一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法与流程

测量装置的制造及其应用技术一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法技术领域1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法。背景技术：2.α-酮戊二酸(α-kg，α-ketoglutaric acid，2-oxoglutaric acid)，cas号328-50-7，是戊二酸的一种氧化物，即戊二酸α位的酮基化衍生物。它也是一种存在于生物体内的代谢物——是三羧酸(tca)循环中的中间产物，是谷氨酸脱氨基的酮酸产物，也是最重要的氮素运载体之一，因此，α-kg在脂质合成、氧化应激、蛋白质修饰和细胞死亡等生理过程中具有十分重要的调控作用。3.2-羟基戊二酸(2hg，2-hydroxyglutaric acid，α-hydroxyglutaric acid)，cas号2889-31-8，由戊二酸在α位羟基化而来，也是α-kg的还原产物。由于2-羟基戊二酸的α位的碳上连有四个不同的基团，这使得它是一个手性(即旋光性)分子，从而具有两种手性异构体(即光学异构体)——l-2hg(或s-2hg或[-]-2hg，cas号13095-48-2)和d-2hg(或r-2hg或[+]-2hg，cas号13095-47-1)。由于生物体内的蛋白质(包括酶)大部分都是具有手性特征的，即拥有不同的三维空间构型，所以l-2hg和d-2hg在生物体内的代谢途径和作用是十分不同的。例如l-2hg被认为是由l-苹果酸脱氢酶(mdh)或在缺氧条件下被乳酸脱氢酶a(ldh-a)由α-kg转化形成，并可被l-2-羟基戊二酸脱氢酶(l2hgdh)转化为α-kg；而d-2hg是由醇酸-酮酸转氢酶(hydroxyacid oxoacid transhydrogenase，hot)由α-kg转化而成，并可由d-2-羟基戊二酸脱氢酶(d2hgdh)转化为α-kg。可见它们具有不一样的代谢通路和生物学意义。[0004]常规的检测手段很难区分手性异构体，因为手性异构体在绝大多数的物理和化学性质上都极度相似。但l-2hg和d-2hg的具体含量和比例对一些疾病的诊断具有重要影响，如胶质瘤(在l-2-羟基戊二酸尿症中连续出现明显的高级胶质瘤)和急性髓系白血病(r-2-羟基戊二酸足以促进白血病发生，其作用是可逆的)。因此，一种有效的、可以分别鉴定l-2hg、d-2hg和α-kg的检测方法是十分必需的。技术实现要素：[0005]本发明主要解决的技术问题是如何同时检测α-酮戊二酸、d-2-羟基戊二酸和l-2-羟基戊二酸的含量。[0006]一种实施例中提供一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法，包括：[0007]样品预处理步骤，包括将待测样品与溶剂混合，提取处理，然后浓缩至干，然后加入含有n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯的溶液以及吡啶，衍生反应后，固液分离，取第一上清液，加入水，再次混匀，固液分离，获得第二上清液；[0008]液相色谱-串联质谱检测步骤，包括采用液相色谱-串联质谱检测所述第二上清液，获得检测结果；2hg和d-2hg的检测手段，以期实现对这三种物质的准确定性和精确定量的检测。[0028]基于上述目的，在一实施例中，本发明通过对样品进行手性衍生处理后，在hplc-ms/ms(超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪)平台上，运用mrm检测方法，实现了对该三种物质的快速和精确的测定。[0029]在一实施例中，从最开始的样品预处理到最后获得检测结果，所需时间大约在3h以内。[0030]在一实施例中，提供一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法，包括：[0031]样品预处理步骤，包括将待测样品与溶剂混合，提取处理，然后浓缩至干，然后加入含有n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯的溶液以及吡啶，衍生反应后，固液分离，取第一上清液，加入水，再次混匀，固液分离，获得第二上清液；[0032]液相色谱-串联质谱检测步骤，包括采用液相色谱-串联质谱检测第二上清液，获得检测结果；[0033]计算步骤，根据检测结果，计算得到待测样品中α-酮戊二酸、d-2-羟基戊二酸、l-2-羟基戊二酸的含量；[0034]液相色谱-串联质谱检测步骤中，液相色谱的检测条件中，流动相有流动相a和流动相b组成，流动相a、b选自如下组合中的任意一种：[0035]1)流动相a为含有乙酸铵的水溶液(亦称乙酸铵水溶液)，流动相b为含有乙酸铵的甲醇溶液(亦称乙酸铵甲醇溶液)；[0036]2)流动相a为含有甲酸铵的水溶液(亦称甲酸铵水溶液)，流动相b为含有甲酸铵的甲醇溶液(亦称甲酸铵甲醇溶液)。[0037]在一实施例中，含有乙酸铵的水溶液中，乙酸铵的浓度为5～10mmol/l。[0038]在一实施例中，含有乙酸铵的甲醇溶液中，乙酸铵的浓度为5～10mmol/l。[0039]在一实施例中，含有甲酸铵的水溶液中，甲酸铵的浓度为5～10mmol/l。[0040]在一实施例中，含有甲酸铵的甲醇溶液中，甲酸铵的浓度为5～10mmol/l。[0041]在一实施例中，液相色谱的洗脱程序如下：[0042]时间(min)a(％(v/v))b(％(v/v))080200.580206554573070830708.18020108020[0043]在一实施例中，液相色谱为高效液相色谱。[0044]在一实施例中，液相色谱的检测条件中，色谱柱为c18色谱柱。[0045]在一实施例中，液相色谱的检测条件中，c18色谱柱为waters acquity uplc beh c18色谱柱，规格为100mm*2.1mm,1.7μm粒径。[0046]在一实施例中，液相色谱的检测条件中，色谱柱温度为30～50℃，优选为38～42℃，更优选为40℃。[0047]在一实施例中，液相色谱-串联质谱检测步骤中，还包括如下a)至j)中的至少一项：[0048]a)串联质谱为三重四级杆质谱；[0049]b)串联质谱的检测条件中，离子源为电喷雾离子源；[0050]c)串联质谱的检测条件中，电离模式为负离子模式；[0051]d)串联质谱的检测条件中，扫描方式为多反应监测(mrm)或选择反应监测(sim)；[0052]e)串联质谱的检测条件中，雾化帘气压为30～40psi；[0053]f)串联质谱的检测条件中，离子化电压为-3500～-4500v；[0054]g)串联质谱的检测条件中，雾化温度为400～600℃；[0055]h)串联质谱的检测条件中，辅助气压为40～60psi；[0056]i)串联质谱的检测条件中，引入电压(ep)为-5～-10v；[0057]j)串联质谱的检测条件中，碰撞池出口电压(cxp)为-5～-10v。[0058]在一实施例中，液相色谱-串联质谱检测步骤中，串联质谱的检测条件中，检测参数如下：[0059][0060]在一实施例中，样品预处理步骤中，溶剂包括但不限于甲醇水溶液。[0061]在一实施例中，样品预处理步骤中，甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为50～80％，优选为80％。[0062]在一实施例中，提取处理的方法包括超声提取。[0063]在一实施例中，浓缩至干的方法包括冷冻蒸干。[0064]在一实施例中，含有n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯的溶液中，n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯的浓度≥1mmol/l，优选为1.5mmol/l。[0065]在一实施例中，含有n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯的溶液中的溶剂包括但不限于乙腈。[0066]在一实施例中，含有n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯的溶液的体积与吡啶的体积之比为(15～50)：1，包括但不限于15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、30：1、40：1、50：1。[0067]在一实施例中，待测样品包括但不限于来源于人或动物体的血液、细胞、组织，优选为人的血液。[0068]在一实施例中，待测样品为来源于人或动物体的血清或血浆，具体是从血液中分离得到。[0069]实施例1[0070]本实施例的具体检测方法如下：[0071]1、样品的制备[0072]取有代表性的样品，本实施例具体为来自人的血液，制成待测样品。对于不同时间下抽取的同一人的血样，则合并处理。[0073]2、样品前处理[0074]d-2hg、l-2hg的衍生化反应原理如图5所示。取待测液体50μl，加入2ml离心管中，再加入500μl 80％甲醇水溶液(甲醇水溶液可以使样品中的蛋白变性，并破坏一些细胞的细胞膜，因此，甲醇水溶液是作为提取液，有效地将样品中的目标检测物提取到提取液中)，涡旋5min混匀，超声提取30min，放入冷冻蒸干仪浓缩至干(冷冻温度为4℃，时间为溶剂完全挥发为止，约10～60min)。加入245μl浓度为1.5mmol/l的n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯(cas：29739-88-6)-乙腈溶液，再加入5μl吡啶(吡啶的作用是催化衍生化反应)，涡旋混匀，衍生10min后，9500r/min 4℃离心10min，取75μl上清液，加入75μl一级水。涡旋混匀后离心10min，取100μl上清液到内衬管中，装入2ml lc进样瓶，供hplc-ms/ms测试。加标样品在加入2ml离心管中以后，首先加入适量的待测物质标准溶液(即含有α-kg、l-2hg、d-2hg的溶液)，之后处理方法同普通样品。[0075]3、液相条件[0076]液相柱：waters acquity uplc beh c18，规格为100mm*2.1mm，1.7μm粒径；[0077]柱温：40℃；样品盘温度：10℃；[0078]进样量：5μl。[0079]流动相及洗脱程序如表1所示。[0080]表1[0081]时间(min)5mm乙酸铵水溶液5mm乙酸铵甲醇溶液080％(v/v)20％(v/v)0.580％(v/v)20％(v/v)655％(v/v)45％(v/v)730％(v/v)70％(v/v)830％(v/v)70％(v/v)8.180％(v/v)20％(v/v)1080％(v/v)20％(v/v)[0082]4、质谱条件：[0083]离子源：电喷雾离子源(esi源)；[0084]电离模式：负离子模式；[0085]监测模式：多反应监测模式(mrm)；[0086]雾化帘气压(cur)：30psi；[0087]离子化电压(is)：-4500v；[0088]碰撞室强度(cad)：9；[0089]雾化温度(tem)：600℃；[0090]辅助气压1(gs1)：60.0psi；[0091]辅助气压2(gs2)：60.0psi；[0092]同时检测目标离子对以及内标离子对q1/q3，mrm监测参数包括：各离子对及其对应的驻留时间(time)、保留时间(rt)、去簇电压(dp)、引入电压(ep)、碰撞电压(ce)和碰撞池出口电压(cxp)，mrm监测参数如下；[0093]表2mrm监测参数[0094][0095]单位“mesc”即为毫秒。“volts”即为伏特，简写为“v”。[0096]测得样品中三种物质的峰面积以后，带入标准物质曲线，即可换算出样品中α-kg、l-2hg、d-2hg的精确含量。[0097]图1为基于实施例1的表1、表2的参数，获得的检测结果中，其中一个样品(sample9)的α-kg和2hg衍生物的lc-ms图；可见，l-2hg衍生物和d-2hg衍生物的谱图做到了分离，可分别进行精确定量。并且，α-kg的峰形良好，可以精确定量。基于实施例1的表1、表2的参数，共检测了50个样品，结果与图1类似，均能对α-kg、l-2hg、d-2hg分别进行精确定量。[0098]图2为α-kg的标准曲线图，图3为d-2hg衍生物的标准曲线图，图4为l-2hg衍生物的标准曲线图。[0099]我们尝试了一些其他的流动相及洗脱程序(质谱条件不变，mrm监测参数同表2)，如表3和表4所示。[0100]表3[0101]时间(min)水甲醇050％(v/v)50％(v/v)0.550％(v/v)50％(v/v)420％(v/v)80％(v/v)520％(v/v)80％(v/v)5.150％(v/v)50％(v/v)650％(v/v)50％(v/v)[0102]表4[0103][0104][0105]谱图分别如图7和图8所示，[0106]图7为使用表3所示流动相比例得到的其中一个样品(sample5)的α-kg和2hg衍生物的lc-ms图；可见，峰型很差，三个物质均无法进行定量分析。[0107]图8为使用表4所示流动相比例得到的其中一个样品(sample22)的α-kg和2hg衍生物的lc-ms图；可见，α-kg峰型较好，可对α-kg进行定量分析。但l-2hg和d-2hg的谱图没有分离，无法分别进行定量分析。[0108]基于表3、表4的参数，共检测了10个样品，结果与图7、8类似，均无法对l-2hg、d-2hg进行精确定量。[0109]实施例2[0110]本实施例的具体检测方法如下：[0111]1、样品的制备[0112]取有代表性的样品，本实施例具体为细胞，制成待测样品。[0113]2、样品前处理[0114]取待测细胞，称取50mg，加入1.5ml 96孔板中，再加入400μl 60％甲醇水溶液，涡旋10min混匀，超声提取40min，放入冷冻蒸干仪浓缩至干。加入190μl浓度为2mmol/l的n-对甲苯磺酰基-l-苯丙氨酰氯(cas：29739-88-6)-乙腈溶液，再加入10μl吡啶，涡旋混匀，衍生20min后，3000r/min离心20min，取60μl上清液，加入60μl一级水。涡旋混匀后离心10min，取100μl上清液到300μl 96孔板中，供hplc-ms/ms测试。加标样品在加入1.5ml96孔板中以后，首先加入适量的待测物质标准溶液(即含有α-kg、l-2hg、d-2hg的溶液)，之后处理方法同普通样品。[0115]3、液相条件[0116]液相柱：waters acquity uplc beh c18，规格为100mm*2.1mm,1.7μm粒径；[0117]柱温：30℃；样品盘温度：4℃；[0118]进样量：2μl。[0119]流动相及洗脱程序如表5所示。[0120]表5[0121]时间(min)10mm甲酸铵水溶液10mm甲酸铵甲醇溶液080％(v/v)20％(v/v)0.580％(v/v)20％(v/v)655％(v/v)45％(v/v)730％(v/v)70％(v/v)830％(v/v)70％(v/v)8.180％(v/v)20％(v/v)1080％(v/v)20％(v/v)[0122]4、质谱条件：[0123]离子源：电喷雾离子源(esi源)；[0124]电离模式：负离子模式；[0125]监测模式：多反应监测模式(mrm)；[0126]雾化帘气压(cur)：30psi；[0127]离子化电压(is)：-4500v；[0128]碰撞室强度(cad)：8；[0129]雾化温度(tem)：600℃；[0130]辅助气压1(gs1)：60.0psi；[0131]辅助气压2(gs2)：60.0psi。[0132]同时检测目标离子对以及内标离子对q1/q3，mrm监测参数包括：各离子对及其对应的驻留时间(time)、保留时间(rt)、去簇电压(dp)、引入电压(ep)、碰撞电压(ce)和碰撞池出口电压(cxp)，mrm监测参数如下。[0133]表6 mrm监测参数[0134][0135]单位“mesc”即为毫秒。“volts”即为伏特，简写为“v”。[0136]测得样品中三种物质的峰面积以后，带入标准物质曲线，即可换算出样品中α-kg、l-2hg、d-2hg的精确含量。[0137]图9为实施例2中，其中一个样品(sample74)的α-kg和2hg衍生物的lc-ms图。可见，l-2hg衍生物和d-2hg衍生物的谱图做到了分离，可分别进行精确定量。α-kg的峰形良好，也可以精确定量。[0138]基于实施例2的表5、表6的参数，共检测了30个样品，结果与图9类似，均能对α-kg、l-2hg、d-2hg分别进行精确定量。[0139]对比例1[0140]本实施例的具体检测方法如下：[0141]1、样品的制备[0142]取有代表性的样品，本对比例具体为血液，制成待测样品。[0143]2、样品前处理[0144]取待测液体50μl，加入2ml离心管中，再加入200μl 80％甲醇水溶液，涡旋5min混匀，超声提取30min，离心10min，取100μl上清液到内衬管中，装入2ml lc进样瓶，供hplc-ms/ms测试。加标样品在加入2ml离心管中以后，首先加入适量的待测物质标准溶液(即含有α-kg、l-2hg、d-2hg的溶液)，之后处理方法同普通样品。[0145]3、液相条件[0146]液相柱：waters acquity uplc beh c18，规格为100mm*2.1mm，1.7μm粒径；[0147]柱温：40℃；样品盘温度：10℃；[0148]进样量：5μl。[0149]流动相及洗脱程序如表7所示。[0150]表7[0151]时间(min)水甲醇050％(v/v)50％(v/v)0.550％(v/v)50％(v/v)420％(v/v)80％(v/v)520％(v/v)80％(v/v)5.150％(v/v)50％(v/v)650％(v/v)50％(v/v)[0152]4、质谱条件：[0153]离子源：电喷雾离子源(esi源)；[0154]电离模式：负离子模式；[0155]监测模式：多反应监测模式(mrm)；[0156]雾化帘气压(cur)：30psi；[0157]离子化电压(is)：-4500v；[0158]碰撞室强度(cad)：9；[0159]雾化温度(tem)：600℃；[0160]辅助气压1(gs1)：60.0psi；[0161]辅助气压2(gs2)：60.0psi。[0162]同时检测目标离子对以及内标离子对q1/q3，mrm监测参数包括：各离子对及其对应的驻留时间(time)、保留时间(rt)、去簇电压(dp)、引入电压(ep)、碰撞电压(ce)和碰撞池出口电压(cxp)，mrm监测参数如下；[0163]表8 mrm监测参数[0164][0165]单位“mesc”即为毫秒。“volts”即为伏特，简写为“v”。[0166]测得样品中物质的峰面积以后，带入标准物质曲线，只能换算出样品中l-2hg、d-2hg的总含量。[0167]图6为对比例1中，其中一个样品(sample15)中l-2hg和d-2hg的lc-ms图；可见，l-2hg和d-2hg在谱图上仅显示为同一个色谱峰，无法进行分离，定量时只能确定总含量，而无法确定每一个手性分子的含量。同时因为没有整合α-kg，无法对α-kg进行定量。[0168]基于对比例例1的表7、表8的参数，共检测了20个样品，结果与图6类似，均无法对α-kg、l-2hg、d-2hg分别进行精确定量。[0169]在一实施例中，本发明成功提供一种精确检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法，可同时检测三种化合物，对α-kg、l-2hg、d-2hg的相关医学疾病的研究有很高的价值和意义。[0170]以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。









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