肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)用于治疗目的的用途的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)用于治疗目的的用途1.本发明涉及肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)作为药物的用途。背景技术：2.生物活性肽激素实现作为信号分子的功能。大多数生物活性肽激素是由较大的无活性前体肽合成的。在它们的生物合成期间，这些肽经历了若干共翻译和翻译后修饰，包括信号肽的切割、特定内肽酶主要在碱性残基对处对前体肽原的内蛋白酶解切割、通过羧肽酶去除碱性残基、二硫键的形成以及n-糖基化和o-糖基化(eipper等人,1993.protein science 2(4):489–97)。超过一半的已知神经和内分泌肽需要额外的修饰步骤才能获得完整的生物活性，包括形成c末端α-酰胺基团(guembe等人,1999.j histochem cytochem 47(5):623–36)。肽激素生物合成的这个最后步骤涉及双功能酶肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)的作用。pam特异性识别其底物中的c末端甘氨酸残基，在两步酶促反应中从肽的c末端甘氨酸残基切割乙醛酸，导致形成c末端α-酰胺化肽激素，其中产生的α-酰胺基团起源于所切割的c末端甘氨酸(prigge等人,2004.science304(5672):864-67)。这种酰胺化反应在酰胺化产物胞吐之前发生在分泌颗粒的内腔中(martinez和treston 1996.molecular and cellular endocrinol 123:113-17)。α-酰胺化肽是例如肾上腺髓质素、p物质、加压素、神经肽y、胰淀素、降钙素、神经激肽a等。然而，之前已经证明pam也可以催化从非肽特性的甘氨酸化底物形成α-酰胺，例如n-脂肪酰基-甘氨酸，其通过pam转化为初级脂肪酸酰胺(pfam)如油酰胺。经鉴定和纯化的肽酰-甘氨酸酰胺化活性表明依赖于铜和抗坏血酸盐(emeson等人,1984.journal of neuroscience:2604–13；kumar等人,2016.j mol endocrinol 56(4):t63-76；wand等人,1985.neuroendocrinology41:482–89)。3.在人类中，pam基因位于染色体5q21.1，长度为160kb，含有25个已知外显子(gaier等人,2014.bmc endocrine disorders 14)。已知通过选择性剪接产生至少6种同工型(seq id 1-6)。发现pam酶在几乎所有哺乳动物细胞类型中均有不同水平的表达，其中在气道上皮、内皮细胞、脑室管膜细胞、成人心房、脑、肾、垂体、胃肠道和生殖组织中均有显著表达。(chen等人,2018.diabetes obes metab 20增刊2:64-76；oldham等人,1992.biochem biophys res commun 184(1):323–29；schafer等人,1992.j neurosci 12(1):222–34)。4.然而，在垂体、茎和下丘脑中描述了最高的人pam活性。15岁以下健康儿童的血浆酰胺化活性显著高于健康成人(wand等人,1985metabolism 34(11):1044–52)。5.由pam cdna编码的已知最大的pam同工型1(seq id no.1)的前体蛋白(1-973个氨基酸)绘示于图1中。n末端信号序列(氨基酸1-20)确保新生pam多肽进入内质网分泌腔的方向并且随后被共翻译切割。之后，pam-肽原由用于生物合成完整膜蛋白和分泌蛋白的相同机制加工，包括切割前区(氨基酸21-30)，确保正确折叠、二硫键形成、磷酸化和糖基化(bousquet-moore等人,2010.j neurosci res88(12):2535-45)。6.如图1中所绘示，pam cdna进一步编码两种不同的酶活性。第一种酶活性被命名为肽酰-甘氨酸α-羟基化单加氧酶(phm；ec1.14.17.3)，是一种能够催化c末端甘氨酸残基转化为α-羟基-甘氨酸的酶。第二种活性被命名为肽酰-α-羟基-甘氨酸α-酰胺化裂解酶(pal；ec 4.3.2.5)，它是一种能够催化α-羟基-甘氨酸转化为α-酰胺并随后释放乙醛酸的酶。这些单独的酶活性的顺序作用导致总体肽酰-甘氨酸α酰胺化活性。第一酶活性(phm)直接位于前区上游(在同工型1(seq id no.7)的氨基酸31-494内)。第二催化活性(pal)位于同工型1中外显子16之后的氨基酸495-817(seq id no.8)内。7.如图2中所绘示，两种活性可以在一个多肽内一起编码为膜结合蛋白(同工型1、2、5、6；对应于seq id no.1、2、5和6)以及在一个多肽内编码为缺乏跨膜结构域的可溶性蛋白(同工型3和4；对应于seq id no.3和4)。虽然在分泌囊泡与质膜融合后，同工型1、2、5和6保留在外质膜中，随后内吞作用和再循环或降解，但缺乏tmd(氨基酸864-887)的可溶性pam同工型(同工型3和4)与肽激素共同分泌(wand等人,1985 metabolism 34(11):1044–52)。此外，激素原转化酶可以通过在分泌途径期间连接pal与tmd的柔性区域(外显子25/26)内的切割将膜结合的pam蛋白转化为可溶性pam蛋白(bousquet-moore等人,2010.j neurosci res 88(12):2535-45)。phm亚基可以通过激素原转化酶从分泌途径内的可溶性或膜结合的pam上切割下来，所述转化酶处理外显子16区域中的双碱性氨基酸切割位点。此外，在内吞作用期间，全长pam蛋白也可以由于α分泌酶和γ分泌酶的作用而转化为可溶形式(bousquet-moore等人,2010.j neurosci res 88(12):2535-45)。来自晚期内体的膜结合pam可以进一步以外泌体囊泡的形式分泌。8.在若干人体组织和体液中测定了phm和pal活性以及全长pam的活性。然而，当允许在相同的隔室、体液或体外实验装置中进行单独的反应时，可溶形式的分离的phm和pal活性也会导致从c末端甘氨酸化底物形成c末端α酰胺化产物。迄今为止，尚未完全了解phm羟基化产物如何转移到pal。有证据表明，羟基化产物释放到溶液中并且不会直接从phm转移到pal(yin等人,2011.plos one6(12):e28679)。迄今为止尚不清楚循环中pam的来源。9.phm的部分反应绘示于图2中。phm是一种铜依赖性单加氧酶，负责在α-碳原子处对c末端甘氨酸进行立体特异性羟基化。在羟基化反应期间，抗坏血酸盐被认为是天然存在的还原剂，而新形成的羟基基团中的氧被证明来源于分子氧。pal的部分反应绘示于图2中。pal的催化作用涉及通过蛋白质骨架衍生的基底从phm形成的羟基-甘氨酸中提取质子，以及羟基基团氧对二价金属的亲核攻击，从而导致乙醛酸的裂解和c末端酰胺的形成。10.因此，术语“酰胺化活性”、“α-酰胺化活性”、“肽酰-甘氨酸α-酰胺化活性”或“pam活性”是指phm和pal的连续酶活性，导致从肽或非肽特性的甘氨酸化底物形成肽或非肽特性的α酰胺化产物，与本发明剪接变体或剪接变体混合物或翻译后修饰的pam酶或可溶性的分离的phm或pal活性或可溶性phm和膜结合pal或所有提到的形式的组合无关。换言之，术语“酰胺化活性”、“α-酰胺化活性”、“肽酰-甘氨酸α-酰胺化活性”或“pam活性”可以描述为位于人pam cdna编码的肽原中氨基酸31至817内的酶活性的顺序作用，与本发明剪接变体或其混合物无关。11.在健康样本或患有若干疾病的那些的若干人体组织和体液中分析了pam活性。过去所做的工作总结如下：12.人体体液中pam活性的检测主要涉及使用放射性标记的合成三肽，例如125i-d-tyrvalgly、125i-n-乙酰基-tyrvalgly或类似修饰的三肽，以及由于γ闪烁而对酰胺化产物进行量化(kapuscinski等人,1993.clinical endocrinology 39(1):51–58；wand等人,1985 metabolism 34(11):1044–52；tsukamoto等人,1995.internal medicine34(4):229–32；wand等人,1987neurology37:1057–61；wand等人,1985 neuroendocrinol 41:482–89)。此外，p物质-gly或截短形式的神经肽y-gly被用作pam活性测定的底物(gether等人,1991 mol cell endocrinol 79(1-3):53–63；等人,1990 pain 43:163–68；jeng等人,1990 analytical biochemistry 185(2):213–19)。13.wand等人(wand等人,1985 metabolism34(11):1044-52)最初证明了人体循环中α-酰胺化活性的存在。他们报告没有性别差异，但在某些疾病状态下pam活性存在一些差异：甲状腺功能减退成人以及甲状腺髓样癌患者中的血浆pam活性增加。pam在甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和胰岛肿瘤的组织中的活性显示升高，表明内分泌肿瘤组织中酰胺化肽的形成增加(gether等人, 1991 mol cell endocrinol 79 (1-3):53–63；wand等人,1985 neuroendocrinol 41: 482–89)。14.与健康对照受试者相比，患有多发性内分泌肿瘤1型(men-1)和恶性贫血的患者显示血浆pam活性降低(kapuscinski等人,1993. clin endocrinol 39(1):51–58)。15.wand及其同事证实了在人脑脊液(csf)中存在酰胺化活性(wand等人,1985 neuroendocrinol 41:482–89)。在患有阿尔茨海默病(ad)的患者中，与健康对照相比，血浆pam活性显示未发生改变，而与来自正常样本的活性相比，csf pam活性显著降低(wand等人,1987neurology 37:1057–61)。此外，在wo2015/103594中，提出与健康对照相比，通过质谱法检测到的ad患者的csf中pam蛋白的存在减少。此外，pam的酰胺化产物之一adm-nh2被证明在患有流行性和偶发性阿尔茨海默病的患者中减少(wo2019/154900)。然而，迄今为止，没有报告循环pam活性与ad的预测、诊断或进展有直接关联。16.使用1-12p物质-gly(sp-gly)作为底物分析了下背部疼痛患者的csf中的酰胺化活性(等人,1990 pain 43:163–68)。患有多发性硬化症(ms)的患者的pam活性显示在csf中增加，而在血清中则显著降低(tsukamoto等人,1995.internal medicine 34(4):229–32；wo2010/005387)。pam的血浆活性与2型糖尿病之间的关联在(wo2014/118634)中进行了描述。17.尽管关于人体体液和疾病或疾病进展中的pam活性进行了一些研究，但没有关于用免疫测定测量的人体体液中、特别是在循环中的pam浓度的信息。如实施例中所示，建立了用于确定受试者体液中pam水平(作为pam的总量或活性)的检测方法。通过这些测定，表明pam水平在许多疾病中以及在会发展疾病的患者中降低。此外，本技术的令人惊讶的发现是，重组pam酶的体内施用可以用于增加循环中的pam水平，这导致pam底物肾上腺髓质素-甘氨酸向成熟肾上腺髓质素-酰胺的转化增强。总之，pam可以在受试者中用作疗法。技术实现要素：18.本技术的主题是用作药物的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)。19.本技术的进一步主题是用作治疗受试者的药物的pam，其中所述治疗包括：20.(i)降低疾病或病症的可能性或风险，和/或21.(ii)减少疾病或病症的发生，和/或22.(iii)降低疾病或病症的严重程度。23.本技术的一个实施方式涉及用作治疗受试者的药物的pam，其中所述疾病或病症选自：痴呆、心血管病症、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病。24.本技术的另一个实施方式涉及用作治疗受试者的药物的pam，其中所述受试者的特征在于25.在所述受试者的体液样品中26.·pam和/或其同工型和/或其片段的水平低于阈值，和/或27.·肽-gly/肽-酰胺比率高于阈值。28.本技术的另一个具体实施方式涉及用作治疗受试者的药物的pam，其中所述肽选自：肾上腺髓质素(adm)、肾上腺髓质素-2、中叶素-短、肾上腺髓质素原n-20末端肽(pamp)、胰淀素、胃泌素释放肽、神经调节蛋白c、神经调节蛋白b、神经调节蛋白s、神经调节蛋白u、降钙素、降钙素基因相关肽(cgrp)1和2、胰岛淀粉样蛋白多肽、嗜铬粒蛋白a、胰岛素、胰抑素、催乳素释放肽(prrp)、胆囊收缩素、大胃泌素、胃泌素、胰高血糖素样肽1(glp-1)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pacap)、促胰液素、生长激素释放素、肽组氨酸蛋氨酸(phm)、血管活性肠肽(vip)、促性腺素释放素、亲吻素(kisspeptin)、mif-1、转移抑制素(metastin)、神经肽k、神经肽γ、p物质、神经激肽a、神经激肽b、肽yy、胰腺激素、新皮啡肽(deltorphin)i、食欲素a和b、促黑激素α(α-msh)、促黑激素γ、促甲状腺素释放激素(trh)、催产素、加压素。29.本技术的另一个实施方式涉及用作治疗受试者的药物的pam，其中所述受试者的特征在于30.在所述患者的体液中31.·adm-gly/bio-adm比率高于阈值，和/或32.·bio-adm浓度低于阈值。33.本技术的另一个优选实施方式涉及用作治疗受试者的药物的pam，其中pam和/或其同工型和/或其片段的水平是pam和/或其同工型和/或其具有至少12个氨基酸的片段的总浓度或者pam和/或其同工型和/或其片段的活性。34.本技术的一个实施方式涉及用作治疗受试者的药物的pam，其中pam和/或其同工型和/或其具有至少12个氨基酸的片段的总浓度或者pam和/或其同工型和/或其片段的活性选自：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8和seq id no.10。35.本技术的另一个实施方式涉及用作治疗受试者的药物的pam，其中所述受试者的体液样品选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。36.本技术的另一个具体实施方式涉及用作药物的pam，其中所述pam选自：分离的和/或重组的和/或嵌合的pam。37.本技术的一个实施方式涉及用作药物的pam，其中所述重组pam选自包括以下的序列：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8和seq id no.10。本技术的一个实施方式涉及在受试者中用作药物的pam，在所述受试者的体液样品中，pam和/或其同工型和/或其片段的水平低于阈值，和/或肽-gly/肽-酰胺比率高于阈值。38.本技术的一个优选实施方式涉及在受试者中用作药物的pam，所述受试者被鉴定为在所述受试者的体液样品中，pam和/或其同工型和/或其片段的水平低于阈值，和/或肽-gly/肽-酰胺比率高于阈值。39.本技术的一个实施方式涉及用作药物的pam，其中所述用途包括测试受试者，在所述受试者的体液样品中所述受试者是否具有低于阈值的pam和/或其同工型和/或其片段的水平，和/或高于阈值的肽-gly/肽-酰胺比率，并且如果所述受试者被鉴定为具有疾病或病症的风险，则提供pam治疗。40.本技术的一个实施方式涉及用作药物的pam，其中pam与抗坏血酸盐和/或铜组合。41.本技术的主题也是一种药物制剂，其包含肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)。42.本技术的一个实施方式涉及一种包含pam的药物制剂，其中所述药物制剂通过口服(例如吸入)、表皮、皮下、皮内、舌下、肌内、动脉内、静脉内或经由中枢神经系统(cns、大脑内、脑室内、鞘内)或经由腹膜内施用进行施用。43.本技术的一个优选实施方式涉及一种药物制剂，其中所述药物制剂为溶液，优选为即用型溶液。44.本技术的另一个实施方式涉及一种药物制剂，其中所述药物制剂为冻干状态。45.本技术的另一个实施方式涉及一种药物制剂，其中所述药物制剂是肌肉内施用的。46.本技术的另一个具体实施方式涉及一种药物制剂，其中所述药物制剂是血管内施用的。47.本技术的另一个优选实施方式涉及一种药物制剂，其中所述药物制剂是经由输注施用的。48.本技术的一个实施方式涉及一种药物制剂，其中所述药物制剂是全身施用的。49.本技术的另一个实施方式涉及一种药物制剂，所述制剂包含pam和/或任选地一种或多种药学上可接受的成分。50.本技术的另一个优选实施方式涉及一种药物制剂，所述制剂包含pam、抗坏血酸盐和/或铜。51.本技术的另一个实施方式涉及一种药物制剂，所述制剂包含pam与抗坏血酸盐和/或铜的组合。52.本技术的主题也是一种治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用pam，所述方法还包括53.i.降低疾病或病症的可能性或风险，和/或54.ii.减少疾病或病症的发生，和/或55.iii.降低疾病或病症的严重程度。56.本技术的一个实施方式涉及一种治疗受试者的方法，其中所述疾病或病症选自：痴呆、心血管疾病、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病。57.本技术的另一个实施方式涉及一种治疗受试者的方法，其中所述对象的特征在于58.在所述受试者的体液样品中59.·pam和/或其同工型和/或其片段的水平低于阈值，和/或60.·肽-gly/肽-酰胺比率高于阈值。61.本技术的另一个优选实施方式涉及一种治疗受试者的方法，其中pam和/或其同工型和/或其片段的水平是pam和/或其同工型和/或其具有至少12个氨基酸的片段的总浓度或者pam和/或其同工型和/或其片段的活性。62.本技术的一个实施方式涉及一种治疗受试者的方法，其中pam和/或其同工型和/no.21)、肽12(seq id no.22)、肽13(seq id no.23)、肽14(seq id no.24)和重组pam(seq id no.10)。71.本技术的一个优选实施方式涉及用作治疗受试者的药物的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)，其中测定受试者的体液样品中pam和/或其同工型或片段的活性的方法包括以下步骤：72.·使所述样品与特异性结合于活性全长pam、其同工型和/或其活性片段的捕获结合剂接触，73.·分离结合于所述捕获结合剂的pam74.·在所述分离的pam中添加pam的底物75.通过测量所述pam的底物的转化来量化pam活性。76.本技术的一个优选实施方式涉及用作治疗受试者的药物的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)，77.其中用于测定受试者的体液样品中pam和/或同工型和/或其片段的活性的方法包括以下步骤：78.·在t＝0min和t＝n+1min使所述样品与pam的底物(肽-gly)接触一段时间间隔79.·在t＝0min和t＝n+1min检测所述样品中pam的反应产物(α-酰胺化肽)，以及80.·通过计算t＝0和t＝n+1之间所述反应产物的差异来量化pam的活性。81.本技术的一个优选实施方式涉及用作治疗受试者的药物的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)，82.其中所述结合剂选自抗体、抗体片段或非ig支架。83.本技术的一个优选实施方式涉及用作治疗受试者的药物的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)，84.其中所述受试者的特征在于85.在所述受试者的体液中86.·pam和/或其同工型和/或其片段的水平低于阈值，和/或87.·肽-gly/肽-酰胺比率高于阈值。88.本技术的一个优选实施方式涉及用作治疗受试者的药物的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)，89.其中所述受试者的特征在于90.在所述患者的体液中91.·adm-gly/bio-adm比率高于阈值，和/或92.·bio-adm浓度低于阈值。93.所述阈值通过测量健康对照中的pam和/或其同工型和/或片段和/或其adm-nh2的水平并计算例如相应的25百分位数、更优选10百分位数、甚至更优选5百分位数来预先确定。如果患病受试者或有患上疾病或发生不良事件风险的受试者的水平低于阈值，则25百分位数、更优选10百分位数、甚至更优选5百分位数的下限限定了健康对比患病患者或健康对比有患上疾病的风险的受试者或没有发生不良事件风险的受试者对比有发生不良事件风险的受试者的阈值。pam和/或其同工型和/或其片段的水平可以被检测为总pam浓度和/或pam活性。关于所述百分位数，通过使用pam活性测定检测血浆中的pam活性来区分健康与患病患者或健康对比有患上疾病的风险的受试者或没有发生不良事件风险的受试者对比有发生不良事件风险的受试者的下限阈值可以介于15μg/(l*h)和8μg/(l*h)之间或更低，更优选介于13.5μg/(l*h)和8μg/(l*h)之间或更低，甚至更优选介于10.5μg/(l*h)和8μg/(l*h)之间或更低，最优选低于8μg/(l*h)；血清中的pam活性可以介于10μg/(l*h)和5μg/(l*h)之间或更低，更优选介于8μg/(l*h)和5μg/(l*h)之间或更低，最优选低于5μg/(l*h)。94.关于所述百分位数，通过检测adm-nh2来区分健康与患病患者或健康对比有患上疾病的风险的受试者或没有发生不良事件风险的受试者对比有发生不良事件风险的受试者的下限阈值等于或低于15pg/ml，优选等于或低于10pg/ml，优选等于或低于5pg/ml。95.通过测量健康对照中的adm-gly与adm-nh2的比率并计算例如相应的75百分位数、更优选90百分位数、甚至更优选95百分位数来预先确定阈值。如果所述患病受试者或有患上疾病或发生不良事件风险的受试者的水平高于阈值，则75百分位数、更优选90百分位数、甚至更优选95百分位数的上限限定了健康对比患病患者或健康对比有患上疾病的风险的受试者或没有发生不良事件风险的受试者对比有发生不良事件风险的受试者的阈值。关于所述百分位数，通过检测adm-gly与adm-nh2的比率来区分健康与患病患者或健康对比有患上疾病的风险的受试者或没有发生不良事件风险的受试者对比有发生不良事件风险的受试者的上限阈值，其中所述adm-gly/adm-nh2比率介于1和10之间、优选介于1.5和7.5之间、优选介于2和5之间的范围内，最优选阈值为2.5。96.取决于某些因素，例如性别、年龄、遗传、习惯、种族等，预定值可以在所选择的特定群体之间变化。97.本领域技术人员知道如何从进行的先前研究中确定阈值。本领域技术人员知道，特定阈值可能取决于用于计算预定阈值的群组，所述预定阈值可以稍后在例行程序中使用。本领域技术人员知道特定阈值可能取决于测定中使用的校准。本领域技术人员知道特定阈值可能取决于专业人员似乎可接受的灵敏度和/或特异度。98.诊断测试的灵敏度和特异度不仅取决于测试的分析“质量”，还取决于对什么构成异常结果的定义。在实践中，接受者操作特征曲线(roc曲线)通常是通过绘制变量值与其在“正常”(即表面上健康)和“疾病”人群(即患有感染的患者)中的相对频率的关系图来计算的。根据要解决的特定诊断问题，参考组不一定是“正常的”，而可能是患有另一种疾病的一组患者，应区分其与所关注的患病组。对于任何特定的标志物，患有疾病和未患疾病的受试者的标志物水平分布可能会重叠。在此类情况下，测试不能以100％的准确度绝对区分正常与疾病，并且重叠区域指示测试无法区分正常与疾病之处。选择一个阈值，高于该阈值(或低于该阈值，取决于标志物如何随疾病发生变化)则测试被认为是异常的，而低于该阈值则测试被认为是正常的。roc曲线下面积是对感知测量结果将允许正确识别疾病的概率的度量。即使测试结果不一定给出准确的数字，也可以使用roc曲线。只要可以对结果进行排序，就可以创建roc曲线。例如，“疾病”样品的测试结果可能会根据程度(例如，1＝低、2＝正常和3＝高)进行排序。此排序可以与“正常”人群中的结果相关联，并创建roc曲线。这些方法在本领域中是众所周知的(参见例如hartley等人,1982)。优选地，选择阈值以提供大于约0.5、更优选大于约0.7的roc曲线面积。上下文中的术语“约”是指给定测量结果的+/-5％。99.一旦通过使用先前的研究群组确定阈值并考虑所有上述要点，医学专业人员会使用预先确定的阈值来诊断或预测疾病和/或预测受试者患上疾病或发生不良事件的风险，并将确定所述受试者是否具有高于或低于所述预定阈值的值，以便进行适当的诊断、预后、预测或监测。100.上面提到的阈值在其他测定中可能不同，如果这些阈值的校准与本发明中使用的测定系统不同的话。因此，考虑到校准的差异，上述阈值应相应地适用于此类不同校准的测定。量化校准差异的一种可能性是通过使用这两种方法测量样品中的相应生物标志物或其活性(例如pam)，对所讨论的测定(例如pam测定)与本发明中使用的相应生物标志物测定进行方法比较分析(相关性)。鉴于该测试具有足够的分析灵敏度，另一种可能性是用所讨论的测定来确定代表性的正常人群的中值生物标志物水平，将结果与利用另一种测定的中值生物标志物水平进行比较，并根据通过这种比较获得的差异重新计算校准。通过本发明中使用的校准，测量了来自正常(健康)受试者的样品：中值血浆pam活性为18.4μg/(l*h)(四分位距[iqr]13.5–21.9μg/(l*h))，中值血清pam活性为11.0μg/(l*h)(四分位距[iqr]8.1–13.1μg/(l*h)。在来自正常(健康)受试者的样品中测量了adm-nh2：中值血浆bio-adm(成熟adm-nh2)为13.7pg/ml(四分位距[iqr]9.6–18.7pg/ml)(weber等人,2017.jalm,2(2):222-233)。[0101]本技术的一个优选实施方式涉及在受试者中用作疗法的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)，[0102]其中所述受试者是已被预测为具有增加的发展疾病或病症的风险的健康受试者。[0103]本技术的另一个优选实施方式涉及在受试者中用作疗法的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)，[0104]其中所述受试者是已被预测为具有增加的未来发展疾病或病症或不良事件的风险的健康受试者。[0105]本公开的术语“pam”是指分离的pam，包括其剪接变体、同工型和多态形式。还包括重组pam(recpam)和嵌合pam。在特定方面，所述pam是recpam。pam同工型1至6的氨基酸序列显示在seq id no.1至6中。在一些方面，本文公开的pam与seq id no.:l至6的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。[0106]本领域技术人员应当理解，如序列表中所示的pam同工型序列(seq id no.1至6)含有n末端信号序列(氨基酸1-20)。该n末端信号序列在蛋白质分泌之前被切断。因此，在一个优选的实施方式中，pam同工型序列(seq id no.1至6)和/或其片段不含n末端信号序列。[0107]在一些方面，所述pam是功能片段(即phm(seq id no.7)和pal(seq id no.8)，pam保留pam的相应功能片段的pam活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少70％、至少约80％或至少约90％。在一些方面，所述pam是本文公开的pam的变体或衍生物。[0108]氨基酸或核酸序列的同一性百分比或术语“序列同一性％”在本文中定义为在比对两个序列并在必要时引入空位以达到最大同一性百分比后，候选氨基酸或核酸序列中与参考序列中的残基相同的残基百分比。在一个优选的实施方式中，所述至少百分比的序列同一性的计算是在不引入空位的情况下进行的。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的，例如“align 2”或国家生物技术信息中心(ncbi)的blast服务。[0109]根据本公开使用的pam可以是商业pam酶，或包含pam酶的任何组合物和在本发明的上下文中能够产生功能性pam酶的任何手段，例如编码pam蛋白的dna或rna核酸。编码pam的核酸可以包埋在合适的载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、(逆转录)病毒、转座子、基因治疗载体和其他能够诱导或赋予pam产生的载体中。在本公开的上下文中，天然或重组微生物如细菌、真菌、原生动物和酵母也可以用作pam的来源。[0110]在一些方面，哺乳动物pam是人或牛pam。[0111]如本文所用，术语“治疗”或“疗法”是指(i)降低疾病或病症例如痴呆、心血管病症、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病的可能性或风险，(ii)减少疾病或病症例如痴呆、心血管病症、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病的发生，(iii)减少疾病或病症例如痴呆、心血管病症、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病的严重程度(例如，改善症状)，或(iv)其组合。[0112]如本文所用的术语“受试者”或“患者”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，其需要疾病的治疗或预后。如本文所用，术语“受试者”或“患者”包括任何人类或非人类动物。如本文所用，诸如“患有疾病的患者”的短语包括将受益于如本文所公开的pam治疗的施用的受试者，例如哺乳动物受试者。[0113]在本公开的一些方面，用于治疗或预防疾病例如痴呆、心血管病症、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病的治疗剂可以包含pam，例如recpam或分离的pam；单独或与一种或多种通常用于治疗或预防疾病例如痴呆、心血管病症、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病的标准治疗剂组合。[0114]“治疗有效量”是指治疗剂的水平或量，其目标是在不对目标造成显著负面或不利副作用的情况下，(1)延迟或预防目标疾病、病症或病状的发作；(2)减缓或停止目标疾病、病症或病状的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)使目标疾病、病症或病状的症状得到改善；(4)降低目标疾病、病症或病状的严重程度或发生率；或(5)治愈目标疾病、病症或病状。治疗有效量可以在目标疾病、病症或病状发作之前施用，以用于防治或预防作用。或者或另外，治疗有效量可以在目标疾病、病症或病状开始后施用，以用于治疗作用。[0115]在一些方面，所述pam(例如recpam)以每剂至少约500u/kg、至少约600u/kg、至少约700u/kg、至少约800u/kg、至少约900u/kg、至少约1000u/kg、至少约1100u/kg、至少约1200u/kg、至少约1300u/kg、至少约1400u/kg、至少约1500u/kg、至少约1600u/kg、至少约1700u/kg、至少约1800u/kg、至少约1900u/kg或至少约2000u/kg的剂量施用。在一些方面，所述pam(例如recpam)以每剂高于2000u/kg的剂量施用。在一些方面，所述pam(例如recpam)以每剂低于500u/kg的剂量施用。[0116]在一些方面，所述pam(例如recpam)以介于约500u/kg和约1500u/kg之间、介于约600u/kg和约1400u/kg之间、介于约700u/kg和约1300u/kg之间、介于约800u/kg和约1200u/kg之间或介于约900u/kg和约1100u/kg之间的剂量施用。在一些具体方面，pam以约1000u/kg的剂量施用。[0117]在一些方面，所述pam是人或牛pam。在一些方面，所述pam是重组pam(recpam)。在一些方面，所述pam是嵌合pam。在一个特定方面，所述嵌合pam是recpam(seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8)。在一些方面，本文公开的pam与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。[0118]在一些方面，所述pam是功能片段(即，phm(seq id no.7)和pal(seq id no.8)，(即，pam的片段，例如，pam保留相应全长pam的pam活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少40％、至少约50％、至少约60％、至少70％、至少约80％或至少约90％)。在一些方面，所述pam是本文公开的pam的变体或衍生物。[0119]pam以显著增加患者血液中bio-adm浓度的剂量施用。bio-adm浓度的显著增加定义为增加约10％，更优选约25％，甚至更优选约50％，甚至更优选约100％，甚至更优选约200％，甚至更优选约300％，甚至更优选约500％，最优选高达1000％。优选将bio-adm的浓度增加到健康人群的中值浓度。已测量来自正常(健康)受试者的样品：中值血浆bio-adm(成熟adm-nh2)为24.7pg/ml，最低值为11pg/ml并且第99个百分位数为43pg/ml(marino等人,2014.critical care 18:r34)。”[0120]在一些方面，所述pam是recpam并且它以每剂至少约0.1mg/kg、至少约0.2mg/kg、至少约0.3mg/kg、至少约0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1mg/kg、至少约1.1mg/kg、至少约1.3mg/kg、至少约1.4mg/kg、至少约1.5mg/kg、至少约1.6mg/kg、至少约1.7mg/kg、至少约1.8mg/kg、至少约1.9mg/kg、至少约2mg/kg、至少约2.1mg/kg、至少约2.2mg/kg、至少约2.3mg/kg或至少约2.4/kg的剂量施用。在一些方面，所述pam以每剂高于2.4mg/kg的剂量施用。[0121]在一些方面，所述pam是recpam，并且它以至少约100u/kg、至少约200u/kg、至少约300u/kg、至少约400u/kg、至少约500u/kg、至少约600u/kg、至少约700u/kg、至少约800u/kg、至少约900u/kg、至少约1000u/kg、至少约1100u/kg、至少约1200u/kg、至少约1300u/kg、至少约1400u/kg、至少约1500u/kg、至少约1600u/kg、至少约1700u/kg、至少约1800u/kg、至少约1900u/kg或至少约2000u/kg的剂量施用。所述pam是recpam，并且它以低于100u/kg的剂量施用，所述pam是recpam，并且它以高于2000u/kg的剂量施用。[0122]在一些方面，所述pam是recpam并且它以介于约0.8mg/kg和约2.4mg/kg之间、介于约0.9mg/kg和约2.3mg/kg之间、介于约1mg/kg和约2.2mg/kg之间、介于约1.1mg/kg和约2.1mg/kg之间、介于约1.2mg/kg和约2mg/kg之间、介于约1.3mg/kg和约1.9mg/kg之间、介于约1.4mg/kg和约1.8mg/kg之间或介于约1.5mg/kg和约1.7mg/kg之间的剂量施用。在一些具体方面，pam以约1.6mg/kg的剂量施用。[0123]在一些方面，所述pam是recpam并且它具有至少约100u/mg、至少约200u/mg、至少约300u/mg、至少约400u/mg、至少约500u/mg、至少约600u/mg、至少约700u/mg、至少约800u/mg、至少约900u/mg、至少约1000u/mg、至少约1100u/mg、至少约1200u/mg、至少约1300u/mg、至少约1400u/mg、至少约1500u/mg、至少约1600u/mg、至少约1700u/mg、至少约1800u/mg、至少约1900u/mg或至少约2000u/mg的比活性。[0124]在一些方面，所述pam是recpam并且它具有约1000u/mg的比活性。在一些方面，所述pam是recpam并且它具有介于约600u/mg和约700u/mg之间、或介于约500u/mg和约800u/mg之间、或介于约400u/mg和约900u/mg之间、或介于约300u/mg和约1000u/mg之间、或介于约200u/mg和约1100u/mg之间、或介于100u/mg和约1200u/mg之间的比活性。在一些方面，所述pam是recpam并且它具有低于100u/mg的比活性。在一些方面，所述pam是recpam并且它具有高于1200u/mg的比活性。[0125]在一些方面，每次治疗仅施用一剂pam(例如recpam)(例如，每天一剂，持续1-7天)。在其他方面，施用多于一剂的pam。在一些方面，施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21剂的pam(例如，每天至少两剂，持续1-7天)。[0126]在一些方面，每天施用pam剂量。在其他方面，每2、3、4、5、6或7天施用pam剂量。[0127]在一些方面，每天施用单一剂量。在一些方面，每天施用2个、3个或更多个剂量。[0128]在一些方面，用pam治疗少于约7天。在一些方面，用pam治疗少于6天、少于5天、少于4天、少于3天、少于2天或少于1天。[0129]在一些方面，pam治疗超过7天、超过14天、超过21天、超过28天、超过1个月、超过3个月、超过6个月、超过12个月、超过2年、超过5年或超过10年。[0130]在一些方面，第二次测量在施用pam(例如recpam)后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周、或在中间时间进行。[0131]根据本文公开的方法，可以调整pam(例如recpam)的制剂、剂量方案和施用途径以提供用于最佳治疗反应的有效量。关于pam的施用，可以通过本领域已知的任何合适的方式、组合物和途径施用pam。关于剂量方案，可以施用单次推注，可以随时间施用若干分次剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。[0132]本公开提供了一种确定是否用包括施用pam的治疗方案来治疗患有疾病的患者或预防疾病的方法，其中所述方法包括：[0133](a)测量所述患者的体液中[0134]·pam和/或其同工型和/或其片段的水平，和/或[0135]·肽-gly/肽-酰胺比率，以及[0136](b)如果与一个或多个预定阈值水平相比或与一个或多个对照中的一个或多个水平相比，确定患者在样品中具有更高或更低的浓度或活性，则用包括施用pam(例如分离的或重组的pam)的治疗方案治疗所述患者或暂停治疗。[0137]所述肽-gly可以选自：肾上腺髓质素(adm)、肾上腺髓质素-2、中叶素-短、肾上腺髓质素原n-20末端肽(pamp)、胰淀素、胃泌素释放肽、神经调节蛋白c、神经调节蛋白b、神经调节蛋白s、神经调节蛋白u、降钙素、降钙素基因相关肽(cgrp)1和2、胰岛淀粉样蛋白多肽、嗜铬粒蛋白a、胰岛素、胰抑素、催乳素释放肽(prrp)、胆囊收缩素、大胃泌素、胃泌素、胰高血糖素样肽1(glp-1)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pacap)、促胰液素、生长激素释放素、肽组氨酸蛋氨酸(phm)、血管活性肠肽(vip)、促性腺素释放素、亲吻素、mif-1、转移抑制素、神经肽k、神经肽γ、p物质、神经激肽a、神经激肽b、肽yy、胰腺激素、新皮啡肽i、食欲素a和b、促黑激素α(α-msh)、促黑激素γ、促甲状腺素释放激素(trh)、催产素、加压素。[0138]在一个优选的实施方式中，所述肽-gly是adm-gly并且所述肽-酰胺是adm-nh2。[0139]如本文所用，术语疾病或病症包括现在已知或将来发现的与pam活性降低和/或肽-gly/肽-酰胺比率增加相关的所有“pam相关”疾病或病症。[0140]在所述疾病或病症的一个具体实施方式中，所述疾病或病症选自：[0141]·痴呆，其中所述痴呆选自：轻度认知障碍(mci)、阿尔茨海默病、血管性痴呆、混合性阿尔茨海默病和血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆、局灶性痴呆(包括进行性失语)、皮质下痴呆(包括帕金森病)和痴呆综合征的继发原因(包括颅内病变)。[0142]·心血管病症，其中所述心血管病症可以选自：动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭(包括急性和急性失代偿性心力衰竭)、心房颤动、心血管缺血、脑缺血性损伤、心源性休克、中风(包括缺血性和出血性中风和短暂性脑缺血发作)和心肌梗塞，[0143]·肾脏疾病，其中所述肾脏疾病可以选自：肾毒性(药物诱发的肾脏疾病)、急性肾损伤(aki)、慢性肾脏疾病(ckd)、糖尿病性肾病、终末期肾病(esrd)，[0144]·癌症，其中所述癌症可以选自：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌(包括黑色素瘤)、胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、肾癌、食道癌、咽癌，[0145]·由例如细菌、病毒、真菌或寄生虫的传染性生物引起的传染性疾病，所述传染性疾病选自：sirs、败血症和败血性休克。[0146]·代谢疾病，选自：1型糖尿病、2型糖尿病、代谢综合征。[0147]在本技术的一个实施方式中，所述疾病是痴呆并且所述痴呆选自：轻度认知障碍(mci)、阿尔茨海默病、血管性痴呆、混合性阿尔茨海默病和血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆、局灶性痴呆(包括进行性失语)、皮质下痴呆(包括帕金森病)和痴呆综合征的继发原因(包括颅内病变)。[0148]在一个具体实施方式中，所述痴呆是阿尔茨海默病。[0149]在本技术的一个实施方式中，所述疾病是癌症并且所述癌症选自：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌(包括黑色素瘤)、胃癌、肝癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、肾癌、食道癌和咽癌。[0150]在一个具体实施方式中，所述癌症是结直肠癌。[0151]在本技术的一个实施方式中，所述疾病是心血管病症，其中所述心血管病症选自：动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭(包括急性和急性失代偿性心力衰竭)、心房颤动、心血管缺血、脑缺血性损伤、心源性休克、中风(包括缺血性和出血性中风和短暂性脑缺血发作)和心肌梗塞。[0152]在一个具体实施方式中，所述心血管病症是心力衰竭(包括急性和急性失代偿性心力衰竭)。[0153]在另一个具体实施方式中，所述心血管病症是中风(包括缺血性和出血性中风和短暂性脑缺血发作)和心肌梗塞。[0154]在另一个具体实施方式中，所述心血管病症是心房颤动。[0155]在本技术的另一个具体实施方式中，所述疾病是sirs、败血症或败血性休克。[0156]在本技术的另一个具体实施方式中，所述疾病是1型糖尿病、2型糖尿病、代谢综合征。[0157]在一个实施方式中，患有“pam相关”疾病或病症的患者是具有长期降低的bio-adm浓度的患者，其可能患有亚临床内皮功能障碍。例如大脑中的亚临床内皮功能障碍可能导致痴呆，尤其是阿尔茨海默病。[0158]在本发明上下文中的体液可以选自血液、血清、血浆、脑脊液(csf)、尿液、唾液、痰和胸腔积液。在所述方法的一个具体实施方式中，所述样品选自全血、血清和血浆。[0159]如本文所用的术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式使得其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且不含对将被施用所述制剂的受试者具有不可接受毒性的额外组分。[0160]本发明还涉及一种药物制剂，其包含治疗有效剂量的pam(例如recpam)与至少一种药学上可接受的赋形剂的组合。[0161]“药学上可接受的赋形剂”是指当施用于受试者时不产生不利、过敏或其他不良反应的赋形剂。除了治疗性蛋白质之外，它还包括载剂、各种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域熟知的其他材料。载剂的特性将取决于施用途径。[0162]在本发明的一个实施方式中，所述药物制剂是通过口服(例如吸入)、表皮、皮下、皮内、舌下、肌内、动脉内、静脉内或经由中枢神经系统(cns、脑内、脑室内、鞘内)或经由腹膜内施用来施用的。[0163]对于通过吸入施用，化合物以气雾剂喷雾的形式从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体如二氧化碳)或喷雾器中递送。[0164]本发明的主题是根据本发明用于治疗受试者的pam药物制剂，其中所述药物制剂为溶液，优选为即用型溶液。[0165]本发明的主题是根据本发明用于治疗受试者的pam药物制剂，其中所述药物组合物处于冷冻干燥状态。[0166]本发明的主题是用于治疗受试者的药物制剂，其中所述药物制剂是经由输注施用的。[0167]本发明的主题是用于治疗受试者的药物制剂，其中所述药物制剂是全身施用的。[0168]用于皮下施用的治疗性蛋白质经常以高浓度施用。特别考虑的高浓度治疗性蛋白质(不考虑化学修饰如聚乙二醇化的重量)为至少约70、80、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、175、180、185、190、195、200、250、300、350、400、450或500mg/ml，和/或小于约250、300、350、400、450或500mg/ml。制剂中治疗性蛋白质例如酶的示例性高浓度可以在约100mg/ml至约500mg/ml的范围内。优选地，根据本发明的治疗性蛋白质的浓度在约100-300mg/ml的范围内，更优选在135-165mg/ml的范围内，最优选在约150mg/ml。进一步最优选的浓度是约100mg/ml。在这种情况下，“约”给定值的浓度，例如给定浓度范围的上限或下限，应理解为涵盖偏离该给定值至多±10％的所有浓度。[0169]化学修饰可以用于保护pam免于降解、延长体内半衰期、提供延长的药物释放、增强药物功效，同时减少副作用、降低施用频率和降低药物剂量。其他优点包括减轻与频繁注射相关的疼痛和显著降低治疗成本。化学修饰包括聚合物如peg(聚乙二醇)、聚唾液酸的共价缀合、高糖基化和甘露糖基化(patel等人,2014.ther.deliv.5(3):337–365)。替代配制方法包括作为蛋白质递送系统的胶体载剂，例如微粒、纳米颗粒、脂质体、碳纳米管和胶束(patel等人,2014.ther.deliv.5(3):337–365)。[0170]在本发明的一个实施方式中，所述共价缀合聚合物选自：支链或无支链聚乙二醇(peg)、支链或无支链聚丙二醇(ppg)羟乙基淀粉(hes)或其衍生物、聚唾液酸(psa)或其衍生物、或富含甘氨酸的同型氨基酸聚合物(hap)(参见wo2020254197以供参考)。所述聚合物可以具有任何分子量。[0171]在本发明的另一个方面，pam可以经由基因疗法施用。基因疗法有两种主要的常规方法，第一种是使用病毒衣壳封装所关注的dna序列以引入哺乳动物组织中。此类病毒衣壳通常被称为病毒载体，并且已经使用了多种载体，包括hiv和腺病毒。这样的病毒载体通常被构建成它们不应在体内复制，并且通常含有导致病毒载体携带的dna剪接到宿主基因组中的逆转录酶。基因疗法的第二种主要常规方法，即dna基因疗法，使用更简单的将dna注射到患者体内的方法。这将相当少的包装材料引入宿主中，并且dna构建体通常更小。dna不会并入宿主基因组中，而是单独保存在细胞核内或细胞内的核壁上的小圈(circlet)中。这些小圈可能与细胞核内的组蛋白相关联。[0172]在本技术的一个具体实施方式中，使用测定来确定pam和/或其同工型和/或其片段的水平，其中这种测定是夹心测定，优选全自动测定。[0173]在本技术的一个实施方式中，它可以是所谓的poc测试(护理点)，它是一种测试技术，其允许在患者附近不到1小时内执行测试，而无需全自动测定系统。该技术的一个实例是免疫色谱测试技术。[0174]在本技术的一个实施方式中，这种测定是使用任何种类的检测技术的夹心免疫测定，包括但不限于酶标记、化学发光标记、电化学发光标记，优选全自动测定。在本发明的一个实施方式中，这样的测定是酶标记夹心测定。自动或全自动测定的实例包括可以用于以下系统之一的测定：rocheabbottsiemensbrahmsbiomerieuxalereortho clinical diagnostics[0175]在本技术的一个具体实施方式中，所述两种结合剂中的至少一种被标记以便被检测。[0176]优选的检测方法包括各种形式的免疫测定，例如放射免疫测定(ria)、均相酶倍增免疫测定(emit)、化学发光和荧光免疫测定、酶联免疫测定(elisa)、基于luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定和快速测试形式例如免疫色谱条测试。[0177]在一个优选的实施方式中，所述标记选自：化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射性碘标记。[0178]所述测定可以是同质或异质测定、竞争性和非竞争性测定。在一个实施方式中，所述测定是夹心测定的形式，其是非竞争性免疫测定，其中待检测和/或量化的分子与第一抗体和第二抗体结合。所述第一抗体可以与固相例如珠、孔或其他容器的表面、芯片或条带结合，并且所述第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适当的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。涉及“夹心测定”的一般组成和程序是充分确立的并且为本领域技术人员所知(the immunoassay handbook,david wild编,elsevier ltd,oxford；第3版(2005年5月)；hultschig等人,2006.curr opin chem biol.10(1):4-10)。[0179]在另一个实施方式中，所述测定包含两种捕获分子，优选抗体，它们都作为分散体存在于液体反应混合物中，其中第一标记组分连接到第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分连接到第二捕获分子，使得在两种捕获分子与分析物结合时产生可测量的信号，其允许检测包含样品的溶液中所形成的夹心复合物。[0180]在另一个实施方式中，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青型染料的组合。在本发明的上下文中，基于荧光的测定包括使用染料，其可以例如选自：fam(5-或6-羧基荧光素)、vic、ned、荧光素、异硫氰酸荧光素(fitc)、ird-700/800，花青染料，例如cy3、cy5、cy3.5、cy5.5、cy7、呫吨(xanthen)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(hex)、tet、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(joe)、n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、6-羧基-x-罗丹明(rox)、5-羧基罗丹明-6g(r6g5)、6-羧基罗丹明-6g(rg6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110，bodipy染料，例如bodipy tmr、俄勒冈绿，香豆素如伞形酮，苯甲酰亚胺如hoechst 33258；菲啶，例如德州红(texas red)、亚基马黄(yakima yellow)、alexa fluor、pet、溴化乙锭、吖啶鎓染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。[0181]在本技术的上下文中，基于化学发光的测定包括基于(kirk-othmer,encyclopedia of chemical technology,第4版,1993.john wiley&sons,第15卷:518-562，通过引用并入本文，包括第551-562页上的引用)中的化学发光材料所描述的物理原理使用染料。优选的化学发光染料是吖啶酯。[0182]如本文所述，“测定”或“诊断测定”可以是应用于诊断领域的任何类型。这样的测定可以基于待检测的分析物与具有一定亲和力的一种或多种捕获探针的结合。可以用于测定pam和/或其同工型和/或其片段的水平的结合剂对pam和/或其同工型和/或其片段表现出至少107m-1、优选108m-1的亲和常数，优选的亲和常数大于109m-1，最优选大于1010m-1。本领域技术人员知道，可以考虑通过应用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且该措施不会导致超出本发明的范围。[0183]在本技术的上下文中，“结合剂分子”是可以用于结合来自样品的一个或多个所关注分子，即分析物(即在本发明上下文中pam和其同工型及其片段)的分子。因此，结合剂分子必须在空间上和表面特征(例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在)方面充分成形，以特异性结合所关注的一种或多种目标分子。因此，结合可以例如由离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或捕获分子与所关注的一种或多种目标分子之间的上述相互作用中的两种或更多种的组合来介导。在本发明的上下文中，结合剂分子可以例如选自：核酸分子、碳水化合物分子、pna分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合剂分子是抗体，包括其对所关注的目标或分子具有足够亲和力的片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或衍生自变体链的片段的化学和/或生化修饰衍生物。[0184]在一个具体实施方式中，所述结合剂可以选自抗体、抗体片段或非igg支架。[0185]化学发光标记可以是吖啶酯标记、涉及异鲁米诺标记的类固醇标记等。[0186]酶标记可以是乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸激酶(cpk)、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。[0187]在本技术的一个实施方式中，所述两种结合剂中的至少一者结合于例如磁性颗粒和聚苯乙烯表面的固相。[0188]本技术的主题是一种使用测定来确定体液样品中pam和/或同工型和/或其片段的水平的方法，其中所述测定包含结合于pam的两个不同表位的两种结合剂，其中所述两种结合剂针对长度为至少5个氨基酸、优选至少4个氨基酸的表位。[0189]表位，也称为抗原决定簇，是抗原(例如肽或蛋白质)中被免疫系统、具体而言被抗体识别的部分。例如，表位是抗体结合的抗原的特定片段。与表位结合的抗体部分被称为互补位。蛋白质抗原的表位根据其结构和与互补位的相互作用分为两个类别：构象表位和线性表位。[0190]线性或连续表位是抗体通过其氨基酸的线性序列或一级结构识别并由连续氨基酸残基相互作用采用的3-d构象形成的表位。构象和线性表位基于表位采用的3-d构象与互补位相互作用，这由所涉及表位残基的表面特征和抗原其他区段的形状或三级结构决定。构象表位由不连续氨基酸残基相互作用所采用的3-d构象形成。[0191]在本技术的一个实施方式中，线性表位与以下pam免疫肽序列有关：肽1(seq id no.11)、肽2(seq id no.12)、肽(seq id no.13)、肽4(seq id no.14)、肽5(seq id no.15)、肽6(seq id no.16)、肽7(seq id no.17)、肽8(seq id no.18)、肽9(seq id no.19)、肽10(seq id no.20)、肽11(seq id no.21)、肽12(seq id no.22)、肽13(seq id no.23)、肽14(seq id no.24)。[0192]在本技术的一个实施方式中，线性和/或构象表位与以下pam序列有关：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10。[0193]所述表位可以包含至少6个氨基酸，优选至少5个氨基酸，最优选至少4个氨基酸。[0194]在本技术的一个实施方式中，所述第一和第二结合剂结合于包含在以下pam序列中的表位：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6。[0195]在本技术的一个实施方式中，所述第一和第二结合剂结合于包含在pam的pal亚基(seq id no.8)中的表位。[0196]在本技术的一个实施方式中，所述第一和第二结合剂结合于包含在pam的phm亚基(seq id no.7)中的表位。[0197]在本技术的一个具体实施方式中，所述第一结合剂结合于包含在pam的pal亚基(seq id no.8)中的表位，并且所述第二结合剂结合于包含在pam的phm亚基(seq id no.7)中的表位。[0198]在本技术的一个具体实施方式中，所述第一和第二结合剂结合于包含在以下pam序列中的表位：肽1(seq id no.11)、肽2(seq id no.12)、肽(seq id no.13)、肽4(seq id no.14)、肽5(seq id no.15)、肽6(seq id no.16)、肽7(seq id no.17)、肽8(seq id no.18)、肽9(seq id no.19)、肽10(seq id no.20)、肽11(seq id no.21)、肽12(seq id no.22)、肽13(seq id no.23)、肽14(seq id no.24)和重组pam(seq id no.10)。[0199]至少两种结合剂用于测定pam和/或其同工型和/或其片段的水平的用途，其中所述至少一种结合剂针对包含在以下pam序列中的表位：肽1(seq id no.11)、肽2(seq id no.12)、肽(seq id no.13)、肽4(seq id no.14)、肽5(seq id no.15)、肽6(seq id no.16)、肽7(seq id no.17)、肽8(seq id no.18)、肽9(seq id no.19)、肽10(seq id no.20)、肽11(seq id no.21)、肽12(seq id no.22)、肽13(seq id no.23)、肽14(seq id no.24)和重组pam(seq id no.10)。[0200]本技术的主题是一种用于确定受试者体液样品中pam和/或同工型和/或其片段的活性的方法，包括以下步骤[0201]·使所述样品与特异性结合于活性全长pam、其同工型和/或其活性片段的捕获结合剂接触，[0202]·分离结合于所述捕获结合剂的pam[0203]·向所述分离的pam中添加pam的底物[0204]·通过测量所述pam的底物的转化来量化pam活性。[0205]在本技术的一个具体实施方式中，所述方法是酶捕获测定法(eca，参见例如us5612186a、us5601986a)。[0206]在用于确定受试者体液样品中pam活性的所述方法的一个具体实施方式中，所述分离步骤是洗涤步骤，其从捕获的pam和/或其同工型和/或其片段中去除样品中未与所述捕获结合剂结合的成分。该分离步骤可以是将结合于所述捕获结合剂的pam与所述体液样品的成分分离的任何其他步骤。[0207]本技术的一个实施方式涉及pam的化学测定。所述测定使用与pam和/或其同工型和/或其片段反应的肽底物以形成可检测的反应产物。或者，可以监测底物的反应速率以确定测试样品中pam和/或其同工型和/或其片段的水平。[0208]实施此类试剂和反应的测定可以在任何合适的反应容器，例如试管或微量滴定板的孔中进行。或者，可以以一次性形式开发测定装置，例如本领域技术人员熟知的并且易于制造和使用的量杆或试纸装置形式。这样的一次性测定装置可以包装成含有所有必要材料、试剂和使用说明的试剂盒形式。[0209]在一个替代的测定实施方式中，可以检测反应发生的速率作为测试样品中存在的pam和/或其同工型和/或其片段的水平的指示。例如，底物反应的速率可以用于指示测试样品中存在的pam和/或其同工型和/或其片段的水平。或者，反应产物形成的速率可以用于指示测试样品中存在的pam和/或其同工型和/或其片段的水平。[0210]在又一个实施方式中，可以进行捕获或结合测定以确定pam和/或其同工型和/或其片段的活性。例如，可以将与pam蛋白反应但不干扰其酶活性的抗体固定在固相上。使测试样品通过固定抗体，并且pam和/或其同工型和/或其片段(如果存在)结合于抗体并且自身被固定以用于检测。然后可以添加底物，并且可以检测反应产物以指示测试样品中pam和/或其同工型和/或其片段的水平。为了本说明书的目的，术语“固相”可以用于包括可在其中或在其上进行测定的任何材料或容器，并且包括但不限于多孔材料、无孔材料、试管、孔、载玻片等。[0211]在通过测定受试者的体液样品中肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)和/或其同工型和/或其片段的水平用于诊断或预后所述受试者中的疾病和/或预测所述受试者中患上疾病或发生不良事件的风险和/或监测所述受试者中的疾病或不良事件的所述方法的一个具体实施方式中，所述捕获结合剂固定在表面上。对于pam活性的确定，与pam和/或其同工型和/或其片段反应但不干扰酶活性超过50％、优选低于40％、优选低于30％的结合剂可以固定在固相上。为了防止pam的抑制，捕获结合剂不应在活性中心和底物结合区域周围的区域中结合pam。[0212]在用于确定受试者体液样品中pam和/或其同工型和/或其片段的水平的所述方法的一个具体实施方式中，所述结合剂可以选自抗体、抗体片段、非ig支架或适体。[0213]本技术的另一个主题是一种用于确定受试者体液样品中pam和/或同工型和/或其片段的活性的方法，包括以下步骤[0214]·在t＝0min和t＝n+1min使所述样品与pam的底物(肽-gly)接触一段时间间隔[0215]·在t＝0min和t＝n+1min检测所述样品中pam的反应产物(α-酰胺化肽)，以及[0216]·通过计算t＝0和t＝n+1之间所述反应产物的差异来量化pam的活性。[0217]本技术的另一个主题是一种用于确定受试者体液样品中的pam活性的方法，包括以下步骤[0218]·在t＝0min和t＝n+1min使所述样品与pam的底物adm-gly接触一段时间间隔[0219]·使用免疫测定在t＝0min和t＝n+1min检测所述样品中pam的反应产物adm-nh2，以及[0220]·通过计算t＝0min和t＝n+1min之间所述反应产物adm-nh2的差异来量化pam的活性。[0221]术语“t＝n+1min”是时间间隔，其中n定义为≥0min。[0222]本技术的一个实施方式涉及一种用于执行诊断或预后受试者的疾病和/或预测受试者中患上疾病或发生不良事件的风险和/或监测受试者中的疾病或不良事件的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少两种结合剂，其针对重组pam(seq id no.10)、肽1(seq id no.11)、肽2(seq id no.12)、肽(seq id no.13)、肽4(seq id no.14)、肽5(seq id no.15)、肽6(seq id no.16)、肽7(seq id no.17)、肽8(seq id no.18)、肽9(seq id no.19)、肽10(seq id no.20)、肽11(seq id no.21)、肽12(seq id no.22)、肽13(seq id no.23)和肽14(seq id no.24)。[0223]本技术的一个具体实施方式涉及一种用于检测pam水平的试剂盒，其包含一种或多种与选自以下的pam序列结合的结合剂：重组pam(seq id no.10)、肽1(seq id no.11)、肽2(seq id no.12)、肽(seq id no.13)、肽4(seq id no.14)、肽5(seq id no.15)、肽6(seq id no.16)、肽7(seq id no.17)、肽8(seq id no.18)、肽9(seq id no.19)、肽10(seq id no.20)、肽11(seq id no.21)、肽12(seq id no.22)、肽13(seq id no.23)和肽14(seq id no.24)。[0224]本技术的另一个实施方式涉及一种用于执行确定受试者体液样品中pam和/或同工型和/或其片段的活性的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含肽-gly作为pam底物，其中所述肽-gly是adm-gly。[0225]pam的活性可以通过检测来自其甘氨酸化前体肽底物(肽-gly)的α-酰胺化肽(肽-酰胺)来测量。近一半的生物活性肽以c末端α-酰胺封端(vishvanatha等人,2014.j biol chem 289(18):12404-20)。所述甘氨酸化前体肽底物可以选自：肾上腺髓质素(adm)、肾上腺髓质素-2、中叶素-短、肾上腺髓质素原n-20末端肽(pamp)、胰淀素、胃泌素释放肽、神经调节蛋白c、神经调节蛋白b、神经调节蛋白s、神经调节蛋白u、降钙素、降钙素基因相关肽(cgrp)1和2、胰岛淀粉样蛋白多肽、嗜铬粒蛋白a、胰岛素、胰抑素、催乳素释放肽(prrp)、胆囊收缩素、大胃泌素、胃泌素、胰高血糖素样肽1(glp-1)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pacap)、促胰液素、生长激素释放素、肽组氨酸蛋氨酸(phm)、血管活性肠肽(vip)、促性腺素释放素、亲吻素、mif-1、转移抑制素、神经肽k、神经肽γ、p物质、神经激肽a、神经激肽b、肽yy、胰腺激素、新皮啡肽i、食欲素a和b、促黑激素α(α-msh)、促黑激素γ、促甲状腺素释放激素(trh)、催产素、加压素。[0226]在一个优选的实施方式中，所述肽-gly是肾上腺髓质素-gly(adm-gly)并且所述肽-酰胺是肾上腺髓质素-酰胺(adm-nh2)。[0227]其他非肽特性的底物可以包括n-脂肪酰基-甘氨酸，它们被pam转化为初级脂肪酸酰胺(pfam)如油酰胺。[0228]在本发明的另一个优选实施方式中，pam(例如recpam)与抗坏血酸盐的施用相结合。[0229]本技术的另一个优选实施方式涉及一种药物制剂，所述制剂包含pam、抗坏血酸盐和/或铜。[0230]本技术的另一个实施方式涉及一种药物制剂，所述制剂包含pam与抗坏血酸盐和/或铜的组合。[0231]在一个实施方式中，抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸或其药学上可接受的盐；或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。l-抗坏血酸也称为维生素c、l-木糖抗坏血酸、3-氧代-l-古洛呋喃内酯(烯醇形式)、l-3-酮苏己糖醛酸内酯、抗坏血病维生素、西维他酸(cevitamic acid)、adenex、allercorb、ascorin、ascorteal、ascorvit、cantan、cantaxin、catavin c、cebicure、cebion、cecon、cegiolan、celaskon、celin、cenetone、cereon、cergona、cescorbat、cetamid、cetabe、cetemican、cevalin、cevatine、cevex、cevimin、ce-vi-sol、cevitan、cevitex、cewin、ciamin、cipca、concemin、c-vin、daviamon c、duoscorb、hybrin、laroscorbine、lemascorb、planavit c、proscorbin、redoxon、ribena、scorbacid、scorbu-c、testascorbic、vicelat、vitacee、vitacimin、vitacin、vitascorbol和xitix。[0232]在一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸。在另一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸的药学上可接受的盐，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。[0233]用于形成l-抗坏血酸的药学上可接受的盐的合适碱包括但不限于无机碱，例如氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化锌和氢氧化钠；和有机碱，例如伯、仲、叔和季、脂肪族和芳香族胺，包括但不限于l-精氨酸、苯乙苄胺(benethamine)、苄星(benzathine)、胆碱、丹醇(deanol)、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二异丙胺、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、异丙胺、n-甲基-葡糖胺、海巴胺、1h-咪唑、l-赖氨酸、吗啉、4-(2-羟乙基)-吗啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、吡咯烷、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、吡啶、奎宁环、喹啉、异喹啉、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、n-甲基-d-葡糖胺、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇和氨丁三醇。[0234]在一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸的碱金属或碱土金属盐，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在另一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸钠、钾、钙或镁，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸钠，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸钠，其也称为维生素c钠(vitamin csodium/ascorbin/sodascorbate/natrascorb/cenolate/ascorbicin/cebitate)。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸钾，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸钙，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸钙。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸镁，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在再一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是l-抗坏血酸镁。[0235]在某些实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸或其药学上可接受的盐、或药学上可接受的溶剂化物或水合物。[0236]在一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸。在另一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸的药学上可接受的盐，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。[0237]用于形成d-抗坏血酸的药学上可接受的盐的合适碱包括但不限于无机碱，例如氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化锌和氢氧化钠；和有机碱，例如伯、仲、叔和季、脂肪族和芳香族胺，包括但不限于l-精氨酸、苯乙苄胺、苄星、胆碱、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二异丙胺、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、异丙胺、n-甲基-葡糖胺、海巴胺、1h-咪唑、l-赖氨酸、吗啉、4-(2-羟乙基)-吗啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、吡咯烷、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、吡啶、奎宁环、喹啉、异喹啉、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、n-甲基-d-葡糖胺、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇和氨丁三醇。[0238]在一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸的碱金属或碱土金属盐，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在另一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸钠、钾、钙或镁，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸钠，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸钠，其也称为维生素c钠(vitamin csodium/ascorbin/sodascorbate/natrascorb/cenolate/ascorbicin/cebitate)。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸钾，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸钙，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸钙。在又一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸镁，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在再一个实施方式中，所述抗坏血酸化合物是d-抗坏血酸镁。[0239]术语“溶剂化物”是指由一种或多种溶质分子(例如本文提供的化合物)和一种或多种溶剂分子形成的复合物或聚集体，其以化学计量或非化学计量的量存在。合适的溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和乙酸。在某些实施方式中，所述溶剂是药学上可接受的。在一个实施方式中，所述复合物或聚集体是结晶形式。在另一个实施方式中，所述复合物或聚集体是非结晶形式。在溶剂为水的情况下，溶剂化物是水合物。水合物的实例包括但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物和五水合物。[0240]在一个实施方式中，各药物组合物中的抗坏血酸化合物独立地为l-抗坏血酸或其药学上可接受的盐，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物。在另一个实施方式中，各药物组合物中的抗坏血酸化合物独立地是l-抗坏血酸的碱金属或碱土金属盐，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物；或其混合物。在又一个实施方式中，各药物组合物中的抗坏血酸化合物独立地是l-抗坏血酸的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，或其药学上可接受的溶剂化物或水合物；或其混合物。在又一个实施方式中，各药物组合物中的抗坏血酸化合物独立地是l-抗坏血酸钠。在又一个实施方式中，各药物组合物中的抗坏血酸化合物独立地是l-抗坏血酸钙。在又一个实施方式中，各药物组合物中的抗坏血酸化合物独立地是l-抗坏血酸镁。在再一个实施方式中，各药物组合物中的抗坏血酸化合物独立地是l-抗坏血酸钠、l-抗坏血酸钙和l-抗坏血酸镁中的两种或三种的混合物。[0241]根据上述上下文，以下连续编号的实施方式提供了本发明的进一步的具体方面：[0242]1.用作药物的肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)。[0243]2.用作治疗受试者的药物的pam，其中所述治疗包括：[0244]i.降低疾病或病症的可能性或风险，和/或[0245]ii.减少疾病或病症的发生，和/或[0246]iii.降低疾病或病症的严重程度。[0247]3.根据实施方式2所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中所述疾病或病症选自：痴呆、心血管病症、肾脏疾病、癌症、炎性或感染性疾病和/或代谢疾病。[0248]4.根据实施方式2和3所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中所述受试者的特征在于[0249]在所述受试者的体液样品中[0250]·pam和/或其同工型和/或其片段的水平低于阈值，和/或[0251]·肽-gly/肽-酰胺比率高于阈值。[0252]5.根据实施方式4所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中所述肽选自：肾上腺髓质素(adm)、肾上腺髓质素-2、中叶素-短、肾上腺髓质素原n-20末端肽(pamp)、胰淀素、胃泌素释放肽、神经调节蛋白c、神经调节蛋白b、神经调节蛋白s、神经调节蛋白u、降钙素、降钙素基因相关肽(cgrp)1和2、胰岛淀粉样蛋白多肽、嗜铬粒蛋白a、胰岛素、胰抑素、催乳素释放肽(prrp)、胆囊收缩素、大胃泌素、胃泌素、胰高血糖素样肽1(glp-1)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pacap)、促胰液素、生长激素释放素、肽组氨酸蛋氨酸(phm)、血管活性肠肽(vip)、促性腺素释放素、亲吻素、mif-1、转移抑制素、神经肽k、神经肽γ、p物质、神经激肽a、神经激肽b、肽yy、胰腺激素、新皮啡肽i、食欲素a和b、促黑激素α(α-msh)、促黑激素γ、促甲状腺素释放激素(trh)、催产素、加压素。[0253]6.根据实施方式4和5所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中所述受试者的特征在于[0254]在所述患者的体液中，[0255]·adm-gly/bio-adm比率高于阈值，和/或[0256]·bio-adm浓度低于阈值。[0257]7.根据实施方式3所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中pam和/或其同工型和/或其片段的水平是pam和/或其同工型和/或其具有至少12个氨基酸的片段的总浓度或者pam和/或其同工型和/或其片段的活性。[0258]8.根据实施方式7所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中pam和/或其同工型和/或其具有至少12个氨基酸的片段的总浓度或者pam和/或其同工型和/或其片段的活性选自：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8和seq id no.10。[0259]9.根据实施方式4-8所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中所述受试者的体液样品选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。[0260]10.根据实施方式1-9所述的用作药物的pam，其中所述pam选自：分离的和/或重组的和/或嵌合的pam。[0261]11.根据实施方式1-10所述的用作药物的pam，其中所述重组pam选自包括以下的序列：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8和seq id no.10。[0262]12.根据实施方式1至11中任一项所述的用作治疗受试者的药物的pam，其中pam与抗坏血酸盐和/或铜组合。[0263]13.一种包含肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(pam)的药物制剂。[0264]14.根据实施方式13所述的包含pam的药物制剂，其中所述药物制剂是经口服、表皮、皮下、皮内、舌下、肌肉内、动脉内、静脉内或经由中枢神经系统(cns、脑内、脑室内、鞘内)或经由腹膜内施用来施用的。[0265]15.根据实施方式13-14所述的药物制剂，其中所述药物制剂为溶液，优选为即用型溶液。[0266]16.根据实施方式13-15所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥状态。[0267]17.根据实施方式13-16所述的药物制剂，其中所述药物制剂是肌肉内施用的。[0268]18.根据实施方式13-17所述的药物制剂，其中所述药物制剂是血管内施用的。[0269]19.根据实施方式13-18所述的药物制剂，其中所述药物制剂是经由输注施用的。[0270]20.根据实施方式13-19所述的药物制剂，其中所述药物制剂是全身施用的。[0271]21.根据实施方式13-20所述的药物制剂，所述制剂包含pam和/或任选地一种或多种药学上可接受的成分。[0272]22.根据实施方式13-21所述的药物制剂，所述制剂包含pam、抗坏血酸盐和/或铜。[0273]23.根据实施方式13-22所述的药物制剂，所述制剂包含pam与抗坏血酸盐和/或铜的组合。附图说明[0274]图1：pam同工型1的示意图。黑色粗箭头指示双碱性氨基酸处的切割位点。[0275]图2：pam催化的酶促反应[0276]图3：重组pam的代表性校准曲线(adm成熟活性[ama]。[0277]图4：自我报告的健康个体(n＝120)中ama的频率分布(直方图)[0278]图5：来自自我报告的健康个体(n＝20)的基质对(肝素锂和血清)中ama的相关性[0279]图6a-l：pam夹心免疫测定的典型校准曲线。a-j以重组pam作为校准材料。(a)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽9(seq id no.19)的抗体；(b)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽10(seq id no.20)的抗体；(c)固相：针对肽9(seq id no.19)的抗体，示踪剂：针对肽10(seq id no.20)的抗体；(d)固相：针对重组pam(seq id no.10)的抗体，示踪剂：针对重组pam(seq id no.10)的抗体；(e)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对重组pam(seq id no.10)的抗体；(f)固相：针对肽13(seq id no.23)的抗体，示踪剂：针对肽10(seq id no.20)的抗体；(g)固相：针对肽14(seq id no.24)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体；(h)固相：针对重组pam(seq id no.10)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体；(i)固相：针对肽13(seq id no.23)的抗体，示踪剂：针对肽9(seq id no.19)的抗体；(j)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体。k和l以天然pam(edta-血浆)作为校准材料：(k)固相：针对肽14(seq id no.24)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体；(l)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体。[0280]图6m-o：酶捕获测定(eca)-(m)针对肽10(seq id no.20)的固相抗体；(n)针对全长pam(seq id no.10)的固相抗体；(o)针对肽7(seq id no.17)、肽8(seq id no.18)、肽9(seq id no.19)、肽13(seq id no.23)和肽14(seq id no.24)的固相抗体，重组pam/肝素血浆用作样品。[0281]图7：典型的adm-gly剂量/信号曲线[0282]图8：mpp研究中的adm成熟活性(pam活性)(阿尔茨海默病的预测)[0283]图9：kaplan-meier曲线(mpp研究中阿尔茨海默病[ad]的预测)[0284]图10：mpp研究中的adm成熟活性(pam活性)(结直肠癌[crc]的预测)[0285]图11：mpp研究中的mr-proadm(结直肠癌[crc]的预测)[0286]图12：kaplan-meier曲线(mpp研究中结直肠癌[crc]的预测)[0287]图13：kaplan-meier曲线(mpp研究中心力衰竭的预测)[0288]图14：kaplan-meier曲线(mpp研究中心房颤动的预测)[0289]图15：用于诊断流行性阿尔茨海默病(ad)的adm成熟活性(pam活性)[0290]图16：在有和没有外源adm-gly作为底物的情况下由天然血浆pam形成bio-adm[0291]图17：通过天然血浆pam和外源重组pam的作用由天然血浆adm-gly形成bio-adm[0292]图18：由于天然血浆pam的反应和外源重组pam对adm-gly/bio-adm比率的影响导致的adm-gly/bio-adm比率的变化[0293]图19：在应用重组人pam或安慰剂之前和之后大鼠血浆中的adm成熟活性(pam活性)[0294]图20：在应用重组人pam之后大鼠血浆中adm成熟活性(pam活性)的单相衰减拟合[0295]图21在大鼠中静脉内注射安慰剂(空心圆)、pam(实心方块)、抗坏血酸盐(空心三角形)和两者的组合(空心方块)。在体外测试注射化合物的效果：(a)在没有外源抗坏血酸盐的情况下如实施例3中所述测定pam-ama。(b)注射化合物后对循环bio-adm水平的影响。对于每个时间点，将bio-adm水平相对于安慰剂水平(设置为100％)归一化。使用具有dunnet校正的双向anova模型与安慰剂相比测试显著性。*：p＝0.042；**：p＝0.0036–0.0073；***：p＝0.0003；****：p＝0.0001；n.s.：不显著。[0296]图22：重组pam在大鼠中的半衰期，由单相衰减模型确定。[0297]图23：在不添加外源抗坏血酸盐的情况下，健康人类志愿者在口服抗坏血酸盐摄入之前(0h)和之后测量的酰胺化活性。t＝0h时的ama设置为100％。具体实施方式[0298]实施例[0299]实施例1-重组pam的生产[0300]pam cdna是根据uniprot登录号p19021合成的，其编码包括对于在哺乳动物细胞中表达密码子优化的pam蛋白的氨基酸21-834。pam的信号序列被人血清白蛋白信号序列(mkwvtfisllflfssaysfr[seq id no.9])替换。在pam的c末端添加了六组氨酸标签，经由gs接头连接到pam。重组pam的序列(没有信号序列和六组氨酸标签的pam的氨基酸21-834)显示在seq id no.10中。使用5'-noti和3'hindiii限制位点将cdna克隆到表达载体(质粒dna)中。将带有用于pam表达的cdna的表达载体在大肠杆菌(e.coli.)中复制并从大肠杆菌制备，作为低内毒素制剂。[0301]在无血清悬浮培养中，使用invect转染试剂用表达载体转染hek-inv细胞。经由与含有gfp-(绿色荧光蛋白)的表达载体共转染来控制转染率。在丙戊酸和青霉素-链霉素存在下在37℃和5％co2下进行细胞培养。当活力达到《60％(》2000g，30-45min，2-8℃)时经由离心收获细胞。细胞培养上清液(ccs)用100mm tris/hcl ph 8.0经由切向流过滤(tff，30kda截止)洗涤5次。[0302]重组pam的纯化包括在q-琼脂糖快速流动树脂(ge healthcare)上应用缓冲液交换的ccs并利用nacl梯度(高达2m)洗脱。将含有酰胺化活性的级分合并并应用到具有100mm tris/hcl、200mm nacl、ph8.0洗脱缓冲液的superdex 200pg(ge healthcare)尺寸排阻色谱柱上。将含有酰胺化活性的级分合并，针对100mm tris hcl、200mm nacl、ph 8.0透析，无菌过滤(0.2μm)。内毒素载量由charles river pts endosafe系统测定并且低于5eu/ml。[0303]实施例2-抗体的生产[0304]根据本发明的抗pam抗体可以如下合成：[0305]合成了用于免疫接种的pam肽，参见表1，(peptides&elephants,hennigsdorf,germany)，带有一个额外的c末端半胱氨酸(如果所选pam序列中不存在半胱氨酸)残基，用于将肽与牛血清白蛋白(bsa)缀合。通过使用sulfolink偶联凝胶(perbio-science,bonn,germany)将肽共价连接到bsa。根据perbio的手册进行偶联程序。重组pam由hennigsdorf的invivo biotech services生产，如实施例1中所述。[0306]表1：pam免疫肽[0307][0308]*根据seq id no.1；氨基酸(aa)[0309]balb/c小鼠在第0天腹膜内(i.p.)注射100μg重组pam或100μg pam-肽-bsa-缀合物(在titermax gold adjuvant中乳化)，在第14天分别注射100μg和100μg(在完全弗氏佐剂中乳化)以及在第21天和第28天分别注射50μg和50μg(在不完全弗氏佐剂中)。所述动物在第40天接受静脉内(i.v.)注射50μg重组pam，或在第45天接受溶解在盐水中的50μg pam-肽-bsa-缀合物。三天后处死小鼠并进行免疫细胞融合。[0310]将经免疫接种小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系sp2/0的细胞与1ml50％聚乙二醇在37℃下融合30s。洗涤后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在hat培养基(补充有20％胎牛血清和hat补充剂的rpmi 1640培养基)中生长来选择杂交克隆。一周后，将hat培养基更换为ht培养基，传代三次，接着恢复为正常细胞培养基。[0311]在融合两周后，主要筛选细胞培养上清液中的重组pam结合igg抗体。因此，将重组pam(seq id no.10)固定在96孔板(100ng/孔)中，并与每孔50μl细胞培养上清液在室温下温育2小时。洗涤板后，加入50μl/孔pod-兔抗小鼠igg并在室温下温育1h。[0312]在接下来的洗涤步骤之后，将50μl色原溶液(柠檬酸盐/磷酸氢盐缓冲液中的3.7mm邻苯二胺，0.012％h2o2)加入每个孔中，在室温下温育15分钟，并且通过加入50μl 4n硫酸来终止显色反应。在490mm处检测吸光度。[0313]将阳性测试的微培养物转移到24孔板中进行增殖。在重新测试后，使用限制稀释技术克隆和重新克隆选定的培养物，并确定同种型。[0314]针对重组人pam或pam肽产生的抗体经由标准抗体生产方法(marx等人,1997)生产并经由蛋白a纯化。根据sds凝胶电泳分析，抗体纯度≥90％。[0315]实施例3-pam活性测定[0316]来自自我报告的健康志愿者的人血清或肝素锂血浆被用作人天然pam的来源。每个样品(20μl)在100mm tris-hcl中稀释两倍，一式两份。通过加入160μl pam反应缓冲液(100mm tris-hcl ph 7.5、6.25μm cuso4、2.5mm l-抗坏血酸盐、125μg/ml过氧化氢酶、62.5μm阿玛他汀(amastatin)、250μm亮抑酶肽(leupeptin)、36ng/ml合成adm-gly和375μg/ml nt-adm抗体)来起始酰胺化反应。之后，将100μl重复样品的每个单独反应物组合并转移到20μl的200mm edta中以终止酰胺化反应并产生t＝0分钟反应时间点，接着在37℃下温育40分钟。之后用10μl 200mm edta停止未终止的反应。为了确定pam活性，使用bio-adm免疫测定(weber等人,2017)在每个样品中对作为反应产物的bio-adm进行量化。使用已知活性的人重组pam生成的6点校准曲线来校准酰胺化测定。以相同方式处理样品和校准物。经由bio-adm免疫测定确定的每个样品的相对光单位(rlu t40min-t0min)针对校准物的rlu(t40min-t0min)进行拟合，以确定样品中的pam活性。pam活性被描述为以每小时和每l样品中形成的μg bio-adm计的“肾上腺髓质素成熟活性”(ama)。[0317]典型的pam校准曲线示于图3中。来自n＝120名自我报告的健康志愿者的肝素锂样品中ama的分布示于图4中。肝素锂ama的中值[iqr]为18.4μg/(l*h)[13.5-21.9]。第10个和第90个百分位数分别为10.5和24.2μg/(l*h)。第2.5个、第97.5个和第99个百分位数分别为8.1、31.6和40.8μg/(l*h)。此外，测量了来自n＝20名受试者的匹配血清样品，并揭示出高度显著的相关性(r＝0.89；p《0.0001)(图5)，尽管与肝素锂相比，血清中的ama值低约40％。[0318]实施例4–pam免疫测定[0319]如实施例1所述产生针对重组pam(seq id no.10)和pam肽(seq id no.11至24)的抗体。[0320]所使用的技术是基于吖啶酯标记的夹心发光免疫测定。[0321]4.1.标记化合物(示踪剂)[0322]纯化的抗体(0.2g/l)通过在10％标记缓冲液(500mmol/l磷酸钠，ph 8.0)中与1:5mol/l比率的macn-吖啶-nhs-酯(1g/l，invent gmbh)一起在22℃下温育20min进行标记。加入5％1mol/l tris-hcl ph 8.0持续10min后，经由centripure p10柱(emp biotech gmbh)将相应抗体与游离标记分离。将纯化的标记抗体稀释在300mmol/l磷酸钾、100mmol/l nacl、10mmol/l na-edta、5g/l牛血清白蛋白(ph 7.0)中。最终浓度为每150μl约20ng标记抗体。[0323]4.2.固相[0324]白色聚苯乙烯微量滴定板(greiner bio-one international ag)用相应的抗体(每孔2μg/0.2ml，50mmol/l tris-hcl，100mmol/l nacl，ph 7.8)包被(20℃下18h)。用30g/l karion、5g/l bsa(不含蛋白酶)、6.5mmol/l磷酸二氢钾、3.5mmol/l磷酸二氢钠(ph 6.5)封闭后，将板真空干燥。[0325]4.3校准[0326]使用如实施例1中所述的重组pam稀释液对测定进行校准。典型浓度范围在5–5,000ng/ml范围内。[0327]4.4.pam免疫测定：[0328]4.4.1.pam-lia[0329]一步版本：将50μl样品/校准物移液到预包被微量滴定板中。在缓冲液(300mmol/l磷酸钾、100mmol/l nacl、10mmol/l na-edta、50μmol/l阿玛他汀、100μmol/l亮抑酶肽、0.1％牛igg、0.02％小鼠igg、0.5％bsa，ph 7.0)中加入200μl标记抗体后，将微量滴定板在2-8℃下在600rpm搅拌下温育20h。通过用洗涤溶液(20mmol/l pbs、1g/l triton x-100，ph 7.4)洗涤5次(每孔每次350μl)去除未结合的示踪剂。通过使用centro lb 960微量滴定板发光读数器(berthold technologies)测量孔结合化学发光，每孔1s。[0330]两步版本：将50μl样品/校准物移液到预包被微量滴定板中。添加200μl缓冲液(如一步版本中所述)后，将微量滴定板在600rpm搅拌下在2-8℃下温育15-20h。通过用洗涤溶液洗涤4次(每孔每次350μl)除去未结合的样品，随后加入200μl示踪剂材料并在室温下温育微量滴定板2h。通过用洗涤溶液洗涤4次(每孔每次350μl)去除未结合的示踪剂。通过使用centro lb 960微量滴定板发光读数器(berthold technologies)测量孔结合化学发光，每孔1s。[0331]结果：用重组pam以及血液样品测试结合于固相的抗体以及针对不同pam免疫肽以及全长(重组)pam的标记抗体(参见实施例2)。不同抗体组合的示例性标准曲线示于图6(a-l)中。图6(a-j)以重组pam作为校准材料：(a)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽9(seq id no.19)的抗体；(b)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽10(seq id no.20)的抗体；(c)固相：针对肽9(seq id no.19)的抗体，示踪剂：针对肽10(seq id no.20)的抗体；(d)固相：针对重组pam(seq id no.10)的抗体，示踪剂：针对重组pam(seq id no.10)的抗体；(e)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对重组pam(seq id no.10)的抗体；(f)固相：针对肽13(seq id no.23)的抗体，示踪剂：针对肽10(seq id no.20)的抗体；(g)固相：针对肽14(seq id no.24)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体；(h)固相：针对重组pam(seq id no.10)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体；(i)固相：针对肽13(seq id no.23)的抗体，示踪剂：针对肽9(seq id no.19)的抗体；(j)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体。图6(k和l)以天然pam(edta-血浆)作为校准材料：(k)固相：针对肽14(seq id no.24)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体；(l)固相：针对肽10(seq id no.20)的抗体，示踪剂：针对肽13(seq id no.23)的抗体。对于所有抗体组合，在人血浆和血清样品中也可检测到pam。[0332]4.4.2.用于检测pam活性的酶捕获测定(eca)[0333]建立酶捕获测定以检测pam的活性。将50μl样品/校准物移液到预包被微量滴定板中(如4.2.中所述)。加入200μl缓冲液(300mmol/l磷酸钾、100mmol/l nacl、50μmol/l阿玛他汀、100μmol/l亮抑酶肽、0.1％牛igg、0.02％小鼠igg、0.5％bsa，ph 7.0)后，在600rpm搅拌下将微量滴定板在室温下温育1h。通过用洗涤溶液洗涤4次(每孔每次350μl)除去未结合的样品，随后每孔加入200μl反应缓冲液并在37℃下温育。除了使用100μg/ml nt-adm-抗体和288ng/ml adm-gly之外，包括所有组分和最终浓度的反应缓冲液如实施例3中所述。通过将10μl的每个单独反应物转移到190μl含有edta的缓冲液(300mmol/l磷酸钾、100mmol/l nacl、10mmol/l na-edta、50μmol/l阿玛他汀、100μmol/l亮抑酶肽、0.1％牛igg、0.02％小鼠igg、0.5％bsa，ph 7.0)中，在若干时间点终止反应。将终止的反应应用于bio-adm免疫测定，以量化所产生的bio-adm。使用针对pam免疫肽10(seq id no.20)的抗体作为固相的典型标准曲线示于图6m中。[0334]图6n示出了使用针对全长重组pam(seq id no.10)的抗体的典型标准曲线。其他针对肽7(seq id no.17)、肽8(seq id no.18)、肽9(seq id no.19)、肽13(seq id no.23)和肽14(seq id no.24)的抗体被用作酶捕获测定的固相，并测量重组pam或肝素血浆样品(250μl)的pam活性(图6o)。这些结果表明，抗体可以用于使用eca技术检测人体样品中的pam活性。在血浆和血清样品中也可检测到pam。[0335]在另一个步骤中，使用pam-lia(针对全长pam的固相抗体，针对肽13[seq id no.23]的示踪抗体)测定来自健康志愿者(n＝26)的肝素样品中的pam活性(如实施例3中所述)和pam浓度。pam活性和pam浓度显著相关，如图6p中所示(spearman r＝0.49，p＝0.0109)。[0336]实施例5–adm-gly免疫测定[0337]基于用于生物活性adm的weber等人(weber等人,2017.jalm2(2):222-233)利用以下修改对adm-gly进行量化：用macn-吖啶鎓-nhs标记的用于adm-gly检测的示踪抗体针对adm-gly的c末端甘氨酸。所述测定用合成的adm-gly校准。adm-gly的检测限(lod)为10pg/ml。针对adm的c末端甘氨酸的抗体与bio-adm的交叉反应性以浓度依赖性方式介于6％和50％之间的范围内。所有确定的adm-gly浓度都针对交叉反应性进行如下校正：对于每个adm-gly定量，使用bio-adm免疫测定对相应样品中的bio-adm进行额外的定量。相应的bio-adm值用于确定在bio-adm校准曲线上用针对adm的c末端甘氨酸的抗体产生的信号(rlu)。所确定的信号(rlu)用于使用adm-gly校准曲线计算假阳性adm-gly浓度(pg/ml)。从最初确定的adm-gly浓度中减去该浓度。典型的标准曲线示于图7中。[0338]实施例6-健康受试者中的疾病预测[0339]马尔默预防项目(preventive project，mpp)在20世纪70年代中期获得资助，旨在探索普通人群的cv风险因素，并招募了居住在马尔默的33,346名个体(fedorowski等人,2010.eur heart j 31:85–91)。在2002年至2006年期间，共有18,240名原始参与者响应了邀请(参与率，70.5％)，并进行了包括全面体格检查和血液样品采集在内的筛查(fava等人,2013.hypertension 2013；61:319–26)。mpp的复查在本研究中被视为基线。基线时有既往cvd的受试者被排除在外。所有参与者都获得了知情同意，并且瑞典隆德的隆德大学伦理委员会(ethical committee of lund university,lund,sweden)批准了研究方案。[0340]商业全自动均相时间分辨荧光免疫测定用于测量血浆中的mr-proadm(brahms mr-proadm kryptor；brahms gmbh,hennigsdorf,germany)(caruhel等人,2009.clin biochem.42(7-8):725-8)。[0341]按照weber等人,2017(weber等人,2017.jama 2(2):222-233)的描述测量bio-adm。如实施例3中所述，在来自mpp的4942个血清样品中测定ama。每个样品一式两份地测量。以相同方式处理样品、对照和校准物。分层至四分位数后ama的基线临床特征示于表2中。[0342]表2：根据所分析受试者在基线时的ama四分位数(q)的基线临床特征[0343][0344][0345]n/a：不适用[0346]统计分析：数值表示为平均值和标准差、中值和四分位距(iqr)，或适当时的计数和百分比。使用kruskal-wallis检验进行连续变量的组比较。对生物标志物数据进行对数转换。cox比例风险回归用于在单变量和多变量分析中分析风险因素对生存的影响。对所有变量的比例风险假设进行了测试。对于连续变量，风险比(hr)被标准化以描述一个iqr的生物标志物变化的hr。给出了风险因素的95％置信区间(ci)和卡方(wald检验)的显著性水平。通过模型似然比卡方统计量评估每个模型的预测值。一致性指数(c指数)作为效果度量给出。它等效于二元结果采用的auc概念。对于多变量模型，给出了c指数的引导校正版本。通过kaplan-meier方法绘制的生存曲线用于说明目的。为了检验pam与临床变量的独立性，我们对嵌套模型使用似然比卡方检验。所有统计检验都是2尾的并且两侧p值为0.05被认为是显著性的。[0347]6.2.阿尔茨海默病的预测ama0.68(0.6-0.85)p《0.000010.588(0.535-0.641)8.51ama、bio-adm p《0.0020.59812.48mr-proadm1.36(1.08-1.72)p《0.050.587(0.532-0.642)6.27ama、mr-proadm p《0.00050.61216.51[0361]6.5.心血管病症的预测[0362]对来自mpp群组的具有关于死亡和心血管事件的信息的4942个样品进行了心血管病症分析。瑞典国家患者登记处(snpr)要求提供关于心血管事件和诊断的信息。登记册中的诊断是根据国际疾病分类(icd)代码的不同修订收集的。[0363]自1987年以来，snpr包括瑞典的所有住院护理，此外，还包含2000年之后记录的私人和公共护理人员的门诊就诊数据，包括日间手术和精神科护理。pam活性(ama)的确定如实施例3中所述。在来自mpp研究群组的一批总共4942份血清样品中，在12.8年的随访期间，278名受试者发生了心力衰竭(偶发性心力衰竭)并且633名受试者发生了心房颤动(偶发性心房颤动)。[0364]血清ama升高强烈预测偶发性心力衰竭(分析中排除了83例流行性hf病例)，风险比(hr)为1.537(ci 1.169–2.021；p《0.0007)(表5)。图13示出了使用ama预测心力衰竭的kaplan-meier曲线。高ama与发生心力衰竭的风险增加相关。[0365]血清ama升高强烈预测偶发性心房颤动(分析中排除了267例流行性af病例)，风险比(hr)为1.459(ci 1.214–1.752；p《0.0001)(表5)。图14示出了使用ama预测心房颤动的kaplan-meier曲线。高ama与发生心房颤动的风险增加相关。[0366]表5：心血管病症的预测[0367][0368]实施例7–疾病的诊断[0369]7.1.阿尔茨海默病的诊断[0370]27名确诊阿尔茨海默病的个体的血清样品获自invent diagnostica gmbh。ad诊断基于认知测试(cerad、demtec、mmst和画时钟测试)以及mri(磁共振成像)和ct扫描。作为对照，使用了来自自我报告的健康志愿者的67份血清样品。如实施例3中所述检测ama。[0371]如图15中所示，与对照群组相比，ad群组的患者显示显著降低的血清ama(n＝67；p《0.0001)。[0372]7.2.心血管和代谢病症的诊断[0373]在来自mpp研究群组的一批总共4942份血清样品中，存在267例流行性心房颤动、83例流行性慢性心力衰竭和533例流行性糖尿病。与没有流行性心房颤动的个体(平均ama：12.8个ama单位，n＝4675)相比，在流行性心房颤动(平均ama：13.92个ama单位，n＝267)中观察到血清ama显著升高(p《0.0001)。与没有流行性心力衰竭的个体(平均ama：12.84个ama单位，n＝4859)相比，在流动性慢性心力衰竭(平均ama：14.31个ama单位，n＝83)中观察到血清ama显著升高(p＝0.0019)。与没有流行性糖尿病的个体(平均ama：12.89个ama单位，n＝4409)相比，在流行性糖尿病(平均ama：12.69个ama单位，n＝533)中观察到血清ama显著降低(p＝0.0035)。[0374]实施例8–通过天然和重组pam将adm-gly转化为bio-adm[0375]a)通过天然pam将adm-gly转化为bio-adm[0376]人类肝素锂血浆(3个具有低adm-gly(《50pg/ml)的样本池)被用作人类天然pam的来源。酰胺化反应在37℃下以120μl的总体积进行。向96μl血浆中掺入adm-gly(5ng/ml最终浓度)。作为对照，将等体积的100mm tris-hcl ph 7.5加入到未处理的血浆中。使制备的样品在室温下冷却15分钟。通过加入24μl pam-反应缓冲液开始酰胺化反应，导致最终浓度分别为2mm l-抗坏血酸盐和5μm cuso4，adm-gly的最终浓度为4ng/ml。在37℃温育0min、30min、60min和90min后，通过加入na-edta(20mm最终浓度)终止反应。使用最近描述(weber等人,2017.jalm 2(2):222-233)的bio-adm免疫测定对反应样品中的bio-adm浓度进行量化。在不添加外源adm-gly的情况下，在低adm-gly样品中未检测到bio-adm浓度的变化。将adm-gly加入到样品中后，在90分钟内检测到线性形成bio-adm(图16)。[0377]b)通过外源(重组)pam将adm-gly转化为bio-adm[0378]在另一项实验中，我们研究了通过天然人血浆pam从内源adm-gly形成bio-adm以及添加外源重组人pam的影响。人肝素锂血浆(5个具有高adm-gly(》400pg/ml)的样本池)用作人天然pam和人天然adm-gly的来源。酰胺化反应在37℃下以315μl的总体积进行。向250μl血浆中掺入65μl反应缓冲液(含或不含重组pam)(参见实施例1)以引发酰胺化反应。反应样品中的最终浓度为：2mm l-抗坏血酸盐、5μm cuso4、50μm阿玛他汀、200μm亮抑酶肽和100μg/ml过氧化氢酶。外源重组pam的浓度为500ng/ml。在37℃温育0min、30min、55min和80min后，通过添加na-edta(20mm最终浓度)终止反应。使用最近描述(weber等人,2017.jalm 2(2):222-233)的bio-adm免疫测定对反应样品中的bio-adm浓度进行量化。adm-gly的浓度如实施例5中所述测定。[0379]如图17所示，内源人pam酶能够以时间依赖性方式将内源人adm-gly转化为bioadm。此外，adm-gly/bio-adm比率以时间依赖性方式向bio-adm移动(图18)。这些数据清楚地表明，pam不仅在分泌囊泡的管腔中而且在循环中发挥其肽激素的c末端酰胺化功能。通过添加外源重组人pam，反应样品中的pam浓度大致翻倍，导致内源人adm-gly(图17)的bio-adm合成速率在每个时间点平均增加1.8倍。此外，adm-gly消耗随着adm-gly/bio-adm比率向bio-adm的更快转变而增加(图18)。这些体外研究结果表明，重组人pam在将潜在不利的循环adm-gly/bio-adm比率转变为bio-adm方面具有出乎意料的高潜力。[0380]实施例9–重组pam的应用(pam在大鼠中的体内半衰期)[0381]两只动物(wistar大鼠，雄性，2-3月龄)接受17μg重组人pam(参见实施例1)作为单剂量，总体积为500μl(在磷酸盐缓冲盐水中)。一只对照动物接受500μl pbs。在应用前30min和应用后30min、2h、4h、8h、24h和48h分别进行血液取样(肝素锂血浆)。[0382]如实施例3中所述测定血浆样品中的ama。应用前的ama被定义为100％，并且应用后的ama相对于应用前的ama进行归一化。三只动物的ama(％)示于图19中。pam酶的半衰期使用单相衰减拟合(graph pad prism)由酶组动物的平均化活性确定(图20)。pam酶的半衰期为47min。[0383]在第二个实验中，三只动物(wistar大鼠，雄性，2-3月龄)接受25μg重组人pam(参见实施例3)作为单剂量，总体积为500μl。一只对照动物接受500μl pbs。在应用前15分钟和应用后15、30、45、60、90min以及2h、3h、4h和8h分别进行血液取样(肝素锂血浆)。如上所述测定pam酶的半衰期，其半衰期为60min，与上述测定相当。[0384]这些数据清楚地证明了静脉内施用的重组人pam在体内将循环adm-gly转化为bio-adm的能力。重组人pam的施用导致bio-adm增加，在4h后达到最大值，pam酶的半衰期约为53.5min。[0385]实施例10–在大鼠中注射重组pam和抗坏血酸盐的组合[0386]将不含内毒素的重组pam(sinobiological)缓冲液交换到无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs,dulbecco)中并调节至50μg/ml。在当地药房购买无菌注射用抗坏血酸盐溶液(200mg/ml，维生素c 1000，pharma)，并在无菌条件下用pbs调节至40mg/ml。对于pam和抗坏血酸盐的联合注射，分别制备等体积的化合物(pam和抗坏血酸盐分别为100μg/ml或80mg/ml)。两种化合物在注射前直接组合，导致pam浓度为50μg/ml并且抗坏血酸盐浓度为40mg/ml。无菌pbs用作安慰剂。所有样品在使用前均保存在-80℃。动物(雄性wistar大鼠，2-3月龄)被分成4组(安慰剂、抗坏血酸盐、pam、pam+抗坏血酸盐)，每组3只动物。个组中的每只动物经静脉内接受500μl相应化合物的单剂量注射。在注射前30min和注射后15、30、45、60、120、180、240和300min以肝素锂形式进行血液取样。如实施例3中所述确定pam活性。[0387]当在测定中不添加外源抗坏血酸盐的情况下进行测量时，在大鼠中注射抗坏血酸盐导致内源pam活性不显著升高(图21a，空心三角形)。pam活性在注射后60分钟内保持升高，在注射后15min后达到最大升高。注射后120min后测量的活性与安慰剂组中的pam活性相当。当在不添加外源抗坏血酸盐的情况下测量时，在大鼠中注射重组人pam导致循环pam活性显著升高(图21a，实心方块)。与安慰剂组相比，pam活性的最大升高在注射后15分钟达到6倍。循环pam活性在注射后60分钟(30min、45min和60min)内保持显著升高，在此期间呈下降趋势。注射120min后测量的pam活性与安慰剂组的pam活性没有显著差异。当在没有外源抗坏血酸盐添加的情况下测量时，在大鼠中注射重组人pam和抗坏血酸盐的组合导致循环pam活性显著升高(图21a，空心方块)。与安慰剂组相比，pam活性的最大升高在注射后15分钟达到24倍。循环pam活性在注射后60分钟(30min、45min、60min)内保持显著升高，在此期间呈下降趋势。与安慰剂组中的pam活性相比，注射后120min后测量的活性保持显著升高。应用不含酶和抗坏血酸盐的安慰剂不会增加循环pam活性(图21a，空心圆圈)。[0388]对所有治疗组的循环中的bio-adm的测定出人意料地揭示了循环bio-adm浓度以时间依赖性方式升高：[0389]应用抗坏血酸盐后，bio-adm浓度在15min后和30min后升高了1.4倍(不显著)，在45min后升高了1.2倍，并在60分钟后恢复到基线水平(图21b，实心圆圈)。在应用重组人pam(图21b，空心方块)后，bio-adm浓度在15min后显著升高了1.8倍并且在30min后升高了2.4倍。45min后bio-adm浓度下降但仍显著升高2倍。60min后bio-adm浓度与安慰剂组相比没有显著差异。在pam+抗坏血酸盐组合组中观察到循环bio-adm的最高升高(图21b，实心方块)：在应用重组人pam和抗坏血酸盐后，bio-adm浓度在15min后高度显著升高了2.3倍，并且在30min后升高了3.2倍。45min后bio-adm浓度下降但仍显著升高2.8倍。60min后bio-adm浓度仍然升高了1.6倍，但与安慰剂组相比差异不显著。在所有3组(抗坏血酸盐、pam和pam+抗坏血酸盐)中，120分钟后bio-adm浓度与安慰剂组没有显著差异。应用不含酶且不含抗坏血酸盐的安慰剂不会增加血浆中的bio-adm浓度(图21b，空心圆圈)。对于每个时间点，安慰剂组的bio-adm浓度被设定为100％，并且治疗组中的bio-adm浓度相对于安慰剂组进行归一化。[0390]这些数据清楚地证明了静脉内施用重组人pam以及重组人pam与抗坏血酸盐的组合在体内将循环adm-gly转化为bio-adm的能力。重组人pam的施用导致bio-adm增加，在30分钟后达到最大值。[0391]如图22中所示，重组人pam在大鼠中的半衰期为52.7分钟。所测定的半衰期与实施例9中测定的半衰期相当(图20)，而半衰期测定的精确度通过在注射后0分钟和60分钟之间生成额外的数据点而提高。[0392]实施例11-抗坏血酸盐对循环人pam活性的影响[0393]健康志愿者(n＝4)接受了2000mg维生素c(dr.scheffler，维生素c)作为口服单剂量。在施用前以及施用后1、2和3小时进行血液取样。如实施例3中所述，在不添加外源抗坏血酸盐的情况下从肝素锂血浆和血清测定基础酰胺化活性并示于图23中。[0394]令人惊讶的是，与抗坏血酸盐摄入前的pam活性相比，口服抗坏血酸盐摄入后1h在不添加外源抗坏血酸盐的情况下测定的pam活性显著升高1.7倍(图23)。此外，口服抗坏血酸盐摄入后2h和3h后，pam活性保持升高了约2倍。这些数据清楚地表明口服抗坏血酸盐摄入适用于调节人体循环pam活性。[0395]序列[0396]seq id no:1-prepro-pam同工型1as 1-973[0397][0398]seq id no:2-prepro-pam同工型2as 1-868[0399][0400]seq id no.:3-prepro-pam同工型3as(seq id no.1的氨基酸829-896缺失)[0401][0402]seq id no.4-prepro-pam同工型4(seq id no.1的氨基酸829-914缺失)[0403][0404]seq id no.5-prepro-pam同工型5(在位置896中具有另一个aa的同工型1)[0405][0406]seq id no.6-prepro-pam同工型6(seq id no.1的氨基酸897-914缺失)[0407][0408]seq id no.7-pam的phm亚基[0409][0410]seq id no.8-pam的pal亚基[0411][0412]seq id no.9–人血清白蛋白信号序列[0413][0414]seq id no.10-重组人pam的序列[0415][0416]seq id no.11-肽1(pam seq id no.1的aa 42-56)[0417][0418]seq id no.12-肽2(pam seq id no.1的aa 109-128)[0419][0420]seq id no.13-肽3(pam seq id no.1的aa 168-180)[0421][0422]seq id no.14-肽4(pam seq id no.1的aa 204-216)[0423][0424]seq id no.15-肽5(pam seq id no.1的aa 329-342)[0425][0426]seq id no.16-肽6(pam seq id no.1的aa 291-310)[0427][0428]seq id no.17-肽7(pam seq id no.1的aa 234-244)[0429][0430]seq id no.18-肽8(pam seq id no.1的aa 261-276)[0431][0432]seq id no.19-肽9(pam seq id no.1的aa 530-557)[0433][0434]seq id no.20-肽10(pam seq id no.1的aa 611-631)[0435][0436]seq id no.21-肽11(pam seq id no.1的aa 562-579)[0437][0438]seq id no.22-肽12(pam seq id no.1的aa 745-758)[0439][0440]seq id no.23-肽13(pam seq id no.1的aa 669-687)[0441][0442]seq id no.24-肽14(pam seq id no.1的aa 710-725)[0443]









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