一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于生物医药和干细胞技术应用领域，涉及一种用于治疗糖尿病足的干细胞制剂，尤其是一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶。背景技术：2.糖尿病足(diabetic foot,df)是糖尿病的并发症之一，是一种慢性、进行性的累及血管、神经、肌腱、骨骼的病变。其发生是在下肢周围血管病变、周围神经病变的基础上合并感染、继而溃疡形成和(或)深部组织的破坏。患者常因足部感染和坏疽导致截肢致残，甚至死亡，尤其下肢动脉硬化闭塞引起足部缺血性病变是截肢致残的主要因素。该病截肢率、致死率高，病程长、难治愈，给患者家庭和社会造成了重大负担。近年来，糖尿病病足溃疡和足坏疽的患者正在增加；据估计，全球每20秒就有1位糖尿病患者因糖尿病足而截肢；目前我国糖尿病足呈现出治愈率提高、截肢率明显下降，但发病率却逐年升高的趋势。3.糖尿病足的治疗一直是临床慢性伤口治疗中的难题。积极控制血糖，增强体质，可以减缓糖尿病足的发展；高压氧疗，中医疗法、药物疗法等可减轻炎症反应，促进创面修复，但是都不能使已受损的神经血管修复。近几十年来，干细胞技术作为细胞治疗中最具革命性的技术，对于开发多种疾病的新疗法，促进人类健康有着巨大的应用潜能。多项研究表明，干细胞在治疗糖尿病足方面具有显著效果，为糖尿病足的治疗提供了新的选择。4.干细胞主要通过分泌一些细胞因子(如上皮生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、膀岛素生长因子-1、血细胞生长因子、成纤维因子、黏连蛋白、il-6、il-8、tnf-β、tnfr-i、leptin和血管蛋白-1)作用于信号调节通路，激活成纤维细胞和内皮细胞，促进其迁移増殖分化，从而促进血管生成。并且，激活的成纤维细胞和内皮细胞也能分泌血管内皮生长因子和上皮生长因子，进一步促进血管生成。血管生成能够增加缺血区的血液供给，因此，缺血性溃疡的愈合能力增强。另外，细胞因子能抑制伤口处的炎症反应，进而加速伤口愈合。除此之外，干细胞还能分化成内皮细胞。上皮细胞和内皮细胞分别是促进溃疡愈合和血管生成的两大细胞。此外，干细胞分化过程形成的内皮祖细胞通过分泌细胞因子hif-α和il-8，可抑制促凋亡蛋白bax和puma的表达，同时增加抗凋亡蛋白bcl-x和bcl-2的表达，从而起到抑制凋亡的作用。5.外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，包含了复杂rna和蛋白质类物质，具有脂质双层膜结构，直径大约为30-150nm。外泌体存在于绝大多数细胞中，其功能取决于其来源的细胞类型，广泛参与了机体免疫应答、细胞分化、细胞通讯、抗原递呈等生物过程，在创伤医学、组织工程、精准诊断和精准治疗等领域具有良好的临床应用前景。有文献报道，干细胞来源的外泌体具有抑制炎症反应、促进血管生成、参与组织修复等功能，与干细胞相比，干细胞来源的外泌体使用更安全，无任何免疫排斥反应，更容易质控和大规模生产。但是，外泌体需要维持其活性，需要较高的保存条件，短期保存在4℃，长期储存需要置于-80℃深低温，不方便使用。因此，需要开发一种发挥其功效的用于治疗糖尿病足的凝胶，便于直接使用。技术实现要素：6.为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶。本发明首先采用超高速离心法分离得到干细胞外泌体，以干细胞外泌体、维生素b、i型胶原蛋白、海藻糖和甘油复配制备得到一种发挥治疗糖尿病足功效的干细胞凝胶。经试验证明，将其用于糖尿病足创面的治疗，创面面积逐渐缩小，且能缩小糖尿病足溃疡体积，使创面重新长出新的肉芽组织，使组织逐渐恢复。7.本发明的技术方案如下：一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶，其特征是，每10ml的干细胞凝胶中包含0.01-0.1g的维生素b、0.1-0.5g的海藻糖、0.08-0.15g的i型胶原蛋白、0.2g-1g的甘油和终浓度为10-200μg/ml的干细胞外泌体，调节ph7.2-7.4。8.制备方法：在冰上混匀，0.22μm过滤除菌，室温下冷却即为干细胞凝胶。9.使用方法：采用3％过氧化氢和生理盐水各冲洗3遍糖尿病足后，再用碘伏消毒创面，涂抹干细胞凝胶，用无菌纱布包扎，每日早晚各一次。10.其中，干细胞外泌体采用超高速离心法分离得到，具体为：11.s1：选择对数生长期(p3-p5代)的间充质干细胞，待细胞融合度达到80-90％，采用胰酶消化，然后加入含5％no-exo-血清替代物的完全培养基培养48-72h，收集培养上清液，用于提取外泌体；12.s2：将上清液1000-2000g离心，去除细胞碎片、完整细胞和死细胞，获得上清液；13.s3：将上清液继续10000-20000g离心，去除沉淀后获得上清液；14.s4：使用0.22μm过滤器过滤上清液，放入超速离心机100,000g离心2-3h；15.s5：弃上清，用预冷的pbs缓冲液清洗获得的沉淀，放入超速离心机100,000g，离心3-6h；16.s6：弃上清，沉淀用预冷的pbs缓冲液重悬，即获得外泌体，浓度为1-5mg/ml，分装后置于-80℃储存。17.含5％no-exo-血清替代物的完全培养基，其具体配方为：先将血清替代物(商品名：elitegrotm-advanced)放入超速离心机离心，获得不含外泌体的血清替代物，即为no-exo-血清替代物；将no-exo-血清替代物加到mscbm培养基中，混匀即得5％no-exo-血清替代物的完全培养基。18.上述对数生长期的间充质干细胞的获取方法为：19.(1)细胞均来源于脐带、脂肪或胎盘组织；20.(2)原代培养：脐带组织分离出华通胶，剪碎组织，贴壁法培养间充质干细胞；脂肪和胎盘组织采用混合酶消化法，获得单个细胞后置于培养瓶中，放在37℃、5％co2培养箱中培养；21.(3)传代培养：原代融合度达到80-90％，胰酶消化法收集细胞进行传代培养；细胞培养到第3-5代，得到间充质干细胞。22.进一步的，间充质干细胞采用流式细胞仪检测细胞的细胞表型和纯度；均采用p4-p5代细胞，均按照《中华人民共和国药典》2020年版检测无菌、内毒素、支原体、内外源病毒因子、细胞表型、细胞数和细胞活性等。23.本发明的干细胞凝胶中加入维生素b，维生素b有增加食欲、维持神经功能、促进生长发育、保护皮肤及黏膜、抑制黑色素生成、帮助肝脏解毒等功能。维生素b2、b3参与机体红细胞形成及抗体制造，可作用于皮肤，帮助皮肤组织代谢，避免发生糙皮病、舌头肿痛、皮炎、脚气、面部痤疮等病症。24.本发明的干细胞凝胶中加入i型胶原蛋白，i型胶原蛋白主要分布于皮肤、骨骼与肌腱等组织，占全部胶原蛋白含量的80％～90％左右，在医学上应用最为广泛。其主要功能为活化上皮细胞，促进胶原酶生成，维持皮肤张力和弹性，对创面修复与增强血液循环具有很重要的作用。25.本发明的技术效果是：26.1.本发明的干细胞凝胶由干细胞外泌体、维生素b、i型胶原蛋白、海藻糖和甘油复配而成，干细胞外泌体凝胶富含上百种细胞因子和microrna、蛋白质等，可以抑制细菌生长和炎症反应，促进血管再生与创面修复。凝胶中添加维生素b可以更好地保护皮肤，帮助皮肤组织代谢，促进新的肉芽组织再生。i型胶原蛋白可以活化上皮细胞，促进胶原酶生成，维持皮肤张力和弹性。海藻糖形成凝胶基质，甘油保湿。上述原料共同作用，得到一种发挥治疗糖尿病足功效的干细胞凝胶。27.2.本发明干细胞外泌体凝胶的原料成分简单，易于大规模生产和质控，成本较低，疗效显著；28.3.本发明制备的干细胞外泌体凝胶除了治疗糖尿病足外，还可用于下肢缺血性疾病、烧烫伤、褥疮等各类皮肤创面治疗。附图说明29.图1为倒置显微镜下观察脐带间充质干细胞的形态图(×40)，其中a：原代培养第9天；b：原代培养第10天；c：传代培养第2天；d：传代培养第3天；30.图2为流式细胞仪检测间充质干细胞的细胞表型图；31.图3为透射电镜检测脐带来源的间充质干细胞外泌体的形态图；32.图4为临床试验患者创面愈合图片，其中a：治疗后1周；b：治疗后2周；c：治疗后4周。具体实施方式33.以下结合实施例来说明其效果。34.实施例1：脐带间充质干细胞的分离培养35.1.用镊子将脐带从无菌采集管中取出，放到灭菌消毒过的不锈钢碗中，用含青霉素-链霉素的生理盐水(终浓度为100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)充分洗涤脐带，清洗6遍，将脐带上的血渍冲洗干净；36.2.用剪刀剪下脐带两头各约1cm后弃至废液缸中；并用剪刀将脐带剪成约2-3cm的4段。用生理盐水洗涤脐带至无血迹；37.3.取小段脐带，用眼科剪将脐带沿血管方向剖开，小心取出三根血管，包括两根动脉和一根静脉血管；38.4.取脐带中的华通氏胶部分，撕成很细的长条状，放入离心管中，同样处理其他小段脐带；39.5.用剪刀将离心管中的华通胶，剪碎至约1mm2的小块，剪的越碎越好；40.6.铺瓶培养：用灭菌消毒过的不锈钢匙，将剪碎的组织均匀的铺在t75细胞培养瓶中；41.7.补液：向培养瓶中缓慢加入15ml无血清培养基(5％血清替代物加95％msc基础培养基)，轻轻晃动均匀覆盖组织块；将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养，前6天不要动，第7天开始每天观察细胞，每隔2-3天半换液。42.8.第9天取出培养瓶，显微镜下观察组织块周围有细胞爬出，呈成纤维状(图1a)，第10天，局部细胞融合度达到80％-90％，进行传代操作(图1b)；43.9.细胞传代：弃掉培养液，加入3ml/瓶生理盐水清洗细胞两遍，加入1ml/瓶0.05％胰蛋白酶消化1min，待细胞皱缩变圆后加入15ml/瓶新鲜培养基终止消化，收集细胞到50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃掉上清液，加入50ml生理盐水重悬细胞，取0.5ml细胞悬液计数，1200rpm离心5min，弃掉上清液，然后加入新鲜培养基重悬细胞，按照8000个/cm2的密度接种细胞。接种第2天，可见细胞呈成纤维状或纺锤状排列，融合度为30-40％(图1c)，第3天细胞增殖迅速，融合度达到80-90％(图1d)。选择p3-p5代的脐带间充质干细胞(msc细胞)进行后续流式检测，以及实施例2的外泌体的分离提取和鉴定。44.10.流式细胞仪检测细胞表型：收集处于对数生长期的p4代msc细胞(细胞总数为8×106)于50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃上清液，加50ml生理盐水重悬洗两次，离心弃上清，保留细胞，加800μl生理盐水重悬细胞，分装100μl/ep管，8管，分别加入10μl pe标记的cd34、cd45、cd73、cd90、cd105、hla-dr和pe-igg抗体，另外一管作为空白对照，混匀，37℃避光孵育30min。1200rpm离心5min，弃上清，加入1ml/ep管的生理盐水洗涤细胞2次，1200rpm离心5min，弃上清，每管加入200μl生理盐水重悬细胞，4℃保存，流式细胞仪上机检测。流式细胞仪检测经流式分选的脐血间充质干细胞的细胞表型如图2所示，从图2可以看出：脐带msc表面抗原分子阳性表达cd105(内皮因子)、cd73(ecto-50-核苷酸酶)和cd90(thy1)≥99％，同时低表达cd45(白蛋白标志物)、cd34(造血干细胞内皮细胞标志物)和hla-dr≤2％，符合间充质干细胞的表型。45.实施例2：脐带间充质干细胞来源的外泌体的分离提取和鉴定46.选择对数生长期的p4代脐带间充质干细胞，细胞融合度达到85％，进行传代操作：弃掉培养液，加入3ml/瓶生理盐水清洗细胞两遍，加入1ml/瓶0.05％胰蛋白酶消化1min，待细胞皱缩变圆后加入15ml/瓶新鲜培养基终止消化，收集细胞到50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃掉上清液，加入50ml生理盐水重悬细胞，取0.5ml细胞悬液计数，1200rpm离心5min，弃掉上清液，然后加入含5％no-exo-血清替代物的完全培养基(具体配方为：先将血清替代物(商品名：elitegrotm-advanced)放入超速离心机100,000g，离心6h，获得不含外泌体的血清替代物即为no-exo-血清替代物；将25mlno-exo-血清替代物加到475ml的mscbm培养基中，混匀即得到5％no-exo-血清替代物的完全培养基)，按照8000个/cm2的密度接种细胞；47.1.培养48h后，收集培养瓶中的上清液，用于提取外泌体；48.2.将上清液1000-2000g，4℃离心10min，去除细胞碎片、完整细胞和死细胞，获得上清液；49.3.将上清液继续10000g，4℃离心10min，去除沉淀后获得上清液；50.4.使用0.22μm过滤器过滤上清液，放入超速离心机100,000g，4℃离心2h；51.5.弃上清，用预冷的pbs缓冲液清洗获得的沉淀，放入超速离心机100,000g，4℃离心4h；52.6.弃上清，沉淀用预冷的pbs缓冲液重悬，即获得外泌体(浓度为1-5mg/ml)，分装后一部分用于检测，一部分置于-80℃储存。53.7.透射电镜观察外泌体形态完整，可见双层膜脂质结构，大小均一，直径约120nm(图3)。54.实施例3：脐带间充质干细胞外泌体凝胶制备55.凝胶制备：称取0.1g的维生素b、0.2g的海藻糖、0.1g的i型胶原蛋白、1g的甘油，加入1ml干细胞外泌体，调节ph值至7.4，加注射用水至10ml，在冰上混匀。0.22μm过滤除菌，室温下冷却即为干细胞凝胶，干细胞外泌体终浓度为100μg/ml。56.用法用量：用3％过氧化氢和生理盐水各冲洗患处3遍糖尿病足，再用碘伏消毒创面，涂抹干细胞外泌体凝胶，用无菌纱布包扎，每日早晚各一次。57.实验结果：连续4周，观察创面愈合情况、肉芽组织生长情况：第1周创面愈合20％，第2周创面愈合50％，长出新的肉芽组织，第4周创面愈合90％，新生皮肤光滑平整(图4)。58.综上，本发明实施例3制备的间充质干细胞外泌体凝胶用于糖尿病足创面的治疗，创面面积逐渐缩小，能够缩小糖尿病足溃疡体积，创面重新长出新的肉芽组织，使组织逐渐恢复。









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