一种二维红外光谱探针及其制备方法和用途

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及二维红外光谱技术领域，具体涉及一种二维红外光谱探针及其制备方法和用途。背景技术：2.二维红外光谱(2d-ir,two-dimensional infrared vibrational echo spectroscopy)是一种三阶非线性超快时间分辨光谱。它的信号是分子体系对一系列超快红外激光脉冲所作出的一种时域非线性响应(受激振动光子回波)在频域中的双频率轴表达。二维红外光谱是一种用于分子动态研究的新兴方法，它可以捕获飞秒到皮秒时间尺度上信号变化。这对研究蛋白质的结构快速变化，氢键网络以及水分子的重排都具有重要意义。虽然二维红外(2d-ir)光谱法非常适合监测静态蛋白质结构周围的飞秒到皮秒范围内(fs-ps)的水动力学，但由于缺乏特定位点的2d-ir探针，其在探测酶活性位点动力学方面的应用受到限制。3.酶在从飞秒到秒的各种时间尺度上移动。尽管人们对慢速动作(即毫秒到秒)如何影响底物结合和产物释放了解很多，但对于飞秒(fs)到皮秒(ps)尺度上发生的快速运动如何影响酶活性知之甚少。有人提出，酶纳秒级时间尺度上的快速运动能够沿着正确的路径引导大规模的慢速运动和反应，从而促进特定的化学反应。然而，这种结构活性相关的许多方面，特别是在fs-ps时间尺度上尚待探索。由于化学反应的过渡态发生在fs级时间尺度中，开发蛋白质标记和光谱工具以促进酶中fs-ps时间尺度的动力学的观察尤为重要。人们一直致力于开发实验工具，以检测酶活性位点的这些快速波动。在这些方法中，二维红外(2d-ir)光谱具有固有的快速的时间分辨率，非常适合监测静态蛋白质结构周围的fs-ps水动学和离子动力学研究。4.实际上，蛋白质位点特异性ir探针的最新进展极大地提高了时间分辨红外技术的空间分辨率，并将其用作蛋白质动态研究的高信息性工具。例如，已使用遗传编码的非天然氨基酸，例如p-叠氮基-l-苯基丙氨酸(n3f)7.和p-氰基-l-苯基丙氨酸(cnf)来跟踪局部电场，表征蛋白质折叠和蛋白质/蛋白质相互作用。然而，由于苯丙氨酸侧链大部分被埋在蛋白质疏水核心内部，并且通常不直接参与酶催化剂，因此这些基因编码的苯丙氨酸类似物在探测酶活性位点动力学的作用有限。技术实现要素：5.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种二维红外光谱探针及其制备方法和用途，所述二维红外光谱探针能够广泛适用于研究fs-ps时间尺度上酶的活性位点动力学。6.本发明提供了一种二维红外光谱探针，为如下式(1)的化合物：[0007][0008]本发明还提供了一种所述的二维红外光谱探针的制备方法，包括：[0009]取3-氨基-l-酪氨酸·2hcl·h2o溶于盐酸溶液中，滴加nano2溶液，0℃下黑暗中搅拌，然后加入nan3溶液，0℃下搅拌。[0010]所述的制备方法，，3-氨基-l-酪氨酸·2hcl·h2o、nano2、nan3的摩尔比为8.8：10.5：21.9。[0011]所述的制备方法，第一次搅拌的时间为10min，第二次搅拌的时间为1h。[0012]所述的二维红外光谱探针或所述的制备方法制备得到的二维红外光谱探针具有如下(1)-(7)中任意一种应用：[0013](1)作为酪氨酸质子化探针；[0014](2)作为蛋白内部环境亲疏水变化探针；[0015](3)作为蛋白红外探针；[0016](4)蛋白质标记；[0017](5)蛋白质分离；[0018](6)荧光探针设计；[0019](7)蛋白质结构和功能研究中的应用；[0020](8)联合蛋白变性剂在蛋白质结构和功能研究中的应用。[0021]所述的应用，所述蛋白质结构和功能包括蛋白质的动态构象。[0022]所述的应用，所述蛋白质结构和功能包括蛋白酶活性中心的柔性和催化活性。[0023]所述的应用，所述蛋白质包括酪氨酸。[0024]所述的应用，所述蛋白质为dddk酶。[0025]所述的应用，所述蛋白变性剂包括盐酸胍本发明技术方案，具有如下优点：[0026]1.本发明提供的二维红外光谱探针，为如下式(1)的化合物；本发明提供了一种新型2d-ir探针，能够广泛适用于研究fs-ps时间尺度上酶的活性位点运动如何直接引导促进特定的化学反应的反应路径，可以利用红外信号的变化而来研究蛋白酶构象的变化。具体的，如可以应用于金属酶dddk，在dddk的活性位点插入2d-ir探针，dddk是一种铁依赖性酶，其催化二甲基硫代丙酸二甲酯向二甲基硫化物的转化，在本发明中利用2d-ir探针检测，dddk催化的反应中铁离子价态的差异导致活性巨大差异的原因可通过与铁离子配位的2d-ir探针红外信号的变化来表征，通过用2d-ir探针替代了金属酶dddk的酪氨酸残基，利用二维红外可以捕捉到蛋白在fs范围时间尺度的信号变化，测定了fe2+和fe3+不同的decay时间，得出结论fe2+结合的活性中心的柔性更大，更加便于底物的结合和产物的生成。[0027]此外，2d-ir探针作为酪氨酸的类似物可以应用于研究各种酪氨酸参与的反应，如质子传递，电子传递，磷酸化等。附图说明[0028]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0029]图1是本发明实施例1中二维红外光谱探针n3y的esi-ms图谱；[0030]图2是本发明实施例1中二维红外光谱探针n3y的核磁共振氢谱；[0031]图3是本发明实施例1中二维红外光谱探针n3y的核磁共振碳谱；[0032]图4是本发明实施例1中二维红外光谱探针n3y的在不同ph下的紫外吸收图谱；图中(a)图为n3y在不同ph磷酸溶液下的紫外吸收图谱，(b)n3y的pka拟合曲线；[0033]图5是本发明实施例1中二维红外光谱探针n3y的在不同ph下的红外吸收图谱；(a)n3y在不同ph磷酸溶液下的红外吸收图谱；(b)n3y的脱质子化和质子化的吸收图谱比较；[0034]图6是本发明实施例1中二维红外光谱探针n3y的在不同极性的溶剂下的红外吸收图谱；[0035]图7是本发明实施例2中二维红外光谱探针n3y合成酶的筛选结果；(a)加n3y和不加n3y荧光蛋白表达情况；(b)sfgfp151突变体的uv图谱；图中的sfgfp151iy表示同时转化sfgfp151tag载体和构建有iy合成酶基因的pevol载体的情况；sfgfp151cly表示同时转化sfgfp151tag载体和构建有cly合成酶基因的pevol载体的情况；sfgfp151n3y表示同时转化sfgfp151tag载体和构建有n3y合成酶基因的pevol载体的情况；[0036]图8是本发明实施例2中二维红外光谱探针n3y插入到sfgfp66tag的表达和鉴定结果；(a)sfgfp66n3y和sfgfp151n3y蛋白颜色比较；(b)sfgfp66n3y的uv图谱；[0037]图9是本发明实施例2中sfgfp66n3y的sds page和使得吸收光谱和发射光谱红移；(a)sfgfp66n3y的sds page(b)sfgfp66n3y的激发和发射光谱；[0038]图10是本发明实施例2中sfgfp66n3y的质谱鉴定结果；[0039]图11是本发明实施例2中sfgfp66n3y的荷质比结果(10m/z ratio of sfgfp66n3y)；[0040]图12是本发明实施例2中sfgfp66n3y的红外吸收图谱鉴定结果；[0041]图13是本发明实施例3中dddk突变体的pcr跑胶鉴定结果；[0042]图14是本发明实施例3中dddk wt和dddk突变体的sds page结果；[0043]图15是本发明实施例3中dmsp和acrylate检测结果；[0044]图16是本发明实施例3中dddk wt和dddk突变体的紫外吸收测量结果；图中(a)dddk活性中心的氨基酸配位(b)dddk wt和dddk突变体的uv吸收图谱；[0045]图17是本发明实施例3中dddk wt和dddk突变体在fe2+和fe3+的酶催化效率检测结果；[0046]图18是本发明实施例3中dddk wt和dddk-64n3y的ftir图谱；[0047]图19是本发明实施例3中dddk64n3y在不同dt浓度下的uv吸收曲线；[0048]图20是本发明实施例3中dddk-64n3y-fe2+和dddk-64n3y-fe3+的ftir图谱；[0049]图21是本发明实施例3中dddk-64n3y-fe3+和dddk-64n3y-fe2+的二维红外图谱；[0050]图22是本发明实施例3中dddk-64n3y-fe2+和dddk-64n3y-fe3+的振动衰减曲线；[0051]图23是本发明实施例4中在不同浓度的盐酸胍下dddk-64n3y-fe2+的催化效率；[0052]图24是本发明实施例4中dddk-64n3y-fe2+在不同浓度的盐酸胍下的色氨酸荧光图谱；[0053]图25是本发明实施例4中dddk-64n3y-fe2+在不同盐酸胍浓度下的ftir曲线；[0054]图26是本发明实施例4中dddk-64n3y-fe2+在不同盐酸胍浓度下的振动decay曲线；[0055]图27是本发明实施例4中dddk-64n3y-fe2+在不同盐酸胍浓度下的二维红外图谱；[0056]图28是本发明实施例4中dddk-64n3y-fe2+和dddk-64n3y-fe3+的振动寿命；[0057]图29是本发明实施例2中n3y位点特异性掺入sfgfp-66tag的示意图；[0058]图30是本发明实施例5中md模拟中cαatoms of bi-bixβ-sheets的均方根；图中(a)为用于rmsd计算的蛋白质残基(残基id从23到112)以黄色显示，不包括环区域(残基id 31至40，以绿色显示；图中(b)为dddk-64n3y-fe2+在100ns md轨迹上的rmsd；图中(c)为dddk-64n3y-fe3+100ns md轨迹上的rmsd；[0059]图31是本发明实施例5中md模拟显示一个胍扩散到dddk的活性部位；图中(a)为md轨迹上cαatoms in the region of bi-bixβ-sheets(残基id从23到112)区域中的rmsd，环形区域(残基id从30到41)被排除在计算中；图中(b)为在md轨道上，fe2+离子与胍基中心碳原子之间的距离。胍在～720ns扩散到活性部位；[0060]图32是本发明实施例5中计算电场矢量；图中(a)用两个指数衰减拟合三个系统的ffcfs的参数；图中(b)用于频移计算的坐标系的定义；[0061]图33是本发明实施例5中ffcf图片；图中(a)-(c)整个体系(dddk-64n3y-fe(iii)，dddk-64n3y-fe(ii)或dddk-64n3y-fe(ii)-1m盐酸胍)(a)，仅蛋白质残基(b)和仅水分子(c)引起的频移分布；(d)-(f)通过包括完整体系(dddk-64n3y-fe(iii)，dddk-64n3y-fe(ii)或dddk-64n3y-fe(ii)-1m盐酸胍)(d)，仅蛋白质残基(e)和仅水分子(f)来计算的ffcf。具体实施方式[0062]提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。[0063]实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。[0064]实验试剂和材料：[0065]3-氨基-l-酪氨酸，cly,nano2，异丙醇均购买于百灵威科技有限公司；fastpfu dna polymerase北京全式金生物有限公司；dpni new england biolabs；top10感受态北京康为世纪有限公司；bl21感受态北京康为世纪有限公司；ni-柱填料南京金斯瑞生物科技有限公司；dmsp百灵威科技有限公司；acrylate北京伊诺凯科技有限公司。盐酸胍由上海生工有限公司提供。[0066]实验仪器和设备：[0067]lc-ms安捷伦液相色谱质谱联用；核磁共振仪波普仪器布鲁克；紫外可见吸收光谱仪器赛默飞；光谱分析仪spectro；高速离心机赛默飞；水浴锅北京五业嘉科技有限公司；pcr仪赛默飞世尔科技有限公司；dna凝胶电泳仪北京六一仪器产；高速离心机赛默飞世尔科技有限公司；sds-page电泳仪北京原平皓生物公司；akta蛋白纯化系统美国通用电气有限公司；2d-ir光谱由中国科学院物理所提供。[0068]实验所用缓冲液：[0069]ph4-10的磷酸缓冲液由0.2m的磷酸氢二钠和0.2m的磷酸二氢钠配置。lysis buffer:20mm的na2hpo4(ph 7.5),500mm的nacl,20mm的咪唑。wash buffer:20mm的na2hpo4(ph 7.5),500mm的nacl,50mm的咪唑。elution buffer:20mm的na2hpo4(ph 7.5),500mm的nacl,500mm的咪唑。[0070]下述实施例中的质粒sfgfp151tag、sfgfp66tag，为通过将市售的sfgfp质粒中sfgfp基因的151位、66位的氨基酸密码子突变为tag终止密码子，即得。[0071]实施例1二维红外光谱探针n3y的合成[0072]本实施例提供了二维红外光谱探针n3y的制备方法，合成路线如下：[0073][0074]制备方法如下：[0075]在0℃条件下，取3-氨基-l-酪氨酸·2hcl·h2o(2.50g,8.8mmol)加入0.5m hcl(28ml)的溶液中，然后缓慢加入nano2(0.724g,10.5mmol,用10ml h2o溶解)的水溶液。将所得的反应混合物在黑暗中于0℃搅拌10分钟。然后添加nan3(1.43g,21.9mmol,用10ml h2o溶解)溶液，并将混合物在于0℃搅拌1h，得到白色固体并过滤，得到产物非天然氨基酸(s)-2-氨基-3-(3-叠氮基-4-羟基-苯基)-丙酸(1.16g)，即得二维红外光谱探针n3y。[0076]esi-ms(m/z)：对于二维红外光谱探针n3y([m-h]+)的计算值为223；实测观察到223。esi-ms图谱如图1所示。[0077]将二维红外光谱探针n3y的1h-nmr进行鉴定，其1h-nmr图谱和产物化学位移如图2所表示，符合预测值。核磁结果表明，合成的n3y的纯度在90％以上。[0078]将二维红外光谱探针n3y的13c-nmr进行鉴定，其13c-nmr图谱如图3所表示。[0079]n3y在不同ph下的紫外吸收图谱：[0080]分别测定n3y在ph 4-10磷酸溶液下的紫外图谱，实验发现随着羟基的脱质子化效应，氨基酸的紫外吸收峰由294nm逐渐向306nm转变，如图4中(a)和(b)所示。根据306nm的紫外吸收强度，通过拟合得出n3y的pka为7.8。[0081]n3y在不同ph下的红外吸收图谱：[0082]实验测n3y的pka为7.8，n3y的叠氮基团位于酪氨酸羟基的邻位，羟基基团的质子化和脱质子化会影响叠氮基团的红外信号。当羟基脱质子化时，由于电子的转移效应会导致波谱的红移。实验分别测定1mm的n3y在不同ph的磷酸溶液下以及1n的naoh下的红外图谱信号，如图5中(a)和(b)所示。试验结果表明在ph等于4的磷酸溶液中，红外图谱的吸收峰在2115cm-1,随着ph的增大，羟基的质子进一步解离，红外吸收峰转移到2128cm-1,总共发生了13个波数的偏移。[0083]n3y在不同极性的溶剂下的红外吸收图谱[0084]非天然氨基酸的红外探针在不同极性的溶剂中会表现差异性的红外吸收图谱，本实验中水作为极性溶剂，而异丙醇作为非极性溶剂。分别测量n3y在水以及异丙醇中的红外吸收图谱，如图6所示，实验表明，在非极性溶剂中，红外吸收图谱相对极性溶剂中红移。可根据在相同溶液,不同的红外吸收峰来表征此探针所处环境的亲疏水性。[0085]综上，本实施例制备的非天然氨基酸n3y具有特殊的红外吸收峰，与同等浓度的叠氮苯丙氨酸的信号强度相同，而比氰基苯丙氨酸的信号强10倍。n3y红外吸收值随ph的变化而变化，范围为2115cm-1-2128cm-1。可以作为酪氨酸质子化的探针。且此非天然氨基酸n3y在不同极性的buffer中有展现不同的红外吸收峰，当其所处环境由极性环境向非极性环境转变时，红外吸收峰发生明显的红移，因此n3y插入到蛋白质去也可作为蛋白内部环境亲疏水变化的探针。且红外信号在2121cm-1左右，有效了避免了水和蛋白酰胺键的红外区域，且叠氮的信号强度大，能减少测量过程中蛋白的使用，红外吸收测定氨基酸的浓度为1mm，此浓度下蛋白一般都能稳定存在，这些优点使得其成为一个有效的蛋白红外探针。[0086]实施例2n3y合成酶的筛选[0087]鉴于n3y与氯代酪氨酸(cly)，溴代酪氨酸(bry)和碘代酪氨酸(iy)结构的相似性，本实验直接将现有公开的cly合成酶(rs),bry合成酶(rs)，和iy合成酶(rs)的基因分别与sfgfp151tag共同转化于bl21感受态中，此种合成酶都构建在pevol载体中，能直接进行蛋白质的表达。具体步骤如下：[0088](1)将三种合成酶的基因分别构建在pevol载体中。[0089](2)将步骤(1)中构建的pevol载体和sfgfp151tag共同转化于bl21感受态中中，放置于37℃培养箱过夜，分别挑单克隆于4ml的lb培养基中，培养基中分别加入终浓度为100μg/ml的氨苄(amp)抗生素和50μg/ml氯霉(cl)抗生素。放置于37℃摇床过夜培养。[0090](3)将菌液按照1:100的体积比例转接于100ml的lb培养基中，加入终浓度为100mg/l抗生素amp和25μg/ml氯霉素，37℃摇床培养至od等于1时，加入终浓度为1mm的n3y,0.2％(质量体积比)的阿拉伯糖(ara)，1mm的iptg于30℃过夜诱导。同时设置对照，即不加入n3y，仅加入终浓度0.2％的阿拉伯糖(ara)，1mm的iptg于30℃过夜诱导。[0091](4)收菌，以转速4000rpm离心15min，倒去上清，菌体加入5ml的lysis buffer重悬。[0092](5)将收集后的菌体用高压破碎机进行破碎，破碎后以15000rpm离心，取上清。[0093](6)将ni柱用lysis buffer洗三次后，与上清液结合1h,使用wash buffer洗两遍，除去结合的杂蛋白，最后用elution buffer洗脱目标蛋白，进行紫外吸收测量。[0094]结果如图7中(a)和(b)表明，cly合成酶和iy合成酶能识别n3y,表达出全长蛋白质。sfgfp151-n3y(表示插入n3y的sfgfp蛋白)的最大紫外吸收峰与sfgfpwt(野生型sfgfp)类似在484nm左右，且cly rs的插入效果要好于iy rs，因此，将cly rs其命名为n3y rs进行蛋白质插入的后续验证。[0095]n3y插入到sfgfp66tag的表达和鉴定[0096]为了进一步验证pevol-cly rs的有效性，将其与sfgfp66tag或sfgfp151tag共转于感受态bl21中，与上述步骤(3)-(6)相同。实验结果如图8的(a)和(b)表明，当n3y插入到sfgfp66位中，如图8的(a)中sfgfp66n3y，绿色荧光蛋白变为红色荧光蛋白，且sfgfp66n3y的紫外吸收峰的540nm,与野生型sfgfp相同，其紫外吸收峰随ph(图8的(b)中ph4.0-7.5)的变化而变化。[0097]如图9所示，未加入n3y的对照组无蛋白产生，66位的n3y替代了酪氨酸与苯丙氨酸和色氨酸形成发色团，叠氮基团加大了发色团的共轭效应，使得吸收光谱和发射光谱红移。sfgfp66n3y的最大发射峰在595nm。[0098]sfgfp66n3y的质谱鉴定[0099]q-tof得到蛋白的分子量为27750.27与预测相符。质谱结果表明n3y成功的插入了sfgfp中，如图10所示，荷质比如图11所示，n3y插入sfgfp的示意图如图29所示。[0100]sfgfp66n3y的红外吸收图谱鉴定[0101]结果如图12表明sfgfp66n3y的红外吸收峰在2115cm-1处，表明n3y所处的环境在蛋白质的疏水区域。红外结果表明n3y成功的插入到sfgfp中。[0102]n3y在使用过程中非常容易降解，而且对光十分敏感。进行蛋白表达和纯化全程需要避光处理。本实验中利用了n3y与cly和bry以及iy的酪氨酸结构的相似性直接用现有的合成酶进行了筛选，省去了筛选的流程，成功了筛选出了能将非天然氨基酸n3y插入到蛋白质中去的合成酶，且合成酶的插入效率高，目标蛋白单一。[0103]实施例3dddk的表达以及n3y的插入[0104]1、dddk突变体的构建[0105]dddk的基因由金斯瑞生物科技有限公司合成，构建在载体pet22b上，dddk的基因长度400bp，其基因序列和氨基酸序列如seq id no.1-2所示。[0106]将dddk的64位的酪氨酸分别突变为tag终止密码子和苯丙氨酸密码子,引物合成由上海生工有限公司合成，引物设计分别如seq id no.3-4和seq id no.5-6所示。[0107]以合成的dddk基因为模板，利用上述引物分别进行如下pcr反应，反应体系如下：[0108]primer-f(10μm):2μl；[0109]primer-r(10μm):2μl；[0110]template:2μl；[0111]fast pfu buffer(10*)：10μl；[0112]dntp mix(2.5mm):8μl；[0113]ddh2o:76μl；[0114]pcr的程序如下：[0115][0116]称取0.6g的琼脂糖，加入60ml的h2o，微波加热2min后，加入3μl的good view试剂，倒胶后，5h后取出pcr产物，取出5μl的反应产物加1μl的loading buffer,检测是否有目的条带。[0117]酶切：使用thermo的dpni酶过夜酶切模板，可以切除甲基化的模板，酶切体系如下：9μl的pcr反应物；1μl的dpni。[0118]转化：(1)从-80℃取出一支top 10感受态细胞，放入冰水中冰浴5min。[0119](2)将酶切产物取出放入感受态细胞中混匀。[0120](3)冰上放置15min。打开水浴锅，调温至42℃，取出1管4ml的lb培养基冰浴。[0121](4)42℃水浴锅热激1min后加入200ml的lb培养基。[0122](5)放入37℃恒温振荡培养箱中150rpm培养1h。[0123](6)4000rpm将转化好的感受态细胞离心2min后倒去上清，将沉淀悬浮后轻轻吹打后涂氨苄抗性平板。[0124](7)挑单克隆，送测序。[0125]质粒提取的步骤：[0126]将elution buffer放置在50℃金属浴上预热5min，加入40μl elution buffer，静置5min后以13000rpm/min的转速离心，洗脱质粒提取柱子上结合的质粒。将提取的质粒用1％的agar凝胶检测，检测结果如图13所示，dddk的基因在400bp左右，dddk突变体都是构建在pet22b载体上，pcr检测条带在5-6kb之间，且产物很纯，只有单个条带。获得的两种dddk突变体质粒，dddk的64位的酪氨酸突变为苯丙氨酸的突变体质粒记为dddk64f，dddk的64位的酪氨酸突变为tag终止密码子的突变体质粒记为dddk64tag。[0127]2、dddk以及dddk突变体的表达和纯化[0128](1)将dddk wt(野生型)，dddk64f和dddk64tag/n3y rs(表示dddk64tag的质粒和pevol-cly rs两种质粒)的质粒转化于bl21感受态细胞中。涂平板，dddk wt和dddk64f为amp抗性，dddk64tag/n3y rs为amp/cl抗性。dddk wt的质粒通过将dddk的基因构建在pet22b(+)载体上获得。[0129](2)分别将dddk wt，dddk64f和dddk64tag/n3y rs挑单克隆于4ml的lb培养基(含氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(25μg/ml))中，至37℃培养箱过夜。[0130](3)将菌液按照1:100的体积比例转接到100ml的lb培养基中于37℃摇床中培养，dddk wt，dddk64f摇至od600 0.8时加入1mm的iptg诱导，dddk64tag/n3y rs摇至od 600等于1时诱导，加入终浓度为1mm的n3y,0.2％(质量体积比)的阿拉伯糖(ara)，1mm的iptg于30℃诱导，且避光处理12h。[0131](4)收菌，4000rpm离心10min弃去上清，菌体加入8ml的lysis buffer重悬。[0132](5)使用高压破碎机破碎细胞，破碎后13000rpm离心30min后取上清。[0133](6)将上清液加入到ni-柱填料中，4℃结合1h。[0134](7)使用wash buffer 50ml洗去非特异性结合的杂蛋白。[0135](8)使用elution buffer 15ml将目标蛋白洗脱。[0136](9)将蛋白放置于3k的超滤管浓缩跑胶，dddk wt,dddk64f,dddk-64n3y(表示表达有非天然氨基酸n3y的dddk蛋白)经过sds page鉴定后，结果见图14，蛋白条带都比较纯，分子量都在17kd左右，且加入了非天然氨基酸n3y的实验组的蛋白表达浓度较高，100ml的培养基可以表达2mg的突变体的蛋白，可以用来后续的酶活检测以及红外检测。[0137]3、二甲基巯基丙酸(dmsp)和丙烯酸盐(acrylate)检测[0138]称取一定量的dmsp和acrylate溶解于水中定量至10mm,离心后分别取50μl上样lc-ms,a泵是水，b泵是乙腈，各加入千分之一体积比的三氟乙酸。方法设定为流速0.8ml/min,a泵92.5％(体积百分比),b泵7.5％(体积百分比)，紫外光检测205nm的吸收，共检测三个样品，样品1为10mm的dmsp,样品2为10mm的acrylate，样品3为10mm的dmsp加10mm的acrylate。[0139]检测结果见图15所示，dddk金属酶的反应底物为dmsp,反应产物为acrylate,反应底物和产物在205nm都有相应的吸收，但是反应底物和产物的出峰时间不同，dmsp的出峰时间在2.3min,而产物acrylate的出峰时间在3.4min，而且当底物和产物同时存在时，并不影响产物的出峰时间，因此，后续酶活实验可以用产物的积分面积来标定dddk酶的催化效率。[0140]4、dddk以及dddk突变体的紫外吸收和酶催化效率测量[0141]将dddk,dddk64f,和dddk64n3y蛋白样品浓缩后稀释定量，测定其紫外吸收光谱，分别取2μl的dddk以及dddk突变体换液至50mm的hepes(ph8.0),20mm的nacl溶液中，稀释100倍紫外定量，反应体系如下所示：[0142]总体积400μl：[0143]反应缓冲液50mm的hepes(ph8.0),20mm的nacl；[0144]酶浓度10μm；[0145]铁离子(fe2+或fe3+中的一种)浓度250μm；[0146]dmsp浓度10mm；[0147]+dtt/-dtt 1mm；[0148]反应体系中的酶最后添加，反应60s后用50％的h3po4终止反应。反应终止后取50μl的反应缓冲液离心，弃去沉淀后用过滤器过滤后上样，检测205nm的吸收值。[0149]dddk wt和dddk突变体的紫外吸收测量结果如图16所示，64位点的酪氨酸残基位于酶分子活性中心，且64位的酪氨酸，62的谷氨酸，58位的组氨酸，96位的组氨酸与铁离子形成配位键，且64位点酪氨酸对于酶催化反应必不可少，64位酪氨酸氨基酸能与活性中心的铁离子形成配位时在550nm左右可以形成配位键，当其突变为苯丙氨酸时，此吸收峰消失，当n3y插入64位点时，仍然能与铁离子形成配位，550nm的吸收峰仍然存在。因此，结果表明，当活性中心的酪氨酸变成n3y时，活性中心的结构并没有发生大的变化。[0150]dddk wt和dddk突变体在fe2+和fe3+的酶催化效率检测结果如图17所示，酶催化反应体系共设置6个样品，对于野生型dddk而言，实验结果表明当活性中心的铁为fe3+，催化效率低。当活性中心的铁为fe2+,催化效率是fe3+的10倍左右。当64位突变成苯丙氨酸时，催化活性完全丧失，而当64位插入n3y时，催化效率相对野生型有降低，但是fe2+结合的蛋白酶的催化效率也是明显高于fe3+结合的催化效率。[0151]5、dddk wt和dddk-64n3y蛋白一维红外测量[0152]dddk wt蛋白样品和dddk-64n3y的蛋白样品，分别浓缩至1mm后测量一维红外。取7.5μl蛋白溶液加入样品池，标记为sample，右边加入7.5μl浓缩管中的buffer为control，spacer厚度大小选用100μm，装样时避免气泡的产生，测量时先测定对应溶液的信号，测量样品时调入对照组信号，光斑面积选用3mm,重复128次测量。[0153]测量结果如图18所示，显示的是蛋白红外的全谱，dddk-64n3y相对于dddk wt有两个红外吸收峰，主峰在2118cm-1,第二吸收峰在2085cm-1。蛋白的红外吸收峰对其没有明显的影响。因此n3y作为红外探针用于蛋白研究不受水信号以及蛋白本身信号的干扰。[0154]6、dddk-64n3y-fe3+和dddk-64n3y-fe2+蛋白样品制备[0155]dddk-64n3y蛋白样品浓缩后透析，透析buffer(50mm tris-hcl,ph 6.5,500mm edta,50mm nacl)配置4l，于4℃冰箱透析4天后去除结合在蛋白中的金属离子。整个透析过程避光处理。透析完成后取出蛋白样品，换液至缓冲液中(50mmtris-hcl,ph 6.5,100mm nacl),将蛋白稀释至10μm后，加入100μm的三氯化铁孵育过夜后，用蛋白ni-柱纯化出去多余的金属离子,样品浓缩后即为dddk-64n3y-fe3+。[0156]dddk-64n3y-fe3+分别加入5mm和10mm的保险粉(msds)(在本发明中简称为dt),测量紫外吸收，当550nm的紫外吸收峰完全消失，即可制得dddk-64n3y-fe2+的样品。紫外吸收曲线如图19所示，当n3y与活性中心的fe3+配位时会形成550nm的吸收峰，当加入5mm的还原剂dt时dddk-64n3y-fe3+，fe3+部分还原成fe2+,当加入dt浓度为10mm时，fe3+完全被还原，表现为550nm吸收峰完全消失。此时蛋白的浓度为500μl。[0157](1)dddk-64n3y-fe3+和dddk-64n3y-fe2+的ftir测量[0158]将dddk-64n3y-fe3+浓缩至1mm时，取7.5μl蛋白溶液加入样品池，标记为sample，右边加入7.5μl浓缩管中的buffer为control，spacer厚度大小选用100μm，装样时避免气泡的产生，测量时先测定对应溶液的信号，测量样品时调入对照组信号，光斑面积选用3mm,重复128次测量。dddk-64n3y-fe3+的样品加入100mm的dt后，蛋白样品由灰绿色变为无色，此时fe3+还原成fe2+，一维红外测量过程如上所示。[0159]测量结果如图20所示，dddk-64n3y-fe3+和dddk-64n3y-fe2+的一维红外，结果表明fe2+结合的结构谱图更宽，说明fe2+的结构更加的非均一性，推测为fe2+配位的活性中心的结构更加的松散。[0160](2)dddk-64n3y-fe3+和dddk-64n3y-fe2+的二维红外(2d-ir)测量[0161]以2100cm-1为中心且具有2.4uj能量的ir脉冲被分成探针(～5％)和泵脉冲(～95％)。泵脉冲被送入自制的脉冲整形器系统。两个泵浦脉冲和探测脉冲之间的等待时间由计算机控制的平移台扫描。泵浦和探针脉冲聚焦在样品上，并且生成的信号被cmos相机上转换和收集。两个泵浦脉冲之间的时间延迟从0到2ps扫描，步长为24fs，干涉图进行傅里叶变换。每隔100fs提取一幅二维红外图谱，提取斜率后做曲线。[0162]结果如图21-22所示，如前述一维红外中显示dddk-64n3y有两个吸收峰，一个是2118cm-1,另一个是2085cm-1,而2118cm-1和2085cm-1非对角区域并没有耦合的峰出现，因此这两个峰之间没有相互转换，认为2085cm-1是费米共振的峰。图21中的(a)和(b)分别显示fe3+和fe2+的二维红外图谱，主要看对角线区域的吸收峰，可以发现fe3+对角线峰的斜率比fe2+对角线峰的斜率达到平衡所需要的时间更少。将每隔100fs的斜率提取做拟合曲线可得fe2+decay的更快，τi为281fs.而fe3+的decay时间为900fs。因此得出fe2+所处的蛋白活性中心的柔性大于fe3+结合的结构。[0163]综上，将n3y替代金属酶dddk中的活性中心酪氨酸残基，模拟了野生型dddk的催化反应。当活性中心的氨基酸残基换成苯丙氨酸时，活性完全消失。因此，n3y作为酪氨酸的类似物未来可以应用于研究各种酪氨酸参与的反应，如质子传递，电子传递，磷酸化等。可以利用红外信号的变化来研究蛋白酶构象的变化。而dddk催化的反应中铁离子价态的差异导致活性巨大差异的原因可通过与铁离子配位的n3y红外信号的变化来表征通过用n3y替代了金属酶dddk的酪氨酸残基，利用n3y一维红外和二维红外信号的变化解释了dddk-64n3y-fe2+相对dddk-64n3y-fe3+活性更高的原因，利用二维红外可以捕捉到蛋白在fs范围时间尺度的信号变化，测定了fe2+和fe3+不同的decay(衰减)时间，得出结论fe2+结合的活性中心的柔性更大，更加便于底物的结合和产物的生成。[0164]实施例4盐酸胍对dddk-64n3y-fe2+活性中心柔性的研究[0165]本实施例通过在dddk活性中心标记非天然氨基酸n3y,测定在不同变性剂浓度下的色氨酸荧光的变化来表征dddk整体结构的变化。通过一维红外以及二维红外来表征蛋白活性中心的柔性。[0166]1、盐酸胍对dddk-64n3y-fe2+的催化活性的影响[0167]称取一定量的盐酸胍，配置成6m的母液1l,dddk-64n3y-fe3+换液至50mm的hepes(ph 8.0),20mm的nacl溶液中，将蛋白先稀释100倍，再测紫外，酶活测量体系如下所示：[0168]总体积400μl：[0169]反应缓冲液50mm的hepes(ph 8.0),20mm的nacl；[0170]dddk-64n3y浓度10μm；[0171]fe3+浓度250μm；[0172]dmsp浓度10mm；[0173]+dt 5mm；[0174]盐酸胍的浓度分别设置为0、100、200、300、500mm；[0175]上述反应体系中的酶最后添加，反应60s后用50％(wt)的h3po4终止反应。反应终止后取50μl的反应缓冲液离心,弃去沉淀后用过滤器过滤后上样，检测205nm的吸收值,将3-4min的紫外吸收峰积分求取面积。[0176]测量结果如图23所示，实验结果表明，加入500mm的盐酸胍后，dddk-64n3y-fe2+的活性几乎完全丧失。加入500mm的盐酸胍后，整体结构无明显的变化。[0177]2、盐酸胍对dddk-64n3y-fe2+整体结构的影响[0178]将dddk-64n3y-fe2+定量至100μm，盐酸胍的浓度采用20mm、200mm、500mm、1m、2m、3m,反应体积为100μl,将盐酸胍加入终浓度为20μm的蛋白样品中反应半小时后测定色氨酸荧光。用290nm的激发光激发，测定其吸收图谱作图。[0179]结果如图24所示(该图中的dddk-64n3y-fe2+简写为dddk64n3y)，实验结果表明，加入低浓度的盐酸胍(0-500mm)时色氨酸的荧光并没有发生大的变化，表明低浓度的盐酸胍，蛋白的整体结构并没有发生大的变化，当盐酸胍的浓度为3m时，由于蛋白整体结构的变化，色氨酸由疏水区域转移暴露到溶液中，色氨酸荧光会发生红移。[0180]3、盐酸胍对dddk-64n3y-fe2+的一维红外的影响测定[0181]设置五个测量样品，盐酸胍的浓度0、100mm、500mm、1m、3m,将盐酸胍缓慢滴加入与低浓度的dddk-64n3y-fe3+蛋白样品中，并且加入100mm的dt,处理半个小时后，用高速离心机以13000rpm离心一小时后测定一维红外。取7.5μl蛋白溶液加入样品池，标记为sample，右边加入7.5μl浓缩管中的buffer为control，spacer厚度大小选用100μm，装样时避免气泡的产生，测量时先测定对应溶液的信号，测量样品时调入对照组信号，光斑面积选用3mm,重复128次测量。[0182]结果如图25所示，实验结果表明加入不同浓度的盐酸胍后，其ftir曲线并没有大的改变。表明高浓度的盐酸胍对蛋白质结构的蛋白的影响用ftir光谱看不到明显差别。[0183]dddk-64n3y-fe2+在不同盐酸胍浓度下的振动decay曲线如图26所示，实验表明，加入高浓度的盐酸胍后，能看出dddk-n3y-fe2+活性中心变的更加的刚性，表现为衰减越快。[0184]4、盐酸胍对dddk-64n3y-fe2+的二维红外的影响测定[0185]设置五个测量样品，盐酸胍的浓度0、100mm、500mm、1m、3m,将盐酸胍缓慢滴加入与低浓度的dddk-64n3y-fe3+蛋白样品中，并且加入100mm的dt,处理半个小时后，上样。每隔500fs提取对角线吸收峰斜率作图，作图后拟合算出decay时间。[0186]二维红外图谱如图27所示，上图是dddk-64n3y-fe2+在不同变形剂下的二维红外图谱，设置的盐酸胍的浓度分别为0mm,100mm,500mm,1m,收集图谱时，分别每隔100fs的时间梯度采集。图谱说明加入不同浓度的盐酸胍时，二维红外对角线都能出现明显的二维红外峰，图片分别为0，50以及500fs的二维红外，从二维红外图谱提取中心线斜率作图可得结果。实验结果表明，当加入低浓度的盐酸胍时，一维红外曲线朝着疏水区域移动，当加大盐酸胍浓度时，一维红外曲线朝着亲水区域移动。表明加入了盐酸胍之后，蛋白活性中心的水分子有变化。二维红外曲线表明，随着盐酸胍浓度的增加，dddk-64n3y-fe2+的二维红外光谱的中心线斜率decay越来越快，说明当加入盐酸胍之后，蛋白活性区域由柔性变为刚性的结构。[0187]dddk-64n3y-fe2+和dddk-64n3y-fe3+的振动寿命如图28所示，实验结果表明，当活性中心的铁离子的价态由fe3+变为fe2+，叠氮的振动寿命没有任何变化，因此证明，在不同金属价态下，二维红外曲线的差异主要是由于叠氮基团所出周围结构的变化相关，而不是由于铁离子价态的变化。[0188]综上，本实施例中测定了加入低浓度的盐酸胍后，蛋白活性完全丧失而蛋白的整体构象并没有发生变化，说明活性中心的结构的对变性剂更加的敏感，而一维红外的数据解释了在低浓度变性剂下活性中心疏水环境的变化可能导致了活性了丧失，而活性的丧失源于活性中心柔性的变化，用二维红外数据表明，加入变性剂后，二维红外对角线斜率的decay速度越快，表现为蛋白活性中心柔性的降低。[0189]实施例5[0190]为了进一步了解所观察到的ffcf弛豫变化的分子机制，对1)溶剂化dddk-64n3y-fe(ii)，2)溶剂化dddk-64n3y-fe(iii)以及3)1mgdnhcl水溶液中的dddk-64n3y-fe(ii)(有关详细信息，请参见支持信息)进行了200ns的分子动力学模拟。然后，对所有三个体系，使用从头预测图(abinitiomap)将瞬时叠氮基频率与环境施加的电场相联系的方式计算了轨迹上每1,000,000md快照中叠氮基不对称拉伸振动的瞬时频率ωtotal(t)(有关详细信息，请参阅支持信息)。图33a和33d分别示出了所有这三个体系的ωtotal(t)的分布和时间相关函数。由于电场的叠加性质，ωtotal(t)可以分解为蛋白质电场ωprotein(t)和水电场ωwater(t)。它们的分布和时间相关函数分别如图33b，33c，33e和33f所示。[0191]仿真模型的构建[0192]以具有fe3+的dddk酶的晶体结构为结构基础，构建仿真模型。缺失的侧链氨基酸由whatif online server添加。为构建fe2+-蛋白质复合体，fe3+直接替换为fe2+。对于dddk-64n3y-fe3+/fe2+体系，叠氮基通过修改y64手动建模得到。对于dddk-64n3y-fe3+/fe2+体系，通过将铁蛋白复合体置于12面体盒子，该盒子的边缘距离蛋白表面至少用tip3p水分子溶解复合物，如果需要，添加抗衡离子以中和系统。对于dddk-64n3y-fe2+-1m盐酸胍体系，将200个胍分子和200个氯离子随机添加到盒子中，添加到体系中前，先用hf/6-31g*优化单个胍分子的构象。[0193]仿真参数和程序[0194]fe3+/fe2+的lennard-jones parameters出自a)p.li,b.p.roberts,d.k.chakravorty,k.m.merz,j.chem.theory comput.2013,9,2733-2748；b)p.li,l.f.song,k.m.merz,j.phys.chem.b 2015,119,883-895。叠氮基团的键合参数取自pieffet等的参数化(g.pieffet,p.a.petukhov,j.mol.model.2009,15,1291-1297)。通过general amber force field生成叠氮基和共轭环之间连接区域的其他缺失键合参数。胍键合参数的构建参照amber99sb-ildn力场中精氨酸的参数(k.lindorff-larsen,s.piana,k.palmo,p.maragakis,j.l.klepeis,r.o.dror,d.e.shaw,proteins 2010,78,1950-1958.)通过抑制静电势方法获得去质子化的n3y和胍的部分电荷(a)c.i.bayly,p.cieplak,w.cornell,p.a.kollman,j.phys.chem.1993,97,10269-10280；b)w.d.cornell,p.cieplak,c.i.bayly,p.a.kollman,j.am.chem.soc.1993,115,9620-9631.)，所述抑制静电势方法遵循与amber force field类似的步骤。其他参数取自amber99sb-ildn force field。[0195]在完全放松md simulations系统之前，执行了最小化和平衡的多个步骤。特别是，首先将铁蛋白复合物的重原子施加了强约束，同时进行了10000-steps的能量最小化。之后，将整个系统的能耗降至最低，而无需再限制10000-steps。接下来，在nvt ensemble下对该系统进行了500ps的仿真，nvt ensemble对复合物的所有重原子都具有强大的位置约束包括在最初的200ps内从50k到298k的温度退火。接下来是在nvt ensemble下(t＝298k)的另一个500ps的的位置限制。随后，在npt ensemble下(t＝298k，p＝1bar)对具有的重原子执行1ns位置限制。位置受限仿真的最终配置用于启动dddk-64n3y-fe2+和dddk-64n3y-fe3+的100ns npt(t＝298k，p＝1bar)仿真。用于dddk-64n3y-fe(ii)-1m盐酸胍的模拟，在位置受限的仿真之后，执行了一个1000ns的仿真。在模拟中，我们应用了v-rescale恒温器(g.bussi,d.donadio,m.parrinello,j.chem.phys.2007,126,014101)和parrinello-rahman恒压器(m.parrinello,a.rahman,j.appl.phys.1981,52,7182-7190)，其耦合时间常数分别为0.1ps和2.0ps。超过截止值的远距离静电相互作用用particle-mesh ewald方法处理(u.essmann,l.perera,m.l.berkowitz,t.darden,h.lee,l.g.pedersen,j.chem.phys.1995,103,8577-8593)。被用作lennard-jones相互作用的截止点。比邻列表每10步更新一次。使用2.0fs的积分时间步长，并应用lincs算法约束所有键。每50ps保存一次快照。所有模拟都是使用gromacs 2016.4执行的。[0196]首先通过将md快照对准基于bi-bixβ-sheets cα原子的晶体结构来计算bi-bixβ-sheets(残基id从23到112)上cα原子的均方根偏差，排除md轨迹上的环区域(残基id从31到40)(图30和图31a).对于dddk-64n3y-fe3+和dddk-64n3y-fe2+体系，发现，经过20ns的仿真，系统具有良好的平衡性。对于dddk-64n3y-fe2+-1m盐酸胍体系，发现一个胍在约720ns处扩散到活性位点(图31b)，因此当胍在活性位点750ns后，选择了md构象，为下面的频移计算启动仿真。[0197]频移计算[0198]为了计算频移，在系统达到平衡后使用配置启动9×1ns仿真。对于dddk-64n3y-fe3+和dddk-64n3y-fe2+体系，选择了80ns，90ns和100ns的构象，并从每种构象中注入了3个1ns的模拟。对于dddk-64n3y-fe2+-1m盐酸胍体系，选择了在750ns，850ns和950ns处有胍的活性构象，并从每个构象开始进行了1ns的模拟。用于1ns模拟的md参数与上述“模拟参数和过程”小节中说明的参数相同，除了md快照每10fs保存一次。按照choi等人(j.-h.choi,k.-i.oh,m.cho,j.chem.phys.2008,129,174512.)所使用的相似方案，计算了n3y中叠氮基团的频移。叠氮基频移δv与它所经历的电场成正比：[0199][0200]和是n1氮原子处的三个电场矢量，该符号同时适用于n2和n3氮原子。and是分布式偶极子的stark tuning rates，其中的值是先前确定的(j.-h.choi,k.-i.oh,m.cho,j.chem.phys.2008,129,174512.)在这里用：i.oh,m.cho,j.chem.phys.2008,129,174512.)在这里用：andmd构象根据坐标系进行重新定向，在该坐标系中，三个氮原子沿z轴排列，n1原子停留在原点，然后计算电场矢量(图32)。用于电场计算的原子部分电荷取自用于md模拟的力场参数。为了计算特定环境分量对频率偏移的贡献，我们在计算中考虑了构成特定环境的分子的部分电荷。[0201]频移的直方图(图33a-c)是使用来自多个1ns模拟的所有md构型计算得出的。ffcf(图33d-f)针对每个单独的1ns模拟计算如下，并在不同轨迹上取平均值：[0202][0203]其中n等于单个1ns轨迹中md构象的总数，k是用于研究ffcf的滞后时间。δvt andδvt+k是在时间点t和t+k处使用md构型计算的频移，t的范围为0到第(n-k)个时间点。μandσ2是轨迹上所有md构象的频移的均值和方差。[0204]综上，与一维ftir实验(实施例4)中的观察结果一致，dddk-64n3y-fe(iii)和dddk-64n3y-fe(ii)-1mgdnhcl中ωtotal(t)的分布相对于dddk-64n3y-fe(ii)产生红移。并且这种位移主要是由蛋白质ωprotein(t)引起的。与实验结果一致，dddk-64n3y-fe(ii)的ffcfωtotal(t)(t)衰减慢于dddk-64n3y-fe(iii)。添加胍(dddk-64n3y-fe(ii)-1mgdnhcl)会加速ffcf的衰减。此外，在所有三个体系中，ωprotein(t)的ffcf几乎相同，而ωwater(t)的ffcf则明显不同。因此，我们的仿真支持了如图33所示：实验中ffcf衰减行为的上述变化确实是由dddk活性位点中水氢键动力学的差异引起的。[0205]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。









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