涤脑切片2小时，以除去储存缓冲液并使其完全干燥。随后将载玻片在dw中水合5分钟，然后用0.1％乙酸甲苯酯紫(abcam，ab246817)染色5分钟。在dw的3次变化中冲洗切片，并置于70→80→90→100％乙醇中1分钟。使切片干燥，然后通过浸在二甲苯中来清除，然后加盖并用数字成像系统(dsr12，nikon)观察。[0274]斑点印迹分析。斑点印迹分析类似于western印迹分析和实验技术。如本文其他部分所述制备不溶性细胞级分。对于斑点印迹分析，用bio-dot微过滤装置(bio-rad)通过重力过滤将细胞裂解物(10μg蛋白质)结合至硝基纤维素膜。这种被动过滤对于定量抗原结合是必需的。[0275](4)icp-mparkin降低ht22细胞中由aβ引起的相对氧化应激(ros)水平[0276]在aβ(2.5μm)处理的ht22细胞中，使用icp-mparkin(10μm)处理后，在第3和第6小时，相对氧化应激(ros)水平降低104％和151％(图44)。[0277]相对氧化应激(ros)的测量。将ht22细胞(小鼠海马神经元细胞)加入到96孔板(1x104个细胞/孔)中。24小时后，用ros缓冲液进行洗涤。将25μmdcfda(细胞活性氧测定试剂盒，abcam，ab113851)在ros缓冲液中处理，并在每个孔中以100μl反应45min。然后，在用ros缓冲液洗涤后，将2.5μm的aβ和10μm的icp-mparkin稀释在ros缓冲液中并在孔中处理。孵育3、6小时后，使用激发和发射波长分别设为488和535的微板系统检测代表ros水平的dcfda荧光强度。[0278](5)parkin浓度和ad模型脑中icp-mparkin递送[0279]利用tsdt平台，存在于脑中的parkin的浓度比没有tsdt平台的情况高452％(图45a)。在ad模型中，与正常相比，icp-mparkin最大脑对脑递送多2.9％(图45b)。[0280]通过lc-ms/ms测量icp-mparkin。通过脑组织的lc-ms/ms分析(与envigo(huntingdon，uk)签约)检测来自icp-mparkin的sdb区的标志肽。简言之，使用两种不同的消化试剂盒smart digest(thermo fisher scientific)和proteinworks(waters)消化脑裂解物，并在具有乙腈梯度的ace ultracore super c18柱(advanced chromatography technologies)上分离肽，并在sciex api 6500+质谱仪(sciex)上分析。









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