解淀粉芽孢杆菌菌株A9及其应用

有机化合物处理,合成应用技术解淀粉芽孢杆菌菌株a9及其应用【技术领域】1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及解淀粉芽孢杆菌菌株a9及其应用。背景技术：2.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)亲缘性很高，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制细菌或真菌的代谢产物，但是目前对于该代谢产物的研究比较宽泛，并没有深入研究具体抑菌的是那种成分。3.虽然，目前有解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌活性物质的报道，但是经过研究发现，不同的解淀粉芽孢杆菌的发酵产物中抑菌物质的成分非常复杂，而且不同的成分对不同细菌有不同的抑菌效果；很难区分是哪种物质对相应的细菌具有相应的抑制作用；而且，也并非所有的解淀粉芽孢杆菌对所有细菌都具有抑菌作用。4.由于解淀粉芽孢杆菌的发酵产物含量较低，粗提的发酵产物往往很难发挥其抑菌的功效，为此，有必要对发酵产物进行进一步的深入研究，得出具体的抑菌物质，并对抑菌物质进行富集，获得更高效的抑菌成为，为后期应用于医疗、保健、食品加工等领域提供更高效的产品，对抑菌物质进行高效利用。技术实现要素：5.鉴于上述内容，有必要对解淀粉芽孢杆菌的发酵产物进行深入研究，研究抑菌机理，能对解淀粉芽孢杆菌的抑菌物质进行高效利用，发酵并富集获得具有高抑菌效果的抑菌物质。6.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：7.菌株bacillus amyloliquefaciens a9，所述菌株的保藏编号为gdmcc no.62173。8.本发明还包括所述的菌株bacillus amyloliquefaciens a9的次级代谢产物。9.本发明还包括具有抑菌活性的蛋白酶，所述蛋白酶由菌株bacillus amyloliquefaciens a9分泌获得，所述菌株a9的保藏编号为gdmcc no.62173。10.进一步的，所述蛋白酶为γ-谷氨酰转移酶；所述γ-谷氨酰转移酶抑制青霉生长。11.进一步的，所述蛋白酶为甘油磷酸二酯酶；所述甘油磷酸二酯酶抑制大肠杆菌生长。12.本发明还包括所述具有抑菌活性的蛋白酶在水果保鲜上的应用。13.进一步的，所述水果为橙子。14.本发明还包括制备所述具有抑菌活性的蛋白酶的方法，所述方法为：将菌株bacillus amyloliquefaciens a9在lb培养基培养上培养、离心、取上清液，进行冷冻干燥，然后经过甲醇抽提，经过蛋白分离柱superdextm7510/300gl进行分离纯化，回收1号峰和5号峰获得具有抑菌活性的蛋白酶。15.本发明具有如下有益效果：16.本发明在研究过程中发现解淀粉芽孢杆菌菌株虽然对细菌具有抑制作用，但是由于发酵产物复杂，很难区分并获得具体具有抑菌效果的蛋白质是什么，而课题组在研究菌株bacillus amyloliquefaciens a9的抑菌作用时，发现可利用蛋白分离柱superdextm7510/300gl进行蛋白分离后，在1号峰获得对青霉菌具有抑菌作用的γ-谷氨酰转移酶、在5号峰获得大肠杆菌对有良好的抑菌作用的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶；对该代谢产物进行进一步的应用研究，实验结果表明，1号峰获得的γ-谷氨酰转移酶在食品保鲜(抑制橙子青霉)方面有良好的抑菌效果。【附图说明】17.图1为本发明a9菌株在平皿上的形态图；18.图2为本发明a9菌株的系统发育树图；19.图3为蛋白分离柱superdextm7510/300gl对a9菌株代谢产物的分离结果图；20.图4为菌株a9对青霉菌的平板拮抗实验图；21.图5为菌株a9对青霉菌对峙结果进行显微拍摄图；22.图6为菌株a9次级代谢产物对青霉菌的抑制孔板实验结果图；23.图7为菌株a9的5号峰纯化产物对大肠杆菌的抑菌平板实验结果图；24.图8为菌株a9的1号峰纯化产物对青霉菌的抑菌平板实验结果图；25.图9为菌株a9对橙子青霉病菌的抑制结果图；26.图10解淀粉芽孢杆菌jy-863与本实验的菌株a9对青霉的抑制效果对比平板实验。【具体实施方式】27.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。28.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。29.实施例1：30.菌株bacillus amyloliquefaciens a9的筛选：31.解淀粉芽孢杆菌菌株bacillus amyloliquefaciens a9，其保藏编号为gdmcc no.62173保藏于：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年12月30日。32.上述菌株于2021年从广西南宁市场腐烂的沃柑中中分离出来。33.分离方法为：将沃柑表皮在无菌水中，悬浮后，取悬浮液100μl在含有选择性培养基的培养皿上铺展，培养皿在28℃下孵育长达1天，然后计算菌落形成单位。分别从所有组织样品中挑取每个细菌菌落并转移到生长培养基板上。经过敏锐的观察和传代培养，根据表型、形态、菌落颜色、大小纹理、不透明度、高度、边缘和表面对纯细菌进行分离。34.对分离的菌株进行形态学分类和分子生物学鉴定，具体如下：35.1、菌株的形态学分类36.菌株的形态学分类：37.如图1所示，菌株a9在lb培养基的察菌落形态特征表现为：呈淡黄色不透明菌落，表面光滑，有隆起，边缘规则。38.2、分子生物学鉴定39.对上述菌株进行测序、验证：采用通用引物对菌株的基因序列进行扩增，对纯化的pcr产物进行测序。使用mega 6.0生成a9和其他菌株序列的多序列比对，构建菌株的系统发育树图：结果如图2所示，菌株a9与芽孢杆菌bacillus sp.都具有99.7％的相似性，属于bacillus sp.属，经过形态鉴定，认为其外形更接近bacillus amyloliquefaciens种，因此，命名为bacillus amyloliquefaciens。40.实施例2：41.菌株a9次级代谢产物的分离：42.将解淀粉芽孢杆菌a9在lb培养基培养24h,离心上清液，冷冻干燥48h，1:50比例甲醇抽提，用蛋白分离柱子superdextm7510/300gl，分离纯化，得到的实验结果如图3所示；43.从左到右依次回收1-8个波峰的产物，每个峰回收500ul，冷冻干燥浓缩至100ul，取5ul进行青霉菌和大肠杆菌抑菌抑菌实验：44.一、代谢产物对青霉菌的抑菌实验：45.经平板对峙实验结果发现：8个波峰的产物仅有1号峰对青霉菌具有抑制效果，具体结果如图4-5所示：46.图4为菌株a9对青霉菌的平板对峙实验，图中a图为对照组；b图为实验组，图中可见，对照组的青霉菌菌丝占满了整个平皿，而接种了菌株a9的平皿，青霉菌菌丝明显减少，由此说明，菌株a9对青霉菌具有抑制作用。47.1号峰纯化产物对青霉菌的抑菌平板实验结果如图8所示，图中，图中左边为对照组，右边为实验组，可见，实验组有明显的抑菌圈，而对照组没有抑菌圈；实验组的抑菌圈的大小平均为12.5mm。48.对上述平板对峙的青霉菌进行显微拍摄，结果如图5所示，图中，左边为对照组，右边为实验组，可见图中的对照组的青霉菌菌丝生长强壮，而a9实验组表现出青霉菌菌丝生长受到，由此说明，菌株a9对青霉菌具有良好的抑制作用。49.将1号峰的次级代谢物物按照pda培养基体积的0(control组)、20％、40％、60％、80％、100％的添加量添加到pda软琼脂培养基中，然后将含有1号峰次级代谢物的pda培养基分装到24孔板中，每个浓度梯度设置4个孔板，之后，将青霉菌接种到含有上述不同浓度细胞提取物的平皿中孵育培养2d，2d后观察不同孔板上菌丝的生长情况。50.结果如图6所示，从图中可见，当a9的代谢产物添加量达到20％时，开始对青霉菌起到抑制作用：当达到40％浓度时，a9的代谢产物完全抑制了菌丝体的生长。51.二、代谢产物对大肠杆菌的抑菌实验：52.经平板抑菌圈实验结果发现：8个波峰的产物仅有5号峰对大肠杆菌具有抑制效果，具体方法如下：53.①大肠杆菌指示平板的制备：54.在lb固体培养基平皿上对称摆放2个牛津杯，将大肠杆菌与已融化冷却至60℃的lb琼脂培养基按1:100比例混匀取1ml倒入上述lb固体培养基上表面，涂布均匀后冷却凝固后，用无菌镊子将牛津杯剔除得到带孔的培养基；55.②上样：56.实验组：移取5号峰的回收产物添加到步骤①指示平板的牛津杯孔内。57.对照组：取等量的lb培养基添加到步骤①指示平板的牛津杯孔内。58.③培养：59.上样完成后，将大肠杆菌指示平板在37℃条件下培养24h。60.④实验结果处理：61.培养结束后，对平板进行拍照观察，平板指示结果如图7所示，图中左边为对照组，右边为实验组，可见，实验组有明显的透明抑菌圈，而对照组没有抑菌圈；实验组的抑菌圈的大小平均为13.17mm。62.实施例3：63.从实施例2可见，1号峰对对青霉有抑制效果、5号峰对大肠杆菌有抑制效果；因此，对1号峰和5号峰的回收产物进行进一步分析，具体如下：64.对1号峰和5号峰进行质谱分析使用thermo公司的q exactive plus液质联用系统进行。样品通过纳升流速的液相ultimate 3000rslcnano系统进行分离。肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至c18捕获柱(3μm,100μm×20mm)，接着被洗脱至分析柱(2μm,75μm×150mm)进行分离。利用两个流动相(流动相a:3％dmso、0.1％formic acid、97％h2o和流动相b:3％dmso,0.1％formic acid,97％acn)建立分析梯度。液相的流速设置为300nl/min。质谱dda模式分析时，每个扫描循环中包含一个ms全扫描(r＝70k,agc＝3e6,max it＝20ms,scan range＝350–1800m/z)，以及随后的15个ms/ms扫描(r＝17.5k,agc＝2e5,max it＝100ms)。hcd碰撞能量设置为28。四级杆的筛选窗口设置为1.6da。离子重复采集的动态排除时间设置为35s。65.通过对1号峰和5号峰肽段打断后进行测序发现：1号峰与γ-谷氨酰转移酶有高度同源性；5号峰与甘油磷酸二酯酶有高度同源性。具体如下：66.表1 1号峰蛋白的测序结果67.n端descriptionconfsequence1gamma-glutamyltransferase99.00000095dgmvatahplasqigadvlk1gamma-glutamyltransferase99.00000095engtftgvadssr1gamma-glutamyltransferase99.00000095gfpidsvladaisdykdk1gamma-glutamyltransferase99.00000095gllnpdyinar1gamma-glutamyltransferase99.00000095ngaaigvnlk1gamma-glutamyltransferase99.00000095tapppssggvfllqmlnllddfk1gamma-glutamyltransferase99.00000095tiidsrera1gamma-glutamyltransferase99.00000095afagdpefvniplkgllnpdyinar68.表2 5号峰蛋白的测序结果69.n端descriptionconfsequence2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095alnaqnvr2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095apetypgmeek2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095dhtlaeiqk2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095hanyyietk2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095llnwgvtgvftnyadifqk2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095lpavqlleaeqmtsmtdadltdik2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095mkadyieldlqmtk2glycerophosphodiesterphosphodiesterase98.8499999vptlddvlk2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095adyieldlqmtk2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095lpavqlleaeqmtsmtdadltdik2glycerophosphodiesterphosphodiesterase99.00000095lpavqlleaeqmtsmtdadltdik70.实施例4：71.菌株a9对橙子的抑制作用，具体如下：72.对橙子青霉的抑制实验：73.用接种针挑取青霉菌菌丝接种在橙子的表皮，共接种橙子6个，其中3个为实验组，3个为对照组，对照组和实验组分别进行如下处理：74.实验组：向橙子表皮喷洒含有a9菌株1号峰的混悬液，每隔72h重复滴施一次，滴施量为10ul，混悬液的有效成分质量百分数的含量为0.3％。75.对照组：向橙子表皮滴施蒸馏水，每隔72h重复滴施一次，滴施量为10ul。76.在室温条件下培养上述橙子，15d后观察橙子表皮霉菌菌斑的生长情况。77.实验结果如图9所示，从图中可见，左边为对照组的橙子，右边为实验组的橙子，明显可见对照组的菌斑大小明显大于实验组，由此说明，本技术的菌株a9的1号峰回收产物(γ-谷氨酰转移酶)对橙子的青霉病有明显的抑制作用。78.实施例5：79.芽孢杆菌对青霉的抑制作用，具体如下：80.对青霉的抑制实验：81.实验组：将106浓度的芽孢杆菌培养液，用0.22um过滤，芽孢杆菌次级代谢物按照100ul，加入到含有挖孔的青霉pda软琼脂培养基孵育培养2d，2d后观察菌丝的生长情况。82.阴性对照组：100ul蒸馏水加入到含有挖孔的青霉pda软琼脂培养基孵育培养2d，2d后观察菌丝的生长情况。83.阳性对照组：100ula9次级代谢产物或者100ul106菌液加入到含有挖孔的青霉pda软琼脂培养基孵育培养2d，2d后观察菌丝的生长情况。84.实验结果如图10所示，从图中可见，右边为解淀粉芽孢杆菌ty-863滤液对照组，中间为a9菌液实验组，左边为a9滤液实验组，明显可见实验组的透明圈，对照组无透明圈，由此说明，并非所有的解淀粉芽孢杆菌都一定对青霉有抑制作用，而本技术的菌株a9的对橙子的青霉病有明显的抑制作用。85.综上所述，本发明的解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciensa9菌株及其代谢产物对青霉菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用，同时对橙子的青霉病具有防护作用，经过对代谢产物的分析发现，菌株a9的代谢产物：γ-谷氨酰转移酶对青霉有良好的抑制作用；甘油磷酸二酯磷酸二酯酶对大肠杆菌具有抑制作用，由此可见，本技术的菌株可广泛应用于：植物防护、食物保鲜等各个领域，应用广泛，是一株适合植物防护、食品保鲜的优良菌株。86.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。









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