微阵列芯片和包括其的寡核苷酸合成装置的制作方法

物理化学装置的制造及其应用技术1.本发明涉及基因芯片技术领域，尤其是涉及一种微阵列芯片和包括其的 寡核苷酸合成装置。背景技术：2.高效、高保真和低成本的基因片段是生物技术、基础医学、信息技术等 研究的目标和核心。现有基因合成技术尽管各有优点，但对于高通量智能合 成系统的适用性仍有待提高。关于辅助高通量智能合成系统，实现高效、高 质量、长片段和高通量地合成寡核苷酸片段的技术、结构和设备鲜有报道。 同样，对于高通量可单独定位的微流体平行反应，也缺少能够在微流控尺度 上精准操控和划分反应溶液的技术。3.因此，为了解决现有技术中存在的问题，需要一种微阵列芯片进行改进 的技术。技术实现要素：4.本发明提供了一种微阵列芯片及包括其的寡核苷酸合成装置，以解决现 有基因合成技术中试剂消耗量过大、利用率较低、均一性差等问题，实现高 通量、低成本、高质量的寡核苷酸合成，更好地服务未来高通量低成本的基 因合成技术和智能高通量合成系统。5.根据一个方面，本发明提供了一种微阵列芯片，所述微阵列芯片从上至 下包括导液层和反应层，所述导液层和所述反应层为一体结构或分体结构， 其中：6.所述导液层具有多个贯通导液孔；7.所述反应层的上表面具有多个非贯通一级孔，在每个所述一级孔的底面 具有贯通至所述反应层底面的二级孔；8.所述导液孔大于所述一级孔，每个所述导液孔对应于一个或者多个一级 孔，每个所述导液孔对应的一级孔组成一个一级反应单元；所述一级孔大于 所述二级孔，每个所述一级孔对应于一个或多个二级孔，每个所述一级孔对 应的二级孔组成一个二级反应单元。9.在一个较佳的实施例中，所述导液层与所述反应层为分体结构，之间设 置有密封层，所述密封层具有与所述导液孔对应的贯通孔。10.在一个较佳的实施例中，所述反应层之下为支撑层，所述支撑层具有贯 通排液孔，所述排液孔用于导流所述二级孔的流出液。11.在一个较佳的实施例中，所述导液层的上下表面、所述密封层的上下表 面、所述反应层的上下表面，以及所述支撑层的上下表面中的至少一个表面 有疏水性修饰；和/或所述导液孔、所述密封层的贯通孔，以及所述排液孔内 表面有疏水性修饰。12.在一个较佳的实施例中，所述一级孔、所述二级孔内表面做亲水性修饰， 所述一级孔口周围0.05mm内有亲水性修饰。13.在一个较佳的实施例中，每个所述导液孔对应于多个一级孔，所述多个 一级孔呈多边形排列，相邻的一级孔之间的间距相等。14.在一个较佳的实施例中，所述多个一级孔呈等边三角形排列。15.在一个较佳的实施例中，所述导液层的导液孔结构和所述支撑层的排液 孔结构的尺寸、数目和排布规律是一致的。16.在一个较佳的实施例中，所述微阵列芯片通过定位装置固定各层的相对 位置，优选所述定位装置为定位杆、定位预紧螺钉或定位凹槽。17.在一个较佳的实施例中，所述支撑层上、所述导液层、所述反应层和优 选的所述密封层相应位置具有配合所述定位装置的定位孔。18.在一个较佳的实施例中，所述定位预紧螺钉为沉头螺钉，导液层的上表 面和支撑层的下表面通过沉头螺钉保证组装完成后平整无凸起的平面结构。19.在一个较佳的实施例中，所述反应层与支撑层为分体结构，之间设置有 密封层，所述密封层具有与所述排液孔对应的贯通孔。20.根据另一个方面，本发明提供了一种寡核苷酸合成装置，所述寡核苷酸 合成装置包括本发明的微阵列芯片。所述寡核苷酸合成装置通过外形尺寸控 制与合成仪配合、定位并安装。21.本方案提出了一种芯片在传统合成仪上应用的设计理念。本发明的微阵 列芯片采用液滴精准控制的分层结构，并结合表面差分功能化的芯片表面处 理技术，从空间上阻隔了孔之间液体的交叉流通。利用本发明的微阵列芯片， 可以在保证寡核苷酸合成质量和效率的同时，提高合成试剂的利用率，降低 合成试剂的消耗量，从而降低合成成本。同时，分层结构搭配微阵列芯片的 组合方式，使得本发明的微阵列芯片能够在普通的柱式合成仪器中得以使 用，从而加快柱法合成仪向高通量芯片合成仪进化的速度，对于高通量芯片 合成仪的开发具有先驱指导意义。附图说明22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面 将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。下面 描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在 不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。23.图1是本发明寡核苷酸合成微阵列芯片的结构示意图。其中，1是导液 层，2是密封层，3是反应层，4是支撑层，5是支撑层上的定位杆。24.图2示出了根据一个实施方案的多层芯片组装后的三维剖视图，其中1 是导液层；2是密封层；3是反应层；4是支撑层。25.图3示出了根据另一个实施方案的寡核苷酸合成微阵列芯片的结构示意 图；其中导液层和反应层为一体结构，11表示导液孔，31表示一级孔，32 表示二级孔。26.图4示出了根据一个实施方案的寡核苷酸合成微阵列芯片的反应层结构 的示意图，一个导液孔对应的反应层上表面(a)，包括数个一级孔，组成 一个一级反应单元，301表示的是一级孔的孔径，单个导液孔所对应的所有 反应单元内，发生同一种化学反应；302表示的是一级孔的孔间距，相邻孔 中心统一间距，保证每个孔与周围相邻孔的间距都是相同的；一个导液孔对 应的反应层下表面(b)，303表示的是二级孔组成的二级反应单元。利用 反应层下表面连接更加精密的单点给液系统，可控制单个二级孔内发生一种 化学反应。27.图5是本发明实施例中微阵列合成芯片合成应用过程中的方法流程图， 包括芯片组装、芯片安装、添加反应试剂、密封反应和氨解反应等五个步骤。具体实施方式28.为了使本发明的上述以及其他特征和优点更加清楚，下面结合附图进一 步描述本发明。应当理解，本文给出的具体实施例是出于向本领域技术人员 解释的目的，仅是示例性的，而非限制性的。29.在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的透彻理解。然而， 对于本领域普通技术人员来说将明显的是，不需要采用具体细节来实践本发 明。在其他情况下，未详细描述众所周知的步骤或操作，以避免模糊本发明。30.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、ꢀ“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、ꢀ“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、ꢀ“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基 于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不 是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和 操作，因此不能理解为对本发明的限制。31.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或 暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第 一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明 的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确 具体的限定。32.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、ꢀ“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以 是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接 相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元 件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言， 可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。33.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”ꢀ或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介 间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是 第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第 二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特 征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特 征。34.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示 例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描 述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例 中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例 或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个 实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域 的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或 示例的特征进行结合和组合。35.本发明提出了液滴精准控制的微阵列分层结构芯片的技术方案，解决了 现有基因合成仪试剂消耗量过大、利用率较低等问题。本发明的微阵列芯片 自上而下包括导液层和反应层。自上而下流通的结构设计，在给液时可以保 证每个反应孔中承接试剂的优先级相同，因此会提高反应的均一性，同时防 止了液体在反应过程中的不期残留。导液层具有多个贯通导液孔。反应层内 规律排布孔，孔为上下套刻的硅基通孔，上为一级孔的大孔，下为二级孔的 小孔，大孔和小孔两者连通，寡核苷酸的合成发生在一级孔和/或二级孔的 内表面。一个导液孔对应一组一级孔(一个或多个)，该组一级孔组成一级 反应单元，该组一级孔对应的二级孔(一个或多个)组成二级反应单元。在 本发明中，可根据应用场景设计导液孔、一级孔和二级孔的尺寸和排布规律。36.在本发明中，导液层可以实现对所述一级反应单元和二级反应单元的给 液条件，所述给液条件包括定位精度和给液量等条件。具体实施过程主要包 含以下四个步骤：1)芯片装置对应的给液系统通过机械自动化设备，如闭 环步进电机、伺服电机或直线电机等，实现至少5微米的位移重复精度。在 一些实施案例中，给液系统具有固定位置，芯片反应台可根据控制程序实现 精准位移。2)通过机械定位栓、光电定位系统等实现给液系统和微阵列芯 片的精准定位。所述精准定位，一般通过给液系统和导液孔双向实现。3) 由上位机内的分发数据程序实时判断并控制给液系统的液路开启状态和持 续时间，实现芯片孔内的给液操作。一般通过电磁阀或压电阀实现液路的开 启，通过控制时间或脉冲波形实现液量的控制。4)重复以上，位移、定位、 给液等操作，实现不同微阵列芯片上不同位置的精准给液。所述给液指的是 化学试剂从给液系统中移动到微阵列芯片反应孔中的一系列操作。一般通过 给液头实现给液系统和芯片的试剂补充。所述给液头由具有固定孔径尺寸的 喷孔或钢针组成。37.在本发明中，寡核苷酸合成过程中的试剂运动轨迹主要包括：1)试剂 由钢针或喷孔中喷出，到达导液孔。2)试剂经由导液孔接触反应层的上表 面，充分接触到一个包含多个二级孔的一级反应单元，在一级反应单元内， 由于表面功能化处理和二级孔之间的排布规律限制，试剂均匀分散进入一级 孔内，由于一级孔内表面的亲水结构，试剂可顺利流动到一级孔底部，所述 底部指的是一级孔与二级孔连接处；3)在外部压力作用下，试剂由一级孔 进入二级孔，并穿过二级孔流出，例如进入支撑层内的排液孔中。4)在较 大压力作用下，试剂经由排液孔离开微阵列芯片装置；5)更多惰性气体通 过微阵列芯片装置，实现装置的干燥处理，保证下一个试剂的高质量反应。 其中，需要补充说明的是，一级孔的孔径尺寸(比如，直径为0.1mm-0.6mm， 优选0.3mm时)能够保证试剂在不受外部压力作用下由于重力原因由反应 层表面进入一级孔内，二级孔的孔径尺寸设计较小(比如，直径为 0.01mm-0.1mm，优选小于0.05mm时)，试剂仅在重力作用下无法以适合反 应的速度进入二级孔内，因此需要在后续合成过程中，对微阵列芯片装置实 行密封、加压处理，助力试剂顺利通过整个装置，并发生有效的化学反应。38.在本发明中，所述导液层和所述反应层可以为一体结构或分体结构。如 果所述导液层和所述反应层为分体结构，则二者之间密封接触。优选地，在 导液层和反应层为分体结构时，它们之间还包含密封层，实现导液层和反应 层之间的密封。优选地，在反应层之下还包括支撑层。因此，本发明的微阵 列芯片由上至下可以依次包含导液层、密封层、反应层和支撑层。本发明的 寡核苷酸合成微阵列芯片的多层结构中，导液层、密封层和支撑层具有微阵 列通孔，至少导液层和密封层的微阵列通孔结构的设计是保持一致的，优选 导液层、密封层和支撑层的微阵列通孔结构的设计是保持一致的。保持一致 优选是指多孔结构的尺寸、数目和排布规律是保持一致的。39.为进一步保证合成过程的发生和合成质量，本发明的寡核苷酸合成微阵 列芯片的多层结构中，导液层、密封层和支撑层的表面和材料也需要做进一 步的表面改性。所述表面改性包括使用一些疏水或超疏水材料或具有相同特 征的表面涂层，保证了反应试剂的不串流、不残留和不黏附。在本发明中， 导液层和支撑层均采用疏水材料或疏水表面修饰，保证孔内的反应试剂不交 叉污染和不残留，提高了寡核苷酸合成的质量和反应效率。导液层/密封层下 表面和反应层表面的疏水修饰保证了反应层的一级反应单元之间液体的独 立和互不流通，从而保证反应单元内的合成准确度。支撑层表面的疏水修饰 保证了试剂在排干过程中不在支撑层与芯片接触面间残留和试剂的回流污 染。40.在本发明中，可以对反应层进行定向化的表面改性，以控制合成试剂在 反应过程中能准确定量地进入二级反应孔，并与反应孔的内表面充分接触， 反应完全。所述对反应层进行定向化的表面改性，包括二级反应孔内表面的 亲水修饰、二级反应孔与一级反应孔连接处的亲水修饰以及其他表面的疏水 修饰。二级反应孔内表面的亲水修饰保证了反应试剂在孔内表面的停留和附 着，以此增加寡核苷酸的附着和生长。二级反应孔与一级反应孔连接处的亲 水修饰保证了反应试剂从一级孔到二级孔的流通。可以对反应层的上下表面 进行疏水修饰，在不同给液系统的应用场景中，疏水特性发挥不同的功能。 在导液层使用时，一级单元作为独立反应单元，单元内发生相同反应。此时， 一级单元之间的疏水特性有助于从物理空间上隔开相邻孔，防止液体的交叉 流通和试剂污染，保证合成质量。一级孔之间的均匀疏水特性有助于从导液 孔内掉落的大液滴在接触一级孔上表面时，均匀分散为小液滴进入一级孔， 保证合成反应的均匀发生。在导液层不使用时，一级孔之间的疏水特性有助 于从物理空间上隔开相邻孔，防止液体的交叉流通和试剂污染，保证合成质 量。41.在本发明中，导液层、密封层和支撑层为反应层的应用提供了良好的反 应环境和条件，保证了反应层中液体的供应、流通和化学反应，解决了柱法 合成仪器上芯片法合成应用的问题。导液层保证了与现有柱法合成仪之间的 液体供应连接，支撑层保证了与现有柱法合成仪器之间的定位连接。42.本发明的寡核苷酸微阵列合成芯片可应用但不限于应用在384、768等 柱法合成仪上进行寡核苷酸的合成。在优选应用中，本发明的微阵列芯片装 置安装在传统柱法合成仪中，替换现有以可控玻璃珠为合成载体的反应柱， 实现微米孔内的可控合成。本发明的方案可以提高单位反应试剂的定量控制 性和利用率，解决了柱法合成仪试剂大量消耗和浪费的问题，从而实现更低 成本的寡核苷酸合成。对于柱法合成仪，本发明的方案是创新性设计，通过 对反应单元中孔的尺寸设计和排列规律设计，可以进一步提高本发明的合成 通量，扩大本发明在现有柱法合成仪器上的应用价值。43.本发明的寡核苷酸微阵列合成芯片主要应用在合成仪上，在给液系统具 有5微米级定位精度和重复位移精度，以及pl级分发液量精度时，芯片的 通量取决于一级孔或二级孔的个数。在一些优选的实例中，在合成仪的给液 系统能够单独定位一级孔时，将一级孔面向给液系统放置，实现一级孔个数 通量的合成。在合成仪的给液系统能够单独定位二级孔时，将二级孔面向给 液系统放置，可实现二级孔个数通量的合成。44.本发明的寡核苷酸微阵列合成芯片的合成载量主要取决于一级孔和二 级孔的个数。在一些优选的实例中，一级孔内表面连接有中间体时，合成发 生在一级孔内，单个反应单元内所包含的一级孔的内表面面积决定了合成载 量的大小。在一些优选的实例中，二级孔内表面连接有中间体时，合成发生 在二级孔内，单个反应单元内包含的二级孔的内表面面积决定了合成载量的 大小。45.本发明的微阵列芯片利用分层结构并结合表面差分功能化的芯片表面 处理技术，从空间上阻隔了孔之间液体的交叉流通，提高并保证了寡核苷酸 合成的质量和效率。具体而言，本发明的微阵列芯片采用液体自上而下流通 的结构设计，并优选采用等间距的孔排列设计，搭载表面阵列差分功能化技 术，保证了反应表面在承接反应试剂时优先级的一致性，以此实现反应试剂 到达反应表面的均匀性和合成反应的均匀发生，可进一步保证寡核苷酸合成 质量。本发明的微阵列芯片结构适合应用于大规模、高通量、低成本的工业 化寡核苷酸的合成，有效提高传统合成仪的合成效率和成本效益。46.以下结合具体实例，对本发明的寡核苷酸微阵列合成芯片进行详细说 明。在如图1所示的寡核苷酸微阵列合成芯片的结构示意图中，由上至下依 次包含导液层1、密封层2、反应层3和支撑层4的多层结构，每层均包含 微阵列通孔结构，用于流体的流动、停留、存储和反应。所述的多层结构可 独立存在，也可通过定位杆、定位栓、预紧栓或定位凹槽等装配连接。导液 层、密封层和反应层的微阵列芯片上可以设计有三点定位孔，通过支撑层的 定位杆5相互组装在一起。图2示出了多层芯片组装后的三维剖视图，其中 1是导液层；2是密封层；3是反应层；4是支撑层。图3示出了导液层和反 应层为一体结构时的三维剖视图。47.在本发明中，导液层负责定位和试剂的传送，导液层保证了与现有柱法 合成仪之间的液体供应连接。当导液层和反应层为分体结构时，导液层的材 料可以是玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯等材料，保证不与使用试剂发生反应的 惰性材料即可。在一些实施方案中，导液层具有可重复使用性。在一些实施 方案中，为达到较好的密封效果，导液层可采用较大密度或较大厚度的材料， 比如316不锈钢等，在连接过程中，给与密封层一定的压力，增强密封效果。 当导液层和反应层为一体结构时，按照反应层偏好选取材料。导液层内排布 导液孔，导液孔可以规律排列，孔个数为至少为1，可根据应用场景进行调 整。导液层的多孔结构均可以为圆孔，但不限圆孔的结构，可以根据反应需 要，进行形状的改进，如三角形，矩形、内凹多边形、外凸多边形、各种截 面形状的沟槽等中的一种或几种。导液层的多孔结构的尺寸、数目和排布可 根据微阵列合成芯片的应用场景进行调节，如将384孔改为768孔适用于768 柱法合成仪等。导液孔的直径至少为3.5mm、3.7mm、3.9mm或4mm，至多 为4mm、4.3mm、4.5mm或4.7mm，例如为3.5mm-5mm。在一些进一步的 实施方案中，导液孔的孔间距至少为4mm、4.3mm、或4.5mm，至多为4.5mm、 4.7mm、4.9mm或5mm。在一些进一步的实施方案中，导液孔的孔深至少为 10mm、15mm或20mm，至多为20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm 或80mm，例如为10mm-80mm。48.在本发明中，密封层连接导液层和反应层，将导液层和反应层紧密连接， 防止一级孔导液时液体渗漏等情况。因此，密封层的材料可以实现与导液层 和反应层的良好接触，防止液体通过导液层与反应层之间的间隙在不同的反 应单元串流。通过密封层进行间隙控制，保证液体自上而下的流动方向，无 液体串流和残留。密封层优选为具有疏水特性的惰性材料，材料包括但不限 于是多聚物，可以是聚合物薄膜、橡胶、硅胶、全氟醚等材料。所述密封层 的厚度至多为0.5mm、1mm、1.5mm或2mm。49.在本发明中，反应层的材料可以为硅片或以硅为主体的材料。反应层包 括上下两面，反应层内排布一级孔和二级孔，寡核苷酸合成反应发生在一级 孔或二级孔内表面。靠近导液层的面为一级孔所依托的面，靠近支撑层为二 级孔所依托的面。一级孔和二级孔可以设计成分布在一个反应层上的阶梯通 孔。在一些优选的案例中，一级孔承担试剂分液和试剂暂时存储的功能；与 二级孔联通的阶梯面上优选存在亲水修饰，这种修饰可以减少试剂进入二级 孔的阻力。一个一级孔连接多个二级孔，且二级孔间距均等，如此保证了一 级孔内的液量相对均匀地分散到二级孔内，同时间接保证了二级孔内试剂的 微小液量(比如pl级液量)。试剂从一级孔进入二级孔，保证了二级孔可 以完全浸润在试剂中。理论上通过二级孔的试剂量是其体积的2-3倍，如此 多的试剂在反应时将暂存在一级孔内。通过外界压力作用，试剂顺序通过二 级孔，2-3倍的试剂量保证了试剂与二级孔内表面充分接触，如此确保了二 级孔内寡核苷酸反应的完全度。在一些实施方案中，一级孔的个数至少为1， 至少大于或等于导液孔的个数。反应层的孔是通过对普通硅片或soi晶片的 双面套刻制作完成的。在一些实施方案中，一级孔的直径至少为0.1mm、 0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm，例如0.1mm-0.6mm。在一些实施方案中， 一级孔的孔间距至少为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm。在一些 实施方案中，一级孔的孔深为至少为0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm或 0.5mm。在一些实施方案中，二级孔的直径至少为0.01mm、0.02mm、0.03mm、 0.04mm、0.05mm或0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm，例如为 0.01mm-0.1mm。在一些实施方案中，二级孔的孔间距至少为0.01mm、 0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm或0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、 0.1mm，例如为0.01mm-0.1mm。在一些实施方案中，二级孔的孔深至少为 0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、 0.09mm、0.1mm，例如为0.01mm-0.1m。在一些实施方案中，基于排布均等 的考虑，一级孔的个数f至少为3，二级孔的个数g至少为3。50.在本发明中，反应层的层厚限制于原硅片的厚度，理论上一级孔的孔深 应大于二级孔，以此保证一级孔内储存的试剂可供应多个二级孔内的合成反 应。在一些优选的实例中，一级孔的孔深约为8-10倍的二级孔深。在本发 明中，一级孔间距应保证孔间隙的疏水处理的有效性。在一些优选的实例中， 一级孔间距和孔经相等，以此保证一级孔之间的相互独立性。二级孔间距应 保证一级孔内的试剂能相对均匀地进入二级孔内。在一些优选实例中，二级 孔的孔间距和二级孔的孔径相等。51.图4(a)示出了一个导液孔所对应的反应层上表面，包含数个一级孔 所组成的一级反应单元，301表示的是一级孔的孔径、302表示的是一级孔 的间距，相邻孔中心统一间距，保证每个孔与周围相邻孔的间距都是相同的。 图4(b)示出了一个导液孔对应的反应层下表面，303表示的是一个一级孔 所对应的数个二级孔，组成一个二级反应单元。在一些优选的实施案例中， 一级反应单元的尺寸范围涵盖二级反应单元。在一些优选的实施案例中，一 级反应单元之间可以同时独立处理不同的化学反应。在一些优选的实施案例 中，二级反应单元之间可以同时独立处理不同的化学反应。52.在本发明中，一组一级孔可以呈等边三角形排列，所述导液孔对应覆盖 一个或者多个等边三角形结构排列的一级孔，使一个导液孔对应的反应层上 的一个反应单元内只合成一种寡核苷酸。一个等边三角形结构中两两相邻的 一级孔的间距相等，使液体在到达反应层表面时，能够均匀分散在不同的一 级孔中，保证同个反应单元中的一级孔内的合成反应均匀发生，进而保证合 成长度的均匀性。本发明的一级孔设计可实现一个芯片可以合成多种不同的 寡核苷酸，提高合成效率，从而有助于实现后续的高质量高浓度寡核苷酸链 的原位组装。53.在本发明中，支撑层负责保护反应层不被压力击碎，同时保证微阵列芯 片装置多层结构之间以及与给液系统的配合连接。支撑层的上表面与反应层 的下表面相配合。支撑层的材料可以是玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯等材料， 保证不与所使用的试剂发生反应的惰性材料即可。在一些实施方案中，支撑 层具有可重复使用性。在一些优选的实施方案中，支撑层上表面可增加方便 芯片放置和拿取的结构设计，比如一些凹槽、凸起设计等。支撑层的多孔结 构可以为圆孔，但不限圆孔的结构，可以根据反应需要，进行形状的改进， 如三角形，矩形、内凹多边形、外凸多边形、各种截面形状的沟槽等中的一 种或几种。导液层和支撑层的多孔结构的尺寸、数目和排布规律可以是保持 一致的，也可以不一致，只要不遮挡二级孔即可。在一些实施方案中，支撑 层具有疏水特性。54.图5是本发明实施例中微阵列合成芯片合成应用过程中的方法流程图， 包括芯片组装、芯片安装、添加反应试剂、密封反应和氨解反应等五个步骤。 具体而言，所述的寡核苷酸微阵列合成芯片的合成工艺包括：1)将多层结 构组装后放入合成仪器的固定腔室中，利用合成仪器的给液系统将合成试剂 准确滴入芯片的孔中；2)合成试剂首先到达芯片导液层的孔中，由于滴入 试剂的速度和重力原因，试剂很快接触反应层的上表面，并进入一级孔内， 由于二级孔的尺寸限制，试剂无法很快进入二级孔内发生反应；3)将包含 微阵列芯片装置的芯片反应台或腔体密封，利用外部压力作用将反应试剂推 送到二级反应孔中；4)反应完成后，利用气体作用清洗并吹干微阵列芯片 装置，为下次反应做准备，保证下次反应的准确率。55.本发明的寡核苷酸合成微阵列芯片的合成方法，采用液体自上而下流通 的结构设计，精准控制液体的流动、分散、反应和残留，保证化学反应对试 剂的利用率，大幅降低合成过程中的试剂使用量。本发明由于滴入试剂的速 度和重力原因，试剂很快接触反应层的上表面，由于反应层的特殊结构和表 面处理，试剂可顺利进入一级孔，但无法保证试剂完全进入反应层的一级孔 和二级孔中。采用密封和正压设计，助力试剂进入二级孔，保证寡核苷酸合 成的有效性。56.实施例57.本发明寡核苷酸合成微阵列芯片的一个实施例中，在60mer的寡核苷酸 合成过程中，导液层包含384个导液孔，每个导液孔孔下对应一个一级反应 单元，每个一级反应单元包含23个一级孔，每个一级孔下对应一个二级反 应单元，每个二级反应单元包含6个二级孔。也即，该芯片的反应层共包含 8832个一级孔，52992个二级孔。在具体合成时，寡核苷酸的合成通量是384 条，每个导液孔内合成的寡核苷酸序列是一样的。给液系统的控制逻辑只需 兼顾384个孔的微量给液即可。芯片结构的设计将每个寡核苷酸序列的合成 位置定量化，这里每条寡核苷酸的合成位点为23*6＝138个二级孔的内表面。 二级孔的直径设置为50微米，孔深为50微米时，完全充满一个二级孔的体 积是39250μm3，6个二级孔的总体积是235500μm3，因此，完全充满一个二 级反应单元需要液体的总体积是235500μm3＝0.2355nl，52992个二级孔的总 体积是2.08μl。一级孔的直径设置为300微米，孔深为450微米时，完全充 满一个一级孔的体积是31.8nl，23个一级孔的总体积是0.731μl，8832个一 级孔的总体积是280.79μl。依据完全反应覆盖规律，原始体积至少是覆盖面 的3-5倍。反应时需保证二级孔的反应体积，每个导液孔单次所需的反应试 剂的体积为23个一级孔和138个二级孔的覆盖体积，也即2.21-3.68μl。相 比较当前384合成仪器上的柱法合成，单个孔每次添加的反应试剂为 20-30μl，利用本发明的芯片结构，可将合成试剂的消耗量降低90％左右， 同时也保证了合成通量。一个二级孔的内表面积为7850um2，138个孔的表 面积为1.0833mm2，由此可计算获得每条寡核苷酸的理论载量约为1pmol。 在引物合成过程中，该载量可以满足要求。58.以上描述的各技术特征可以任意地组合。尽管未对这些技术特征的所有 可能组合进行描述，但这些技术特征的任何组合都应当被认为由本说明书涵 盖，只要这样的组合不存在矛盾。59.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对 其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通 技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修 改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。









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