一种除臭乳酸菌的测序分析法的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及测序分析技术领域，具体为一种除臭乳酸菌的测序分析法。背景技术：2.国内外对恶臭气体主要采用物理、化学和生物法进行处理，其中生物法主要利用微生物除臭，具有低投资、高效率和生态环保等优点，成为研究和应用的热点。与此同时，微生态制剂在畜禽健康养殖过程中具有促生产和促生长，提高饲料利用率和养殖效益等作用，也可使粪污显著减量。3.因此，既具备益生菌功能又兼具除臭效果的微生物菌剂的研究和开发受到重视。乳酸菌是最常用的益生菌，具备产酸抑制腐败微生物生长的性能，也可有效去除恶臭气体，是益生除臭菌研究和应用的重点，基于此，本研究从福建宁德规模养猪场粪污中富集、分离乳酸菌，并从中筛选具备较好除臭性能的菌株，为适于区域畜禽养殖用多功能微生态制剂的开发和应用奠定基础，但是对于除臭乳酸菌的测序分析，仍存在着较大的进步空间。技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一种除臭乳酸菌的测序分析法，具有具体分析、精准定位、方便高效的优点，解决了现有技术中的问题。5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种除臭乳酸菌的测序分析法，包括1.样品采集：选择位于福建省宁德市和柘荣县的两个养猪场，从堆积的粪便中间和底层共采集约30 g样品，装入无菌自封袋后置于冰盒中保存，3 h内送至实验室，用于目标菌株分离和筛选。2.菌种的分离与筛选：取5g采集的样品于装有100 ml无菌水的250 ml三角瓶中，放入摇床中，在温度30 ℃、转速200 r/min的条件下处理2 h后取出，静止1 h。取上清液5ml于装有50 mlmrs培养基的250 ml三角瓶中，放入摇床中，在温度30 ℃、转速120 r/min的摇床中处理48 h。富集处理后的样品，取样采用10倍稀释法，从10-3、10-5、10-7、10-9稀释度下吸取0.1 ml于mrs固体平板上涂布，30 ℃恒温培养。2 d后观察平板上产生透明圈的不同菌落并采用平板划线法进一步纯化，编号后移入斜面培养基上并于4 ℃保存备用。3.除臭菌的筛选和鉴定，乳酸菌的除臭效果初筛，采用六级强度评价法[14]检验除臭效果并对分离获得的菌株进行初筛。分离获得的乳酸菌用mrs液体培养基在摇瓶中培养48h后备用。取新鲜猪粪200g 置于1 000 ml广口瓶中，将待测菌液以od值稀释一致后，以5 % 的接种量将菌液入并与猪粪搅拌均匀，以不接种组为对照，每组实验设置3个重复。密封广口瓶， 30 ℃静止培养7 d后评价各菌株的除臭效果。除臭菌株的复筛，经初筛获得的有较好效果的除臭菌，摇瓶发酵制备菌剂。取新鲜猪粪300 g装入1000 ml的广口瓶中，按照5 % 的接种量接入菌液并与猪粪搅拌均匀，在广口瓶中放置2个50 ml烧杯，分别装有20 ml2%的硼酸溶液和20 ml 0.2%的锌铵络盐溶液。广口瓶用胶塞密封并覆盖双层保鲜膜后在30 ℃静置培养。以不接种组为对照，每组实验设置3个重复。培养第 7 天取出吸收液，分别测定氨气和硫化氢的释放量[15]，计算不同菌株对氨气和硫化氢的去除率以确定效果最佳的除臭菌。4.除臭菌株的16s测序和系统发育分析。[0006]计算公式：降解率 = 对照组释放量—实验组释放量/对照组释放量×ꢀ100%。[0007]优选的，除臭菌安全评价，参照gb15193.3-2014采用大鼠急性毒性试验对除臭菌的安全性进行评价，采用最大耐受剂量法进行。健康大鼠随机分为 2 组，雌雄各10 只，一次经口灌胃量为2 ml/100 g，灌胃后连续 7d 观察大鼠是否有中毒、发病和死亡现象，并按照ld50剂量分级表进行判定。[0008]优选的，除臭菌剂发酵，采用既有的乳酸菌液体发酵规模生产的配方初步检验除臭菌的生产性能。所用生产用培养基配方1为：食用红糖2%；安琪蛋白胨0.4%；安琪酵母浸膏1.8 %；磷酸氢二钾0.2%；硫酸镁0.05%；结晶醋酸钠1.5%；0.5%碳酸钙。配方2为：葡萄糖1.5%；蛋白胨1.0%；酵母膏2%；磷酸氢二钾0.4%；硫酸镁0.05%；碳酸钠0.5%；0.5%碳酸钙。以mrs液体培养基作为对照，每种培养基均为3个重复，采用2 l的摇瓶在30 ℃、160 r/min的摇床中处理48 h后，采用平板菌落计数法测定活菌数。[0009]优选的，除臭菌剂应用效果实验，在养猪场用30 l桶装入10 kg新鲜猪粪，发酵获得的除臭菌剂，按照1%、3%和5% 的接种量加入并搅拌均匀，上方放置两个250 ml的烧杯，分别装有100 ml2%的硼酸溶液和100 ml 0.2%的锌铵络盐溶液。随后用双层保鲜膜封口，猪场自然条件下静置培养，以不接种组为对照，每组实验设置3个重复。分别在第7和第14天测定取出吸收液，分别测定氨气和硫化氢的释放量，计算氨气和硫化氢的去除率。具体实施方式[0010]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，[0011]基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0012]实施例1：一种除臭乳酸菌的测序分析法,通过对各菌株去除氨气和硫化氢的能力进行复筛，各菌株7d的氨气和硫化氢去除率分别在38.3％—81.7％和33.0％—63.0％之间，对氨气的去除率显著高于对硫化氢的去除率，所有菌株中，bdlc-1 和bdlc-3对氨气和硫化氢的去除率显著高于其它3株，其中菌株bdlc-3对氨氮和硫化氢的去除率分别为81.7％±1.5％和63.0％±2.5％，显著高于bdlc-1 (p《0.05)。基于此，筛选获得的bdlc-3将作为目标菌做进一步研究。对菌株 bdlc-3进行了测序分析，培养后提取基因组dna，扩增获得16srdna片段后测序。测得的16s rdna序列经比对和系统发育分析，确定为短乳杆菌 (lactobacillus brevis)。[0013]工作原理：本发明一种除臭乳酸菌的测序分析法，确定的除臭菌株培养收集菌体后提取基因组dna，并扩增16s rdna。pcr反应体系为：含有15 mmol∙l−1的mg2 +的10×缓冲液2.5 μl，2.5 mmol∙l−1的dntp2 μl，引物27f和1492r（10 μmol∙l−1)各0.4 μl，dna模板约30 ng，全式金dna聚合酶0.75 u，用ddh2o补至25 μl。pcr条件为：94℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 2 min，30个循环；最后72℃ 5 min。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送交上海生工生物技术有限公司测序。将所得的序列在genbank中进行blast分析后，采用mega 4.0软件进行多重序列比对分析，并以n-j法构建系统发育树。[0014]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。[0015]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。









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