一种3-苯基戊二酸衍生物小分子在制备防治缺血再灌注导致的慢性肾脏病药物中的应用的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种3-苯基戊二酸衍生物小分子在制备防治缺血再灌注导致的慢性肾脏病药物中的应用。背景技术：2.肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，iri)是由于肾脏血液供给不足随后恢复血液灌注后，肾脏功能无法恢复正常，甚至加重其功能障碍及结构损伤的病理现象。临床上，肾脏iri常发生于肾移植、休克后微循环再通、以及心脏手术术后，是造成急性肾损伤的主要原因之一，致死率占住院患者的20％，且存活的病人中也有19％-31％最终演变为慢性肾脏病(chronic kidney disease，ckd)甚至终末期肾脏病(end-stage renal disease，esrd)，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，肾脏iri导致的ckd转变已经成为重要的公共健康问题，但临床上尚无理想措施来抑制肾脏缺血再灌注损伤向ckd进展。3.肾脏缺血再灌注损伤病理生理学机制复杂，已报道与自由基损伤、炎症作用、微循环障碍及间质纤维化等有关。iri导致肾小管上皮细胞钙超载，活性氧增多，导致肾小管上皮细胞受损，启动细胞死亡程序(如凋亡、焦亡，坏死等)激活。此外，受损伤的肾小管上皮细胞炎症因子释放增加，导致肾纤维化。4.3-苯基戊二酸衍生物小分子84-b10，化学名为：5.5-[2-(4-methoxyphenoxy)-5-(trifluoromethyl)anilino]-5-oxo-3-phenylpentanoicacid，分子式为c25h22f3no5，cas号为698346-43-9，是一种结构新颖的活性小分子，其作用及机制尚无报道，更无其在缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病药物中的研究。技术实现要素：[0006]本发明提供了一种3-苯基戊二酸衍生物小分子在制备防治缺血再灌注导致的慢性肾脏病药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。[0007]为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：[0008]一种3-苯基戊二酸衍生物小分子在制备防治缺血再灌注导致的慢性肾脏病药物中的应用，其特征在于，所述小分子84-b10能够减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病的肾脏病理改变，降低其肾组织纤维化相关指标的蛋白及mrna水平，从而起到改善慢性肾脏病的作用。[0009]本发明为缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病提供一种新的候选化合物；具体为将84-b10制成慢性肾脏病药物的组合物；所述84-b10的化学名为：[0010]5-[2-(4-methoxyphenoxy)-5-(trifluoromethyl)anilino]-5-oxo-3-phenylpentanoicacid，分子式为c25h22f3no5，cas号为698346-43-9，化学结构为：[0011][0012]与现有技术相比，本发明的优点在于：[0013]本发明提出了将3-苯基戊二酸衍生物类小分子84-b10在制备防治缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病药物中的应用，能够减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病的肾脏病理改变，降低其肾组织纤维化相关指标的蛋白及mrna水平，从而起到改善慢性肾脏病的作用，具有良好的开发应用前景。附图说明[0014]图1为显示治疗剂量的84-b10对假手术(sham)及uir模型小鼠心、肝、肾无毒副作用的示意图。[0015]图2为显示在小鼠uir模型中，马松染色表明低剂量(ld，2.5mg/kg/d)与高剂量(hd，2.5mg/kg/d)的84-b10治疗均可显著减轻肾脏病理的损伤程度，改善肾间质纤维化的示意图。[0016]图3为显示在小鼠uir模型中，低剂量(ld，2.5mg/kg/d)与高剂量(hd，5mg/kg/d)的84-b10治疗均可显著降低肾脏组织中纤维化指标的蛋白水平的示意图。[0017]图4为显示在小鼠uir模型中，低剂量(ld，2.5mg/kg/d)与高剂量(hd，5mg/kg/d)的84-b10治疗均可显著降低肾脏组织中纤维化指标的mrna水平的示意图。具体实施方式[0018]下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。[0019]本实施例中涉及的技术方案介绍如下：[0020](1)小鼠饲养、单侧肾脏缺血再灌注(unilateral renal ischemia-reperfusion，uir)模型建立与药物干预[0021]本实施例使用的c57bl/6雄性小鼠(购买时7周龄，体重20-23g)购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，饲养于南京医科大学实验动物中心spf级屏障环境中，每笼5只小鼠，进食标准鼠粮，自由饮水，恒温恒湿控制室，维持12：12h光暗节律，适应性饲养1周后进行实验。[0022]急性肾损伤(aki)是慢性肾脏病(ckd)发生和发展的一个重要因素，而uir诱导肾脏急性缺血-再灌注性损伤，当损伤无法修复，aki会向ckd转变，是常用的aki-ckd过渡模型。将小鼠适应性饲养1周后随机分为sham组，uir组，低剂量治疗组uir+ld和高剂量治疗组uir+hd，每组小鼠数量为8-10只。[0023]小鼠置于37℃恒温台，以上述同样方法麻醉并打开腹腔，使用无损伤微型动脉夹迅速阻断左侧肾蒂，肾脏由红色变紫黑色表示夹闭成功，共持续夹闭45min，松开动脉夹，肾脏由紫黑色变红色，假手术(sham)组小鼠打开腹腔并找到肾蒂，但不夹闭肾蒂，随后逐层关闭腹腔。[0024]化合物84-b10给药时采用的溶媒为10％dmso/生理盐水。uir+ld组小鼠84-b10的剂量为2.5mg/kg/d，uir+hd组小鼠84-b10的剂量为5mg/kg/d，给药方式为腹腔注射。在uir手术后72h后开始每天定时给药1次，sham组和uir组注射给予同样体积的上述溶媒，小鼠于uir造模21天后处死。取下腔静脉血进行血清生化分析；并取适量肾脏组织分别进行masson染色、western blot分析及实时荧光定量pcr分析。[0025](2)小鼠血清生化分析[0026]取下腔静脉取血，15000rpm×15min离心分离血清，采用血清生化分析仪对血清样本中肾功能标志物尿素氮(bloodurea nitrogen，bun)、血肌酐(serum creatinine，scr)，肝功能标志物谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，alt)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，ast)，和心功能标志物乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)、肌酸激脢(creatine kinase-muscle/brain，ck-mb)的浓度进行检测。[0027](3)masson染色[0028]参照masson三色染色液试剂盒(servicebio公司)说明书操作，步骤如下：[0029]石蜡切片脱蜡至水；切片浸入a液中浸泡过夜；于65℃烤箱中加热30min，同时将d液和f液放于65℃烤箱内预热；自来水洗1min；b液和c液等量混合，浸染切片1min，流水稍洗；1％盐酸酒精分化30s；流水稍洗，d液浸染8min；将多余水分沥干，e液浸染1min；不水洗，沥干多余e液，直接加入f液染色30s；1％冰醋酸分化3次，每次约8s；无水乙醇、二甲苯脱水透明；中性树脂封片，风干过夜。[0030](4)免疫印迹(westernblot)[0031]蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)提取细胞和组织蛋白，用bca试剂盒测定蛋白浓度，将吸取的上清按比例加入5×上样缓冲液，混匀后100℃金属浴煮沸10min。采用雅酶page凝胶快速制备试剂盒制备10％聚丙烯酰胺凝胶，每个样本上样量为30或50μg。恒压100v，电泳1.5h至溴酚蓝指示剂至分离胶底部，恒流300ma湿转1.5h至pvdf膜上。pvdf膜于5％脱脂奶粉/tbst中室温封闭1h后孵育一抗(4℃摇床过夜)，一抗alpha smooth muscle actin(α-sma)(proteintech，货号14395-1-ap)，vimentin(abcam，货号ab92547)，fibronectin1(fn1)(abcam，货号ab2413)，gapdh(proteintech，货号60004-1-ig)均1：1000稀释于tbst中；再孵育二抗(室温摇床孵育1h)，二抗购自碧云天生物技术有限公司，1：2000稀释于tbst中。孵育完成后，滴加ecl化学发光液并置于凝胶成像系统显影，采用chemidoc xrs+对显影所得条带进行灰度值定量。[0032](5)实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，rt-pcr)[0033]加入trizol提取细胞和组织总rna，用分光光度法测rna浓度，取质量1μg的rna即刻逆转录成cdna。采用罗氏sybr green pcr方法，在罗氏lightcycler96实时荧光定量pcr仪中进行扩增，反应体系为10μl，见表1。[0034]表1：real-time pcr反应体系[0035][0036]pcr反应程序：预变性95℃10min，随后95℃15s和60℃1min循环40次。[0037](6)统计分析：[0038]使用均值±sem表示数据。多组间比较用方差分析(an0va)，两组间数据比较用t检验。p《0.05为具有统计学意义；相对于sham组，p《0.05标记为*；p《0.01标记为**；p《0.001标记为***；相对于uir组，p《0.05标记为#；p《0.01标记为##；p《0.001标记为###。[0039]下面结合具体实施例详细阐述本发明：[0040]实施例1[0041]治疗剂量的84-b10对sham及uir小鼠心、肝、肾无毒副作用：[0042]小鼠随机分为假手术(sham)组、单侧肾脏缺血再灌注(uir)组、低剂量84-b10给药组(uir+ld)及高剂量84-b10给药组(uir+hd组)，其中uuo+ld组小鼠84-b10的给药剂量为2.5mg/kg/d，uuo+hd组小鼠84-b10的给药剂量为5mg/kg/d，给药方式为腹腔注射。在uir手术后72h给药，之后每天定时给药1次，sham组和uir组注射给予同样体积的溶媒，小鼠于uir造模3周后处死并收集各组别的小鼠全血样本于edta抗凝管中，室温离心机4000rpm，15min，移取血清样本，测定肾功能标志物bun、scr，肝功能标志物alt、ast，和心功能标志物ldh、ck-mb水平。[0043]实验结果：[0044]sham组、uir组和低剂量84-b10给药组(uir+ld)及高剂量84-b10给药组(uir+hd组)小鼠的肾功能标志物bun(图1a)和scr(图1b)、肝功能标志物alt(图1c)和ast(图1d)、心功能标志物ldh(图1e)和ck-mb(图1f)水平无明显差异，说明上述剂量的84-b10给药对小鼠的肾脏、肝脏和心脏均无毒副作用。[0045]实施例2[0046]治疗剂量的84-b10可延缓uir小鼠模型急性肾损伤向慢性肾脏病的转变：[0047]sham组、uir组和低剂量84-b10给药组(uir+ld)及高剂量84-b10给药组(uir+hd组)小鼠同实施例1造模与给药方法，末次给药结束后处死小鼠，取sham组左侧肾组织，以及uir组和给药组患侧肾组织，4％多聚甲醛1ml室温固定组织24h，石蜡包埋、切片，进行masson染色。[0048]实验结果：[0049]uir诱导肾脏急性缺血-再灌注性损伤，当损伤无法修复，急性肾损伤会向慢性肾脏病转变，表现为肾脏大面积的纤维化。因此，我们使masson染色评估各组肾脏纤维化程度。结果显示，uir组小鼠在损伤后21天出现明显的病理损伤‑‑‑肾间质纤维化(胶原沉积，被染为蓝色)，给药组(uir+ld及uir+hd组)小鼠肾间质纤维化明显减轻(图2a)。定量结果显示，84-b10给药可剂量依赖性地减少缺血再灌注引起的肾组织纤维化面积，其差异有统计学意义(图2b)。[0050]实施例3[0051]治疗剂量的84-b10可显著降低uir小鼠肾脏组织中纤维化指标的蛋白水平：[0052]sham组、uir组和低剂量84-b10给药组(uir+ld)及高剂量84-b10给药组(uir+hd组)小鼠同实施例2造模与给药方法，末次给药结束后处死小鼠，取sham组左侧肾组织，以及uir组和给药组患侧肾组织，各组分别取适量肾组织，采用western blot法检测各组纤维化指标α-sma、vimentin、fn1的蛋白表达水平。[0053]实验结果：[0054]与sham组相比，uir小鼠的肾组织中，α-sma、vimentin、fn1的蛋白表达均明显升高，其差异有统计学意义，表明纤维化程度较重，而低剂量与高剂量84-b10均可降低减少缺血再灌注引起的纤维化相关指标的高表达，其蛋白灰度值差异均有统计学意义(图3a-b)。[0055]实施例4[0056]治疗剂量的84-b10可显著降低uir小鼠肾脏组织中纤维化指标的mrna水平：[0057]sham组、uir组和低剂量84-b10给药组(uir+ld)及高剂量84-b10给药组(uir+hd组)小鼠同实施例2造模与给药方法，末次给药结束后处死小鼠，取sham组左侧肾组织，以及uir组和给药组患侧肾组织，各组分别取适量肾组织，采用rt-pcr法检测各组纤维化指标α-sma、vimentin、fn1、collagen iii的mrna水平。[0058]实验结果：[0059]与实施例3结果相符，uir小鼠的肾组织中纤维化指标α-sma、vimentin、fn1、collagen iii的mrna水平较sham组明显升高，其差异有统计学意义，而低剂量与高剂量84-b10均可显著降低减少缺血再灌注引起的各纤维化指标的高表达，其差异有统计学意义(图4a-d)。[0060]综上，所有实施例共同说明了，治疗剂量(2.5mg/kg/d，5mg/kg/d)的84-b10对假手术小鼠及缺血再灌注模型小鼠均无明显毒性，且可减轻缺血再灌注后期小鼠肾脏的肾小管间质纤维化，延缓缺血再灌注小鼠肾脏损伤向慢性肾脏病的转变。[0061]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明新型精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。









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