两步基因交换的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术两步基因交换1.相关申请的交叉引用2.本技术要求于2020年1月09日提交的美国临时专利申请号62/958,805的权益，其全部内容通过援引以其全文并入本文。技术领域：：3.本公开涉及植物分子生物学领域，尤其涉及用于改变细胞的基因组的组合物和方法。背景技术：：：4.重组dna技术使得在靶基因组位置处插入dna序列和/或修饰特定内源染色体序列成为可能。已经使用了采用位点特异性重组系统的位点特异性整合技术以及其他类型的重组技术来在各种生物体中产生目的基因的靶向插入。基因组编辑技术如设计师的锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应子核酸酶(talen)或归巢大范围核酸酶可以用于产生靶向基因组干扰，但这些系统倾向于具有低特异性并且使用需要对每个靶位点进行重新设计的经设计的核酸酶，这使得它们的制备成本高昂且耗时。5.已经鉴定了利用古细菌或细菌适应性免疫系统的较新技术，称为crispr(成簇的规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats))，其包含效应子蛋白的不同结构域，这些效应子蛋白包含多种活性(dna识别、结合和任选择地切割)。6.已经显示直接靶向dna双链断裂(dsb)可显著增加基因组编辑的频率和准确性。crispr-cas技术已经成功应用于多种植物物种的基因组编辑，然而，不同类型的基因组编辑应用的成功率却大相径庭。基因或基因任何部分或启动子的替换是困难的，因为它需要发生两个事件-基因/基因片段的缺失和通过同源定向修复(hdr)以非常精确的方式进行新序列的插入。7.尽管鉴定了这些系统中的一些，但仍需要用于提高替换细胞基因组中的内源多核苷酸的频率和/或功效的方法和组合物。技术实现要素：8.提供了用于用另一个多核苷酸替换细胞基因组中的一个多核苷酸，例如用提供疾病耐受性的等位基因替换负责疾病易感性的等位基因的方法和组合物。还提供了用于替换包含高度重复区域的基因组中的多核苷酸和用于改善生物体的表型的方法和组合物。9.附图和序列表的说明10.根据下列的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本公开，所述详细描述和附图以及序列表形成本技术的一部分。11.图1描绘了用于用另一个(替换)多核苷酸替换细胞基因组中的一个(例如，内源)多核苷酸序列的两步方法。wus＝wuschel形态发生因子；bbm＝babyboom形态发生因子；cas9＝代表性cas内切核酸酶；grna＝指导rna；nptii＝终止子；ts1＝靶位点1；ts2＝靶位点2。12.图2是玉米8号染色体的一部分的示意图，该染色体包含多个北方叶枯病(nlb)疾病易感性/抗性基因座。13.图3是创建疾病抗性近交玉米系的示意图。14.图4示出了玉米中nlb18基因座处用疾病抗性基因取代疾病易感基因的两步基因交换为玉米植物赋予疾病抗性表型。15.图5示出了玉米中nlb18基因座处的基因表达，用于四种等位基因交换系的表达。hom＝具有nlb18基因的2个拷贝的纯合子；null＝来自相同转化的不含nlb18-bc26b的分离体；ti＝渗入到相同系中的nlb18-bc26n；wt＝野生型种质，没有nlb18-bc26n。具体实施方式16.本文公开了用于内源多核苷酸的两步交换和用异源替换多核苷酸进行替换的方法和组合物。内源多核苷酸可以是宿主生物体的基因组内天然存在的，或者可以是异源的并且是先前引入的。17.除非另有指定，否则权利要求书和说明书中使用的术语如下文阐述定义。必须注意，除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。18.如本文所用，“核酸”意指多核苷酸，并且包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸还可以包括片段和修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用以表示单链或双链的rna和/或dna和/或rna-dna的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5’‑单磷酸酯形式发现)以其单字母名称表示如下：“a”表示腺苷或脱氧腺苷(分别用于rna或dna)，“c”表示胞苷或脱氧胞苷，“g”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“u”表示尿苷，“t”表示脱氧胸苷，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。19.术语“基因组”当应用于原核或真核细胞或生物体细胞时不仅涵盖在细胞核内发现的染色体dna，还涵盖在细胞的亚细胞组分(例如线粒体、或质体)内发现的细胞器dna。[0020]“可读框”缩写为orf。[0021]术语“选择性杂交”包括参考在严格的杂交条件下将核酸序列杂交到特定的核酸靶序列上，相比其杂交到非靶核酸序列和基本上排除非靶核酸，该杂交达到可检测地更大程度(例如，至少为背景值的2倍)。选择性杂交序列典型地彼此具有约至少80％序列同一性、或90％序列同一性、高达并且包括100％序列同一性(即，完全互补)。[0022]术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括提及在体外杂交测定中探针将与其靶序列选择性杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交条件和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度为小于约1000个核苷酸，任选地是长度小于500个核苷酸。通常，严格条件将是以下条件：在ph7.0至8.3下盐浓度为小于约1.5mna离子、通常约0.01至1.0mna离子浓度(或其他一种或多种盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃，并且对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。添加去稳定剂如甲酰胺也可以实现严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下用30％至35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50℃至55℃下在1x至2xssc(20xssc＝3.0mnacl/0.3m柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1mnacl、1％sds中杂交，并且在55℃至60℃下在0.5x至1xssc中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中杂交，并且在60℃至65℃下在0.1xssc中洗涤。[0023]“同源”意指dna序列是相似的。例如，在供体dna上发现的“与基因组区域同源的区域”是与细胞或生物体基因组中给定的“基因组序列”具有类似序列的dna的区域。同源的区域可以具有足以促进在切割的靶位点处的同源重组的任何长度。例如，同源的区域的长度可以包括至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得同源的区域具有足够的同源性以与相应的基因组区域进行同源重组。“足够的同源性”表示两个多核苷酸序列具有足够的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总长度以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可以通过在序列的整个长度上的百分比序列同一性和/或通过包含局部相似性(例如具有100％序列同一性的连续核苷酸)的保守区域以及在序列长度的一部分上的百分比序列同一性来描述。[0024]如本文所用，“基因组区域”是存在于靶位点任一侧上的细胞的基因组中的染色体的区段，或者可替代地，还包含靶位点的一部分。基因组区域可以包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800。5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得基因组区域具有足够的同源性以与相应的同源区域进行同源重组。[0025]如本文所用，“同源重组(hr)”包括在同源的位点处的两个dna分子之间的dna片段的交换。同源重组的频率受多个因素影响。不同的生物体相对于同源重组的量和同源与非同源重组的相对比例而变化。通常，同源区域的长度会影响同源重组事件的频率：同源区域越长，频率越高。为观察同源重组而需要的同源区域的长度也是随物种而异的。在许多情况下，已经利用了至少5kb的同源性，但已经观察到具有仅25-50bp的同源性的同源重组。参见，例如，singer等人，(1982)cell[细胞]31：25-33；shen和huang，(1986)genetics[遗传学]112：44l-57；watt等人，(1985)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]82：4768-72，sugawara和haber，(1992)molcellbiol[分子细胞生物学]12：563-75，rubnitz和subramani，(1984)molcellbiol[分子细胞生物学]4：2253-8；ayares等人，(1986)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]83：5199-203；liskay等人，(1987)genetics[遗传学]115：161-7。[0026]在核酸的或多肽的序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”是指在两个序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定的比较窗口上比对最大对应度时是相同的。[0027]“序列同一性的百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)比较两个序列的最佳比对时，该多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过以下方式计算所述百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将所述结果乘以100以产生序列同一性的百分比。百分比序列同一性的有用实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或从50％至100％的任何百分比。可以使用本文描述的任何程序确定这些同一性。[0028]序列比对和百分比同一性或相似性计算可以使用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于lasergene生物信息计算包(dnastar公司(dnastarinc.)，麦迪逊(madison)，威斯康星州)的megaligntm程序。在此申请的上下文中，应当理解的是，在使用序列分析软件来分析的情况下，分析的结果将基于参考的程序的“默认值”，除非另有说明。如本文所用，“默认值”将意指当第一次初始化时，最初加载该软件的任何一组值或参数。[0029]“比对的clustalv方法”对应于标记为clustalv的比对方法(由以下描述：higgins和sharp，(1989)cabios5：151-153；higgins等人，(1992)computapplbiosci[生物科学中的计算机应用]8：189-191)，并且发现于lasergene生物信息计算包(dnastar公司，麦迪逊，威斯康星州)的megaligntm程序中。对于多重比对，默认值对应于空位罚分(gappenalty)＝10和空位长度罚分(gaplengthpenalty)＝10。使用clustal方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为ktuple＝1、空位罚分＝3、窗口(window)＝5、以及存储的对角线(diagonalssaved)＝5。对于核酸，这些参数是ktuple＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、并且存储的对角线＝4。使用clustalv程序比对序列后，可能通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。“比对的clustalw方法”对应于标记为clustalw的比对方法(由以下描述：higgins和sharp，(1989)cabios5：151-153；higgins等人，(1992)computapplbiosci[生物科学中的计算机应用]8：189-191)，并且发现于lasergene生物信息计算包(dnastar公司，麦迪逊，威斯康星州)的megaligntmv6.1程序中。用于多重比对的默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(delaydivergenseqs，％)＝30、dna转换权重＝0.5、蛋白质权重矩阵＝gonnet系列、dna权重矩阵＝iub)。使用clustalw程序比对序列后，可能通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。除非另有说明，本文中提供的序列同一性/相似性值是指使用gap版本10(gcg，accelrys公司，圣迭戈，加利福尼亚州)使用以下参数获得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用50的空位产生罚分权重和3的空位长度延伸罚分权重以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用8的空位产生罚分权重和2的空位长度延伸罚分权重以及blosum62评分矩阵(henikoff和henikoff，(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]89：10915)。gap使用needleman和wunsch(1970)jmolbiol[分子生物学杂志]48：443-53的算法来找到使匹配数目最大化并且使空位数目最小化的两个完整序列的比对。gap考虑所有可能的比对和空位位置，并且使用匹配碱基的单位中的空位产生罚分和空位延伸罚分，产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。“blast”是美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)提供的用于寻找生物序列之间的相似性的区域的搜索算法。该程序将核苷酸或者蛋白质序列与序列数据库比较，并计算匹配的统计显著性以鉴定出与查询序列具有足够的相似性的序列，这样使得相似性不会被预测为已经随机发生。blast报告鉴定的序列和它们与查询序列的局部比对。本领域技术人员很清楚地理解，许多水平的序列同一性在鉴定来自其他物种的多肽或修饰的天然的或合成的多肽中是有用的，其中此类多肽具有相同或相似的功能或活性。百分比同一性的有用实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或从50％至100％的任何百分比。实际上，在描述本公开中，从50％至100％的任何氨基酸同一性会是有用的，如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。[0030]多核苷酸和多肽序列、其变体、以及这些序列的结构关系，可以用术语“同源性”、“同源的”、“基本上相同的”、“基本上类似的”以及“基本上相应”来描述，这些术语在本文中可互换使用。这些是指多肽或核酸序列，其中在一个或多个氨基酸或核苷酸碱基上的变化不影响分子的功能，如介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指相对于初始未修饰的核酸，基本上不改变所得核酸的功能特性的核酸序列的一个或多个修饰。这些修饰包括在核酸片段中一个或多个核苷酸的缺失、取代、和/或插入。所涵盖的基本上类似的核酸序列可以通过这些核酸序列与本文所示例的序列杂交，或与本文所公开的并且与任何本文所公开的核酸序列在功能上等价的核苷酸序列的任何部分杂交(在中严格条件下，例如0.5xssc，0.1％sds，60℃)的能力来定义。可以调整严格条件以筛选适度类似的片段(如来自远缘生物体的同源序列)，至高度类似的片段(如复制来自近缘生物体的功能性酶的基因)。杂交后的洗涤决定了严格条件。[0031]“厘摩”(cm)或“图距单位”是两个多核苷酸序列、连锁的基因、标志物、靶位点、基因座或它们的任何配对之间的距离，其中1％的减数分裂的产物是重组的。因此，一厘摩与等于两个连锁的基因、标志物、靶位点、基因座或它们的任何配对之间的1％平均重组频率的距离相当。[0032]“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、或蛋白质、或其生物活性部分是基本上或本质上不含与如在其天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白质正常相伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽或蛋白质当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在从其衍生出该多核苷酸的生物体的基因组dna中天然地在该多核苷酸侧翼的序列(即，位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳地是蛋白质编码序列)。例如，在不同实施例中，该分离的多核苷酸可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，在该多核苷酸从其衍生出的细胞的基因组dna中，该核苷酸序列天然地位于该多核苷酸的侧翼。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。[0033]术语“片段”是指核苷酸或氨基酸的连续集合。在一个实施例中，片段是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或大于20个连续核苷酸。在一个实施例中，片段是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或大于20个连续氨基酸。片段可能表现出或可能不会表现出在所述片段的长度上共享一定百分比同一性的序列的功能。[0034]术语“在功能上等价的片段”和“功能等价片段”在本文中可互换使用。这些术语是指分离的核酸片段或多肽的显示出与其衍生自的较长序列相同的活性或功能的一部分或子序列。在一个实例中，无论片段是否编码活性蛋白，该片段都保留改变基因表达或产生某种表型的能力。例如，片段可用于设计基因以在修饰的植物中产生所希望的表型。可以将基因设计为用于在抑制中使用，无论该基因是否编码活性酶，通过以相对于植物启动子序列的有义或反义取向连接其核酸片段。[0035]“基因”包括表达功能性分子(诸如但不限于，特定蛋白质)的核酸片段，包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指在其天然内源性位置中发现的具有其自身调节序列的基因。[0036]术语“内源性”是指天然存在于细胞或生物体中的序列或其他分子。在一个方面，通常在细胞的基因组中发现内源多核苷酸；也就是说，不是异源的。[0037]“等位基因”是占据染色体上给定基因座的基因的若干种替代形式中的一种。当染色体上在给定基因座处存在的所有等位基因都相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上在给定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。[0038]“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的多核苷酸序列。“调节序列”是指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关的编码序列的转录、rna加工或稳定性、或翻译。调节序列包括但不限于：启动子、翻译前导序列、5’非翻译序列、3’非翻译序列、内含子、聚腺苷酸化靶序列、rna加工位点、效应子结合位点、和茎环结构。[0039]“突变基因”是通过人为干预已经改变的基因。这样的“突变基因”具有通过至少一个核苷酸添加、缺失或取代而与相应的非突变基因的序列不同的序列。在本公开的某些实施例中，该突变的基因包含由如本文公开的指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统引起的改变。突变的植物是包含突变基因的植物。[0040]如本文所用，术语“靶向突变”是通过使用本领域技术人员已知的任何方法(包括涉及如本文公开的指导的cas内切核酸酶系统的方法)改变靶基因内的靶序列而产生的基因(称为靶基因)包括天然基因中的突变。[0041]术语“敲除”、“基因敲除(geneknock-out)”和“基因敲除(geneticknock-out)”在本文中可互换使用。敲除表示已经通过用cas蛋白进行靶向使得细胞的dna序列部分或完全无效；例如，这样的dna序列在敲除之前可能已编码氨基酸序列，或可能已具有调节功能(例如，启动子)。[0042]术语“敲入”、“基因敲入(geneknock-in)”、“基因插入”和“基因敲入(geneticknock-in)”在本文中可互换使用。敲入表示通过用cas蛋白(例如，通过同源重组(hr)，其中还使用合适的供体dna多核苷酸)靶向在细胞中的特异性dna序列处进行的dna序列的替代或插入。敲入的实例是异源氨基酸编码序列在基因的编码区中的特异性插入，或转录调节元件在遗传基因座中的特异性插入。[0043]“结构域”意指核苷酸(可以为rna、dna、和/或rna-dna组合序列)或氨基酸的连续延伸。[0044]术语“保守结构域”或“基序”是指沿进化相关蛋白的比对序列在特定位置处保守的一组多核苷酸或氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置处的氨基酸可以发生变化，但在特定位置处高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性、或活性来说是必需的氨基酸。因为它们通过蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守性而被鉴定，所以它们可以用作标识符或“特征”，以确定具有新确定的序列的蛋白质是否属于先前鉴定的蛋白质家族。[0045]“密码子修饰的基因”或“密码子偏好的基因”或“密码子优化的基因”是其密码子使用的频率被设计为模拟宿主细胞的偏好的密码子使用的频率的基因。[0046]“优化的”多核苷酸是已经过优化以改善特定异源宿主细胞中的表达的序列。[0047]“植物优化的核苷酸序列”是为了在植物中表达(特别是为了在植物中增加的表达)而优化的核苷酸序列。植物优化的核苷酸序列包括密码子优化的基因。可以使用一个或多个植物偏好的密码子来改善表达，通过修饰编码蛋白质(例如像如本文公开的cas内切核酸酶)的核苷酸序列，来合成植物优化的核苷酸序列。有关宿主偏好的密码子使用的讨论，参见，例如campbell和gowri，(1990)plantphysiol.[植物生理学]92：1-11。[0048]启动子是参与rna聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的dna区域。启动子序列由近端元件和较远端上游元件组成，后一元件通常称为增强子。“增强子”是可以刺激启动子活性的dna序列，并且可以是该启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部来源于天然基因，或者由来源于在自然界存在的不同启动子的不同元件构成，和/或包含合成的dna区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全限定，一些变异的dna片段可能具有相同的启动子活性。[0049]在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。术语“诱导型启动子”是指对内源或外源刺激的存在，例如通过化学化合物(化学诱导剂)响应，或对环境、激素、化学品、和/或发育信号响应，选择性表达编码序列或功能rna的启动子。诱导型或调节型启动子包括例如通过光、热、胁迫、水淹或干旱、盐胁迫、渗透胁迫、植物激素、伤口或化学品(如乙醇、脱落酸(aba)、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂)诱导或调节的启动子。[0050]“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列与编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的mrna上游。翻译前导序列可以影响初级转录物对mrna的加工、mrna稳定性、或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(例如，turner和foster，(1995)molbiotechnol[分子生物技术]3：225-236)。[0051]“3’非编码序列”、“转录终止子”或“终止序列”是指位于编码序列的下游的dna序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mrna加工或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常特征在于影响聚腺苷酸片添加到mrna前体的3’末端。由ingelbrecht等人，(1989)plantcell[植物细胞]1：671-680示例了不同的3′非编码序列的用途。[0052]“rna转录物”是指由dna序列的rna聚合酶催化的转录产生的产物。当rna转录物是dna序列的完全互补拷贝时，rna转录物被称为初级转录物或前mrna。当rna转录物是源自初级转录物前mrna的转录后加工的rna序列时，rna转录物被称为成熟rna或mrna。“信使rna”或“mrna”是指不含内含子并且可以被细胞翻译成蛋白质的rna。“cdna”是指与mrna模板互补并且使用逆转录酶从mrna模板合成的dna。cdna可以是单链的或者可以使用dna聚合酶i的klenow片段转化成双链形式。“正义”rna是指包含mrna并且可以在细胞内或体外翻译成蛋白质的rna转录物。“反义rna”是指与靶初级转录物或mrna的全部或部分互补、并且阻断靶基因的表达的rna转录物(参见，例如美国专利号5,107,065)。反义rna可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。“功能性rna”是指反义rna、核糖酶rna、或可以不进行翻译但是仍对细胞过程具有作用的其他rna。术语“互补序列”和“反向互补序列”在本文中关于mrna转录物可互换使用，并且意在限定信使的反义rna。[0053]术语“基因组”指存在于生物体或病毒或细胞器的每个细胞中的遗传物质的全部互补序列(基因和非编码序列)；和/或从一个亲本遗传为(单倍体)单元的完整染色体组。[0054]术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能被另一个核酸序列调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达(即，该编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以在正义或反义取向上可操作地连接到调节序列。在另一个实例中，互补的rna区域可以直接或间接与靶mrna的5′、或靶mrna的3′可操作地连接、或在靶mrna内、或第一个互补区是5′且其互补序列是靶mrna的3′。[0055]通常，“宿主”是指已引入异源组分(多核苷酸、多肽、其他分子、细胞)的生物体或细胞。如本文所用，“宿主细胞”是指体内或体外的真核细胞、原核细胞(例如，细菌或古细菌细胞)，或来自作为单细胞实体培养的多细胞生物体的细胞(例如，细胞系)，其中已引入异源多核苷酸或多肽。在一些实施例中，所述细胞选自下组，所述组由以下组成：原始细胞、细菌细胞、真核细胞、真核单细胞生物体、体细胞、生殖细胞、干细胞、植物细胞、藻类细胞、动物细胞、无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、鱼类细胞、青蛙细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、猪细胞、牛细胞、山羊细胞、绵羊细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、非人类的灵长类动物细胞和人类细胞。在一些情况下，该细胞是体外细胞。在一些情况下，该细胞是体内细胞。[0056]术语“重组”是指例如通过化学合成或者通过基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分开的序列区段进行人工组合。[0057]术语“质粒”、“载体”和“盒”是指线性或环状染色体外元件，其通常携带非细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常呈双链dna的形式。此类元件可以是衍生自任何来源的、单链或双链dna或rna的、处于直链或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体、或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经被连接或重组成能够将目的多核苷酸引入细胞中的独特构造。“转化盒”是指包含基因并具有促进特定宿主细胞转化的基因之外的元件的特定载体。“表达盒”是指包含基因并具有允许在宿主中表达该基因的基因之外的元件的特定载体。[0058]术语“重组dna分子”、“重组dna构建体”、“表达构建体”、“构建体”、和“重组构建体”在本文中可互换使用。重组dna构建体包含核酸序列，例如在自然界中未全部一起发现的调节序列和编码序列的人工组合。例如，重组dna构建体可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然发生的方式排列的调节序列和编码序列。这种构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员熟知的将用于将载体引入宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上以便成功转化，选择和繁殖宿主细胞的遗传元件。本领域技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可能导致不同的表达水平和模式(jones等人，(1985)emboj[欧洲分子生物学学会杂志]4：2411-2418：dealmeida等人，(1989)molgengenetics[分子和普通遗传学]218：78-86)，因此典型地筛选多个事件，以获得显示所希望的表达水平和模式的品系。此类筛选可以是完成的标准分子生物学测定、生物化学测定以及其他测定，这些测定包括dna的印迹分析、mrna表达的northern分析、pcr、实时定量pcr(qpcr)、逆转录pcr(rt-pcr)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶测定或活性测定、和/或表型分析。[0059]术语“异源性”是指特定多核苷酸或多肽序列的原始环境、位置、或组成与其当前环境、位置、或组成之间的差异。非限制性实例包括分类学衍生(例如，如果从玉蜀黍(zeamays)获得的多核苷酸序列被插入到水稻(oryzasativa)植物或玉蜀黍的不同品种或栽培种的基因组中，则该多核苷酸序列将是异源的；或者从细菌获得的多核苷酸被引入植物的细胞中)或序列(例如，多核苷酸序列从玉蜀黍获得，分离，修饰，并且重新引入玉米植物中)的差异。如本文所用，关于序列的“异源性”可以指该序列源于不同物种、变种、外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。可替代地，本文提供的一个或多个调节区域和/或多核苷酸可以是整体地合成的。[0060]如本文所用，术语“表达”是指处于前体抑或成熟形式的功能性终产物(例如，mrna、指导rna或蛋白质)的产生。[0061]“成熟”蛋白质是指翻译后加工的多肽(即，从其中已经去除存在于初级翻译产物中的任何前肽(pre-peptide)或原肽(propeptide)的一种多肽)。[0062]“前体”蛋白质是指mrna的翻译的初级产物(即，仍存在前肽或原肽)。前肽或原肽可以是但不限于细胞内定位信号。[0063]“crispr”(成簇的规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats))基因座是指dna切割系统的某些遗传基因座编码组分，例如，被细菌和古细菌细胞用来破坏外源dna的那些(horvath和barrangou，2010，science[科学]327：167-170；2007年3月01日公布的wo2007025097)。crispr基因座可以由crispr阵列组成，包含由短的可变dna序列(称为‘间隔区’)分开的短的正向重复序列(crispr重复序列)，其可以是侧翼不同cas(crispr相关的)基因。[0064]如本文所用，“效应子”或“效应子蛋白”是具有包括识别、结合、和/或切割多核苷酸靶或使多核苷酸靶产生切口的活性的蛋白质。效应子或效应子蛋白也可以是内切核酸酶。crispr系统的“效应子复合物”包括参与crrna及靶识别和结合的cas蛋白。一些组分cas蛋白可以另外包含参与靶多核苷酸切割的结构域。[0065]术语“cas蛋白”是指由cas(crispr相关联的)基因编码的多肽。cas蛋白包括但不限于：cas9蛋白、cpf1(cas12)蛋白、c2c1蛋白、c2c2蛋白、c2c3蛋白、cas3、cas3-hd、cas5、cas7、cas8、cas10、或这些的组合或复合物。当与合适的多核苷酸组分复合时，cas蛋白可以是能够识别、结合特定多核苷酸靶序列的全部或部分、并任选地使特定多核苷酸靶序列的全部或部分产生切口或切割特定多核苷酸靶序列的全部或部分的“cas内切核酸酶”或“cas效应子蛋白”。本文描述的cas内切核酸酶包含一个或多个核酸酶结构域。本公开的内切核酸酶可以包括具有一个或多个ruvc核酸酶结构域的内切核酸酶。cas蛋白被进一步定义为天然cas蛋白的功能性片段或功能性变体，或与天然cas蛋白的至少50、50与100之间、至少100、100与150之间、至少150、150与200之间、至少200、200与250之间、至少250、250与300之间、至少300、300与350之间、至少350、350与400之间、至少400、400与450之间、至少500、或大于500个连续氨基酸具有至少50％、50％与55％之间、至少55％、55％与60％之间、至少60％、60％与65％之间、至少65％、65％与70％之间、至少70％、70％与75％之间、至少75％、75％与80％之间、至少80％、80％与85％之间、至少85％、85％与90％之间、至少90％、90％与95％之间、至少95％、95％与96％之间、至少96％、96％与97％之间、至少97％、97％与98％之间、至少98％、98％与99％之间、至少99％、99％与100％之间、或100％序列同一性并且保留至少部分活性的蛋白。[0066]“cas内切核酸酶”可以包含使其能够充当双链断裂诱导剂的结构域。“cas内切核酸酶”还可以包含一个或多个消除或降低其切割双链多核苷酸(dcas)的能力的修饰或突变。在一些方面，cas内切核酸酶分子可以保留使单链多核苷酸产生切口的能力(例如，cas9内切核酸酶分子中的d10a突变)(ncas9)。[0067]cas内切核酸酶的“功能性片段”、“功能上等价的片段”和“功能等价片段”在本文中可互换使用，并且是指本公开的cas内切核酸酶的一部分或子序列，其中保留识别、结合并任选地解旋靶位点、使靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)靶位点的能力。cas内切核酸酶的部分或子序列可以包含其任何一个结构域的完整肽或部分(功能性)肽，例如像但不限于cas3hd结构域完整的功能性部分、cas3解旋酶结构域完整的功能性部分、cascade蛋白完整的功能性部分(诸如但不限于cas5、cas5d、cas7和cas8b1)。[0068]cas内切核酸酶或cas效应子蛋白的术语“功能性变体”、“功能上等价的变体”和“功能等价变体”在本文中可互换使用，并且是指本文公开的cas效应子蛋白的变体，其中保留识别、结合并任选地解旋靶序列的全部或部分、使靶序列的全部或部分产生切口或切割靶序列的全部或部分的能力。[0069]cas内切核酸酶还可以包括多功能cas内切核酸酶。术语“多功能cas内切核酸酶”和“多功能cas内切核酸酶多肽”在本文中可互换使用，并且包括提及具有cas内切核酸酶功能(包含至少一个可以用作cas内切核酸酶的蛋白质结构域)和至少另一种功能的单个多肽，该至少另一种功能诸如但不限于，形成cascade的功能(至少包括可以与其他蛋白质形成cascade的第二蛋白质结构域)。在一个方面，该多功能cas内切核酸酶包含相对于cas内切核酸酶的那些典型结构域的至少一个另外的蛋白结构域(在内部上游(5’)或下游(3’)，或在内部5’和3’两处，或其任何组合)。[0070]术语“cascade”和“cascade复合物”在本文中可互换使用，并且包括提及可与多核苷酸组装形成多核苷酸-蛋白复合物(pnp)的多亚基蛋白复合物。cascade是一种依赖于多核苷酸的pnp，以实现复合物组装和稳定性以及鉴定靶核酸序列。cascade用作监视复合物，其发现并任选地结合与指导多核苷酸的可变靶向结构域互补的靶核酸。[0071]术语“切割就绪的cascade”、“crcascade”、“切割就绪的cascade复合物”、“crcascade复合物”、“切割就绪的cascade系统”、“crc”和“crcascade系统”在本文中可互换使用，并包括提及可以与多核苷酸组装形成多核苷酸-蛋白复合物(pnp)的多亚基蛋白复合物，其中cascade蛋白之一是cas内切核酸酶，所述cas内切核酸酶能够识别、结合靶序列的全部或部分、并任选地使靶序列的全部或部分解旋、使靶序列的全部或部分产生切口或切割靶序列的全部或部分。[0072]术语“5′‑帽”和“7-甲基鸟苷酸(m7g)帽”在本文中可互换使用。7-甲基鸟苷酸残基位于真核生物中信使rna(mrna)的5′末端。在真核生物中，rna聚合酶ii(polii)转录mrna。信使rna加帽通常如下：用rna末端磷酸酶去除mrna转录物的最末端5’磷酸根基团，留下两个末端磷酸根。用鸟苷酸转移酶将一磷酸鸟苷(gmp)添加至转录物的末端磷酸根，在转录物末端处留下5′‑5′三磷酸连接的鸟嘌呤。最后，此末端鸟嘌呤的7-氮被甲基转移酶甲基化。[0073]术语“不具有5′‑帽”等在本文中用于指具有例如5′‑羟基基团而不是5′‑帽的rna。例如，此类rna可以被称为“未带帽的rna”。因为5′‑带帽的rna有核输出的倾向，转录以后未带帽的rna可以更好地积累在细胞核中。本文中的一种或多种rna组分是未带帽的。[0074]如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与cas内切核酸酶(包括本文所述的cas内切核酸酶)形成复合物，并且使得该cas内切核酸酶能够识别、任选地结合并任选地切割dna靶位点的多核苷酸序列。指导多核苷酸序列可以是rna序列、dna序列、或其组合(rna-dna组合序列)。[0075]术语指导rna、crrna或tracrrna的“功能片段”、“功能上等价的片段”和“功能等价片段”在本文中可互换使用，并且分别是指本公开的指导rna、crrna或tracrrna的一部分或子序列，其中分别保留用作指导rna、crrna或tracrrna的能力。[0076]术语指导rna、crrna或tracrrna(分别地)的“功能性变体”、“功能上等价的变体”和“功能等价变体”在本文中可互换使用，并且分别是指本公开的指导rna、crrna或tracrrna的变体，其中分别保留用作指导rna、crrna或tracrrna的能力。[0077]术语“单指导rna”和“sgrna”在本文中可互换使用，并涉及两个rna分子的合成融合，其中包含可变靶向结构域(与tracrrna杂交的tracr配对序列连接)的crrna(crisprrna)与tracrrna(反式激活crisprrna)融合。单指导rna可以包含可与ii型cas内切核酸酶形成复合物的ii型crjspr/cas系统的crrna或crrna片段和tracrrna或tracrrna片段，其中所述指导rna/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶引导至dna靶位点，使得cas内切核酸酶能够识别、任选地结合dna靶位点、并任选地使dna靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)dna靶位点。[0078]术语“可变靶向结构域”或“vt结构域”在本文中可互换使用，并且包括可以与双链dna靶位点的一条链(核苷酸序列)杂交(互补)的核苷酸序列。第一个核苷酸序列结构域(vt结构域)与靶序列之间的互补百分比可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶向结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在一些实施例中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向结构域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列、或其任何组合构成。[0079]术语(指导多核苷酸的)“cas内切核酸酶识别结构域”或“cer结构域”在本文中可互换使用，并且包括与cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列。cer结构域包含(反式作用)tracr核苷酸配对序列，随后是tracr核苷酸序列。cer结构域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列(参见例如，2015年2月26日公布的us20150059010a1)、或其任何组合构成。[0080]如本文所用，术语“指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物”、“指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统”、“指导多核苷酸/cas复合物”、“指导多核苷酸/cas系统”和“指导的cas系统”、“多核苷酸指导的内切核酸酶”、“pgen”在本文中可互换使用，并且是指能够形成复合物的至少一种指导多核苷酸和至少一种cas内切核酸酶，其中所述指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶引导至dna靶位点，使cas内切核酸酶能够对dna靶位点进行识别、结合、并且任选地产生切口或进行切割(引入单链或双链断裂)。本文中的指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以包含已知的crispr系统(horvath和barrangou，2010，science[科学]327：167-170；makarova等人2015，naturereviewsmicrobiology[自然评论微生物学]第13卷：1-15；zetsche等人，2015，cell[细胞]163，1-13；shmakov等人，2015，molecularcell[分子细胞]60，1-13)中任一种的一种或多种cas蛋白和一种或多种合适的多核苷酸组分。[0081]术语“指导rna/cas内切核酸酶复合物”、“指导rna/cas内切核酸酶系统”、“指导rna/cas复合物”、“指导rna/cas系统”、“grna/cas复合物”、“grna/cas系统”、“rna指导的内切核酸酶”、“rgen”在本文中可互换使用并且指能够形成复合物的至少一种rna组分和至少一种cas内切核酸酶，其中所述指导rna/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶引导至dna靶位点，使cas内切核酸酶能够识别、结合dna靶位点并任选地使dna靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)dna靶位点。[0082]术语“靶位点”、“靶序列”、“靶位点序列”、“靶dna”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、“基因组靶基因座”、“靶多核苷酸”和“前间隔子”在本文中可互换地使用，并且是指多核苷酸序列，例如，但不限于，在细胞的染色体、附加体、基因座或基因组中的任何其他dna分子(包括染色体dna、叶绿体dna、线粒体dna、质粒dna)上的核苷酸序列，在这些序列处指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以进行识别、结合并任选地产生切口或进行切割。靶位点可以是细胞的基因组中的内源位点，或者可替代地，靶位点对于该细胞可以是异源的并且从而不是天然存在于细胞的基因组中，或者与在自然界发生的位置相比，可以在异质基因组位置中找到靶位点。如本文所用，术语“内源靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换使用，是指对细胞基因组来说是内源的或天然的、并且位于细胞的基因组中该靶序列的内源或天然位置处的靶序列。“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换使用，并且是指已经引入细胞的基因组中的靶序列。这样的人工靶序列可以在序列上与细胞的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于细胞的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。[0083]本文中的“前间隔序列邻近基序”(pam)指与由本文所述的指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统识别的(靶向的)靶序列(前间隔序列)相邻的短核苷酸序列。如果靶dna序列后面不是pam序列，则cas内切核酸酶可能无法成功识别该靶dna序列。本文中的pam的序列和长度可以取决于所使用的cas蛋白或cas蛋白复合物而不同。pam序列可以是任何长度，但典型地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸长度。[0084]“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、“修饰的靶序列”在本文中可互换使用，并且是指如本文公开的靶序列，当与非改变的靶序列相比时，该靶序列包含至少一个改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。[0085]“经修饰的核苷酸”或“经编辑的核苷酸”是指当与其非修饰的核苷酸序列相比时，包含至少一个改变的目的核苷酸序列。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。[0086]用于“修饰靶位点”和“改变靶位点”的方法在本文中可互换使用，并且是指用于产生改变的靶位点的方法。[0087]如本文所用，“供体dna”是dna构建体，其包括待插入到cas内切核酸酶的靶位点的目的多核苷酸。[0088]术语“多核苷酸修饰模板”包括，当与待编辑的核苷酸序列相比时，包含至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。核苷酸修饰可以是至少一个核苷酸取代、添加或缺失。任选地，多核苷酸修饰模板可以进一步包含位于至少一个核苷酸修饰侧翼的同源核苷酸序列，其中侧翼同源核苷酸序列为待编辑的希望的核苷酸序列提供了充足同源性。[0089]本文的术语“植物优化的cas内切核酸酶”是指由已经针对在植物细胞或植物中表达进行优化的核苷酸序列编码的cas蛋白，包括多功能cas蛋白。[0090]“编码cas内切核酸酶的植物优化的核苷酸序列”、“编码cas内切核酸酶的植物优化的构建体”和“编码cas内切核酸酶的植物优化的多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指编码cas蛋白、或其变体或功能片段的核苷酸序列，已经针对在植物细胞或植物中表达对其进行优化。包含植物优化的cas内切核酸酶的植物包括：包含编码cas序列的核苷酸序列的植物，和/或包含cas内切核酸酶蛋白的植物。在一个方面，植物优化的cas内切核酸酶核苷酸序列是玉米优化、稻优化、小麦优化、大豆优化、棉花优化或卡诺拉油菜优化的cas内切核酸酶。[0091]术语“植物”通常包括整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子和植物的后代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚胎、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。“植物元件”意在指整株植物或植物组分，可以包括分化和/或未分化的组织，例如但不限于植物组织、部分和细胞类型。在一个实施例中，植物元件是以下之一：整株植物、幼苗、分生组织、基本组织、维管组织、皮膜组织、种子、叶、根、芽、茎、花、果实、匍匐茎、鳞茎、块茎、球茎、无性末梢枝、芽、幼芽、肿瘤组织，以及细胞和培养物的各种形式(例如，单细胞、原生质体、胚胎、愈伤组织)。术语“植物器官”是指植物组织或构成植物的形态上和功能上不同部分的一组组织。如本文所用，“植物元件”是植物的“部分”的同义词，是指植物的任何部分，并且可以包括不同的组织和/或器官，并且可以在全文中与术语“组织”互换使用。类似地，“植物繁殖元件”意在一般性地指能够通过该植物的有性或无性繁殖而创造其他植物的任何植物部分，例如但不限于：种子、幼苗、根、芽、切条、接穗、嫁接苗、匍匐茎、鳞茎、块茎、球茎、无性末梢枝或幼芽。植物元件可以存在于植物中或植物器官、组织培养物或细胞培养物中。[0092]“后代”包括植物的任何后续子代。[0093]如本文使用，术语“植物部分”是指植物细胞、植物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(诸如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中完好的植物细胞，连同这些部分自身。谷物意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。这些再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含经引入的多核苷酸。[0094]术语“单子叶植物的”或“单子叶植物”是指被子植物的亚类，也称为“单子叶植物纲”，其种子典型地仅包含一个胚叶或子叶。该术语包括对整个植物、植物元件、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其后代的指代。[0095]术语“双子叶植物的”或“双子叶植物”是指被子植物的亚类，也称为“双子叶植物纲”，其种子典型地包含两个胚叶或子叶。该术语包括对整个植物、植物元件、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其后代的指代。[0096]如本文使用，“雄性不育植物”是不产生有活力的或在其他情况下能够受精的雄配子的植物。如本文使用，“雌性不育植物”是不产生有活力的或在其他情况下能够受精的雌配子的植物。应当认识到雄性不育植物和雌性不育植物可以分别是雌性可育的和雄性可育的。应当进一步认识到，雄性可育(但雌性不育)植物当与雌性可育植物杂交时可以产生有活力的后代，并且雌性可育(但雄性不育)植物当与雄性可育植物杂交时可以产生有活力的后代。[0097]本文中术语“非常规酵母”是指不是酵母属(例如，酿酒酵母)或裂殖酵母属酵母物种的任何酵母。(参见“non-conventionalyeastsingenetics，biochemistryandbiotechnology：practicalprotocols[遗传学、生物化学和生物技术中的非常规酵母菌：实践方案]”，k.wolf，k.d.breunig，g.barth，编辑，springer-verlag，berlin，germany[德国柏林施普林格出版社]，2003)。[0098]在本公开的上下文中，术语“杂交的”或“杂交”(cross或crossing)是指经由授粉将配子融合从而产生后代(即，细胞、种子、或植物)。该术语涵盖有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自体授粉，即当花粉和胚珠(或小孢子和大孢子)是来自同一植物或遗传上相同的植物时)。[0099]术语“渗入”是指遗传基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如，可以经由两个亲本植物之间的有性杂交将指定基因座处的所需等位基因的渗入传递给至少一个后代植物，其中至少一个亲本植物在其基因组内具有所需等位基因。可替代地，例如等位基因的传递可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有所希望的等位基因。所希望的等位基因可以是，例如转基因、修饰的(突变的或编辑的)天然等位基因、或标志物或qtl的选择的等位基因。[0100]术语“同系(isoline)”是一个比较性术语，指遗传上相同但处理方法不同的生物体。在一个实例中，可以将两个遗传上相同的玉米植物胚胎分成两个不同的组，一个组接受处理(诸如引入crispr-cas效应子内切核酸酶)，而一个组作为对照不接受这种处理。因此，两组之间的任何表型差异都可能仅归因于该处理，而不是归因于该植物的内源基因组成的任何固有性。[0101]“引入”旨在意指以这样一种方式将多核苷酸或多肽或多核苷酸-蛋白复合物提供于靶标，诸如细胞或生物体中，以致于这一种或多种组分得以进入该生物体的细胞的内部或进入细胞自身。[0102]“目的多核苷酸”包括编码改善作物的合意性(即，农艺学目的性状)的蛋白或多肽的任何核苷酸序列。目的多核苷酸：包括但不限于，编码对农艺学、除草剂-抗性、杀昆虫抗性、疾病抗性、线虫抗性、除草剂抗性、微生物抗性、真菌抗性、病毒抗性、能育性或不育性、谷粒特征、商业产品、表型标志物而言重要的或任何其他具有重要农艺学或商业意义的性状的多核苷酸。目的多核苷酸可以另外以有义或反义取向加以利用。此外，可以一起或“堆叠”利用多于一个目的多核苷酸以提供额外的益处。[0103]“复杂性状基因座”包括具有彼此遗传连锁的多个转基因的基因组基因座。[0104]本文的组合物和方法可以为植物提供改善的“农艺学性状”或“具有农艺学重要性的性状”或“具有农艺学意义的性状”，这些性状可以包括但不限于以下：与不包含衍生自本文方法和组合物的修饰的同系植物相比的抗病性、耐旱性、耐热性、耐寒性、耐盐性、金属耐性、除草剂耐性、改善的水分利用效率、改善的氮利用率、改善的固氮作用、有害生物抗性、食草动物抗性、病原抗性、产量改善、健康增强、活力改善、生长改善、光合能力改善、营养增强、改变的蛋白质含量、改变的油含量、生物量增加、芽长度增加、根长度增加、根结构改善、代谢产物的调节、蛋白质组的调节、种子重量的增加、改变的种子碳水化合物组成、改变的种子油组成、改变的种子蛋白质组成、改变的种子营养成分。[0105]“农艺学性状潜力”旨在意指植物元件在其生命周期中的某个时刻表现出一种表型(优选地为一种改善的农艺学性状)的能力，或将所述表型传递至在同一种植物中与其相关联的另一种植物元件的能力。[0106]如本文所用，术语“减少”、“较少”、“较慢”和“增加”、“较快”、“增强”、“更大”是指与未修饰的植物元件或产生的植物相比，经修饰的植物元件或产生的植物的特征降低或增加。例如，特征的降低可以是低于未处理的对照至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与20％之间、至少15％、至少20％、20％与30％之间、至少25％、至少30％、30％与40％之间、至少35％、至少40％、40％与50％之间、至少45％、至少50％、50％与60％之间、至少约60％、60％与70％之间、70％与80％之间、至少75％、至少约80％、80％与90％之间、至少约90％、90％与100％之间、至少100％、100％与200％之间、至少200％、至少约300％、至少约400％或更多，并且增加可以是高于未处理的对照至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、5％与10％之间、至少10％、10％与20％之间、至少15％、至少20％、20％与30％之间、至少25％、至少30％、30％与40％之间、至少35％、至少40％、40％与50％之间、至少45％、至少50％、50％与60％之间、至少约60％、60％与70％之间、70％与80％之间、至少75％、至少约80％、80％与90％之间、至少约90％、90％与100％之间、至少100％、100％与200％之间、至少200％、至少约300％、至少约400％或更多。[0107]如本文所用，当提到序列位置时，术语“之前”是指一个序列在另一序列上游或5’处出现。[0108]缩写的含义如下：“sec”意指秒、“min”意指分钟、“h”意指小时、“d”意指天、“ul”意指微升、“ml”意指毫升、“l”意指升、“um”意指微摩尔、“mm”意指毫摩尔、“m”意指摩尔、“mmol”意指毫摩尔、“umole”或“umole”意指微摩尔、“g”意指克、“ug”或“ug”意指微克、“ng”意指纳克、“u”意指单位、“bp”意指碱基对、以及“kb”意指千碱基。[0109]双链断裂(dsb)诱导剂(dsb剂)[0110]由双链断裂诱导剂(诸如在多核苷酸链中切割磷酸二酯键的内切核酸酶)诱导的双链断裂可以导致dna修复机制的诱导，包括非同源末端连接途径以及同源重组。内切核酸酶包括一系列不同的酶，包括限制性内切核酸酶(参见，例如，roberts等人，(2003)nucleicacidsres[核酸研究]1：418-20)、roberts等人，(2003)nucleicacidsres[核酸研究]31：1805-12、和belfort等人，(2002)在mobiledna[运动dna]ii，第761-783页，编辑craigie等人，(asm出版社，华盛顿特区)中)、大范围核酸酶(参见例如，wo2009/114321；gao等人(2010)plantjoumal[植物杂志]1：176-187)、tal效应子核酸酶或talen(参见例如，us20110145940，christian，m.，t.cermak，等人2010.targetingdnadouble-strandbreakswithtaleffectornucleases.[用tal效应子核酸酶靶向dna双链断裂]genetics[遗传学]186(2)：757-61和boch等人，(2009)，science[科学]326(5959)：1509-12)、锌指核酸酶(参见例如，kim，y.g.，j.cha等人(1996).“hybridrestrictionenzymes：zincfingerfusionstofokicleavage[杂交限制性内切酶：锌指与foki融合蛋白的切割]”)、和crispr-cas内切核酸酶(参见例如，2007年3月1日公布的wo2007/025097申请)。[0111]除了双链断裂诱导剂，还可以实现位点特异性碱基转化以工程化一个或多个核苷酸变化，从而在基因组中创建一个或多个本文所述的eme。这些包括例如，由c·g至t·a或a·t至g·c碱基编辑脱氨酶介导的位点特异性碱基编辑(gaudelli等人，programmablebaseeditingofa·ttog·cingenomicdnawithoutdnacleavage.[在无dna切割时基因组dna中a·t至g·c的可编程碱基编辑]″nature[自然](2017)；nishida等人“targetednucleotideeditingusinghybridprokaryoticandvertebrateadaptiveimmunesystems.[使用杂交体原核和脊椎动物适应性免疫系统进行靶向核苷酸编辑]”science[科学]353(6305)(2016)；komor等人“programmableeditingofatargetbaseingenomicdnawithoutdouble-strandeddnacleavage.[在无双链dna切割时基因组dna中靶碱基的可编程编辑]”nature[自然]533(7603)(2016)：420-4)。[0112]任何双链断裂或-切口或-修饰诱导剂均可用于本文所述的方法，包括例如但不限于：cas内切核酸酶、重组酶、talen、锌指核酸酶、限制性内切核酸酶、大范围核酸酶和脱氨酶。[0113]crispr系统和cas内切核酸酶[0114]提供了利用crispr相关(cas)内切核酸酶进行多核苷酸修饰的方法和组合物。i类cas内切核酸酶包含多亚基效应子复合物(i型、iii型和iv型)，而2类系统包含单蛋白效应子(ii型、v型和vi型)(makarova等人，2015，naturereviewsmicrobiology[自然微生物学综述]卷13：1-15；zetsche等人，2015，cell[细胞]163，1-13；shmakov等人，2015，molecularcell[分子细胞学]60，1-13；haft等人，2005，computationalbiology，ploscomputbiol[美国科学公共图书馆计算生物学]1(6)：e60；以及koonin等人2017，curropinionmicrobiology[微生物学新见]37：67-78)。在2类ii型系统中，该cas内切核酸酶与指导rna(grna)复合起作用，该指导rna引导cas内切核酸酶切割dna靶标，以使靶标能够被cas内切核酸酶识别、结合和切割。该grna包括与cas内切核酸酶相互作用的cas内切核酸酶识别(cer)结构域，以及与靶dna中的核苷酸序列杂交的可变靶向(vt)结构域。在一些方面，该grna包含crisprrna(crrna)和反式激活crisprrna(tracrrna)，以将cas内切核酸酶指导到其dna靶标上。该crrna包含与双链dna靶标的一条链互补的间隔区和与tracrrna碱基配对形成rna双链体的区域。在一些方面，该grna是包含crrna和tracrrna的合成融合体的“单指导rna”(sgrna)。在许多系统中，该cas内切核酸酶指导的多核苷酸复合物识别与靶序列(前间区序列)相邻的短核苷酸序列，称为“前间区序列邻近基序”(pam)。[0115]cas内切核酸酶的实例包括但不限于cas9和cpf1。cas9(以前称为cas5、csn1或csx12)是2类ii型cas内切核酸酶(makarova等人，2015，naturereviewsmicrobiology[自然微生物学综述]卷13：1-15)。cas9-grna复合物可识别靶位点的3′pam序列(化脓链球菌cas9为ngg)，从而使指导rna的间隔区能够侵入双链dna靶标，并且如果间隔区与前间区序列之间存在足够的同源性，则产生双链断裂切割。cas9内切核酸酶包含一起产生双链断裂的ruvc结构域和hnh结构域，并且二者可分别产生单链断裂。对于化脓链球菌cas9内切核酸酶，该双链断裂留下平末端。cpf1是2类v型cas内切核酸酶，并且包含核酸酶ruvc结构域，但缺少hnh结构域(yamane等人，2016，cell[细胞]165：949-962)。cpf1内切核酸酶产生“粘性”突出端。[0116]基因组靶位点上cas9-grna系统的一些用途包括但不限于在靶位点上一个或多个核苷酸的插入、缺失、取代或修饰；修饰或替换目的核苷酸序列(如调节元件)；目的多核苷酸的插入；基因敲除；基因敲入；修饰剪接位点和/或引入替换的剪接位点；编码目的蛋白质的核苷酸序列的修饰；氨基酸和/或蛋白质融合；以及通过将反向重复序列表达为目的基因来进行基因沉默。[0117]在一些方面，提供了“多核苷酸修饰模板”，与要编辑的核苷酸序列相比，该模板包含至少一个核苷酸修饰。核苷酸修饰可以是至少一个核苷酸取代、添加、缺失或化学改造。任选地，多核苷酸修饰模板可以进一步包含位于至少一个核苷酸修饰侧翼的同源核苷酸序列，其中侧翼同源核苷酸序列为待编辑的希望的核苷酸序列提供了充足同源性。[0118]在一些方面，将目的多核苷酸插入靶位点并作为“供体dna”分子的一部分提供。如本文所用，“供体dna”是dna构建体，其包括待插入到cas内切核酸酶的靶位点的目的多核苷酸。供体dna构建体进一步包含位于目的多核苷酸侧翼的同源的第一区域和第二区域。供体dna的同源的第一区域和第二区域分别与存在于细胞或生物体基因组的靶位点中或位于所述靶位点侧翼的第一和第二基因组区域共享同源性。供体dna可以与指导多核苷酸进行系链。系链的供体dna可以允许共定位靶标和供体dna，可用于基因组编辑、基因插入和靶向的基因组调节，并且还可以用于靶向有丝分裂后期细胞，在这些细胞中内源性hr机制的功能预计会大大降低(mali等人，2013naturemethods[自然方法]第10卷：957-963)。靶标和供体多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可以变化并且包括总长度和/或区域。[0119]使用修饰模板编辑cas9-grna双链断裂位点的基因组序列的过程通常包括：为宿主细胞提供cas9-grna复合物，该复合物识别宿主细胞基因组中的靶序列并能够诱导基因组序列中的单链或双链断裂，并且任选地提供包含与要编辑的核苷酸序列相比至少一个核苷酸改变的至少一种多核苷酸修饰模板。该多核苷酸修饰模板还可以包含侧翼于该至少一个核苷酸改变的核苷酸序列，其中侧翼序列与侧翼于双链断裂的染色体区域基本同源。已经在例如以下中描述了使用双链断裂诱导剂(如cas9-grna复合物)的基因组编辑：2015年3月19日公布的us20150082478，2015年2月26日公布的wo2015026886，2016年1月14日公布的wo2016007347，以及于2016年2月18日公布的wo2016025131。[0120]为了促进真核细胞的最佳表达和核定位，可以如2016年11月24日公布的wo2016186953中所述对包含cas内切核酸酶的基因进行优化，然后通过本领域已知的方法将其作为dna表达盒递送至细胞中。在一些方面，该cas内切核酸酶作为多肽提供。在一些方面，该cas内切核酸酶作为编码多肽的多核苷酸提供。在一些方面，该指导rna作为编码一种或多种rna分子的dna分子提供。在一些方面，该指导rna作为rna或经化学修饰的rna提供。在一些方面，该cas内切核酸酶蛋白和指导rna作为核糖核蛋白复合物(rnp)提供。[0121]一旦在基因组中诱导了双链断裂，则细胞dna修复机制被激活以修复断裂。[0122]双链断裂修复和多核苷酸修饰[0123]双链断裂诱导剂，例如引导cas内切核酸酶可以识别、结合dna靶序列，并且引入单链(切口)或双链断裂。一旦在dna中诱导单链断裂或双链断裂，则细胞的dna修复机制被激活来例如经由会导致靶位点处的修饰的非同源末端连接(nhej)、或同源定向修复(hdr)过程修复断裂。用来将断裂的末端结合在一起的最常见的修复机制是非同源末端连接(nhej)途径(bleuyard等人，(2006)dnarepair[dna修复]5：1-12)。染色体的结构完整性典型地通过修复来保存，但是缺失、插入或其他重排(如染色体易位)是可能的(siebert和puchta，2002plantcell[植物细胞]14：1121-31；pacher等人，2007genetics[遗传学]175：21-9)。nhej通常容易出错，并且可以在靶位点引入小突变。在植物中，nhej通常是修复dsb的主要途径；因此，需要改善植物中hdr或hr的概率的方法和组合物。[0124]如podevin(podevin，n.，davies，h.v.，hartung，f.，nogue，f.和casacuberta，j.m.(2013)site-directednucleases：aparadigmshiftinpredictable，knowledge-basedplantbreeding.[位点定向核酸酶：可预测的、基于知识的植物育种的范式转变]trendsbiotechnol.[生物技术趋势]31(6)，375-383)、hilscher(hilscher，j.，burstmayr，h.和stoger，e.(2016)targetedmodificationofplantgenomesforprecisioncropbreeding.[针对精确农作物育种的靶向植物基因组修饰]biotechnol.j.[生物技术杂志]11，1-14)、和pacher(pacher和puchta(2016)，fromclassicalmutagenesistonuclease-basedbreeding-directingnaturaldnarepairforanaturalend-product.[从经典诱变到基于核酸酶的育种-指导天然dna修复以生产天然终产物]theplantjournal[植物杂志]90(4)：819-833)所描述，根据欧盟(eu)新技术工作组(ntwg；欧盟委员会等)对zfn活性和调节目的分类，已经定义了三类位点定向核酸酶介导的基因组修饰：[0125]sdn1涵盖了sdn的应用，而没有另外的供体dna或修复模板。因此，反应结果显然取决于植物基因组的dsb修复途径。由于主要的dsb修复途径是nhej，因此可能会发生小插入或缺失(sdn1a)。在sdn串联排列的情况下，可以获得较大的缺失(sdn1b)。此外，可通过多路复用sdn1方法生成倒置(sdn1c)或易位(sdn1d)(hilscher等人，2016)。[0126]sdn2描述了将sdn与另外的dna“多核苷酸修饰模板”一起使用，从而以受控方式引入小突变。在这里，提供了主要与靶序列同源的模板，作为诱导一个或两个相邻dsb后hr介导的dsb修复的底物。这种方法允许引入本身也可以自然发生的小突变。考虑到植物基因组的大小，统计上可将多达20个核苷酸的小修饰视为类似于自然发生的基因组变化的ge。因此，使用odm的靶向基因组修饰也被认为与sdn2具有可比性。[0127]sdn3描述了将sdn与另外的“供体多核苷酸”或“供体dna”一起使用，以便在预定基因座引入大区段外源dna，从而增加或替换遗传信息。从机制上讲，此过程依赖于hr介导的dsb修复(如sdn2)，并且区分是任意的，因为插入序列的大小可能会显著变化。[0128]sdn2和sdn3两者都是多核苷酸中双链断裂的同源定向修复(hdr)类型，并且涉及引入异源多核苷酸作为修复双链断裂(sdn2)的模板或作为在双链断裂位点(sdn3)处新双链多核苷酸的插入。sdn2修复可通过一个或几个核苷酸变化(突变)的存在来检测。sdn3修复可以通过新的连续异源多核苷酸的存在来检测。[0129]靶多核苷酸的修饰包括以下任何一种或多种：至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的化学改变、至少一个核苷酸的替换或至少一个核苷酸的突变。在一些方面，dna修复机制造成双链断裂的不完全修复，导致断裂位点处的核苷酸改变。在一些方面，可以将多核苷酸模板提供给断裂位点，其中修复导致了断裂的模板定向修复。在一些方面，可将供体多核苷酸提供至断裂位点，其中修复导致了供体多核苷酸并入断裂位点。[0130]在一些方面，本文描述的方法和组合物改善dsb处的非nhej修复机制结果的概率。在一个方面，实现了hdr与nhej修复比率的增加。[0131]同源定向修复和同源重组[0132]同源定向修复(hdr)是在细胞中用来修复双链dna和单链dna断裂的机制。同源定向修复包括同源重组(hr)和单链退火(ssa)(lieber.2010annu.rev.biochem.[生物化学年鉴]79：181-211)。hdr的最常见形式称为同源重组(hr)，其在供体与受体dna之间具有最长的序列同源性要求。hdr的其他形式包括单链退火(ssa)和断裂诱导的复制，并且这些需要相对于hr更短的序列同源性。缺口(单链断裂)处的同源定向修复可以经由与在双链断裂处的hdr不同的机制发生(davis和maizels.pnas[美国科学院院报](0027-8424)，111(10)，第e924-e932页)。[0133]“同源”意指dna序列是相似的。例如，在供体dna上发现的“与基因组区域同源的区域”是与细胞或生物体基因组中给定的“基因组序列”具有类似序列的dna的区域。同源的区域可以具有足以促进在切割的靶位点处的同源重组的任何长度。例如，同源的区域的长度可以包括至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得同源的区域具有足够的同源性以与相应的基因组区域进行同源重组。“足够的同源性”表示两个多核苷酸序列具有足够的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总长度以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可以通过在序列的整个长度上的百分比序列同一性和/或通过包含局部相似性(例如具有100％序列同一性的连续核苷酸)的保守区域以及在序列长度的一部分上的百分比序列同一性来描述。[0134]由靶和供体多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可以变化，并且包括总长度和/或在约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb，或多达并包括靶位点的总长度的范围内具有单位整数值的区域。这些范围包括所述范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可以通过在两个多核苷酸的完整比对长度上的百分比序列同一性来描述，其包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的百分比序列同一性。足够的同源性包括多核苷酸长度、总体百分比序列同一性，和任选地连续核苷酸的保守区域或局部百分比序列同一性的任何组合，例如，足够的同源性可以被描述为与靶标基因座的区域具有至少80％序列同一性的75-150bp的区域。足够的同源性也可以通过预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如sambrook等人，(1989)molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，(coldspringharborlaboratorypress，ny[纽约州冷泉港实验室出版社])；currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验指南]，ausubel等人编辑(1994)currentprotocols[实验室指南]，(greenepublishingassociates，inc.[格林出版联合公司]和johnwiley&sons，inc.[约翰威利父子公司])；以及tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology‑‑hybridizationwithnucleicacidprobes[生物化学与分子生物学实验技术一与核酸探针杂交]，(elsevier，newyork[纽约爱思唯尔公司])。[0135]dna双链断裂可以是刺激同源重组途径的有效因子(puchta等人，(1995)plantmolbiol[植物分子生物学]28：281-92；tzfira和white，(2005)trendsbiotechnol[生物技术趋势]23：567-9；puchta，(2005)jexpbot[实验植物学杂志]56：1-14)。使用dna断裂剂，在植物中的人工构建的同源dna重复序列之间观察到同源重组的两倍至九倍的增加(puchta等人，(1995)plantmolbiol[植物分子生物学]28：281-92)。在玉米原生质体中，用线性dna分子进行的实验证实了在质粒之间增强的同源重组(lyznik等人，(1991)molgengenet[分子和普通遗传学]230：209-18)。[0136]原核和真核细胞或生物细胞的基因组的改变，例如通过同源重组(hr)，对于基因工程而言的有力工具。已经证明了在植物中(halfter等人，(1992)molgengenet[分子和普通遗传学]231：186-93)和昆虫中(dray和gloor，1997，genetics[遗传学]147：689-99)的同源重组。在其他生物体中也可以实现同源重组。例如，在寄生原生动物利什曼原虫中，至少需要150-200bp的同源性进行同源重组(papadopoulou和dumas，(1997)nucleicacidsres[核酸研究]25：4278-86)。在丝状真菌构巢曲霉(aspergillusnidulans)中，已经用仅50bp侧翼同源性实现基因替换(chaveroche等人，(2000)nucleicacidsres[核酸研究]28：e97)。在纤毛虫嗜热四膜虫中也已经证明了靶向基因替换(gaertig等人，(1994)nucleicacidsres[核酸研究]22：5391-8)。在哺乳动物中，使用可以在培养基中生长、转化、选择、和引入小鼠胚胎中的多能胚胎干细胞系(es)，同源重组在小鼠中已经是最成功的(watson等人，(1992)recombinantdna[重组dna]，第2版，scientificamericanbooksdistributedbywhfreeman&co.[由whfreeman&co.公司发行的科学美国人图书])。[0137]提高dsb修复中hdr的概率[0138]基于以下事实，考虑了几种促进经由hdr修复双链断裂的方法：(1)cas9对其切割的底物具有高亲和力，并且释放速度缓慢(richardson，c.等人(2016)nat.biotechnol.[自然生物技术]34：339-344)；以及(2)发明人观察到，多核苷酸切割的突变结果通常是非随机且可再现的(未公布)。发明人设想重新靶向多核苷酸双链断裂位点，从而为dsb修复提供多个机会，促进hdr(例如，hr)相对于nhej的发生。发明人还设想因为重组基因中间体涉及3’突出端，所以位于双链断裂位点侧翼的额外单链断裂将产生不稳定的双链体，从而产生重组基因中间体。在一些情况下，使用不同的内切核酸酶(例如，来自不同来源的生物体或crispr基因座，或工程化酶，或切口酶)。[0139]在一些方面，hr读段的分数或百分比大于比较对象，例如对照样品，具有nhej修复的样品，或与总突变读段相比。在一些方面，hr读段的分数或百分比大于对照样品(无dsb剂)。在一些方面，hr读段的分数或百分比大于nhej读段的分数或百分比。在一些方面，hr读段的分数或百分比大于总突变读段(nhej+hr)的分数或百分比。[0140]在一些方面，相对于比较对象的hr读段的分数为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、在10与15之间、15、在15与20之间、20、在20与25之间、25、在25与30之间、30、在30与40之间、40、在40与50之间、50、在50与60之间、60、在60与70之间、70、在70与80之间、80、在80与90之间、90、在90与100之间、100、在100与125之间、125、在125与150之间，大于150、或无限大。[0141]在一些方面，相对于比较对象的hr读段百分比是至少为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、20％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％更大。[0142]在一些方面，hr读段的百分比大于零。[0143]在方法的一个方面，通过任何方法或组合物，例如但不限于cas内切核酸酶和指导rna，创建、修复、并反复切割双链断裂。简而言之，dsb诱导剂(例如，cas内切核酸酶和第一指导rna)识别、结合、并切割靶多核苷酸。创建并修复第一双链断裂。在一些方面，该修复导致靶位点多核苷酸序列的变化(例如但不限于核苷酸的插入、核苷酸的缺失、或核苷酸的替换)。在一些方面，为特定的靶多核苷酸修复组合物结果提供修复模板。在这种情况下，修复模板的侧翼为反向靶位点(内部是pam)。引入第二指导rna，该第二指导rna与通过第一双链断裂修复所创建的突变互补。在一些方面，dsb修复组合物结果通过引入供体多核苷酸模板或插入确定，并且第二指导rna被设计为与此确定的靶序列结果互补。在一些方面，第二指导rna被设计为与最常创建的修复突变互补。在一些方面，第二指导rna被设计为与所需dna修复结果互补。在一些方面，设计了与靶位点的所有可能突变互补的第二指导rna的文库。通过第一双链断裂修复创建的一个或多个突变可以是已知的或以生物信息学方式预测。第二指导rna与cas内切核酸酶(重新提供或与针对第一dsb存在的相同cas内切核酸酶)协同作用，以在相同位点(在cas内切核酸酶/第一指导rna复合物的中靶识别序列内)处创建第二双链断裂。在一些方面，代替创建第二dsb的第二指导rna和cas内切核酸酶，可以引入另一种dsb诱导剂。与第一dsb的修复相比，第二dsb的hdr修复概率高于nhej修复概率(即hdr的概率增加，或hdr的频率增加，或hdr与nhej的比率增加)。通常，在先前的切割位点处具有后续切割，在一些方面，该后续切割可以通过引入另一个cas内切核酸酶/grna复合物来实现。以顺序方式继续切割增加了hdr作为dsb修复机制的频率。[0144]在方法的一个方面，通过任何方法或组合物，例如但不限于cas内切核酸酶和指导rna，创建、修复、并递归地切割双链断裂。简而言之，dsb诱导剂(例如，cas内切核酸酶和第一指导rna)识别、结合、并切割靶多核苷酸。第一指导rna作为质粒上的dna序列提供，该质粒进一步包含间隔子序列。在一些方面，编码grna的dna可操作地连接到调节表达元件。创建并修复第一双链断裂。修复的靶多核苷酸的组合物用作通过对包含grnadna和间隔子的质粒上的间隔子进行cas编辑而生成的突变的基础。突变的间隔子组合物指导第二grna的生成，该第二grna与第一dsb的修复的靶向多核苷酸的序列互补，并且通过cas内切核酸酶和第二grna在靶位点处诱导第二双链断裂。然后可以重复该循环，然后将新修复的第二dsb的序列用作与修复的第二dsb多核苷酸的序列互补的第三grna的组合物的模板，并且以此类推。以这种方式发生了dsb生成和修复的循环，与第一次修复的机制相比，第一次之后的每次后续修复经由hdr修复的概率高于nhej。该过程可以通过多种方法中的任一种来停止，包括但不限于：滴定试剂可用性，在grnadna表达构建体的区域中诱导使表达盒或转录的grna无功能的突变，可以任选地是可诱导或可阻遏的外部因子，或经由引入另一种分子。[0145]在方法的一个方面，创建与靶多核苷酸上的双链断裂相邻的切口(仅在两个磷酸骨架之一上切割双链dna)。在此方面的一个变异中，创建单个切口。在此方面的一个变异中，创建两个切口。在此方面的一个变异中，创建两个切口，每个位于dsb的两侧的侧翼。在一个实施例中，通过一种cas内切核酸酶创建双链断裂，并且通过不同的分子(例如，衍生自不同生物体的分子，或缺乏双链断裂创建功能但具有切口酶活性的cas内切核酸酶(例如，ncas9))创建一个或多个切口。由于存在一个或多个相邻切口，靶位点处dsb的双链断裂修复通过hdr进行修复的概率高于通过nhej进行修复的概率，或者与同一基因座处的没有一个或多个与dsb相邻的切口的dsb相比，hdr的频率更高。在一些方面，切口与dsb位点之间的距离的长度是10个碱基对、10与20个碱基对之间、20个碱基对、20与30个碱基对之间、30个碱基对、30与40个碱基对之间、40个碱基对、40与50个碱基对之间、50个碱基对、50与60个碱基对之间、60个碱基对、60与70个碱基对之间、70个碱基对、70与80个碱基对之间、80个碱基对、80与90个碱基对之间、90个碱基对、90与100个碱基对之间、100个碱基对、100与110个碱基对之间、110个碱基对、110与120个碱基对之间、或大于120个碱基对。[0146]除了提高hdr修复机制结果的概率之外，考虑使用本文所述的方法改进的其他dna修复结果包括基因靶向、基因编辑、基因退出、基因交换(缺失加插入)、和启动子交换(缺失加插入)。[0147]基因靶向[0148]本文所述的组合物和方法可用于基因靶向。[0149]通常，可以通过在具有与合适的指导多核苷酸组分缔合的cas内切核酸酶的细胞中的特异性多核苷酸序列处切割一条或两条链来进行dna靶向。一旦在dna中诱导单链断裂或双链断裂，则细胞的dna修复机制被激活来经由会导致靶位点处的修饰的非同源末端连接(nhej)、或同源定向修复(hdr)过程修复断裂。[0150]靶位点处的dna序列的长度可以变化，并且包括例如为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或多于30个核苷酸长度的靶位点。还有可能靶位点可以是回文的，即，一条链上的序列与在互补链上以相反方向的读取相同。切口/切割位点可以在靶序列内，或者切口/切割位点可以在靶序列之外。在另一种变异中，切割可以发生在彼此正好相对的核苷酸位置处，以产生平端切割，或者在其他情况下，切口可以交错以产生单链突出端，也称为“粘性末端”，其可以是5′突出端抑或3′突出端。还可以使用基因组靶位点的活性变体。此类活性变体可以包含与给定靶位点至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性变体保留生物活性，因此能够被cas内切核酸酶识别和切割。[0151]测量由内切核酸酶引起的靶位点的单链或双链断裂的测定是本领域已知的，并且通常测量试剂在包含识别位点的dna底物上的总体活性和特异性。[0152]本文的靶向方法能以例如在该方法中靶向两个或更多个dna靶位点的这样的方式进行。这种方法可以任选地被表征为多重方法。在某些实施例中，可以同时靶向两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个靶位点。多路复用方法典型地通过本文的靶向方法进行，其中提供了多个不同的rna组分，每一个被设计成将指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物引导到唯一的dna靶位点。[0153]基因编辑[0154]组合dsb和修饰模板来编辑基因组序列的过程通常包括：向宿主细胞引入dsb诱导剂或编码dsb诱导剂的核酸(识别染色体序列中的靶序列并且能够诱导基因组序列中的dsb)，和与待编辑的核苷酸序列相比时包含至少一个核苷酸改变的至少一个多核苷酸修饰模板。多核苷酸修饰模板还可以包含侧翼于所述至少一个核苷酸变化的核苷酸序列，其中侧翼序列与侧翼于dsb的染色体区域基本同源。已经在例如以下中描述了使用dsb诱导剂(如cas-grna复合物)的基因组编辑：2015年3月19日公布的us20150082478，2015年2月26日公布的wo2015026886，2016年1月14日公布的wo2016007347，以及于2016年2月18日公布的wo/2016/025131。[0155]已经描述了指导rna/cas内切核酸酶系统的一些用途(参见例如：2015年3月19日公布的us20150082478a1，2015年2月26日公布的wo2015026886，和2015年2月26日公布的us20150059010)并且包括但不限于修饰或替换目的核苷酸序列(诸如调节元件)、目的多核苷酸插入、基因退出、基因敲除、基因敲入、剪接位点的修饰和/或引入交替剪接位点、编码目的蛋白的核苷酸序列的修饰、氨基酸和/或蛋白融合物、以及通过在目的基因中表达反向重复序列引起的基因沉默。[0156]可以按不同方式改变蛋白，这些方式包括氨基酸取代、缺失、截短、和插入。用于此类操作的方法通常是已知的。例如，可以通过在dna中的突变制备一种或多种蛋白质的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法包括，例如，kunkel，(1985)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]82：488-92；kunkel等人，(1987)methenzymol[酶学方法]154：367-82；美国专利号4,873,192；walker和gaastra，编辑(1983)techniquesinmolecularbiology[分子生物学技术](macmillanpublishingcompany，newyork[麦克米伦出版公司，纽约])，以及其中所引用的文献。发现关于不太可能影响蛋白质生物学活性的氨基酸取代的引导，例如，在dayhoff等人，(1978)atlasofproteinsequenceandstructure[蛋白质序列和结构图谱集](natlbiomedresfound，washington，d.c.[国家生物医学研究基金会，美国华盛顿哥伦比亚特区])的模型中。保守取代，例如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，会是优选的。未预期保守缺失、插入、和氨基酸取代会产生在蛋白质特征中的根本变化，并且可以通过常规筛选测定来评价任何取代、缺失、插入、或其组合的作用。对双链-断裂-诱导活性的测定是已知的，并且通常测量试剂对包含靶位点的dna底物的总体活性和特异性。[0157]本文描述了用于使用切割就绪的cascade(cleavagereadycascade，crcascade)复合物进行基因组编辑的方法。在对指导rna和pam序列进行表征后，可利用裂解就绪cascade(crcascade)复合物的组分和相关联的crisprrna(crrna)来修饰包括植物在内的其他生物体中的染色体dna。为了促进最佳表达和核定位(对于真核细胞)，可以如2016年11月24日公布的wo2016186953中所述对包含crcascade的基因进行优化，然后通过本领域已知的方法将其作为dna表达盒递送至细胞中。也可以将必需包含活性crcascade复合物的组分作为rna(具有或不具有保护rna免于降解的修饰)或作为有帽或无帽的mrna(zhang，y.等人，2016，nat.commun.[自然通讯]7：12617)或cas蛋白指导多核苷酸复合物(公布于2017年4月27日的wo2017070032)、或其任何组合递送。另外，crcascade复合物和crrna的一个或多个部分可以从dna构建体表达，而将其他组分作为rna(具有或不具有保护rna免于降解的修饰)或以带帽或不带帽的mrna(zhang等人2016nat.commun.[自然通讯]7：12617)或cas蛋白指导多核苷酸复合物(公布于2017年4月27日的wo2017070032)或其任何组合递送。为了体内产生crrna，trna衍生的元件也可以用于募集内源rna酶以将crrna转录物切割成能够将crcascade复合物指导至其dna靶位点的成熟形式，例如，如2017年6月22日公布的wo2017105991中所述。crcascade切口酶复合物可单独使用或协同使用，以在一条或两条dna链上产生单个或多个dna切口。此外，可以通过改变切割结构域中的关键催化残基来使cas内切核酸酶的切割活性灭活(sinkunas，t.等人，2013，emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]32：385-394)，从而产生受rna指导的解旋酶，其可以用于增强同源定向修复，诱导转录激活或重塑局部dna结构。而且，cas切割和解旋酶结构域的活性可以都被敲除并与其他dna剪切、dna切口、dna结合、转录激活、转录阻遏、dna重塑、dna脱氨、dna解旋、dna重组增强、dna整合、dna倒置和dna修复剂组合使用。[0158]可以如2016年11月24日公布的wo2016186946和2016年11月24日公布的wo2016186953中所述推导用于crispr-cas系统(如果存在的话)和crispr-cas系统的其他组分(如可变靶向结构域、crrna重复序列、环、反重复序列)的tracrrna的转录方向。[0159]如本文所述，一旦建立了适当的指导rna要求，就可以检查本文公开的每个新系统的pam偏好。如果切割就绪的cascade(crcascade)复合物导致随机pam文库的降解，则可以通过诱变关键残基或通过在无atp的情况下组装反应使atp酶依赖性解旋酶活性无效，从而将crcascade复合物转化为切口酶，如先前所述(sinkunas，t.等人，2013，emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]32：385-394)。可以利用由两个前间隔子靶隔开的pam随机化的两个区域来生成双链dna断裂，所述双链dna断裂可以被捕获并测序以检查支持各自的crcascade复合物切割的pam序列。[0160]在一个实施例中，本发明描述了用于修饰细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括将至少一种cas内切核酸酶和指导rna引入细胞中，并鉴定在所述靶位点上具有修饰的至少一个细胞。[0161]待编辑的核苷酸可以位于由cas内切核酸酶识别和切割的靶位点的内部或外部。在一个实施例中，该至少一个核苷酸修饰不是由cas内切核酸酶识别和切割的靶位点上的修饰。在另一个实施例中，该待编辑的至少一个核苷酸与基因组靶位点之间有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、900或1000个核苷酸。[0162]可以通过插入缺失(通过nhej在靶dna序列中插入或缺失核苷酸碱基)，或通过特异性去除在靶向位点处或其附近处降低或完全破坏序列功能的序列来产生敲除。[0163]指导多核苷酸/cas内切核酸酶诱导的靶向突变可以发生在位于由cas内切核酸酶识别和切割的基因组靶位点内部或外部的核苷酸序列中。[0164]用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法可以是通过恢复无功能基因产物的功能而不使用外源选择性标志物的方法。[0165]在一个实施例中，本发明描述了用于修饰细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括将至少一种本文所述的pgen和至少一种供体dna引入细胞中，其中所述供体dna包含目的多核苷酸，并且任选地，所述方法进一步包括鉴定至少一个将所述目的多核苷酸整合到所述靶位点中或附近的细胞。[0166]在一个方面，本文公开的方法可采用同源重组(hr)以在靶位点处提供目的多核苷酸的整合。[0167]可以采用多种方法和组合物来产生具有经由本文所述的crispr-cas系统组分的活性插入靶位点的目的多核苷酸的细胞或生物。在本文所述的一种方法中，经由供体dna构建体，将目的多核苷酸引入生物体细胞。如本文所用，“供体dna”是dna构建体，其包括待插入到cas内切核酸酶的靶位点的目的多核苷酸。供体dna构建体进一步包含位于目的多核苷酸侧翼的同源的第一区域和第二区域。供体dna的同源的第一区域和第二区域分别与存在于细胞或生物体基因组的靶位点中或位于所述靶位点侧翼的第一和第二基因组区域共享同源性。[0168]供体dna可以与指导多核苷酸进行系链。系链的供体dna可以允许共定位靶标和供体dna，可用于基因组编辑、基因插入和靶向的基因组调节，并且还可以用于靶向有丝分裂后期细胞，在这些细胞中内源性hr机制的功能预计会大大降低(mali等人，2013naturemethods[自然方法]第10卷：957-963)。[0169]由靶和供体多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可以变化，并且包括总长度和/或在约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb，或多达并包括靶位点的总长度的范围内具有单位整数值的区域。这些范围包括所述范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可以通过在两个多核苷酸的完整比对长度上的百分比序列同一性来描述，其包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的百分比序列同一性。足够的同源性包括多核苷酸长度、总体百分比序列同一性，和任选地连续核苷酸的保守区域或局部百分比序列同一性的任何组合，例如，足够的同源性可以被描述为与靶标基因座的区域具有至少80％序列同一性的75-150bp的区域。足够的同源性也可以通过预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如sambrook等人，(1989)molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，(coldspringharborlaboratorypress，ny[纽约州冷泉港实验室出版社])；currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验指南]，ausubel等人编辑(1994)currentprotocols[实验室指南]，(greenepublishingassociates，inc.[格林出版联合公司]和johnwiley&sons，inc.[约翰威利父子公司])；以及tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology‑‑hybridizationwithnucleicacidprobes[生物化学与分子生物学实验技术-与核酸探针杂交]，(elsevier，newyork[纽约爱思唯尔公司])。[0170]还可以将附加体dna分子连接至双链断裂中，例如，将t-dna整合至染色体双链断裂中(chilton和que，(2003)plantphysiol[植物生理学]133：956-65；salomon和puchta，(1998)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]17：6086-95)。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被涉及双链断裂的成熟的外切核酸酶活性改变，则基因转换途径可以恢复原始结构，如果有同源序列的话，例如非分裂的体细胞中的同源染色体，或dna复制后的姊妹染色单体(molinier等人，(2004)plantcell[植物细胞]16：342-52)。异位的和/或表观遗传的dna序列还可以充当用于同源重组的dna修复模板(puchta，(1999)genetics[遗传学]152：1173-81)。[0171]在一个实施例中，本公开包含用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括引入至少一种本文所述的pgen和多核苷酸修饰模板，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰，并且该方法任选地进一步包括选择至少一个包含经编辑的核苷酸序列的细胞。[0172]指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统可以与至少一个多核苷酸修饰模板组合使用以允许编辑(修饰)目的基因组核苷酸序列。(还参见2015年3月19日公布的us20150082478和2015年2月26日公布的wo2015026886)。[0173]目的多核苷酸和/或性状可以在复杂性状基因座中堆叠在一起，如在2012年9月27日公布的wo2012129373和2013年8月01日公布的wo2013112686中所述。本文所述的指导多核苷酸/cas9内切核酸酶系统提供了用来产生双链断裂并允许将性状在复杂性状基因座中堆叠的有效系统。[0174]如本文所述的介导基因靶向的指导多核苷酸/cas系统可以在以下方法中使用，所述方法用于以类似于2012年9月27日公布的wo2012129373中公开的方式引导异源基因插入和/或产生包含多个异源基因的复杂性状基因座，其中使用如本文公开的指导多核苷酸/cas系统来代替使用双链断裂诱导剂引入目的基因。通过将独立的转基因插入在彼此的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2、或甚至5厘摩(cm)内，这些转基因可以作为单个遗传基因座进行育种(例如，参见2013年10月03日公布的us20130263324或2013年3月14日公布的wo2012129373)。在选择包含转基因的植物后，可以将包含(至少)一个转基因的植物进行杂交从而形成包含全部两个转基因的f1。在来自这些f1(f2或bc1)的后代中，1/500的后代将具有重组在相同的染色体上的两个不同的转基因。然后，可以将复合物基因座繁育为具有全部两个转基因性状的单遗传基因座。可以重复该过程以堆叠尽可能多的性状。[0175]已经描述了指导rna/cas内切核酸酶系统的进一步用途(参见例如：2015年3月19日公布的us20150082478，2015年2月26日公布的wo2015026886，2015年2月26日公布的us20150059010，2016年1月14日公布的wo2016007347，和2016年2月18日公布的pct申请wo2016025131)并包括但不限于修饰或替换目的核苷酸序列(诸如调节元件)、目的多核苷酸插入、基因敲除、基因敲入、剪接位点的修饰和/或引入交替剪接位点、编码目的蛋白的核苷酸序列的修饰、氨基酸和/或蛋白融合物、以及通过在目的基因中表达反向重复序列引起的基因沉默。[0176]可以评估本文描述的基因编辑组合物和方法产生的特征。可以鉴定与目的表型或性状相关的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界扩展到涵盖将与控制目的性状的基因连锁的标志物。换句话说，扩展染色体区间，这样使得位于区间内的任何标志物(包括限定区间的边界的末端标志物)可以用作特定性状的标志物。在一个实施例中，染色体区间包含至少一个qtl，并且此外，确实可以包含多于一个qtl。相同区间中非常接近的多个qtl可以搅乱特定标志物与特定qtl的关联，因为一个标志物可显示与多于一个qtl连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标志物显示与期望表型性状共分离，则有时分不清楚是否那些标志物中的每一个鉴定相同qtl或两个不同的qtl。术语“数量性状基因座”或“qtl”是指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种群体中)，与数量表型性状的差异表达关联的dna区域。qtl的区域涵盖或紧密地连锁于影响所考虑的性状的一个或多个基因。“qtl的等位基因”可以包含在连续的基因组区域或连锁群中的多个基因或其他遗传因子，例如单倍型。qtl的等位基因可以表示在指定窗口内的单倍型，其中所述窗口是可以用一组的一个或多个多态性标志物定义和追踪的连续的基因组区域。单倍型可以指定被窗口内的每一标志物的等位基因的独特指纹定义。[0177]细胞的重组构建体和转化[0178]可以将本文公开的指导多核苷酸、cas内切核酸酶、多核苷酸修饰模板、供体dna、指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统以及其任意一种组合(任选地进一步包含一个或多个目的多核苷酸)引入细胞中。细胞包括但不限于人、非人、动物、细菌、真菌、昆虫、酵母、非常规酵母和植物细胞，以及通过本文所述的方法产生的植物和种子。[0179]本文使用的标准重组dna和分子克隆技术是在本领域熟知的，并且更全面地描述于sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]；coldspringharborlaboratory：coldspringharbor，ny[冷泉港实验室：冷泉港，纽约州](1989)中。转化方法是本领域技术人员熟知的并且在下文中进行了描述。[0180]载体和构建体包括环状质粒和包含目的多核苷酸的线状多核苷酸，以及任选地包括接头、衔接子、用于调节或分析的其他组分。在一些实例中，识别位点和/或靶位点可以包8kb、5-10kb，或多达并包括靶位点的总长度的范围内具有单位整数值的区域。这些范围包括所述范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可以通过在两个多核苷酸的完整比对长度上的百分比序列同一性来描述，其包括至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％至99％、99％、99％至100％或100％的百分比序列同一性。足够的同源性包括多核苷酸长度、总体百分比序列同一性，和任选地连续核苷酸的保守区域或局部百分比序列同一性的任何组合，例如，足够的同源性可以被描述为与靶标基因座的区域具有至少80％序列同一性的75-150bp的区域。足够的同源性也可以通过预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如sambrook等人，(1989)molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，(coldspringharborlaboratorypress，ny[纽约州冷泉港实验室出版社])；currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验指南]，ausubel等人编辑(1994)currentprotocols[实验室指南]，(greenepublishingassociates，inc.[格林出版联合公司]和johnwiley&sons，inc.[约翰威利父子公司])；以及tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology‑‑hybridizationwithnucleicacidprobes[生物化学与分子生物学实验技术-与核酸探针杂交]，(elsevier，newyork[纽约爱思唯尔公司])。[0190]在给定的基因组区域和在供体dna上发现的相应的同源的区域之间的结构相似性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，由供体dna的“同源的区域”和生物体基因组的“基因组区域”共享的同源性或序列同一性的量可以是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，这样使得序列进行同源重组[0191]供体dna上的同源的区域可以与靶位点侧翼的任何序列具有同源性。虽然在一些情况下，同源的区域与紧邻靶位点侧翼的基因组序列共享显著的序列同源性，但是应当认识到同源的区域可以被设计为与可能更靠近靶位点的5′或3′的区域具有足够的同源性。同源的区域还可以与靶位点的片段以及下游基因组区域具有同源性[0192]在一个实施例中，第一同源的区域进一步包含靶位点中的第一片段，并且第二同源的区域包含靶位点中的第二片段，其中第一片段和第二片段不同。[0193]目的多核苷酸[0194]在本文中进一步描述了目的多核苷酸，并且包括反映涉及作物发育的那些的商业市场和利益的多核苷酸。目的作物和市场发生变化，以及随着发展中国家打开国际市场，新作物和技术也将出现。此外，随着我们对农艺学性状和特征(例如产率和杂种优势增加)的理解逐渐深入，对用于基因工程的基因的选择将会相应变化。[0195]目的多核苷酸的一般类别包括，例如涉及信息的那些目的基因(诸如锌指)，涉及通讯的那些基因(诸如激酶)，以及涉及管家的那些基因(诸如热休克蛋白)。更特定的目的多核苷酸包括但不限于涉及具有农艺学重要性的性状的基因，这些具有农艺学重要性的性状例如但不限于：作物产量、谷粒质量、作物营养成分、淀粉和碳水化合物质量和数量的基因、连同影响籽粒大小、蔗糖载量、蛋白质量和数量、固氮和/或氮利用、脂肪酸和油组成的那些基因、编码赋予对非生物胁迫(例如干旱、氮、温度、盐度、毒性金属、或痕量元素)的抗性的蛋白质，或赋予对毒素(例如杀有害生物剂和除草剂)的抗性的那些蛋白质的基因、编码赋予对生物胁迫(例如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的攻击以及与这些生物体相关的疾病的发展)的抗性的蛋白质的基因。[0196]除了使用传统的育种方法之外，还可以通过遗传方式改变农艺学上重要的性状(诸如油、淀粉、和蛋白质含量)。修饰包括增加油酸、饱和及不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸、以及还有对淀粉的修饰。在美国专利号5,703,049、5,885,801、5，885，802和5，990,389中描述了戈多硫蛋白(hordothionin)的蛋白修饰。[0197]目的多核苷酸序列可以编码涉及提供疾病或有害生物抗性的蛋白。“疾病抗性”或“有害生物抗性”意在是植物避免为植物-病原体相互作用后果的有害症状的发生。有害生物抗性基因可以编码对严重影响产率的有害生物的抗性，这些有害生物例如根虫、切根虫、欧洲玉米黍螟等。疾病抗性基因和抗昆虫基因，例如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕杀菌肽，或用于抗真菌保护的蛋白，例如防御素、葡聚糖酶、或几丁质酶，或用于控制线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素、或糖苷酶，均是有用的基因产物的实例。编码疾病抗性性状的基因包括解毒基因，如抗伏马毒素(美国专利号5,792,931)；无毒力(avr)和疾病抗性(r)基因(jones等人(1994)science[科学]266：789；martin等人(1993)science[科学]262：1432；和mindrinos等人(1994)cell[细胞]78：1089)；等。抗昆虫基因可以编码对严重影响产率的有害生物的抗性，这些有害生物例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等。此类基因包括，例如，苏云金芽孢杆菌有毒蛋白基因(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和geiser等人(1986)gene[基因]48：109)；等。[0198]“除草剂抗性蛋白”或由“除草剂抗性编码核酸分子”表达生成的蛋白包括这样的蛋白，其赋予细胞与未表达该蛋白的细胞相比耐受更高浓度除草剂的能力，或赋予细胞与未表达该蛋白的细胞相比对某种浓度的除草剂耐受更长时段的能力。除草剂抗性性状可通过如下基因引入进植物中：编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(als，也称为乙酰羟基酸合酶，ahas)的作用的除草剂(特别是磺酰脲(sulfonylurea)(uk：磺酰脲(sulphonylurea))类除草剂)的抗性的基因、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂(例如草丁膦或basta)的抗性的基因(例如bar基因)、编码对草甘膦的抗性的基因(例如epsp合酶基因和gat基因)、编码对hppd抑制剂的抗性的基因(例如hppd基因)或本领域已知的其他此类基因。参见例如美国专利号7,626,077、5,310,667、5,866,775、6,225,114、6,248,876、7,169,970、6,867,293、和9,187,762。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptii基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且als-基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。[0199]此外，认识到目的多核苷酸还可以包括与针对目的所靶向的基因序列的信使rna(mrna)的至少一部分互补的反义序列。构建反义核苷酸以与相应的mrna杂交。可以对该反义序列作出修饰，只要该序列与相应的mrna杂交并干扰相应的mrna的表达。在该方式中，可以使用与相应的反义序列具有70％、80％、或85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可以用来破坏该靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或更多个核苷酸的序列。[0200]此外，目的多核苷酸还可以按有义取向来使用从而抑制植物中内源基因的表达。以有义取向使用多核苷酸用于抑制植物中基因表达的方法是本领域已知的。这些方法通常涉及用包含启动子的dna构建体的转化植物，该启动子可操作地连接到至少一部分的对应于该内源基因的转录物的核苷酸序列上，驱动在植物中的表达。通常，此类核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有实质性的序列同一性，通常大于约65％序列同一性、约85％序列同一性、或大于约95％序列同一性。参见美国专利号5,283,184和5,034,323。[0201]目的多核苷酸还可以是表型标志物。表型标志物是可筛选或选择性标志物，其包括视觉标志物和选择性标志物，无论它是阳性还是阴性选择性标志物。可以使用任何表型标志物。具体地，可选择或可筛选标志物包含允许人们通常在特定条件下鉴定或选择包含它的分子或细胞或对其进行选择的dna区段。这些标志物可以编码活性，例如但不限于rna、肽或蛋白质的产生，或可以提供rna、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等的结合位点。[0202]选择性标志物的实例包括但不限于包含限制性内切酶位点的dna区段；编码对另外的毒性化合物提供抗性的产物的dna区段，所述毒性化合物包括抗生素，例如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、basta、新霉素磷酸转移酶ii(neo)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)；编码在受体细胞中本身缺乏的产物的dna区段(例如，trna基因、营养缺陷型标志物)；编码易于鉴定的产物的dna区段(例如，表型标志物如β-半乳糖苷酶，gus；荧光蛋白如绿色荧光蛋白(gfp)、青色(cfp)、黄色(yfp)、红色(rfp)和细胞表面蛋白)；产生用于pcr的新引物位点(例如，以前未并列的两个dna序列的并列)，包含通过限制性内切核酸酶或其他dna修饰酶、化学品等不起作用或起作用的dna序列；并且包含允许其鉴定的特异性修饰(例如，甲基化)所需的dna序列。[0203]另外的选择性标志物包括赋予除草剂化合物(例如磺酰脲、草胺磷、溴草腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-d))抗性的基因。参见例如，用于对磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶磺酰胺、嘧啶水杨酸和磺酰基氨基羰基-三唑啉酮(shaner和singh，1997，herbicideactivity：toxicolbiochemmolbiol[除草剂活性：毒理学，生物化学，分子生物学]69-110)；草甘膦抗性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(epsps)(saroha等人，1998，j.plantbiochemistry&biotechnology[植物生物化学&生物技术杂志]卷7：65-72)的抗性的乙酰乳酸合酶(als)；[0204]目的多核苷酸包括与其他性状(例如但不限于除草剂抗性或本文描述的任何其他性状)组合堆叠或使用的基因。目的多核苷酸和/或性状可以在复杂性状基因座中堆叠在一起，如2013年10月03日公布的us20130263324和2013年8月01日公布的wo/2013/112686中所述。[0205]目的多肽包括由本文描述的目的多核苷酸编码的蛋白或多肽。[0206]进一步提供了用于鉴定至少一个植物细胞的方法，该植物细胞在其基因组中包含在靶位点处整合的目的多核苷酸。可以使用多种方法来鉴定在靶位点处或靶位点附近插入到基因组中的那些植物细胞。此类方法可被认为是直接分析靶序列以检测靶序列中的任何变化，包括但不限于pcr方法、测序方法、核酸酶消化、dna印迹法、及其任何组合。参见例如，2009年5月21日公布的us20090133152。所述方法还包括从包含整合至其基因组中的目的多核苷酸的植物细胞重新获得植物。所述植物可以是不育的或可育的。应当认识到，可以提供任何目的多核苷酸，将该多核苷酸在靶位点处整合到植物的基因组中，并在植物中表达。[0207]用于在植物中表达的序列的优化[0208]本领域中可获得用于合成植物偏好性基因的方法。参见，例如，美国专利号5,380,831和5,436,391，以及murray等人(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17：477-498。已知另外的序列修饰以增强在植物宿主中的基因表达。例如，这些序列修饰包括消除：编码假多聚腺苷酸化信号的一个或多个序列、一个或多个外显子-内含子剪接位点信号、一个或多个转座子样重复、以及其他可能对基因表达有害的此类良好表征的序列。可以将序列的g-c含量调节至通过参考宿主植物细胞中表达的已知基因而计算出的给定植物宿主的平均水平。当可能时，修饰序列以避免出现一个或多个预测的发夹二级mrna结构。因此，本公开的“植物优化的核苷酸序列”包括一个或多个此类序列修饰。[0209]表达元件[0210]可将编码cas蛋白，其他crispr系统组分或本文公开的其他多核苷酸的任何多核苷酸功能性地连接至异源表达元件，以促进宿主细胞中的转录或调节。此类表达元件包括但不限于：启动子、前导子、内含子和终止子。表达元件可以是“最小的”‑意指源自天然来源的较短序列，其仍充当表达调节子或修饰子起作用。可替代地，表达元件可以是“优化的”‑意指其多核苷酸序列已经从其天然状态改变，以便在特定宿主细胞中以更期望的特征起作用(例如但不限于，可以将细菌启动子进行“玉米优化”以改善其在玉米植物中的表达)。可替代地，表达元件可以是“合成的”‑意指其是用计算机设计的并且被合成用于在宿主细胞中使用。合成的表达元件可以是完全合成的或部分合成的(包含天然存在的多核苷酸序列的片段)。[0211]已经显示某些启动子能够以比其他启动子更高的速率引导rna合成。这些被称为“强启动子”。已经显示某些其他启动子仅以较高的水平在特定类型的细胞或组织中指导rna合成，并且如果所述启动子优选在某些组织中而且还以降低的水平在其他组织中指导rna合成则通常将其称为“组织特异性启动子”或“组织偏好性启动子”。[0212]植物启动子包括能够在植物细胞中起始转录的启动子。关于植物启动子的综述，参见potenza等人，2004invitrocelldevbiol[体外细胞与发育生物学]40：1-22；porto等人，2014，molecularbiotechnology[分子生物技术](2014)，56(1)，38-49。[0213]组成型启动子包括，例如，核心camv35s启动子(odell等人，(1985)nature[自然]313：810-2)；稻肌动蛋白(mcelroy等人，(1990)plantcell[植物细胞]2：163-71)；泛素(christensen等人，(1989)plantmolbiol[植物分子生物学]12：619-32；als启动子(美国专利号5,659,026)等。[0214]组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的表达。组织偏好性启动子包括，例如，2013年7月11日公布的wo2013103367，kawamata等人，(1997)plantcellphysiol[植物细胞生理学]38：792-803；hansen等人，(1997)molgengenet[分子和普通遗传学]254：337-43；russell等人，(1997)transgenicres[转基因研究]6：157-68；rinehart等人，(1996)plantphysiol[植物生理学]112：1331-41；vancamp等人，(1996)plantphysiol.[植物生理学]112：525-35；canevascini等人，(1996)plantphysiol.[植物生理学]112：513-524；lam，(1994)resultsproblcelldiffer[细胞分化中的结果与问题]20：181-96；以及guevara-garcia等人，(1993)plantj.[植物杂志]4：495-505。叶偏好性启动子包括，例如，yamamoto等人，(1997)plantj[植物杂志]12：255-65；kwon等人，(1994)plantphysiol[植物生理学]105：357-67；yamamoto等人，(1994)plantcellphysiol[植物细胞生理学]35：773-8；gotor等人，(1993)plantj[植物杂志]3：509-18；orozco等人，(1993)plantmolbiol[植物分子生物学]23：1129-38；matsuoka等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]90：9586-90；simpson等人，(1958)emboj[欧洲分子生物学学会杂志]4：2723-9；timko等人，(1988)nature[自然]318：57-8。根偏好性启动子包括，例如，hire等人，(1992)plantmolbiol[植物分子生物学]20：207-18(大豆根特异性谷氨酰胺合酶基因)；miao等人，(1991)plantcell[植物细胞]3：11-22(胞质谷氨酰胺合酶(gs))；keller和baumgartner，(1991)plantcell[植物细胞]3：1051-61(法国菜豆的grp1.8基因中的根特异性控制元件)；sanger等人，(1990)plantmolbiol[植物分子生物学]14：433-43(根癌农杆菌(a.tumefaciens)的甘露氨酸合酶(mas)的根特异性启动子)；bogusz等人，(1990)plantcell[植物细胞]2：633-41(从榆科糙叶山黄麻(parasponiaandersonii)和山黄麻(trematomentosa)分离的根特异性启动子)；leach和aoyagi，(1991)plantsci[植物科学]79：69-76(发根农杆菌(a.rhizogenes)rolc和rold根诱导型基因)；teeri等人，(1989)emboj[欧洲分子生物学学会杂志]8：343-50(农杆菌伤口诱导的tr1′和tr2′基因)；vfenod-grp3基因启动子(kuster等人，(1995)plantmolbiol[植物分子生物学]29：759-72)；以及rolb启动子(capana等人，(1994)plantmolbiol[植物分子生物学]25：681-91)；菜豆球蛋白基因(murai等人，(1983)science[科学]23：476-82；sengopta-gopalen等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]82：3320-4)。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。[0215]种子偏好性启动子包括在种子发育期间有活性的种子特异性启动子以及在种子发芽期间有活性的种子发芽性启动子两者。参见thompson等人，(1989)bioessays[生物学分析]10：108。种子偏好性启动子包括但不限于cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cz19b1(玉米19kda玉米醇溶蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)；以及例如，在2000年3月02日公布的wo2000011177和美国专利6,225,529中公布的那些。对于双子叶植物，种子偏好性启动子包括但不限于：菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子偏好性启动子包括但不限于玉米15kda玉米醇溶蛋白、22kda玉米醇溶蛋白、27kdaγ玉米醇溶蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1、油质蛋白和nuc1。还参见2000年3月09日公布的wo2000012733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子。[0216]可以使用化学品诱导型(调节型)启动子以通过应用外源化学调节剂来调节原核和真核细胞或生物体中的基因表达。在应用化学品诱导基因表达的情况下启动子可以是化学品诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达的情况下启动子可以是化学品阻抑型启动子。化学品诱导型启动子包括但不限于：由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米in2-2启动子(deveylder等人，(1997)plantcellphysiol[植物细胞生理学]38：568-77)、由用作出苗前除草剂的疏水性亲电子化合物激活的玉米gst启动子(gst-ii-27，1993年1月21日公布的wo1993001294)、以及由水杨酸激活的烟草pr-1a启动子(ono等人，(2004)bioscibiotechnolbiochem[生物科学生物技术生物化学]68：803-7)。其他化学品调节型启动子包括类固醇反应启动子(参见，例如，糖皮质激素诱导型启动子(schena等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]88：10421-5；mcnellis等人，(1998)plantj[植物杂志]14：247-257)；四环素诱导型启动子和四环素阻抑型启动子(gatz等人，(1991)molgengenet[分子和普通遗传学]227：229-37；美国专利号5,814,618和5,789,156)。[0217]在被病原体感染后诱导的病原体诱导型启动子包括但不限于调节pr蛋白、sar蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的表达的启动子。[0218]胁迫诱导型启动子包括rd29a启动子(kasuga等人(1999)naturebiotechnol.[自然生物技术]17：287-91)。本领域技术人员熟悉模拟胁迫条件(如干旱、渗透胁迫、盐胁迫、和温度胁迫)并评价植物的胁迫耐受性的规程，所述植物已经遭受了模拟的或天然存在的胁迫条件。[0219]在植物细胞中有用的诱导型启动子的另一个实例是zmcas1启动子，描述于2013年11月21日公布的us20130312137中。[0220]不断发现在植物细胞中有用的不同类型的新启动子；许多实例可以在okamuro和goldberg，(1989)thebiochemistryofplants[植物生物化学]，第115卷，stumpf和conn编辑(纽约，纽约州：学术出版社[academicpress])第1-82页的汇编中发现。[0221]将系统组分引入细胞[0222]本文所述的方法不取决于用于将序列引入生物体或细胞中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入生物体的至少一个细胞的内部即可。引入包括提到将核酸并入到真核细胞或原核细胞中，其中核酸可以被并入细胞的基因组中，并且包括提到核酸、蛋白或多核苷酸-蛋白质复合物(pgen、rgen)被瞬时(直接)提供至细胞中。[0223]用于将多核苷酸或多肽或多核苷酸-蛋白质复合物引入细胞或生物体的方法是本领域已知的，并且包括但不限于显微注射、电穿孔、稳定转化方法、瞬时转化方法、弹道粒子加速(粒子轰击)、晶须介导的转化、农杆菌介导的转化、直接基因转移、病毒介导的引入、转染、转导、细胞穿透肽、介孔二氧化硅纳米粒子(msn)-介导的直接蛋白递送、局部应用、有性杂交、有性育种、及其任何组合。[0224]例如，指导多核苷酸(指导rna，cr核苷酸+tracr核苷酸，指导dna和/或指导rna-dna分子)可以作为单链或双链多核苷酸分子直接引入细胞(瞬时地)。指导rna(或crrna+tracrrna)还可以通过引入包含编码指导rna(或crrna+tracrrna)的异源核酸片段的重组dna分子被间接引入细胞中，该指导rna与能够在所述细胞中转录该指导rna(或crrna+tracrrna)的特异性启动子可操作地连接。特异性启动子可以是但不限于rna聚合酶iii启动子，其允许具有精确定义的未修饰的5’‑和3’‑末端的rna转录(ma等人，2014，mol.ther.nucleicacids[分子疗法-核酸]3：e161；dicarlo等人，2013，nucleicacidsres.[核酸研究]41：4336-4343；2015年2月26日公布的wo2015026887)。可以使用能够在细胞中转录指导rna的任何启动子，并且这些启动子包括可操作地连接到编码指导rna的核苷酸序列的热休克/热可诱导的启动子。[0225]本文中的cas内切核酸酶，诸如本文所述的cas内切核酸酶可以通过直接引入cas多肽本身(称为cas内切核酸酶的直接递送)、编码cas蛋白的mrna和/或指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物本身，使用本领域已知的任何方法而引入细胞中。cas内切核酸酶也可以通过引入编码cas内切核酸酶的重组dna分子间接引入细胞中。使用本领域已知的任何方法，可以瞬时地将内切核酸酶引入细胞中，或可以将内切核酸酶并入宿主细胞的基因组中。可以用如在2016年5月12日公布的wo2016073433中描述的细胞穿透肽(cpp)，促进内切核酸酶和/或指导的多核苷酸摄取进入细胞。可以使用能够在细胞中表达cas内切核酸酶的任何启动子，并且这些启动子包括可操作地连接到编码cas内切核酸酶的核苷酸序列的热休克/热可诱导的启动子。[0226]将多核苷酸修饰模板直接递送到植物细胞中可以通过粒子介导递送来实现，并且任何其他直接递送方法，诸如但不限于聚乙二醇(peg)介导的原生质体转染、晶须介导的转化、电穿孔、粒子轰击、细胞穿透肽或介孔二氧化硅纳米粒子(msn)介导的直接蛋白递送可以成功地用于在真核细胞(诸如植物细胞)中递送多核苷酸修饰模板。[0227]可以通过本领域已知的任何手段引入供体dna。可以通过本领域已知的任何转化方法(包括，例如农杆菌介导的转化或生物射弹粒子轰击)提供供体dna。供体dna可以瞬时地存在于细胞中，或可以经由病毒复制子引入。在cas内切核酸酶和靶位点的存在下，将供体dna插入到转化植物的基因组中。[0228]指导的cas系统组分中的任何一个的直接递送可以伴随着可以促进接受指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物组分的细胞的富集和/或可视化的其他mrna的直接递送(共递送)。例如，指导多核苷酸/cas内切核酸酶组分(和/或指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物本身)与编码表型标志物(诸如但不限于转录激活剂诸如crc(bruce等人2000theplantcell[植物细胞]12：65-79))的mrna直接共递送可以通过恢复无功能基因产物的功能而不使用外源性可选择标志物来实现细胞的选择和富集，如在2017年4月27日公布的wo2017070032中所述。[0229]将本文所述的指导rna/cas内切核酸酶复合物(代表本文所述的切割就绪的cascade)引入细胞中包括将所述复合物的各组分单独地或组合地引入细胞中，并且直接地(作为rna(对于指导物)和蛋白(对于cas内切核酸酶和蛋白亚基或其功能性片段)直接递送)或经由表达这些组分(指导rna、cas内切核酸酶、蛋白亚基或其功能性片段)的重组构建体引入。将指导rna/cas内切核酸酶复合物(rgen)引入细胞中包括将该指导rna/cas内切核酸酶复合物作为核糖核苷酸-蛋白引入细胞中。可以将该核糖核苷酸-蛋白质在引入如本文所述的细胞中之前进行组装。包含指导rna/cas内切核酸酶核糖核苷酸蛋白(至少一种cas内切核酸酶、至少一种指导rna、至少一种蛋白亚基)的组分可以在体外组装或在引入细胞(靶向用于如本文所述的基因组修饰)之前通过本领域已知的任何方法组装。[0230]植物细胞与人和动物细胞的不同之处在于，植物细胞含有植物细胞壁，其可以作为核糖核蛋白的直接递送和/或这些组分的直接递送的屏障。[0231]将包含cas内切核酸酶蛋白和指导rna的核糖核蛋白直接递送到植物细胞中可以通过粒子介导的递送(粒子轰击)来实现。基于本文所述的实验，技术人员现在可以预想任何其他直接递送方法(诸如但不限于聚乙二醇(peg)介导的对原生质体的转染、电穿孔、细胞穿透肽或介孔二氧化硅纳米粒子(msn)介导的直接蛋白递送)都可以成功用于将rgen核糖核蛋白递送到植物细胞中。[0232]核糖核蛋白的直接递送允许在细胞的基因组中的靶位点进行基因组编辑，其后可以迅速降解复合物，并且仅允许细胞中短暂存在该复合物。复合物的这种短暂存在可能导致脱靶效应降低。相比之下，经由质粒dna序列递送组分(指导rna、cas9内切核酸酶)可以导致从这些质粒的恒定表达，该恒定表达在一些情况下可以促进脱靶切割(cradick，t.j.等人(2013)nucleicacidsres[核酸研究]41：9584-9592；fu，y等人(2014)nat.biotechnol.[自然生物技术]31：822-826)。[0233]直接递送可以通过将指导rna/cas内切核酸酶复合物(代表本文所述的切割就绪的cascade)的任何一种组分(诸如至少一种指导rna、至少一种cas蛋白、和任选地至少一种另外蛋白)与包含微粒子(诸如但不限于金粒子、钨粒子、和碳化硅晶须粒子)的粒子递送基质组合来实现(还参见2017年4月27日公布的wo2017070032)。[0234]在一个方面，指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物是复合物，其中形成所述指导rna/cas内切核酸酶复合物的指导rna和cas内切核酸酶蛋白分别作为rna和蛋白引入细胞。[0235]在一个方面，指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物是复合物，其中形成该指导rna/cas内切核酸酶复合物的指导rna和cas内切核酸酶蛋白和cascade的至少一个蛋白亚基分别作为rna和蛋白引入细胞。[0236]在一个方面，指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物是复合物，其中形成该指导rna/cas内切核酸酶复合物(切割就绪的cascade)的指导rna和cas内切核酸酶蛋白和cascade的至少一个蛋白亚基在体外预组装并作为核糖核苷酸-蛋白质复合物引入细胞中。[0237]用于在真核细胞诸如植物或植物细胞中引入多核苷酸、多肽或多核苷酸-蛋白复合物(pgen，rgen)的方案是已知的并且包括显微注射(crossway等人，(1986)biotechniques[生物技术]4：320-34和美国专利号6,300,543)、分生组织转化(美国专利号5,736,369)、电穿孔(riggs等人，(1986)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]83：5602-6)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、晶须介导的转化(ainley等人2013，plantbiotechnologyjournal[植物生物技术杂志]11：1126-1134；shaheena.和m.arshad2011propertiesandapplicationsofsiliconcarbide[碳化硅的特性和应用](2011)，345-358编辑：gerhardt，rosario.出版商：印天科技公司(intech)，里耶卡(rijeka)，克罗地亚(croatia).代码：69pqbp；isbn：978-953-307-201-2)、直接基因转移(paszkowski等人，(1984)emboj[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-22)、以及弹道粒子加速(美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；tomes等人，(1995)“directdnatransferintointactplantcellsviamicroprojectilebombardment[经由微粒轰击将dna直接转移到完整植物细胞中]”在plantcell，tissue，andorganculture：fundamentalmethods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，编辑gamborg和phillips(springer-verlag，berlin[柏林施普林格出版社])；mccabe等人，(1988)biotechnology[生物技术]6：923-6；weissinger等人，(1988)annrevgenet[遗传学年鉴]22：421-77；sanford等人，(1987)particulatescienceandtechnology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；christou等人，(1988)plantphysiol[植物生理学]87：671-4(大豆)；finer和mcmullen，(1991)invitrocelldevbiol[体外细胞与发育生物学]27p：175-82(大豆)；singh等人，(1998)theorapplgenet[理论与应用遗传学]96：319-24(大豆)；datta等人，(1990)biotechnology[生物技术]8：736-40(稻)；klein等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]85：4305-9(玉米)；klein等人，(1988)biotechnology[生物技术]6：559-63(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；klein等人，(1988)plantphysiol[植物生理学]91：440-4(玉米)；fromm等人，(1990)biotechnology[生物技术]8：833-9(玉米)；hooykaas-vanslogteren等人，(1984)nature[自然]311：763-4；美国专利号5,736,369(谷物)；bytebier等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]84：5345-9(百合科(liliaceae))；dewet等人，(1985)在theexperimentalmanipulationofovuletissues[胚珠组织的实验操作]，chapman等人编辑(longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花粉)中；kaeppler等人，(1990)plantcellrep[植物细胞报告]9：415-8)和kaeppler等人，(1992)theorapplgenet[理论与应用遗传学]84：560-6(晶须介导的转化)；d′halluin等人，(1992)plantcell[植物细胞]4：1495-505(电穿孔)；li等人，(1993)plantcellrep[植物细胞报告]12：250-5；christou和ford(1995)annalsbotany[植物学年鉴]75：407-13(稻)和osjoda等人，(1996)natbiotechnol[自然生物技术]14：745-50(经由根癌农杆菌转化的玉米)。[0238]可替代地，可以通过使细胞或生物体与病毒或病毒核酸接触来将多核苷酸引入细胞中。通常，此类方法涉及将多核苷酸并入病毒dna或rna分子内。在一些实例中，可以最初将目的多肽作为病毒多聚蛋白的一部分合成，然后将合成的多肽在体内或在体外通过蛋白水解加工从而产生所希望的重组蛋白。用于将多核苷酸引入植物，并且表达在其中编码的蛋白质(涉及病毒dna或rna分子)的方法是已知的，参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、以及5,316,931。[0239]可以使用多种瞬时转化方法，将多核苷酸或重组dna构建体提供至或引入原核和真核细胞或生物体中。这种瞬时转化法包括但不限于将多核苷酸构建体直接引入植物中。[0240]可以通过任何方法将核酸和蛋白提供至细胞，该方法包括使用分子来促进指导的cas系统(蛋白质和/或核酸)的任何或所有组分(诸如细胞穿透肽和纳米载剂)的摄取的方法。还参见2011年2月10日公布的us20110035836和2015年1月07日公布的ep2821486a1。[0241]可以使用将多核苷酸引入原核和真核细胞或生物体或植物部分中的其他方法，包括质体转化方法，以及用于将多核苷酸引入来自幼苗或成熟种子的组织中的方法。[0242]“稳定转化”旨在意指将引入生物体中的核苷酸构建体整合到该生物体的基因组中，并且能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸引入该生物体中并且不整合到该生物体的基因组中，或者将多肽引入生物体中。瞬时转化表明所引入的组合物仅在生物体中暂时表达或存在。[0243]可以使用多种方法来鉴定在靶位点处或靶位点附近具有改变的基因组的那些细胞，而不使用可筛选标志物表型。此类方法可被认为是直接分析靶序列以检测靶序列中的任何变化，包括但不限于pcr方法、测序方法、核酸酶消化、dna印迹法、及其任何组合。[0244]细胞与生物体[0245]可以将本文公开的多核苷酸和多肽引入细胞中。细胞包括但不限于人类、非人类、动物、哺乳动物、细菌、原生生物、真菌、昆虫、酵母、非常规酵母和植物细胞，以及通过本文所述的方法产生的植物和种子。在一些方面，生物体的细胞是生殖细胞、体细胞、减数分裂细胞、有丝分裂细胞、干细胞、或多能干细胞。来自任何生物体的任何细胞都可以与本文所述的组合物和方法一起使用，包括单子叶植物和双子叶植物以及植物元件。[0246]动物细胞[0247]可以将本文公开的多核苷酸和多肽引入动物细胞中。动物细胞可以包括但不限于：以下门的生物体，该门包括脊索动物门、节肢动物门、软体动物门、环节动物门、腔肠动sativa))、黑麦(黑麦(secalecereale))、高粱(双色高粱(sorghumbicolor)、高粱(sorghumvulgare))、粟(例如，珍珠粟、御谷(pennisetumglaucum))、黍稷(粟米(panicummiliaceum))、谷子(谷子(setariaitalica))、穇子(龙爪稷(eleusinecoracana))、小麦(小麦属物种，例如小麦(triticumaestivum)、一粒小麦(triticummonococcum))、甘蔗(甘蔗属物种(saccharumspp.))、燕麦(燕麦属(avena))、大麦(大麦属(hordeum))、柳枝稷(柳枝黍(panicumvirgatum))、菠萝(菠萝(ananascomosus))、香蕉(香蕉属物种(musaspp.))、棕榈、观赏植物、草坪草、以及其他草。[0253]可以使用的双子叶植物的实例包括但不限于大豆(大豆(glycinemax))、芸苔属物种(例如但不限于：油菜或卡诺拉油菜)(欧洲油菜(brassicanapus)、白菜型油菜(b.campestris)、芜菁(brassicarapa)、芥菜(brassica.juncea))、苜蓿(紫花苜蓿(medicagosativa)、烟草(烟草(nicotianatabacum))、拟南芥属(arabidopsis)(拟南芥(arabidopsisthaliana))、向日葵(向日葵(helianthusannuus))、棉花(木本棉(gossypiumarboreum)、海岛棉(gossypiumbarbadense))、和花生(花生(arachishypogaea))、番茄(番茄(solanumlycopersicum))、马铃薯(马铃薯(solanumtuberosum))。[0254]可以使用的另外的植物包括红花(safflower、carthamustinctorius)、甘薯(番薯(ipomoeabatatas))、木薯(cassava，manihotesculenta)、咖啡(咖啡属物种(coffeaspp.))、椰子(coconut，cocosnucifera)、柑橘树(柑橘属物种(citrusspp.))、可可(cocoa，theobromacacao)、茶树(tea，camelliasinensis)、香蕉(芭蕉属物种(musaspp.))、鳄梨(avocado，perseaamericana)、无花果(fig，ficuscasica))、番石榴(guava，psidiumguajava)、芒果(mango，mangiferaindica)、橄榄(olive，oleaeuropaea)、木瓜(番木瓜(caricapapaya))、腰果(cashew，anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(macadamia，macadamiaintegrifolia)、巴旦杏(almond，prunusamygdalus)、甜菜(sugarbeets，betavulgaris)、蔬菜、观赏植物、和针叶树。[0255]可以使用的蔬菜包括番茄(lycopersiconesculentum)、莴苣(例如，莴苣(lactucasativa))、青豆(菜豆(phaseolusvulgaris))、利马豆(limabean，phaseoluslimensis)、豌豆(香豌豆属物种(lathyrusspp.))和黄瓜属的成员诸如黄瓜(cucumber，c.sativus)、香瓜(cantaloupe，c.cantalupensis)、和甜瓜(muskmelon，c.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属物种(rhododendronspp.))、八仙花(macrophyllahydrangea)、朱槿(hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属物种(rosaspp.))、郁金香(郁金香属物种(tulipaspp.))、水仙(水仙属物种(narcissusspp.))、矮牵牛(petuniahybrida)、康乃馨(dianthuscaryophyllus)、一品红(euphorbiapulcherrima)、和菊花。[0256]可以使用的针叶树包括松树，诸如火炬松(loblollypine，pinustaeda)、湿地松(slashpine，pinuselliotii)、西黄松(ponderosapine，pinusponderosa)、黑松(lodgepolepine，pinuscontorta)、和辐射松(montereypine，pinusradiata)；花旗松(douglasfir，pseudotsugamenziesii)；西方铁杉(westernhemlock，tsugacanadensis)；北美云杉(sitkaspruce，piceaglauca)；红杉(redwood，sequoiasempervirens)；枞树(truefirs)，如银杉(胶冷杉(abiesamabilis))和胶枞(香脂冷杉(abiesbalsamea))；以及雪松，如西方红雪松(thujaplicata)和阿拉斯加黄雪松(chamaecyparisnootkatensis)。[0257]在本公开的某些实施例中，可育植物是产生活雄配子和雌配子并且是自身可育的植物。这种自身可育的植物可以产生后代植物，而没有来自任何其他植物的配子及其中所含的遗传物质的贡献。本公开的其他实施例可以涉及使用非自身可育的植物，因为该植物不产生有活力的或在其他情况下能够受精的雄配子或雌配子或二者。[0258]本公开可用于包含一个或多个引入性状或经编辑的基因组的植物的育种。[0259]如下描述两个性状如何以彼此之间例如5cm的遗传距离堆叠到基因组中的非限制性实例：将包含整合到基因组窗口内的第一dsb靶位点中且不具有第一目的基因组基因座的第一转基因靶位点的第一植物与第二转基因植物杂交，所述第二转基因植物在基因组窗口内的不同基因组插入位点处包含目的基因组基因座，并且所述第二植物不包含所述第一转基因靶位点。来自该杂交的约5％的植物后代将基因组窗口内具有整合到第一dsb靶位点中的第一转基因靶位点和整合在不同基因组插入位点处的第一目的基因组基因座。在定义的基因组窗口中具有两个位点的后代植物可以进一步与第三转基因植物杂交，所述第三转基因植物在定义的基因组窗口内包含整合到第二dsb靶位点中的第二转基因靶位点、和/或第二目的基因组基因座并且缺乏所述第一转基因靶位点和所述第一目的基因组基因座。然后选择具有在基因组窗口内的不同基因组插入位点处整合的第一转基因靶位点、第一目的基因组基因座和第二目的基因组基因座的后代。此类方法可用于产生包含复杂性状基因座的植物，所述复杂性状基因座具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多个整合到dsb靶位点中的转基因靶位点和/或整合在基因组窗口内的不同位点的目的基因组基因座。以这种方式，可以产生各种复杂性状基因座。[0260]尽管已经参考优选实施例和各种替代实施例明确示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对其在形式和细节上进行各种改变。例如，尽管下面的特定实例可以阐述本文中使用特定植物来描述的方法和实施例，但是这些实例中的原理可以应用于任何植物。因此，应当理解，本发明的范围被本文和说明书中记载的本发明的实施例所涵盖，而不是由以下示例的具体实例所涵盖。出于所有目的，在本技术中提到的所有引用的专利和出版物通过援引以其全文并入本文，其程度如同它们各自单独和特别地通过援引并入。[0261]实例[0262]以下是本发明一些方面的具体实施例的实例。提供这些实例仅出于说明目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。就使用的数字(例如量、温度等)而言，已努力确保其准确性，但仍应允许有一些实验误差和偏差。[0263]实例1：疾病易感性基因的两步修复[0264]由真菌病原体玉米大斑病菌(exserohilumturcicum)(以前称为大斑病长蠕孢(helminthosporiumturcicum))诱导的北方叶枯病(northernleafblight，nlb)是在许多热带和温带环境中严重的玉米叶枯萎病。症状的范围可以从下部叶片上的雪茄形病变到叶子的完全破坏，从而降低可用于光合作用的叶表面积的量。光合能力的降低导致籽粒灌浆所需的碳水化合物缺乏，这会影响籽粒产量。因为露期很长且温度适中，热带的中海拔区域(海平面以上约900-1600m)有对北方叶枯病尤其有利的气候。然而，在温带环境中(诸如在美国)，在湿季期间，特别是如果在抽丝期在植物的上部叶上确定感染，则北方叶枯病还可能产生30％-50％的损失。控制北方叶枯病的最有效和最优选的方法是种植抗性杂交种。某些天然疾病抗性玉米基因可以控制对特定病原体物种的抗性，这些天然疾病抗性玉米基因诸如ht1、ht2、ht3、htm1、htn1、htn、htp、ht4和rt(welz和geiger2000.plantbreeding.[植物育种]119(1)：1-14；ogliari等人2005.genetmolbiol[遗传学与分子生物学]28：435-439；hurni等人2015pnas[美国科学院院报]112(28)：8780-5)。然而，将抗性基因渗入其他近交系中是一项艰巨的任务，由于连锁累赘，这可能会或可能不会带来产量损失。通过编辑赋予对北方叶枯病的增强抗性的基因(例如像ht1和nlb18)，或通过将ht1和nlb18的抗性等位基因移动到基因组中的另一个位点，使得可以通过将包含多个核苷酸序列(每个赋予对北方叶枯病的增强抗性)的单个基因组基因座渗入玉米植物中来获得对北方叶枯病的增强抗性，可以克服在常规育种中将北方叶枯病抗性渗入玉米系的局限性。[0265]玉米基因组的8号染色体包含多个nlb等位基因，包括nlb15、nlb17、和nlb18(图2)。nlb18与nlb17是高度同源的，在基因组附近和基因组的其他区域中具有重复序列。在此，我们描述了具有对nlb的改善抗性的crispr-cas玉米的生成，其中nlb18基因的疾病敏感等位基因(被称为nlb18-s)已经用nlb18基因的疾病抗性等位基因(被称为nlb18-r)替换。最初，靶向等位基因替换的技术方法被认为是使用一次转化的单一步骤。然而，在这种单一转化方法中没有回收到具有等位基因替换的植物。从初始转化中回收了缺失nlb18-s等位基因的植物(被称为nlb18-s缺失系)。然后将第二步骤添加到原始方法中。在第二步骤中，将nlb18-r等位基因在缺失的nlb18-s等位基因的位置处并入nlb18-s缺失系中。因此，所得的系在其天然基因组位置处含有nlb18-r等位基因，以代替nlb18-s等位基因。[0266]通过引入以下两个指导rna(grna)以在预定位置中在玉米近交系ph1v5t的dna中生成两个切口来实现nlb18-s缺失：与位于易感等位基因的启动子区域中的上游序列同源的一个5′指导rna，和与位于易感等位基因的3′utr中的下游序列同源的一个3′指导rna。用七个质粒轰击未成熟的玉米胚胎。质粒1是cas9内切核酸酶的供体；质粒2和3分别是5′指导rna和3′指导rna的供体；质粒4携带来自玉米近交系ph26n的nlb18-rdna序列(其在步骤1的产物中不存在)；质粒5和6是用于提高胚胎应答和植物生成频率的两个辅助基因(zm-odp2和zm-wus2)的供体；并且质粒7是nptii可选择标志物的供体。[0267]虽然将含有nlb18-r的dna序列的dna修复模板的质粒供体包括在转化中；但是没有回收到含有完整nlb18-rdna序列的t0植物。然而，回收了具有两个dsb之间的nlb18-sdna序列缺失的t0植物。将来自这些nlb18-s缺失植物的后代移至步骤2。[0268]在第二次转化中实现nlb18-r等位基因替换的目标，该第二次转化引入了单个grna，以在来自步骤1的nlb18-s缺失的修复位点的dna序列中生成一个dsb。将未成熟的玉米胚胎经历用质粒8进行的农杆菌介导的转化(图3)。质粒8是cas9内切核酸酶；指导rna；nlb18-rdna序列；用于提高胚胎应答和植物生成频率的两个辅助基因(zm-odp2和zm-wus)；和nptii可选择标志物的供体。[0269]回收了t0植物，这些植物在先前缺失的nlb18-s的位置中含有完整nlb18-rdna序列。因此，两步法的产物与针对假设产物(具有对nlb的改善抗性的crispr-cas玉米)描述的一步法相同，其中：[0270]·抗性等位基因是同一玉米基因的替代等位基因，[0271]·抗性等位基因替换敏感等位基因，[0272]·抗性等位基因存在于其天然基因组位置处，并且[0273]·类似的结果可以在自然界中找到，并且可通过常规育种来实现。[0274]两步法的产物进行了分子表征，以确认nlb18等位基因替换和来自转化质粒的非预期dna序列整合不存在，以及增加nlb抗性的表型确认。[0275]分析了t0幼苗的完美基因/序列缺失和t-dna随机整合到基因组中。结果在表1中示出。[0276]表1：来自农杆菌介导的转化的t0胚胎[0277][0278][0279]通过捕获测序(southern-by-sequencing)在t1植物中确认了等位基因替换，如表2中所示。结果也描绘在图5中。具有对nlb的改善抗性的crispr-cas玉米的分子表征包括分析，以确认来自所有转化质粒的非预期质粒dna不存在。使用捕获测序(sbstm，一种有效的基于测序的分子表征工具)用于此分析(brink等人，2019；zastrow-hayes等人，2015)。sbs分析涵盖所有八种质粒的序列，并且如果发生了非预期质粒dna整合，检测在植物基因组dna与衍生自转化质粒的非预期序列之间产生的独特连接。选择并改进未检测到非预期质粒衍生dna的植物以进行进一步开发。[0280]表2：来自农杆菌介导的转化的t1胚胎[0281][0282]与当前使用的两代方法相比，这种方法允许在一代中进行基因替换。它还允许简化，并节省劳动力和时间。[0283]实例2：农杆菌介导的转化和粒子轰击转化是有效的[0284]使用类似的载体，使用粒子枪轰击转化t0植物。如表3所示(去除了所有的假阳性)，这两种方法都成功地用疾病抗性等位基因替换了易感的nlb18等位基因。[0285]表3：农杆菌和粒子轰击介导的转化结果[0286][0287]实例3：具有疾病抗性的优良近交玉米系的开发[0288]图3描绘了近交系开发的一般示意图。用以上所述的质粒通过粒子轰击转化玉米近交系的未成熟胚胎。在nlb18基因座处通过连接pcr和sanger测序分析t0植物，以鉴定nlb18-s被nlb18-r靶向替换的植物。没有鉴定到用完整nlb18-r等位基因代替nlb18-s等位基因的t0植物。鉴定到确认nlb18-s缺失的t0植物(其中nlb18-s等位基因在两个dsb之间缺失，而没有额外核苷酸的任何添加或缺失)，并且与野生型近交系回交。所得的bc0(f1)植物进行了基于下一代测序(ngs)的分析，以确认核苷酸水平下的nlb18-s缺失。对确认nlb18s缺失的bc0(f1)植物进行自体授粉，并且对鉴定为对nlb18s缺失是纯合的所得bc0(f2)植物进行自体授粉。将所得的bc0(f3)未成熟胚胎用作步骤2中的转化组织。[0289]如图3所示，用质粒8将步骤1中产生的bc0(f3)未成熟胚胎经由根癌农杆菌介导的方法进行转化。在nlb18基因座处通过连接pcr和sanger测序分析t0植物，以鉴定在先前缺失的nlb18-s的靶向位置中具有nlb18-r的植物。将确认在靶向位置中含有nlb18-r的若干t0植物与野生型近交系回交。对所得的bc0(f1)植物进行全面的分子分析，包括：基于ngs的分析，以确认靶向位置处存在单一完整nlb18r：和基于ngs的分析，以验证不存在来自八个转化质粒(七个来自步骤1并且一个来自步骤2)的非预期质粒dna。[0290]对确认在靶向位置中含有nlb18-r并且没有无意整合的质粒dna的个体bc0(f1)植物进行自体授粉。针对增加的nlb抗性，对所得的bc0(f2)植物进行表型分析。另外，将确认在靶向位置中含有nlb18r并且没有无意整合的质粒dna的个体bc0(f1)植物与野生型近交系回交以进行优良近交系开发。[0291]实例4：近交系中等位基因替换的确认[0292]通过将含有完整nlb18-s的野生型玉米的nlb18基因区域序列与来自步骤2的bc0(f1)植物中的相同区域进行比较，使用基于下一代测序(ngs)的技术来表征用nlb18-r替换nlb18-s。具有对nlb的改善抗性的crispr-cas玉米的预期变化是在两个同源臂之间用nlb18-r基因序列替换nlb18-s。测序分析显示，单一完整nlb18-r等位基因存在于nlb18-s缺失位置处，并且通过同源臂区域未检测到dna序列变化，其中天然同源定向修复(hdr)机制能够允许在没有创建新颖遗传物质组合的情况下进行等位基因替换。[0293]实例5：近交系中没有来自转化质粒的非预期dna整合的确认[0294]使用sbs分析个体bc0(f1)植物。用于转化的质粒上的若干遗传元件是玉米内源性的(在图2和图3中以绿色描绘)。预期这些序列的sbs分析将检测到在其天然环境中具有对nlb的改善抗性的crispr-cas玉米中的这些内源序列。通过检测质粒序列与玉米基因组序列之间的连接序列，可以明显看出具有对nlb的改善抗性的crisprcas玉米中存在非预期的质粒衍生序列。[0295]因此，确认了质粒1序列不存在，因为没有检测到独特的质粒基因组连接，并且在具有对nlb基因组dna的改善抗性的crispr-cas玉米中的天然基因组环境中仅检测到预期的玉米内源遗传元件。对在用于生成对nlb的抗性改善的crispr-cas玉米的两个转化步骤中使用的其余七个质粒进行了类似的分析。还确认了质粒2、3、4、5、6、7和8序列不存在，因为没有检测到独特的质粒基因组连接，并且在为开发具有对近交玉米的nlb的改善抗性的crispr-cas系而推进的bc0(f1)植物中仅检测到其天然基因组环境中的预期内源元件。[0296]因此，使用提供序列水平信息的sbs分析来确认来自八个质粒的非预期质粒dna不存在，这八个质粒用于在没有创建新颖遗传物质组合的情况下生成具有对nlb的改善抗性的crispr-cas玉米。然后改进未检测到非预期质粒衍生dna的植物以进行进一步开发。[0297]实例6：对nlb的抗性增加的确认[0298]crispr-casnlb玉米的预期表型是对nlb的抗性改善。对nlb的抗性可以通过在接种引起nlb的真菌之后基于对植物的目视检查进行评估来确认。与具有nlb18-s的野生型近交系相比，确认了具有nlb18-r的近交系对nlb的抗性改善。[0299]将多株bc0(f2)植物在标准条件下在温室中生长。当植物达到v3-v4阶段(即第三片叶和第四片叶的根颈分别可见的阶段(abendroth等人，2011))时，向它们接种玉米大斑病菌(setosphaeriaturcica)的分生孢子悬浮液。将分生孢子悬浮在无菌蒸馏水中，达到10,000个孢子/ml的密度。将悬浮液以100μl/植物施用于每株植物的轮生体。接种之后14天，基于对nlb特征性症状的目视观察，将植物评分为抗性或易感性(munkvold，2016)。通过典型病变的存在或不存在易于鉴定分别对nlb易感或具有抗性的植物(图4)。[0300]这些结果确认了，使用crispr-cas技术靶向等位基因替换来用nlb18-r替换nlb18-s会导致对nlb的抗性增加的预期表型变化。[0301]虽然本文的实例描述了用异源多核苷酸替换内源基因以实现表型变化，但是本领域技术人员将理解，可以通过本文提供的方法来替换任何内源多核苷酸(例如但不限于调节元件、编码rna的dna等)。当前第1页12当前第1页12









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!