用于定量检测金黄色葡萄球菌蛋白A的ELISA试剂盒及检测方法与流程

测量装置的制造及其应用技术ph 7.4的pbs定容即可形成所述抗体贮存液。11.优选的，所述pbs，即0.15m ph 7.4的磷酸盐缓冲液具体成分如下:[0012][0013]称取上述原料后，加双蒸水定容至1000ml，高压灭菌后，贮存于4℃冰箱保存。[0014]优选的，所述elisa专用稀释液为：0.15m ph 7.4pbs混合总体积百分比0.1％吐温20。[0015]优选的，所述elisa包被缓冲液为1.59g na2co3和2.93g nahco3加双蒸水定容至1l，高压灭菌而成。[0016]本发明还提出一种用于定量检测金黄色葡萄球菌蛋白a的酶联免疫法，包括以下步骤：[0017]步骤1：包被，以包被缓冲液将鸡抗蛋白a抗体稀释到工作浓度0.5-10μμg/ml，加入到酶标板，放入湿盒，4℃孵育过夜，用洗涤缓冲液洗涤，拍干；[0018]步骤2：抗原配制，向所述elisa微孔板中加入步骤1中工作浓度的蛋白a溶液，孵育1.5h,用浓缩洗涤液洗涤，拍干；[0019]步骤3：检抗配制，向所述elisa微孔板中加入工作浓度的兔抗蛋白a酶标抗体，孵育1h,用浓缩洗涤液冲液洗涤，拍干；[0020]步骤4：显色，向所述elisa微孔板中先后各加入elisa显色底物a液和显色底物b液，37℃避光显色10-15min；[0021]步骤5：终止，向所述elisa微孔板中每孔加入终止液，终止反应；[0022]步骤6：读数，450nm波长下，利用elx800酶标仪读取吸光度值。[0023]进一步的，在步骤1中，所述酶标板每孔加入100μl的工作浓度蛋白a溶液；[0024]在步骤2中，所述elisa微孔板中每孔加入100μl的工作浓度蛋白a溶液，环境温度为37℃；[0025]在步骤3中，所述elisa微孔板中每孔加入100μl的工作浓度的兔抗蛋白a酶标抗体，环境温度为37℃；[0026]在步骤4中，向所述elisa微孔板中先后各加入50μl的elisa显色底物a液和显色底物b液，37℃避光显色10-15min；[0027]在步骤5中，向所述elisa微孔板中每孔加入50μl 1m h2so4作为终止液，终止反应。[0028]与现有技术相比，本发明的优势之处在于：1.样本加热处理时间短，且处理方法较解离buffer法，更可靠，实验重复性好，普遍适用于不同的抗体纯化样本检测；[0029]2.稳定性方面37℃加速破坏72h，能够达到不低于70％的活性；[0030]3.标准曲线能够稳定在0-200pg/ml浓度区间；批内批间均小于10％；[0031]4.灵敏度可以达到小于3pg/ml；附图说明[0032]图1为本发明实施例中通过双抗夹心elisa法检测反应值绘制的标准曲线。具体实施方式[0033]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案作进一步地说明。[0034]材料与方法[0035]1.1.1实验仪器[0036][0037][0038]1.1.2试剂[0039]稳定剂；[0040]牛血清白蛋白粉末，无蛋白酶/dnase,ph7.0；[0041]海藻糖，na2co3，nahco3，kh2po4，k2hpo4，na2hpo4·12h2o,吐温20，nacl，kcl，洗液，显色a液，显色b液，终止液[0042]elisa包被缓冲液‑‑‑‑(ph9.6 0.05m碳酸盐缓冲液)[0043]标准品蛋白：金黄色葡萄球菌蛋白a；[0044]包被抗体：鸡抗蛋白a；[0045]检测抗体：兔抗蛋白a-hrp；[0046]na2co3 1.59g；[0047]nahco3 2.93g；[0048]加双蒸水定容至1l。高压灭菌备用。[0049]封闭液：[0050]0.05％-0.5％的牛血清白蛋白，溶解在pbs中；[0051]0.15m ph 7.4磷酸盐缓冲液(pbs)配制方法[0052][0053]加双蒸水定容至1000ml。[0054]所有配制好的溶液高压灭菌后，贮存于4℃冰箱保存。[0055]0.01m ph 7.4磷酸盐缓冲液(pbs)配制方法：[0056]pbs(135mm nacl,2.7mm kcl，1.5mm kh2po4，8mm k2hpo4，ph 7.2)[0057][0058]溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l。保存于4℃冰箱中即可。[0059]缓冲液：[0060]2％bsa+0.1％tween 20用0.15m pbs溶解(或者封闭液中加入0.1％tween20)[0061]1.2实验方法[0062]1.2.1实验步骤[0063]双抗夹心elisa法是一种灵敏度较高的elisa法，本实验中夹心elisa法操作步骤如下：[0064]步骤1：包被：以包被缓冲液将chicken anti spa抗体稀释到工作浓度，加入到酶标版，每孔100l，放入湿盒，4℃孵育过夜，用洗涤缓冲液洗涤，拍干；[0065]步骤2：封闭：每孔加入480μl封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤，拍干；[0066]步骤3：向微孔板中加入工作浓度的spa溶液，每孔100μl,37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液洗涤，拍干；[0067]步骤4：向微孔板中加入工作浓度的rabbit anti-spa-hrp酶标抗体，每孔100μl，37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液洗涤，拍干；[0068]步骤5：显色：向微孔板中加入50l显色底物a液和显色底物b液各50μl，避光显色10-15min；[0069]步骤6：终止：每孔加入50μl 1m h2so4，终止反应；[0070]步骤7：读数：450nm波长下，利用elx800酶标仪读取吸光度值。[0071]1.2.2、spa标准曲线的绘制[0072]1.2.2.1标准品的确定[0073]标准品的选择是试剂盒质量保证的重要组成。为了选出合适的标准品，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，分别加上启泰和博奥森的spa，并通过双抗夹心elisa法检测反应值，以确定最佳的标准品。具体操作步骤如下：[0074](1)包被:用包被缓冲液稀释chicken anti-spa抗体母液至工作浓度10g/ml和1g/ml，每个微孔板加入100l,将微孔板连同板架一起放入湿盒中，4℃，孵育过夜；[0075](2)封闭:每孔加入480l封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；[0076](3)向微孔板中分别加入工作浓度为100ng/ml的spa溶液。每孔100l，37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液5次，拍干；[0077](4)向微孔板中加入工作浓度的rabbit anti spa酶标抗体，每孔100l,37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液5次，拍干；[0078](5)显色:向微孔板中加入50μl显色底物a液和显色底物b液各50l，避光显色10-15min；[0079](6)终止:每孔加入50l 1m h2so4，终止反应；[0080](7)读数450nm下，利用elx800酶标仪读取吸光度值。[0081]1.2.2.2、包被抗体及检测抗体浓度的确定[0082]包被抗体及检测抗体的工作浓度是elisa试剂盒一个重要的参数，为了摸索合理的包被抗体及检测抗体浓度，本实验通过棋盘法来确定检测抗体及包被抗体的最适工作浓度。[0083]包被抗体浓度的确定，具体操作步骤如下：[0084](1)包被：用包被缓冲液稀释chicken anti spa抗体母液至终浓度为1μg/ml和0.5μg/ml，每个微孔板加入100μl,将微孔板连同板架一起放入湿盒中，4℃，孵育过夜；[0085](2)封闭：每孔加入480μl封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；[0086](3)向微孔板中加入工作浓度的spa溶液，设置三个不同的蛋白浓度：2.5ng/ml，0.05ng/ml及0ng/ml。0ng/ml的微孔加入相同体积的elisa稀释液每孔100μl，37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液5次，拍干；[0087](4)向微孔板中加入浓度为0.2μg/ml的rabbit anti spa酶标抗体，每孔100μl,37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液5次，拍干；[0088](5)显色：向微孔板中加入50μl显色底物a液和显色底物b液各50μl，避光显色10-15min；[0089](6)终止：每孔加入50μl 1m h2so4，终止反应；[0090](7)读数450nm波长下，利用elx800酶标仪读取吸光度值。[0091]检测抗体浓度的确定[0092]检测抗体浓度是elisa试剂盒另外一个重要的参数，根据上一步所确定的最佳包被抗体浓度，在保持包被浓度不变的前提下，包被不同浓度的检测抗体，再通过双抗夹心elisa法检测反应值，以确定最佳的检测抗体浓度。具体操作步骤如下：[0093](1)包被：根据上一步所确定的最佳包被抗体浓度，用包被缓冲液稀释chickenanti spa抗体母液至工作浓度0.5μg/ml，每个微孔板加入100μl，将微孔板连同板架一起放入湿盒中，4℃，孵育过夜；[0094](2)封闭：每孔加入480μl封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；[0095](3)向微孔板中加入工作浓度的spa溶液，设置三个不同的蛋白浓度：2500pg/ml，500pg/ml及0pg/ml。0pg/ml的微孔加入相同体积的elisa稀释液每孔100μl，37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；[0096](4)向微孔板中加入工作浓度的rabbit anti spa酶标抗体，每孔100μl,37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液5次，拍干；[0097](5)显色：向微孔板中加入显色底物a液和显色底物b液各50μl，避光显色10-15min；[0098](6)终止：每孔加入50μl 1m h2so4，终止反应；[0099](7)读数：450nm波长下，利用elx800酶标仪读取吸光度值。[0100]1.2.2.3、标准品浓度梯度的确定[0101]标准品浓度梯度的确定是获得较为理想的标准曲线的前提。根据前两步所确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置9个不同浓度的标准品梯度：2500pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml，10pg/ml，5pg/ml及0pg/ml。并通过双抗夹心elisa法检测反应值，以确定最佳的标准品浓度梯度。具体操作步骤如下：[0102](1)包被：用包被缓冲液稀释chicken anti spa抗体母液至工作浓度2.0μg/ml，每个微孔板加入100μl，将微孔板连同板架一起放入湿盒中，4℃，孵育过夜；[0103](2)封闭：每孔加入480μl封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤4次，拍干；[0104](3)向微孔板中分别加入工作浓度为2500pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml,100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml，10pg/ml，5pg/ml及0pg/ml的spa溶液。其中0pg/ml的spa溶液设置一个复孔。0pg/ml的微孔加入相同体积的elisa稀释液，每孔100μl，37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液5次，拍干；[0105](4)向微孔板中加入工作浓度的rabbit anti spa酶标抗体，每孔100μl,37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液5次，拍干；[0106](5)显色：向微孔板中加入显色底物a液和显色底物b液各50μl，避光显色10-15min；[0107](6)终止：每孔加入50μl 1m h2so4，终止反应；[0108](7)读数：450nm下，利用elx800酶标仪读取吸光度值。[0109]1.2.3、spa检测试剂盒qc分析[0110]1.2.3.1线性分析[0111]以spa作为原材料，用elisa稀释液按1:10，1:100进行梯度稀释，利用双抗夹心elisa计算各个稀释倍数下的样本浓度，以评估该试剂盒是否具有良好的线性。[0112]1.2.3.2、回收率分析[0113]以spa作为原材料，利用本实验室配制的buffer1，buffer2，buffer3(即cho k1无血清培养基)和buffer4(即10倍稀释的cho k1无血清培养基)稀释spa，使其终浓度为800pg/ml和200pg/ml。elisa检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的od计算样本浓度，并分别与起始浓度800pg/ml和200pg/ml比较，计算回收率。回收率计算方法如下：[0114]回收率＝实际计算的浓度/200pg/ml×100％。[0115]1.2.3.3、批内批间分析[0116]包被三个不同批次的chicken anti spa微孔板(每个批次5条共计40个微孔)，其中三条用于绘制标准曲线，其余16孔用于检测样本的浓度。用双抗夹心elisa法检测样本与抗原抗体反应值，并计算浓度，以评估本试剂盒的批内批间差。批内批间差计算公式如下：[0117]cv％＝sd/x×100％，其中sd为浓度标准差，x为浓度平均值。[0118]1.2.3.4、灵敏度分析[0119]取出40孔已经包被了工作浓度的chicken anti spa的微孔板，室温放置20min。其中三条用于绘制标准曲线。其余16个微孔中加入elisa稀释液，利用双抗夹心elisa法，检测反应值，以计算本试剂盒的灵敏度。灵敏度计算方法如下：[0120]读取16个微孔的od值，计算16个od值的方差和平均值。将od平均值加上两倍的方差，得到一个新的od值，然后利用所得的od代入到标准曲线的方程中，所计算出来的浓度即为本试剂盒的灵敏度。[0121]1.2.3.5、特异性分析[0122]以本实验室纯化的大肠杆菌宿主细胞蛋白、cho hcp、牛igg和bsa作为检测样本，利用双抗夹心elisa法检测交叉反应性，以评估本试剂盒包被抗体和检测抗体的特异性。[0123]1.2.3.6、稳定性分析[0124]微孔板稳定性分析[0125](1)包被10条chicken anti spa，封闭，拍干后，向每个微孔板中加入100μl稳定剂，37℃，孵育2h，轻轻甩掉微孔中的液体。并用真空包装机，真空封闭。[0126](2)取样，将微孔板放入37℃烘箱，进行破坏性实验，每隔两天取出两条微孔板，置于放入4℃冰箱，保存备用。2天、4天后，利用双抗夹心elisa法检测抗原抗体反应值，以评估本试剂盒中包被抗体的微孔板的稳定性。[0127]检测抗体及spa抗原稳定性分析[0128](1)利用本实验室自主研发的抗原抗体稳定剂，配制rabbit anti spa辣根过氧化没标记的检测抗体及spa抗原的100倍浓缩液，置于安瓿瓶中，封口备用。[0129](2)将浓缩液放入37℃恒温培养箱，进行破坏性实验。以后分别在0h，24h，48h，72h，96h，120h和144h后，取样，立即放入-20℃保存备用。[0130]八天后，采用双抗夹心elisa法，检测抗原抗体反应吸光值，以评估本试剂盒中抗原抗体的稳定性。[0131]二、结果与讨论[0132]2.1标准曲线的绘制[0133]2.1.1标准品的确定[0134]在包被抗体和检测抗体浓度确定的情况下，通过检测相同浓度的spa，检测最后的od值，取od值高的作为本试剂盒的标准品。[0135][0136]如上表所示，在包被抗体和检测抗体浓度一定时，相同浓度的启泰spa比博奥森spa所做出的最后od值稍微高一点。因此最终确定启泰的spa作为本试剂盒最后的标准品。[0137]2.1.2包被抗体和检测抗体浓度的确定[0138](1)在检测抗体浓度和标准品浓度固定的情况下，通过比较用不同浓度的包被抗体实验后的od值，取最终od值区分度较好，本底较低的包被抗体浓度作为本试剂盒的包被抗体浓度。[0139](2)在包被抗体浓度和标准品浓度固定的情况下，通过比较用不同浓度的检测抗体实验后的od值，取最终od值区分度较好，本底较低的检测抗体浓度作为本试剂盒的检测抗体浓度。[0140][0141]如上表所示，[0142](1)在spa抗原浓度一定时，在相同spa检测抗体浓度下，1μg/ml的spa包被抗体的板最终检测的od值比0.5μg/ml的spa包被抗体的板最终检测的od值稍高。但是1μg/ml的spa包被抗体的板最终检测od值的本底值比0.5μg/ml的spa包被抗体的板最终检测od值本底值要高，所以最终选择0.5μg/ml作为本试剂盒spa包被抗体的浓度。[0143](2)在spa抗原浓度一定时，在相同spa包被抗体浓度下，0.1μg/ml的spa检测抗体的板最终检测的od值比50ng/ml的spa检测抗体的板最终检测的od值稍高。但是0.1μg/ml的spa检测抗体的板最终检测od值的本底值比50ng/ml的spa检测抗体的板最终检测od值本底值要高，所以最终选择50ng/ml作为本试剂盒spa检测抗体的浓度。[0144]2.1.4标准品浓度梯度的确定[0145]根据前两步所确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置9个不同浓度的标准品梯度：2500pg/ml,1000pg/ml,500pg/ml,100pg/ml,50pg/ml,25pg/ml,10pg/ml,5pg/ml及0pg/ml。其中0pg/ml设一个复孔，并通过双抗夹心elisa法检测反应值，以确定最佳的标准品浓度梯度。[0146][0147]如上表所示，读板后发现在1ng/ml到0pg/ml的标准品浓度区间内最终od值有很好的区分度，且od值不会显得特别高，因此最后选取1ng/ml到0pg/ml之间的浓度作为最终的标准品浓度梯度。[0148]2.1.5标准曲线的确定[0149]根据前三部确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，以及他们所能检测的标准品浓度范围，在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置10个不同浓度的标准品梯度：1000pg/ml，400pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml，12.5pg/ml，6.25pg/ml，3.125pg/ml以及0pg/ml。每个浓度另设4个复孔，以尽可能减少实验操作误差的干扰。通过双抗夹心elisa法检测反应值，并以此绘制标准曲线，如图1所示。[0150][0151]2.2.1spa检测试剂盒qc分析[0152]2.2.2线性分析[0153]以博奥森的spa作为原材料，用elisa稀释液按1：10，1：100进行梯度稀释，利用双抗夹心elisa计算各个稀释倍数下的样本浓度，以评估该试剂盒是否具有良好的线性。[0154]稀释梯度回算样本浓度(pg/ml)线性(％)1:11547.0381001:101509.47697.61:1001653.028106.9[0155]如上表所示，本试剂盒的线性范围为：97.6％-106.9％，可见其具有很好的线性。[0156]2.2.2.2回收率分析[0157]以启泰spa作为原材料，利用本实验室配制的buffer1，buffer2，buffer3(即chok1无血清培养基)和buffer4(即10倍稀释的chok1无血清培养基)稀释spa，使其终浓度为800pg/ml和200pg/ml。elisa检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的od计算样本浓度，并分别与起始浓度800pg/ml和200pg/ml比较，计算回收率。回收率计算方法如下：[0158]回收率＝实际计算的浓度/200pg/ml×100％。[0159][0160]如上表所示，buffer1、buffer2、buffer3和buffer4的溶剂体系回收率在88％-126％之间。说明本试剂盒具有很好的准确度。[0161]2.2.2.3批内批间分析[0162]每隔1天包被1块启泰鸡抗spa抗体的微孔板，洗板封闭后加入100μl稳定剂，37℃，孵育2h，轻轻甩掉微孔中的液体。并用真空包装机，真空封闭，置于密封袋中保存。共三个批次。第七天将所有装有微孔条的密封袋，在室温条件下静置20min后，其中3条用于绘制标准曲线，其余16孔用于检测样本的浓度。用双抗夹心elisa法检测样本与抗原抗体反应值，并计算浓度，以评估本试剂盒的批内批间差。结果如下：[0163]批内差：[0164]检测次数平均浓度pg/ml变异系数cv(％)8811.2245.68200.8936.68208.7307.68705.84912.88742.89612.88189.82011.27740.5104.78189.6972.88741.3318.78184.9768.88726.5829.08178.13813.6[0165]批间差：[0166]检测次数平均浓度pg/ml变异系数cv(％)23735.9517.524184.8999.224753.32311.824199.8159.1[0167]由表可知，本试剂盒批间差小于10％，批内差均小于15％，表明试剂盒精确度较高。[0168]2.2.2.4灵敏度分析[0169]通过计算发现本试剂盒的灵敏度为3.0pg/ml。[0170]读取16个微孔的od值，计算16个od值的方差和平均值。将od平均值加上两倍的方差，得到一个新的od值，然后利用所得的od代入到标准曲线的方程中，所计算出来的浓度即为本试剂盒的灵敏度。[0171]2.2.2.5特异性分析[0172]分别取134ng/ml的e.coli hcp、161ng/ml的cho hcp、100ng/ml的牛igg和100ng/ml的bsa各200l，每孔100μl,加到包被并封闭好的试剂盒孔内。每个样本做一个复孔，进行夹心法elisa实验，检测各待测样本与试剂盒的交叉反应程度。[0173][0174]如上表所示，134ng/ml的e.coli hcp、161ng/ml的cho hcp、100ng/ml的牛igg和100ng/ml的bsa与试剂盒之间均小于0.005％，基本无交叉反应。说明本试剂盒有很好的特异性。[0175]包被鸡抗spa-igg微孔板在37℃稳定性：[0176][0177][0178]可以看出，微孔板在24-96h之间，稳定性保持在84.602％-114.64％之间，相当于4℃稳定保存半年。[0179]spa抗原稳定性：[0180][0181]根据数据发现蛋白抗原在37℃经过72h加热破坏，可以保持70.4％的活性，相当于4℃保存6个月。[0182]兔抗spa-hrp检抗稳定性：[0183][0184]根据数据发现蛋白抗原在37℃经过72h加热破坏，可以保持73.2％的活性，相当于4℃保存6个月。[0185]三、试剂盒组成[0186][0187]试剂盒中相关组分的制备[0188]3.1：放chicken anti-spa igy酶标微孔板[0189]3.2：spa标准品溶液(0.5μg/ml)[0190]3.3：酶结合物兔抗spa-hrp(20ng/ml)[0191]3.4：稀释液：0.15m ph 7.4pbs含0.1％tween 20[0192]3.5：显色液：由显色液a液和显色液b液组成，显色液a液为过氧化氢，显色液b液为邻苯二胺。[0193]3.6：终止液为1-2mol/l硫酸溶液。[0194]3.7：浓缩洗涤液[0195]四、操作步骤[0196]4.1：标准品浓度配制[0197]按照说明书要求配制各种不同的标准品浓度：1000pg/ml，400pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml，12.5pg/ml，0pg/ml。[0198]从试剂盒中取出标准品(0.5μg/ml)[0199]1.从标准品中取100ml+900ml稀释液＝50ng/ml[0200]2.从1中取20ml+980ml稀释液＝1000pg/ml[0201]3.从2中取300ml+300ml稀释液＝400pg/ml[0202]4.从3中取300ml+300ml稀释液＝200pg/ml[0203]5.从4中取300ml+300ml稀释液＝100pg/ml[0204]6.从5中取300ml+300ml稀释液＝50pg/ml[0205]7.从6中取300ml+300ml稀释液＝25pg/ml[0206]8.从7中取200ml+200ml稀释液＝12.5pg/ml[0207]4.2：加样[0208]取出酶标板，按照标准品的次序分别加入100μl的标准品溶液于空白微孔中。空白对照组中加入100μl的稀释液。其余微孔中加入100μl的样品。[0209]加好后将酶标板置于振荡器上，震荡90s，以使试剂充分混匀但不要让液体溅出影响实验结果。然后将酶标板用封口胶密封，37℃孵育反应1.5小时(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)。[0210]洗涤：37℃孵育反应1.5小时后，取出酶标板，撕掉封口胶，甩掉里面的液体(甩掉液体时注意，不可让各孔之间的液体互相污染，甩干时稍微倾斜用力)。然后在干净的毛巾或吸水纸上彻底拍干，直至里面没有液体。[0211]拍干后用洗涤液充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压。手洗时洗涤液要加满微孔，但不要溢出。(浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释)。洗完后再次在干净的毛巾或吸水纸上彻底拍干，直至里面没有液体。[0212]加酶标结合物：取拍干后的酶标板，每孔加入100μl的酶标结合物(加样时要避免起泡，一次加样时间最好控制在5分钟之内)。[0213]加好后将酶标板置于振荡器上，震荡90s，以使试剂充分混匀但不要让液体溅出影响实验结果。(如无振荡器也可用手轻轻敲打酶标板，切勿用力敲击)。然后将酶标板用封口胶密封，37℃孵育反应1小时(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)。[0214]洗涤：37℃孵育反应1小时后，取出酶标板，撕掉封口胶，甩掉里面的液体(甩掉液体时注意，不可让各孔之间的液体互相污染，甩干时稍微倾斜用力)。然后在干净的毛巾或吸水纸上彻底拍干，直至里面没有液体。[0215]拍干后用洗涤液充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压，洗涤液要加满微孔，但不要溢出。(浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释)。[0216]洗完后再次在干净的毛巾或吸水纸上彻底拍干，直至里面没有液体。[0217]显色：取拍干后的酶标板，每孔先加入50μl的显色液a液，加好后再依次每孔加入50μl的显色液b液(请务必先加a液，后加b液，否则可能不会出现颜色，导致实验失败)。[0218]加好后将酶标板置于振荡器上，震荡90s，以使试剂充分混匀但不要让液体溅出影响实验结果。[0219]然后将酶标板置于37℃下避光反应10-15分钟。(定时观察反应孔的颜色变化，比如：10分钟左右，如果颜色较深，则加入终止液终止反应。)[0220]终止：37℃下避光反应10-15分钟后，取出酶标板，各孔加入50μl终止液，终止反应。[0221]加好后将酶标板置于振荡器上，震荡90s，以使试剂充分混匀但不要让液体溅出影响实验结果。(如无振荡器也可用手轻轻敲打酶标板，切勿用力敲击)。[0222]读板：将终止后的酶标板置于酶标仪上，并在450nm波长下读取吸光度。[0223]上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。









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