一种乌蔹莓及其伪品的快速鉴别方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药鉴定领域，特别涉及一种能快速鉴定乌蔹莓及其伪品的引物和pcr方法。背景技术：2.中药材乌蔹莓为葡萄科乌蔹莓属植物乌蔹莓(cayratia japonica)的全草。现代研究表明，乌蔹莓可有效防治咽喉肿痛、腮腺炎、毒蛇咬伤、痈肿、疔疮、风湿痛、黄疸、痢疾、咯血、尿血等病症。由于乌蔹莓在形态上与绞股蓝、葎草等植物较为相似导致目前市售乌蔹莓质量存在安全性问题。其伪品主要包括绞股蓝(gynostemma pentaphyllum)、葎草(humulus scandens)和雪胆属植物，如马铜铃(hemsleya graciliflora)和曲莲(hemsleya amabilis)等。因此建立乌蔹莓快速、准确的鉴定方法，对保证临床用药安全是十分重要的。技术实现要素：3.本发明人基于叶绿体基因组psba-trnh序列，设计了1对乌蔹莓的位点特异性引物，通过pcr扩增和凝胶电泳等操作，即可达到快速准确鉴定检测材料中是否含有乌蔹莓。4.1.一种鉴定乌蔹莓和伪品的特异性引物，其特征在于所述引物为wlm-3f、wlm-3r，其序列为：5.表1 1对乌蔹莓的特异性引物[0006][0007]2.一种基于特异性引物鉴定乌蔹莓的pcr方法，其特征在于，所述鉴定方法包括如下步骤：[0008](1)待测样品dna的提取[0009](2)用权力要求1所述的引物进行pcr反应，获得扩增产物。dna扩增体系包括：25μl反应体系(超光速mix酶12.5μl，wlm-3f、wlm-3r引物各1μl(10pmol)，dna模板1μl(约50ng)，ddh2o 9.5μl)；反应体系：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸8min。[0010](3)获得的pcr扩增产物使用核酸染料进行染色，分别取10μl扩增产物上样，后通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。如果(2)的产物在凝胶电泳谱图中观察到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中含有乌蔹莓；如果在凝胶电泳谱图中观察不到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中不含有乌蔹莓。[0011]3.一种乌蔹莓的pcr鉴别方法，其特征在于，待测样品为乌蔹莓植物。附图说明[0012]图1：wlm-3f+wlm-3r特异引物鉴别，该引物能够特异性扩增获得乌蔹莓叶绿体基因组psba-trnh上491bp的鉴别条带，而对其他伪品则没有扩增产物。m：marker；xy：乌蔹莓中国药科大学校园；hen：乌蔹莓河南；qls：乌蔹莓青龙山；ah：乌蔹莓安徽；sx：乌蔹莓陕西；ls：绞股蓝老山(jgl-ls)；lc：葎草；mtl：马铜铃；ql：曲莲；ck：阴性对照。[0013]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：[0014](1)对乌蔹莓及其伪品进行收集，各取100mg样品使用冷冻研磨仪进行研磨粉碎，使用核分离液清洗至上清液无色，离心后使用移液枪小心弃去上清液，再使用ctab法提取样品总dna。[0015]表2核分离液配置表[0016][0017]表3 ctab溶液配置表[0018][0019]表4乌蔹莓及其伪品收集表[0020][0021](2)将dna稀释至30-50ng/μl，乌蔹莓特异性引物由金斯瑞生物科技有限公司(中国，南京)合成，并稀释为10μmol/l。pcr反应在200μl pcr反应管中进行，包括：[0022][0023]pcr反应体系为：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸8min，获得的pcr产物使用核酸染料进行染色，分别取10μl扩增产物上样，后通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果，通过凝胶成像结果即可确定待测样品中是否含有乌蔹莓。技术特征：1.一种鉴定乌蔹莓及其伪品的特异性引物，其特征在于所述引物为wlm-3f、wlm-3r，其序列为：wlm-3f：5’‑gactcaatggaagctgttctaa-3’wlm-3r：5’‑gaatgataaccataacgaaaacg-3’。2.一种基于特异性引物鉴定乌蔹莓的pcr方法，其特征在于，所述鉴定方法包括如下步骤：(1)待测样品dna的提取(2)用权利要求1所述的引物进行pcr反应，获得扩增产物。dna扩增体系包括：25μl反应体系(超光速mix酶12.5μl，wlm-3f、wlm-3r引物各1μl(10pmol)，dna模板1μl(约50ng)，ddh2o 9.5μl)；反应体系：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸8min。(3)获得pcr扩增产物后，使用核酸染料染色并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行观察。如果(2)的产物在凝胶电泳谱图中观察到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中含有乌蔹莓；如果在凝胶电泳谱图中观察不到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中不含有乌蔹莓。3.一种乌蔹莓的pcr鉴别方法，其特征在于，待测样品为乌蔹莓植物。技术总结本发明公开了一种用于鉴定乌蔹莓与4种伪品的特异性引物对。本发明提供了1对鉴别引物，为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。采用特异性引物对待测样品进行扩增时，如果能实现有效扩增，则待测样品中含有乌蔹莓。如果不能实现有效扩增，则可以证明待测样品中不含有乌蔹莓。本发明能快速地鉴定出乌蔹莓，且其灵敏度高，稳定性好。使用此方法鉴别乌蔹莓，只需要通过DNA提取、PCR扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别，这为乌蔹莓的快速准确鉴定提供了依据。准确鉴定提供了依据。技术研发人员：陆续 李萍 徐文波受保护的技术使用者：中国药科大学技术研发日：2021.11.19技术公布日：2022/9/1









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!