用于校正从液柱内的对象检测到的位置相关电磁辐射的系统和方法与流程

测量装置的制造及其应用技术用于校正从液柱内的对象检测到的位置相关电磁辐射的系统和方法背景技术：1.对象辨别设备和技术将不同类型的对象(比如具有不同特性的对象)区分开。这些设备和技术对于分析细胞以及甚至根据特定感兴趣的特性对细胞进行分类特别有用。一些细胞分类方法依赖于从细胞或经染色细胞发出的光来确定它们的类型。在一些实施方式中，在液柱中行进的细胞暴露于激发源以生成输出电磁辐射以供检测。第一类型或具有特别特性的细胞产生在某种特性(例如，波长和/或强度)上与其他细胞相比不同的输出电磁辐射。这种差异用作细胞类型辨别和分类的基础。技术实现要素：2.一些实施例涉及一种用于基于从设置在液柱内的对象发出的电磁辐射在不同类型的对象间进行辨别的辨别系统。液柱形成结构产生液柱，在该液柱内不同位置处包含对象，并且激发源生成被引导朝向液柱中在测量区域处的对象的激发电磁辐射。液柱内的对象响应于该激发电磁辐射发出输出电磁辐射。光学布置从对象收集输出电磁辐射并且检测器响应于输出电磁辐射的强度而生成电信号。分析器包括存储在其上用于执行如下操作的指令：i)基于液柱中的对象的位置来对用电信号表示的输出电磁辐射的强度进行归一化，并且ii)将第一类型的对象与其他对象区分开。3.根据检测系统的一些实施例，光学布置从液柱中的对象收集输出电磁辐射并且检测器响应于由光学布置收集的输出电磁辐射的强度而生成电信号。分析器具有存储在其上用于执行如下操作的指令：i)基于液柱中的对象的位置来对用电信号表示的输出电磁辐射的强度进行归一化，并且ii)将第一类型的对象与其他对象区分开。4.根据其他实施例，一种方法通过产生液柱开始进行辨别对象，在该液柱内的不同位置处包含对象。激发电磁辐射被引导朝向液柱中在测量区域处的对象。测量区域处的对象响应于该激发电磁辐射发出输出电磁辐射，该激发电磁辐射被收集并且用于响应于输出电磁辐射的强度而生成电信号。基于液柱中的对象的位置和与其他对象区分开的第一类型的对象来对用电信号表示的输出电磁辐射的强度进行归一化。附图说明5.图1是根据某些实施例的辨别系统的简图。6.图2示出了图1的系统的测量区域中的液柱的x-y平面截面。7.图3示出了从位于液柱中心附近的对象发出的光，其中在液柱的液-气界面处相对于用作收集光学器件的光学装置具有基本均匀的光折射。8.图4示出了从位于液柱的椭圆形芯的上部分中的对象发出的光，其中在液-气界面处相对于用作收集光学器件的光学装置展现出不均匀的光折射。9.图5展示了用于开发平面内光线密度的角度相关性作为位置x的函数的解析公式的几何形状。10.图6提供了示出了液柱内的不同对象位置的辐射的角度相关性的一系列图形。11.图7提供了针对收集光学器件的不同数值孔径，从液柱收集的光的相对强度与沿着x轴的对象位置的关系一系列图形。12.图8是根据一些实施例的用于通过校正检测到的输出光的位置变化来识别在液柱中行进的对象的方法的流程图。13.图9提供了包括来自单一检测器的位置和强度检测的实施例的示意图。14.图10提供了包括用于检测强度的第一检测器和用于确定对象位置的第二检测器的实施例的示意图。15.图11展示了用于用分裂式检测器确定对象位置的模拟的输出。16.图12展示了通过基于精子核的位置校正检测值来改进强度测量的实验的结果。17.图13展示了通过基于活精子细胞的位置校正检测值来改进强度测量的实验的结果。18.图14展示了寻求用基于精子核位置的校正因数来改进对齐不良的仪器的性能的实验的结果。19.图15提供了不同对象位置的辐射的角度相关性的一系列图形并且示出了排除区域。20.图16示出了当不排除角度时、当排除角度在-0.3拉德至+0.3拉德之间的射线时、以及当排除角度在-0.4拉德至+0.4拉德之间的射线时，从液柱收集的光的相对强度与沿着x轴的对象位置的关系。21.图17展示了利用校正因数和用于光学地降低强度测量的位置相关性的元件两者的实验的结果。22.附图未必按比例绘制。附图中使用的类似数字指类似元件。然而，将理解的是，在给定附图中使用数字来指部件并不旨在限制在另一附图中用相同数字标记的部件。具体实施方式23.本文所描述的实施例涉及用于在不同类型的对象间进行辨别的设备、系统和方法。这些对象响应于被引导朝向比如流动流的液柱中的对象的激发光而发出输出光。如本文所使用的，术语“发出”指反射和发荧光的电磁辐射两者，比如光。如本文所使用的，术语“光”指可见光谱中的波长处的电磁辐射以及红外线和紫外线光谱中的波长处的电磁辐射两者。这种输出电磁辐射可以包括从对象直接反射和发荧光的光以及通过与对象相关联的染色剂或染料反射和发荧光的光。在一些实施方式中，基于从对象发出的输出电磁辐射的强度将细胞类型区分开。强度可以确定为峰值强度或甚至确定为总强度，比如依据强度信号的整合区域。本文所描述的具体实施例涉及将x染色体精子细胞与y染色体精子细胞区分开。进一步的实施例涉及将有活力的携带x染色体的精子细胞与除有活力的携带x染色体的精子细胞之外的对象区分开，包括携带y染色体的精子细胞和两种性别的没有活力的细胞。24.将了解的是，本披露内容的方法可以更通常地应用于将任何不同类型的对象区分开，只要当与从另一对象类型发出的电磁辐射相比较时，从一个对象类型发出的输出电磁辐射生成在至少一个特性上可辨别的差异。在提供的一些示例中，液柱是具有曲线边界或界面的流动流，其中电磁辐射的折射可能发生。例如，液柱的曲线边界在截面上可以是大体圆形的。液柱可以通过固体壁来限界，比如在比色皿内或在微流通道内，或可以被喷射到空气中，比如在“空气中喷射”流式细胞仪中。对象可以沿着液柱移动穿过由至少部分围绕中心芯的鞘液成形的中心芯。在精子分类应用的情况下，中心芯可以包括包含精子细胞的样品液的芯流。出于定向非球面精子细胞的目的，芯流可以被调节成大体带形状或可以具有大体椭圆形截面。从对象发出的电磁辐射在对象与其他材料之间(比如在液柱与空气之间的界面处)遭遇至少一个光学折射边界。25.至少部分地由于鞘液与空气的不同折射性质，从柱内的对象发出的光在液柱外部的光收集效率取决于这种系统的对象的位置。随着位置而变化的光收集效率在从对象发出的光必须精确量化并且这种精确性受对象的随机(不是直接可观察到的)位置波动的限制的应用中是不利的。具体来说，在性别区别精子的情况下，这种系统寻求区别非常明亮并且紧密相关的荧光强度。通常用hoechst 33342将精子细胞和精子核染色以形成这种区别。hoechst 33342是与双链核dna的小沟中的a-t碱基对选择性地组合的明亮的细胞渗透性染料。用hoechst 33342进行的精子细胞的化学染色将x染色体与y染色体区别为具有轻微不同数量的核dna。例如，许多家畜具有大约4％的差异。当精子细胞被合适地染色和定向时，这种小的差异可以在精子细胞受适当的激发源(比如在355nm的波长处或附近操作的激光器)辐照时，通过与精子细胞的核dna相关联的hoechst 33342的荧光强度进行区分。26.由于若干原因，难以检测到这4％的差异。首先，精子核dna驻留在精子头部内，是非球面的或在大多数物种中具有桨状的形状。这种不对称使精子在扁平侧和更窄侧发出不同的荧光。实际上，这种波动在dna含量上超过的4％的差异，意味着精子必须被定向以便基于核染色体的含量而区别。定向的几何形状往往会产生具有带形状或椭圆截面的芯流。这种椭圆截面提供了比正常纬度更大的精子以便放置在一个轴上。27.本文所披露的方法增强了可以由这种波动限制的系统的精确性，比如“空气中喷射”流式细胞仪。如下文中更详细的描述，可以利用针对强度对位置的相关性进行校正的算法来解决从液柱中的对象收集的光强度的位置可变性。28.本文所概述的方法可特别地适用于流式细胞仪。然而，可以将方法应用于如下的任何系统：在界面的一侧上收集在界面的另一侧从对象发出的光，其中，界面以取决于对象相对于检测器的位置的方式导致发出光线路径的变化。本文用于校正液柱内的位置变化的方法因此提供了更准确的测量值以便区分开对象的类型。29.在图1中示意性展示的“空气中喷射”流式细胞仪系统100是可以用于讨论本披露内容的概念的一种类型的辨别系统。“空气中喷射”流式细胞仪系统100包括产生流动流的液柱形成结构，该流动流包括以高速度(例如，大约20米每秒)从室110的出口喷嘴160喷射出的液柱150。从出口喷嘴160排出的液柱150在截面上可以是大致圆形的并且在一些实施方式中可以具有大约10μm到大约100μm的直径。在一些实施例中，室110和/或出口喷嘴160的内部配置有内部几何形状，该几何形状水动力地将精子定向在液柱内。作为非限制性示例，出于定向精子和生成液柱的同轴流的目的，可以并入美国专利6,782,768和6,263,745中描述的那些喷嘴类似的喷嘴。液柱150由鞘液152内的芯流151构成，其中，图1中的箭头指示芯流151和鞘液152的流动方向。鞘液152可以具有大体圆形截面，而芯流具有具长轴和短轴的大体椭圆形截面。30.在室110内，样品注入元件111引入包含可以是多个类型的对象171、172的芯流151。芯流151通过包括鞘液的鞘液152限界并且在室110中通过水动力成形。鞘液152至少部分围绕芯流151，并且鞘液152和芯流151基本不混合。室110的斜坡或倾斜壁115施加使芯流151成形并且使芯流151内的对象171、172加速的力。当液柱150从室110喷射时，鞘液152的移动约束芯流151中的对象171、172以朝向液柱150的中心移动。液柱150将对象171、172(例如，依次)输送到液柱150的测量区域175。31.当对象穿过液柱150的测量区域175时，来自激发源180的光向对象171、172提供激发光。激发源180可以在宽波长带中或在窄波长带中提供光。例如，激发源180可以是激光器。可以采用适合于从对象或与对象相关联的染料产生响应的任何激光器。脉冲激光器和连续波激光器各自都很适合产生适当的响应。在一些配置中，可以通过光学元件181修改通过激发源(比如激发光)生成的电磁辐射。例如，可以通过一个或多个透镜181将激发光聚焦于测量区域175上。透镜可以用于将激发电磁辐射聚焦成被聚焦于测量区域上的合适的光束形状。测量区域175中的对象172a响应于激发源180发出光，例如，散射光或荧光。32.第一类型的对象171将发出输出电磁辐射，该输出电磁辐射与从第二类型的对象172发出的输出电磁辐射相比至少在一个特性上存在不同。例如，在一些情景中，第一类型的对象171发出的光将具有比从第二类型的对象172发出的光高的强度。33.光学收集布置190被定位以收集从测量区域175内的对象172a发出的输出电磁辐射161，该测量区域在液-气界面153处穿越液柱150的光学折射边界。在一些实施例中，光学布置190可以被配置成修改输出电磁辐射161以提供经修改输出电磁辐射162，该经修改输出电磁辐射将从测量区域175中的对象172a发出的输出电磁辐射聚焦到检测器185上。在一些实施例中，光学收集布置190可以包括降低输出电磁辐射161的位置相关性的元件。检测器185接收经修改输出电磁辐射162，并且作为响应，生成表示经修改输出电磁辐射的特性的电信号。只是作为示例，检测器185可以是前向荧光检测器。当然，可以并入其他检测器来检测感兴趣的特性，比如散射、衰减、相移或其他感兴趣的特性。只是作为非限制性示例，检测器可以是光电倍增管(pmt)、硅光电倍增器(sipm)、光电二极管阵列，或分裂式检测器。在一些实施例中，检测器185可以表示多于一个检测器。在一些实施例中，可以利用第二位置检测器。在其他实施例中，可以采用侧检测器来检测侧散射或侧荧光。除了检测器185之外，仍其他实施例还可以并入位置检测器和侧检测器两者。34.在一些情景中，电信号的振幅对于不同的对象类型可以是不同的。通过分析器187使用电信号来区分不同类型的对象171、172。例如，分析器187可以被配置成将电信号的振幅与阈值比较以在第一类型的对象171与第二类型的对象172间进行辨别。分析器187可以包括用于操纵来自一个或多个检测器的一个或多个信号的一个或多个模拟电路和/或数字处理器。只是作为一个示例，可以相对于检测器185的90度来采用侧检测器以检测侧散射或侧荧光。在精子分类的情况下，侧荧光允许分析器187区别适当定向的精子和未定向的精子。35.分析器187可以包括处理器188，该处理器具有存储在其上的可执行指令。除了已知目的为收集，比较并且操纵来自检测器信号的信息的那些指令198外，该处理器还可以包括指令192，该指令用于基于液柱150中在测量区域175处的对象172a的位置对来自检测器的以用电信号表示的输出电磁辐射的强度值进行归一化。可以用任何数目的方式来对强度值进行归一化。只是作为一个示例，可以由用户基于包括荧光强度和位置信息的数据的初始采样将手绘线条或曲线输入到图形用户界面中。36.处理器188还可以包括用于辨别对象的指令182。图2示出了在图1中描绘的测量区域175中的液柱150的x-y平面截面。在测量区域175的x-y截面中，芯流151在形状上是椭圆的，并且芯流151的液体包括悬浮于缓冲溶液中的至少一个对象172a，还可以称为样品。鞘液152基本围绕芯流151。在本披露内容中用于这种讨论的特别示例中，对象171、172是精子细胞并且系统100被实施为将x染色体精子与y染色体精子区分开。37.通过激发源180生成的聚焦激光束辐照测量区域175内的精子细胞172a。用荧光染料将细胞171、172染色，并且激发电磁辐射使测量区域175内的细胞172a发出荧光的输出电磁辐射。大体椭圆形芯流151的目的是定向精子细胞172a使得精子细胞的扁平侧面向如图2中所示出的左边和右边。在这个定向中，精子细胞的扁平侧172a分别面向激光器180和光学收集布置190。当每个细胞171、172在测量区域175处以类似定向存在时，可以大大降低基于定向的随机可变性。然而，在这个定向中起到辅助作用的椭圆截面还提供了相对于液柱150内的细胞的位置的显著纬度。38.为了获得期望的定向，椭圆芯流151存在与在图2中描绘的x-轴平行的长轴。精子细胞172a可以在芯流151内沿着的x-轴取任何数目的位置。图2示出了椭圆芯151中的精子细胞172a的三个代表性的可能位置，尽管可以了解的是，精子可以位于所描绘的位置之间的任何地方。在图2中所示出的定向中，芯流151中的精子细胞172a的第一可能位置大约在椭圆芯151的中心处(在光学收集布置190的光轴199上)，第二可能位置在芯流151的顶部处(在光轴199上方)，以及第三可能位置在芯流151的底部处(在光轴199下方)。从精子细胞172a发出的输出光线的位置相关折射发生在芯流151内的不同位置处的液-气界面153处。如本文所使用的，比如“顶部”、“底部”、“上部”和“下部”的相对位置术语应理解为关于在附图中描绘的特征之间的关系是描述性的并且不限制权利要求，尤其是芯流151中的精子的位置。39.当精子细胞172a位于第一位置并且液柱150具有如图2中所示出的圆形截面时，从精子细胞172a发出的光的平面内光线大约正常地入射于液-气界面153上。从背离其中心的精子细胞172a的点发出的射线，或从附图的平面发出的射线并不完全正常地入射于界面153上；在这简化的讨论中不考虑这些射线，但是本领域的普通技术人员可以知道如何可以将讨论推广到包括它们。因此，就在液-气界面153处发生的任何光折射而言，它以相对于检测器185以更均匀的方式发生。40.图3的简图示出了当精子细胞172a在图2中所示出的椭圆芯151内的第一位置处时随着电磁辐射穿越界面153而从精子细胞172a发出的输出电磁辐射298的均匀光折射。相应地，从图3中的液柱150出射的光线298的平面内密度相对于射线角度是均匀的。光线的均匀角度密度与随射线角度而变的均匀辐射相对应。41.相比之下，当精子细胞172a偏离光轴199并且更靠近椭圆芯151的顶部或底部时，例如，在图2中所示出的椭圆芯151的第二和第三位置处时，从精子细胞172a发出的输出射线中的至少一些以斜角遭遇液-气界面153。这些输出射线与上文描述的正常入射情景相比之下以不均匀的方式在液-气界面153处折射。最斜的射线是折射最严重的。光线的折射使从液柱150出射的荧光的辐射分布跨液-气界面153变得不均匀并且随着沿着x轴的细胞172a的位置而变化。也就是说，这种折射改变了在液柱150外部从精子细胞172a发出的输出电磁辐射的辐射分布。42.例如，当细胞172a位于偏离光轴199处时，例如，在图2中所示出的第二或第三位置处，当与分别平行于光轴199成角度或成负射线角度或正射线角度时界面153的空气侧上的辐射相比时，光线的密度并且因此界面153的空气侧上的辐射在相对于光轴199成正射线角度或负射线角度时更高。正和负指在图5中射线角度γ的正负号。图4是展示了当细胞172a位于椭圆芯151的第二位置时从细胞172a发出并且穿过液-气界面153从液柱150出射的光线299的简图。在这个情景中，成正射线角度的光线或辐射的密度大于平行于光轴199或成负射线角度的光线的密度。对于具有预定数值孔径(na)的光学系统，由该系统从相同类型的细胞收集的量(例如，收集效率)可以取决于细胞是在第一位置中还是在第二位置中而变化。系统收集效率的位置相关性导致在确定细胞类型时的不准确性。43.参考图5，使用斯涅尔定律确定随射线角度γ和精子位置x而变的光线密度的解析公式，其中，γ是在液-气界面处折射之后从对象发出的光线相对于光轴的角度。这种分析仅考虑流动流的二维截面内或与其相切的射线。44.我们希望求解光线相对于角度γ的密度，我们可以使用该密度来确定用于每个精子位置x的光学收集系统的入射光瞳处的射线的密度。这可以写为：45.iγ(γ)。ꢀꢀꢀ(1)46.出于我们的目的，我们可以假设精子细胞在所有方向上均匀地发出光，所以发出的光线相对于角度θ的密度是：47.iθ(θ)＝1/π，ꢀꢀꢀ(2)48.也就是说，从到均匀地分布。通过几何分析：[0049][0050][0051][0052]其中，角度γ，θ，φ，α，β，和距离x在图5中示出。由于流动流具有折射率n，斯涅尔定律得出了角度之间的另一种关系：[0053]sinβ＝nsin∝。ꢀꢀꢀ(6)[0054]界面iβ(β)外部的光线的密度通过如下公式与界面iα(α)内部的光线的密度相关，其中，t(α)表示穿过界面的透射性跨两个偏振的平均值：[0055][0056]依据如下公式，使透射性与s-偏振和p-偏振的菲涅耳反射系数相关，rs(α)和rp(α)：[0057]t(∝)＝1-r(∝)，ꢀꢀꢀꢀ(8)[0058][0059][0060][0061]将方程(7)与上文以及如下附加关系一起使用：[0062][0063][0064][0065]我们具有射线相对于γ的密度的表达式：[0066][0067]现在，光学收集布置的na由最大射线角度γ0的正弦来给出，所以我们可以根据na来求解这个角度：[0068]γ0＝sin-1(na)ꢀꢀꢀꢀ(16)[0069]最终，随精子位置x而变的所收集光的相对强度通过从-γ0到γ0的对方程(15)进行积分并且通过以x＝0的整数值进行归一化来给出：[0070][0071]使用方程(15)的射线密度分布的公式，射线密度(辐射)对于不同精子位置的角度相关性可以如在图6中所绘制。在图6中，线条中的每一个表示针对给定精子位置x射线随角度γ而变的密度，其中，角度γ是呈弧度的形式。曲线图与位于关于x＝0对称的范围内的一系列位置相对应，(与图6中的图形404相对应)，这就是射线密度(辐射)随角度而变是均匀的之处。当x为正时(例如，图2中的第二位置，与图形402相对应)，相对辐射对于正射线角度γ是高的并且对于负射线角度γ是低的，并且当x为负时情况正好相反(例如，图2中的第三位置，与图形403相对应)。[0072]如果收集光学器件(图1和图2中的光学收集布置190)的数值孔径是大的，例如，接近1，则对于从椭圆芯内的对象发出的光所收集光学强度相对于位置的变化相对小。这是因为从对象发出并且被向右引导的基本上所有光将由收集光学器件收集而不管精确的射线方向，并且发出光的总量与对象位置是不变的(给定的均匀激发)。相比之下，小数值孔径导致相对于对象位置相对大的收集强度变化，因为对象位置的改变影响辐射分布，并且小数值孔径意味着仅这个改变的辐射分布的部分被收集。实际系统可以具有显著小于1，例如小于0.5，或小于0.3的na。在图7中提供的一系列图形展示了通过具有不同na的收集光学器件从对象收集的光随对象位置x而变的相对强度。图6展示了通过图7的不同数值孔径捕获的角度γ的范围。[0073]在图7的一系列图形中，图形412展示了对于具有0.2的数值孔径(na)的收集光学器件(例如，在图1和图2中所示出的光学收集布置190)沿着x轴相对于位置的相对强度；图形414示出了对于具有0.4的na的收集光学器件沿着x轴相对于位置的相对强度；图形416示出了对于具有0.6的na的收集光学器件沿着x轴相对于位置的相对强度；图形418示出了对于具有0.8的na的收集光学器件沿着x轴相对于位置的相对强度；以及图形419示出了对于具有0.9的na的收集光学器件沿着x轴相对于位置的相对强度。从图6和图7清楚的看出，当与具有较大na的收集光学器件相比较时，具有较小na的收集光学器件产生所收集光强度相对于对象位置的较大变化。此外，具有较大na的收集光学器件与具有较小na的收集光学器件相比收集具有较宽折射角度范围的光线，并且因此具有更高的总收集效率。[0074]特别是关于精子辨别或分类应用，可以理解的是，芯流151的椭圆长轴(图1和图2)在长度上可以是大约50μm，从而在纬度上提供大约25μm的精子以在任意方向上移动。返回参照图7，可以看出当对象偏离中心大约17μm时，0.2的na仅捕获对象相对强度的大约90％。类似地，对于偏离中心大约17μm的对象，0.4的na仅捕获92％的相对强度，并且在相同位置处，0.6的na捕获稍微多于94％的相对强度。可以进一步了解的是，收集光学器件的na对于精子分类器可以在大约0.3与0.6之间。尽管图7展示了越来越大的数值孔径的益处，但是这种数值孔径越来越昂贵并且具有较浅的景深，意味着更大的孔径必须放置在更接近喷嘴处。然而，在精子分类应用中可以将收集光学器件放置得多近存在限制。在典型的精子分类仪器中，孔径可以在0.5与0.6之间。本文所描述的校正对测量的强度的位置相关性的实施例允许较小数值孔径收集光学器件来执行类似较高数值孔径收集光学器件的功能。[0075]精子位于芯流151中在接近图2的第二位置和第三位置的位置处，因此，发出电磁辐射的显著地较低总强度，该总强度最终被检测用于分析和辨别。实际上，芯流151在高事件率下(以每秒60,000事件以及更大的量值)可以具有在长度上大约50μm的椭圆长轴。一些精子将在第一位置的两侧偏离中心达20μm或甚至高达大约25μm。在极其明亮和紧密相关的荧光信号的背景下，这种变化可以掩盖区别携带x染色体的精子与携带y染色体的精子的经染色核dna的大约4％的差异。[0076]此外，在缓冲液的样品内的给定精子浓度下增加事件的数目需要增加液柱中穿过测量区域的每单位时间的样品容积。以这种方式增加每秒检测到的事件的数目还增加了液柱内的芯流的椭圆截面，包括长轴的长度。作为自然结果，并且正如那些本领域的技术人员知道的，一般来说，通过增加样品的流速来增加分类速度减小了精子分类装备的灵敏度。因此，本文所描述的实施例不仅改进了在惯常速度下精子分类的精确性，而且还可以根据吞吐量在增加的总速度下提供精子分类而没有遭受精确性上的损失。[0077]在图8的流程图中展示了一种用于在存在位置变化的情况下标识在液柱中行进的对象的方法。该过程包括产生510液柱，在该液柱内的不同位置处包含对象。液柱可以是通过“空气中喷射”流式细胞仪产生的同轴液流。这种液柱可以包括芯流，该芯流的椭圆截面具有对象可以沿其定位的长轴。芯流可以同轴地包含在鞘液内。在一些实施例中，液柱可以具有气-液界面，凭此折射发生。在其他实施例中，液柱可以形成于比色皿或微流通道内。在这种情况下，可以存在液-玻璃界面以及可能地玻璃-气界面并且发出的光可以折射两次。预期这种折射两次的光极大地受益于某些实施例的角度相关性校正。[0078]该过程通过生成520激发电磁辐射以及将530激发电磁辐射朝向液柱中在测量区域处的对象引导而继续。液柱内的对象响应于测量区域处的激发电磁辐射而发出输出电磁辐射。从液柱中的对象(包括液柱内在测量区域处具有不同的位置的对象)收集540输出电磁辐射，并且检测器响应于由光学布置收集的输出电磁辐射的强度生成550电信号。[0079]接下来，分析器或其他合适的器件基于液柱中的对象的位置来对560由输出信号表示的强度进行归一化。归一化可以借助校正来执行，凭此偏离中心轴(朝向并且包括图2的第二位置和第三位置)而生成的信号是基于它们的位置而通过适当的校正因数来放大的。可以在图7中看出适当的校正因数的量值。一旦通过校正进行了归一化，该方法便通过从其他对象中辨别570第一类型的对象而继续。辨别可以发生在流式细胞仪分析器中并且可以包括一个或多个附加操作。例如，可以生成展示荧光强度的分布的单变量直方图。还可以用经校正信号以及用进一步计算的值生成二变量直方图。这些经校正和计算的值可以与流式细胞仪分析器中的门控区域进行比较或与查找表进行比较以将第一类型的对象与其他类型的对象区分开。[0080]作为示例性对象，精子可以被辨别为携带x染色体的精子或携带y染色体的精子。进一步，除二次淬灭染料外，还可以用dna选择性染料对精子进行染色。淬灭染料典型地渗透到膜受损的精子细胞，比如死亡或即将死亡的精子细胞，并且大大降低了通过与那些受损细胞相关联的dna选择性染料产生的荧光。这种经淬灭细胞被从经历辨别/分类的紧密相关种群有效地移除。以这种方式，系统可以将活的或有活力的精子细胞与即将死亡或受损精子细胞区分开。系统还可以将有活力的携带x染色体的精子与所有剩余细胞区分开，将携带y染色体的精子与所有剩余细胞区分开，或甚至同时地将有活力的携带x染色体的精子和携带y染色体的精子与所有其他精子细胞区分开。[0081]图9展示了基本上与图1和图2中描绘的辨别系统类似的辨别系统的第一实施例，其中，从位于测量区域中的对象172a发出的输出电磁辐射161由光学收集布置190收集。光学收集布置190可以包括将经修改输出电磁辐射聚焦到检测器185上的收集透镜。在描绘的实施例中，该检测器既起到测量经修改输出电磁辐射的特性的作用也起到用于确定液柱150的芯流151内的对象172a的位置的位置检测器186的作用。[0082]适合于确定经修改输出电磁辐射162的特性和确定测量区域中的对象172a的位置两者的检测器185可以包括分裂式检测器或pmt，sipm，针式光电二极管检测器阵列或类似物。这些检测器可以位于对象的像平面中或傅里叶平面中以确定对象的位置。在像平面中，检测器直接测量对象的位置，而在傅里叶平面中，将从横向强度分布(例如左右不对称)提取位置信息。[0083]流式细胞仪应用通常需要非常灵敏的(降到单光子计数)和快速的(对象以约20m/s的速度移动10μm)检测器。具有必要的速度和灵敏性的检测器典型地是那些提供内部增益的检测器。在还被称为像素化雪崩光电二极管的光电倍增管(pmt)或硅光电倍增器(sipm)中，单个光子产生高达大约106个电子的级联。两种检测器类型都可作为检测器阵列来商购。sipm可能更适合用于适合于确定对象的位置的检测器阵列，因为它们是通过标准技术在硅晶片上制作的。一些检测器(比如sipm)可以特别适合于放置在傅里叶平面中以便在检测器的较大面积上分布光。[0084]图10展示了替代性的实施例，其中，分束器191或其他合适的光学器件重新引导经修改输出电磁辐射162的功率的部分。大部分的经修改输出电磁辐射162被引导并且聚焦到检测器185上。在这个实施例中，检测器185包括用于检测感兴趣的特性的第一检测器176。第一检测器176可以是通常适合于量化感兴趣的特定特性的任何检测器。在典型的流式细胞仪应用中，光电二极管、光电倍增管(pmt)以及硅光电倍增器可以特别地适合于检测散射的或发荧光的电磁强度。[0085]分束器191可以包括介质镜197，然而那些本领域的技术人员将了解，其他合适的光学部件(比如立方体分束器、棱镜分束器以及类似物)可以用于重新引导经修改输出电磁辐射162功率的一部分。不管以何种方式分裂输出功率，第一光束部分164是沿着第一路径被引导到检测器，并且第二光束部分165是沿着不同的路径被引导到呈位置检测器177形式的第二检测器173。位置检测器可以是相机，位置敏感设备(“psd”)(比如各向同性传感器或电荷耦合设备(ccd))、分裂式检测器、pmt的检测器阵列、sipm、针式光电二极管或类似物。[0086]转向图11，执行展示分裂式检测器用于确定流式细胞仪系统中的位置信息的可行性的模拟。该模拟采用包括并排安装的3mm sipm检测器的分裂式sipm检测器。检测器交汇的边缘被校准为中心x坐标位置，从而模拟探询激光器的光束轴以及液柱的对称中心。使1.5mm光斑尺寸从大约-12mm到12mm之间的x位置扫掠跨越分裂式检测器，并且记录通过每个检测器测量的相对强度。第一图形601展示了从介于大约-12mm到大约12mm范围内的x位置针对来自检测器之一的光束光斑记录的相对强度，其中，x位置与sipm检测器的平面相对应。图形602展示了在从大约-12mm到大约12mm的x位置的范围中由其他检测器检测的光束光斑的相应相对强度。如可以看到的，两个检测器中的位置差异基于1.5mm光斑的x位置导致了不同的测量强度。这些差异与位置相关并且可以通过处理器件转换为近似位置信息。模拟中包括了噪声，但是它与强度无关。在最大强度处，噪声与0.8％变化系数相对应。模拟演示了可以基于由分裂式检测器布置中的每个sipm检测的相对强度，在分裂式检测器布置中确定x位置。那些本领域的技术人员可以了解，本发明的实施例不仅限于这种配置，并且适合于确定液柱内的粒子的位置的其他检测器配置还被设想用于本文。只是作为一个示例，在分裂式检测器布置中可以采用其他检测器。那些本领域的技术人员将了解的是，检测器应具有低噪声，因为组合的信号必须具有足够低的变化系数。[0087]图12展示了并入用于液柱中的精子核的位置校正，从而导致显著改善区别携带x染色体的精子核与携带y染色体的精子核的实验的结果。通过由cytonome制造的genesis iii精子分类仪器来处理用hoechst 33342染色的精子核。该仪器配备有sipm分裂式检测器。调整样品和鞘压以建立为每秒35,000事件的事件率。用coherent genesis cw-355激光器，以150mw的平均功率来探询核。曲线图形610描绘了二变量直方图，该直方图展示了对照液柱中的核的位置δ绘制的来自分裂式检测器中的每个检测器的荧光强度的和。如先前所描述的，位置δ的范围表示椭圆芯流的长轴，核可以沿着该长轴进入测量区域。携带x染色体的核的种群612被视为呈新月形。如预期的，测量的强度在靠近0位置δ时为最大，其中当核移动背离中心位置时，曲线向下缩减。携带y染色体的核的种群614被视为x种群下方的第二新月形，并且同样，最高强度出现在靠近0位置δ处，其中当核移动背离中心位置时，相对强度损失显著。[0088]曲线图形620呈现了与曲线图形610中绘制的强度相对应的经求和荧光强度的单变量直方图。尽管可以看出不同的携带x染色体的核的种群612和携带y染色体的核的种群614，但是曲线图形610与曲线图形620的对比使得偏离中心的携带x染色体的精子核与正中心的携带y染色体的精子核越来越重叠显而易见。实际上，峰谷比被计算为76.8％。[0089]根据本发明的实施例，校正因数616展示为曲线图形610中的弯曲线。校正因数616展示了使检测得荧光强度去除由事件的随机位置引入的变化所需的校正程度。相应校正被应用于在曲线图形630中描绘的荧光和值以产生经校正携带x染色体的核的种群632以及经校正携带y染色体的核的种群634。经校正携带x染色体的核的种群632形成大体矩形形状并且不再演示基于液柱中的核的位置的波动。在曲线图形630中可以看出经校正携带x染色体的核的种群632与经校正携带y染色体的核的种群634之间的更明显差距。曲线图形640展示了相应单变量直方图，该直方图在经校正携带x染色体的核的种群632与经校正携带y染色体的核的种群634之间具有94％的峰谷比。曲线图形620与曲线图形640之间的鲜明对比在视觉上是明显的。此外，该差异是可量化的，高出17.2个百分点。[0090]图13展示了根据本文描述的实施例的并入校正的示例的结果。通过由cytonome制造的genesis iii精子分类仪器来处理用hoechst 33342染色的活精子。调整样品和鞘压以达到每秒43,000事件的事件率，并且用以100mw平均功率操作的coherent genesis cw-355激光器来探询精子。曲线图形710展示了经求和荧光强度以及活精子在芯流中的相对位置的二变量直方图。同样，携带x染色体的精子的种群712可以被视为在携带y染色体的精子的种群714上方的第一种群。曲线图形710中也描绘了用于对经求和强度值进行归一化的校正因数716。曲线图形720展示了未校正的经求和强度的单变量直方图，并且演示了携带x染色体的精子的种群712与携带y染色体的精子的种群714之间的为75.3％的峰谷比。[0091]曲线图形730提供了在精子分类应用中常见的二变量直方图的类型。在这种情况下，经校正正向荧光强度是对照侧荧光来绘制的。正向荧光对侧荧光直方图对于分类活精子是有用的，因为侧荧光提供了关于每个细胞的取向的信息。相比之下，对精子核进行超声波粉碎处理并且从非球面的精子头部移除。因此，当分类精子核时取向不是问题。出于这个原因，核更容易分类并且通常被用于校准精子分类流式细胞仪。曲线图形730描绘了经校正携带x染色体的精子的种群732和经校正携带y染色体的精子的种群734。[0092]与先前示例很类似，曲线图形740仍然在y轴中与曲线图形730的经校正正向荧光相关。在曲线图形740的单变量曲线图中，经校正携带x染色体的精子的种群732和经校正携带y染色体的精子的种群734可以被视为具有机器计算的81.0％峰谷比的更明显的峰值。并且同样，经校正直方图呈现了对演示用于活精子的校正位置的值的曲线图形720显著改善。[0093]在另一方面，本文所描述的实施例可以提供基本上易于在流式细胞仪中进行对齐过程的系统和方法。例如，在精子的情况下，测量区域、检测器、以及甚至形成鞘液的结构必须适当地并且精确地对齐以便生成和收集足够清晰的信号，以便区别非常明亮并且紧密相关的携带x染色体的精子种群与携带y染色体的精子种群。甚至在精确并且适当对齐中，液柱中的经定向精子可以具有沿着芯流的长轴的任何数目的位置。如上文关于图3至图7所描述的，这意味着甚至当流式细胞仪的部件均完美对齐时，也存在对所检测输出电磁辐射的角度相关性。这种角度相关性引入类似噪声的变化，因为细胞可以被随机定位在芯流内。[0094]在商业精子分类应用中，技术人员典型地进行若干次进程调整，随后接着针对多个轴中的多个分量进行若干次精细调整以便将仪器对齐。由于仪器对每次调整的灵敏度，所检测信号的极紧密相关本质以及可能调整的次数，对于操作精子分类仪器的技术人员来说，这种对齐可能是消耗时间的任务。当在样品间切换时，用于商业分类精子的机器对齐可能要花费几分钟时间，甚至高达5分钟。在对喷嘴进行清淤或以其他方式移除，替换或调整需要校准的其他部件之后，技术人员可能需要花费5分钟、15分钟，以及在很少情况下长达30分钟时间以便针对商业性别分类精子将仪器放置成合适对齐。[0095]图14展示了其中针对辨别精子核极大地缩减对齐过程的示例的结果。通过由cytonome制造的genesis iii精子分类器来处理用hoechst 33342染色的精子核。该仪器装配有sipm分裂式检测器。正向荧光检测在不到1分钟内对齐，导致粗略对齐。使精子核以每秒33,000核的事件率运行并且用以150mw平均功率操作的coherent genesis cw-355激光器来探询。曲线图形810展示了二变量直方图，该直方图示出对照由sipm在每个事件时检测的位置绘制的经求和正向荧光。在携带x染色体的核的种群812和携带y染色体的核的种群814中的每一个中对齐不良是显而易见的。在不良对齐中，新月形是不对称的，并且与负x方向相比，荧光强度值在正x方向上大幅下降。携带y染色体的核的种群814演示了相同的偏斜性。[0096]校正因数816展示为两个种群之间的线条。这个校正因数816展示了将在每个x方向处对经求和荧光值执行的校正的程度。换句话说，校正因数816表示将通过校正被归一化为扁平线的弯曲线。沿着线条的相应x位置处的每个经求和荧光值接收与校正因数816相同的增加或减少的量值。[0097]由粗略对齐导致的畸变在曲线图形820的荧光强度直方图中更明显，其中，增加的重叠在携带x染色体的核的种群812与携带y染色体的核的种群814之间导致72.3％的峰谷比。[0098]在曲线图形830中，经校正的正向荧光求和值是对照每个事件的所检测位置以二变量直方图形式绘制的。可以看出，同样，通过基于细胞的位置，用校正因数816来对荧光强度值进行归一化，出现了两个清洁的细胞种群。经校正携带x染色体的核的种群832和经校正携带y染色体的核的种群834在曲线图形830中更清晰且不同地分组。重要地，这些种群的正交关系转换成曲线图形840中看到的单变量荧光强度直方图，其中，两种不同的单变量峰值具有94.4％的经计算峰值比。[0099]除了使用校正，本文所披露的一些实施例还包括降低所收集光强度相对于流动流中的对象位置的变化的元件。本文所描述的一些实施例可以提供经修改输出光，在对象的位置偏差小于流动流沿着垂直于光轴的轴背离流动流的中心的半径的60％的情况下，该输出光的所测量强度变化小于大约3％、或小于大约2％、或甚至小于大约1％。许多应用对强度测量误差是敏感的，可能是各种根源引起的。由于通过精确控制流动流内的对象的位置来降低强度波动是困难的，通过仔细设计光学收集布置来降低所收集光强度相对于对象位置的变化反而是有用的。对于比如x/y精子分类的应用，情况通常是：两个或更多个细胞种群是基于这些种群之间的所测量荧光强度的差异来分开的。如果随机位置波动引起所收集光强度的波动在量值上大于两个种群的荧光强度的标称差异，则不可能同时用高产量和高纯度来区别它们。x精子细胞与y精子细胞之间的荧光强度差异典型地仅几个百分点(例如，对于牛精子为约4％)。当前精子分类器系统在理论上可以通过增加芯流的流率来实现高吞吐量，但是这具有增加芯流的宽度的影响。因此，流动流的芯内的精子位置将存在很大的不确定性。这种位置不确定性和所收集荧光强度的由此引起的波动将当前精子分类器系统的最大吞吐量限制到并不遮蔽x精子与y精子之间的小荧光强度差异的水平。[0100]可以参考图6和图7来理解一种用于强度-位置校正的方法。图6中的括号突出显示了与具有给定na荧光收集光学器件相对应的积分区域。在图7中提供了针对图6的na相对于对象位置的所收集强度变化的图形。在图7中，对于给定的na，执行对荧光收集区域的积分，使得可以依据每个精子位置来绘制所收集光的强度。从图7明显的看出，增加收集光学器件的na有助于减少对象位置对经由收集光学器件聚集的荧光强度的影响。[0101]在一些实施例中，可以用降低相对于对象位置的所收集光强度变化的元件来修改收集光学器件(例如，图1和图2中的光学收集布置190)，如上文描述的。在美国专利申请号16/133,531中更详细地描述了这种实施例，该申请通过援引并入本文。根据一些这种实施例，收集光学器件通过掩蔽“角度空间”中的某些射线来操作，也就是说，收集光学器件选择性地收集、衰减和/或阻挡来自不同角度γ的射线以便实现期望的强度对比位置量变曲线。在实践中，可以在光学系统的光瞳(例如，入口光瞳、出口光瞳或孔径光阑)处应用“角度空间”掩蔽功能，其中，与光瞳平面相交的射线的位置与角度γ相对应。在一些实施例中，收集光学布置通过优选地收集较高角度(指向背离光轴)的光线来排除某些较低角度光线来实现期望的(例如，较扁平的)强度对比位置量变曲线。[0102]图15和图16展示了在给定的na下排除低-角度反射射线如何使强度对比位置曲线变平。排除低角度射线会排除在强度对位置量变曲线中产生最多变化的光线，而高正角度下辐射的角度变化往往会消除高负角度下的相应变化。图15示出了对于对象沿着x轴的不同位置，相对辐射对射线角度γ的曲线图，其中，角度γ呈弧度的形式。在图15中，每个图与在图5中指示的流动流的芯内的对象位置x相对应。图15中的括号示出了当具有小于0.3拉德的角度量值的射线被排除时(图15中的底部括号)以及当具有小于0.4拉德的角度量值的射线被排除时(图15中的顶部括号)，将由收集光学器件针对每个位置x排除的光线的部分。[0103]图16示出了当不排除角度时(图形900)、当排除角度在-0.3拉德至+0.3拉德之间的射线时(图形903)以及当排除角度在-0.4拉德至+0.4拉德之间的射线时(图形904)，沿着x轴的对象的相对所收集光强度对位置。图16示出了当较低角度射线被排除时，相对强度对位置图展现了相对于位置的更小强度变化。[0104]图17展示了在收集光路径中并入如所描述相对于对象位置降低所收集光强度变化的基于软件的位置校正和基于硬件的元件两者的实验的结果。通过由cytonome制造的genesis iii精子分类器来处理用hoechst 33342染色的精子核。精子分类器装配有sipm分裂式检测器，该检测器具有放置于光收集路径中的导线以便排除从精子核产生的低收集角度电磁辐射。在美国专利申请号16/133,531中描述了用于阻挡低收集角度电磁辐射的适合导线和其他元件。[0105]调整样品和鞘压以达到每秒60,000事件的事件率，并且用以90mw的平均功率操作的coherent genesis cw-355激光器来探询核。在曲线图形1010中可以看出导线减轻了对液柱内的核位置的强度相关性的某一影响。然而，当核沿着x轴在正方向上进一步移动时，仍然存在相对强度的显著减少。携带x染色体的精子的核的种群1012和携带y染色体的核的种群1014被视为在x轴中、在正方向上显著地下垂。从曲线图形1020的荧光强度直方图计算的相应峰谷比是81.5％。同样，朝向液柱的一端定位的携带x染色体的核不能充分检测到。因此，这端处的核的经求和荧光强度具有与携带y染色体的核的种群1014内的居中携带y染色体的核类似的强度值。这种偏斜性在曲线图形1020的单变量直方图中是明显的，表现形式为肩部向下移位和携带y染色体核的种群1014的夸张峰值。[0106]校正因数1016展示在曲线图形1010上。对于每个位置，校正值被添加到检测的荧光强度相应校正因数。曲线图形1030展示了具有经校正携带x染色体的核的种群1032和经校正携带y染色体的核的种群1034的二变量直方图，这两个种群是更明显的矩形种群。曲线图形1040提供了与每个事件的位置无关的经校正的经求和强度值的相应单变量直方图。经校正携带x染色体的核的种群1032和经校正携带y染色体的核的种群1034更显著地具有大约相等峰值高度和92.6％的峰谷比。[0107]已出于说明和描述以及非限制性目的而呈现了上述对各个实施例的描述。所披露的实施例不旨在夸大或将可能的实施方式限制到所披露的实施例。根据以上传授内容，许多修改和变化都是可能的。









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