使用编码具有增加的表达的重组FVIII变体的病毒载体的A型血友病的基因疗法的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术使用编码具有增加的表达的重组fviii变体的病毒载体的a型血友病的基因疗法1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2019年12月12日提交的序列号为62/947,104的美国临时专利申请的优先权，所述专利申请特此以引用的方式整体并入。3.序列表4.本技术含有序列表，所述序列表以ascii格式以电子方式提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ascii副本创建于2019年7月15日，名为008073_5202_wo01_sequence_listing.txt且大小为85千字节。5.发明背景6.血液凝固通过称为凝血级联的相互依赖的生物化学反应的复杂且动态的生物途径进行。凝血因子viii(fviii)是级联中的关键组分。因子viii被募集至出血位点，并且与活化的因子ix(fixa)和因子x(fx)形成x酶复合物。x酶复合物活化fx，fx又将凝血酶原活化为凝血酶，然后凝血酶活化凝血级联中的其他组分以产生稳定的凝块(在saenko等人,trends cardiovasc.med.,9:185-192(1999)；lenting等人,blood,92:3983-3996(1998)中综述)。7.a型血友病是一种以缺乏因子viii活性为特征的先天性x连锁性出血性病症。降低的因子viii活性抑制了凝血级联中的正反馈回路。这会导致不完全凝固，表现为持续时间延长、大面积青紫、自发性口腔和鼻腔出血、关节僵硬和慢性疼痛以及严重情况下可能出现内出血和贫血的出血事件(zhang等人,clinic.rev.allerg.immunol.,37:114-124(2009))。8.常规地，通过因子viii替代疗法来治疗a型血友病，所述因子viii替代疗法由向患有a型血友病的个体施用因子viii蛋白(例如血浆源性或以重组方式产生的因子viii)组成。预防性地施用因子viii以预防出血事件或降低出血事件的频率从而应对急性出血事件，并且/或者在手术前后进行施用以控制手术期间的出血。然而，因子viii替代疗法有几个不希望的特征。9.首先，因子viii替代疗法用于治疗或控制a型血友病，但不能治愈潜在的因子viii缺乏。由于这个原因，患有a型血友病的个体在其一生中都需要因子viii替代疗法。持续治疗是昂贵的，并且要求个体保持严格的依从性，因为仅缺少少数预防性剂量就会对患有严重a型血友病的个体产生严重后果。10.其次，因为因子viii在体内的半衰期相对较短，常规预防性因子viii替代疗法需要每两天或每三天进行施用。这给个体在其生活中保持依从性带来负担。尽管第三代“长效”因子viii药物可能会降低施用频率，但使用这些药物的预防性因子fviii替代疗法仍需要永久性地每月、每周或更频繁地施用。举例来说，用eloctatetm[抗血友病因子(重组)，fc融合蛋白]进行预防性治疗需要每3至5天施用(eloctatetm prescribing information,biogen idec inc.,(2015))。此外，尚未完全了解化学修饰的生物制剂(例如聚乙二醇化多肽)的长期影响。[0011]第三，接受因子viii替代疗法的所有个体中有15％至30％形成抗因子viii抑制剂抗体，从而导致疗法效率低下。可使用因子viii旁路疗法(例如，施用血浆源性或以重组方式产生的凝血酶原复合物浓缩物)来治疗形成抑制剂抗体的个体的血友病。然而，因子viii旁路疗法与因子viii替代疗法相比不太有效(mannucci p.m.,j thromb haemost.,1(7):1349-55(2003))并且可能与心血管并发症的风险增加有关(luu和ewenstein,haemophilia,10增刊2:10-16(2004))。[0012]体细胞基因疗法为a型血友病的治疗带来极大的希望，因为它可以补救潜在的低表达功能性因子viii活性(例如，归因于错义或无义突变)，而不是提供一次剂量的因子viii活性给个体。由于作用机制的这种差异，与因子viii替代疗法相比，一次施用因子viii基因疗法载体可为个体提供数年的因子viii，从而降低治疗成本并且消除了对持续患者依从性的需要。[0013]凝血因子ix(fix)基因疗法已被有效地用于治疗患有b型血友病的个体，b型血友病是一种以因子ix活性降低为特征的相关凝血疾患(manno c.s.等人,nat med.,12(3):342-47(2006))。然而，因子viii基因疗法存在几个独特的挑战。举例来说，全长野生型因子viii多肽(2351个氨基酸；uniprot登录号p00451)比全长野生型因子ix多肽(461个氨基酸；uniprot登录号p00740)大五倍。因此，野生型因子viii的编码序列为7053个碱基对，这太大而不能包装在常规aav基因疗法载体中。此外，报道的因子viii的b结构域缺失变体(bdd-fviii)的重组表达是差的。因此，若干小组已试图改变bdd-fviii构建体的密码子使用，但取得的成功有限。技术实现要素：[0014]因此，对编码序列更高效地包装到基因疗法载体中并且经由基因疗法载体递送的因子viii变体存在需要。还需要更高效地表达因子viii的合成的密码子改变的核酸。此类因子viii变体和密码子改变的核酸允许改善对因子viii缺乏(例如a型血友病)的治疗。所公开的密码子改变的因子viii变体减少或消除了上述缺乏和与治疗因子viii缺乏(例如a型血友病)相关的其他问题。[0015]根据一些实施方案，本公开提供编码因子viii变体的核酸，所述核酸与所公开的密码子改变的因子viii重链(例如cs04-hc-na)和轻链(cs04-lc-na)的序列具有高序列同一性。在一些实施方案中，这些核酸在编码因子viii重链和轻链的序列之间还包括编码接头序列的序列，所述接头序列替代天然因子viii b结构域(例如包含弗林蛋白酶裂解位点(furin cleavage site)的接头序列)。[0016]在一方面，本公开提供一种包括编码因子viii多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因子viii多肽包括轻链、重链以及将重链的c端连接至轻链的n端的多肽接头。因子viii多肽的重链由与cs04-hc-na(seq id no:3)具有至少95％同一性的第一核苷酸序列编码。因子fviii多肽的轻链由与cs04-lc-na(seq id no:4)具有至少95％同一性的第二核苷酸序列编码。多肽接头包含弗林蛋白酶裂解位点。[0017]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多肽接头由与bdlo04(seq id no:5)具有至少95％同一性的第三核苷酸序列编码。[0018]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与对应重链序列(例如cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少96％同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与对应轻链序列(例如cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少96％同一性。[0019]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与对应重链序列(例如cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少97％同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与对应轻链序列(例如cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少97％同一性。[0020]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与对应重链序列(例如cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少98％同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与对应轻链序列(例如cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少98％同一性。[0021]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与对应重链序列(例如cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少99％同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与对应轻链序列(例如cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少99％同一性。[0022]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与对应重链序列(例如cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少99.5％同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与对应轻链序列(例如cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少99.5％同一性。[0023]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与对应重链序列(例如cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少99.9％同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与对应轻链序列(例如cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少99.9％同一性。[0024]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列为cs04-hc-na(seq id no:3)，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列为cs04-lc-na(seq id no:4)。[0025]在一方面，本公开提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与cs04-fl-na具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码因子viii多肽。[0026]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与对应全长多核苷酸序列(例如cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少96％同一性。[0027]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与对应全长多核苷酸序列(例如cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少97％同一性。[0028]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与对应全长多核苷酸序列(例如cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少98％同一性。[0029]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与对应全长多核苷酸序列(例如cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少99％同一性。[0030]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与对应全长多核苷酸序列(例如cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少99.5％同一性。[0031]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与对应全长多核苷酸序列(例如cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少99.9％同一性。[0032]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列为cs04-fl-na(seq id no:1)。[0033]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少95％同一性的氨基酸序列的因子viii多肽。[0034]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少96％同一性的氨基酸序列的因子viii多肽。[0035]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少97％同一性的氨基酸序列的因子viii多肽。[0036]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少98％同一性的氨基酸序列的因子viii多肽。[0037]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99％同一性的氨基酸序列的因子viii多肽。[0038]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.5％同一性的氨基酸序列的因子viii多肽。[0039]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.9％同一性的氨基酸序列的因子viii多肽。[0040]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码包含cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸序列的因子viii多肽。[0041]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少95％同一性。[0042]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少96％同一性。[0043]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少97％同一性。[0044]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少98％同一性。[0045]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少99％同一性。[0046]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少99.5％同一性。[0047]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少99.5％同一性。[0048]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组。[0049]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括可操作地连接至编码因子viii多肽的多核苷酸的启动子元件。[0050]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括可操作地连接至编码因子viii多肽的多核苷酸的增强子元件。[0051]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括可操作地连接至编码因子viii多肽的多核苷酸的聚腺苷酸化元件。[0052]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括以操作方式连接至编码因子viii多肽的核苷酸序列的内含子。[0053]在上文所描述的多核苷酸的一个实施方案中，内含子位于启动子元件与编码因子viii多肽的核苷酸序列的翻译起始位点(例如，第一编码atg)之间。[0054]在另一方面，本公开提供一种包含如上文所描述的多核苷酸的哺乳动物基因疗法载体。[0055]在上文所描述的哺乳动物基因疗法载体的一个实施方案中，哺乳动物基因疗法载体为腺相关病毒(aav)载体。[0056]在上文所描述的哺乳动物基因疗法载体的一个实施方案中，aav载体为aav-8载体。[0057]在另一方面，本公开提供一种用于治疗a型血友病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如上文所描述的哺乳动物基因疗法载体。[0058]在另一方面，本公开提供一种如上文所描述的哺乳动物基因疗法载体，其用于治疗a型血友病。[0059]在另一方面，本公开提供如上文所描述的哺乳动物基因疗法载体用于制造用于治疗a型血友病的药物的用途。附图说明[0060]图1示出野生型和refacto型人因子viii蛋白构建体的示意图。[0061]图2a和图2b示出根据一些实施方案的编码因子viii变体的cs04密码子改变的核苷酸序列(seq id no:1)(对于全长编码序列，“cs04-fl-na”)。[0062]图3示出根据一些实施方案的由cs04密码子改变的核苷酸序列编码的因子viii变体氨基酸序列(seq id no:2)(对于全长氨基酸序列，“cs04-fl-aa”)。[0063]图4示出根据一些实施方案的编码因子viii变体的重链的cs04密码子改变的核苷酸序列(seq id no:3)(“cs04-hc-na”)的部分。[0064]图5示出根据一些实施方案的编码因子viii变体的轻链的cs04密码子改变的核苷酸序列(seq id no:4)(“cs04-lc-na”)的部分。[0065]图6示出根据一些实施方案的b结构域取代的接头的示例性编码序列(seq id no:5)。bdlo04(seq id no:5)为编码b结构域取代的接头的cs04密码子改变的核苷酸序列的对应部分。[0066]图7a、图7b和图7c示出根据一些实施方案的含有cs04密码子改变的核苷酸序列的aav载体序列(seq id no:8)(“cs04-av-na”)。[0067]图8a和图8b示出根据一些实施方案的编码因子viii变体的cs08密码子改变的核苷酸序列(seq id no:7)(“cs08-fl-na”)。[0068]图9a和图9b示出根据一些实施方案的编码因子viii变体的cs10密码子改变的核苷酸序列(seq id no:8)(“cs10-fl-na”)。[0069]图10a和图10b示出根据一些实施方案的编码因子viii变体的cs11密码子改变的核苷酸序列(seq id no:9)(“cs11-fl-na”)。[0070]图11a和图11b示出根据一些实施方案的cs40野生型refacto编码序列(seq id no:10)(“cs40-fl-na”)。[0071]图12a和图12b示出根据一些实施方案的编码因子viii变体的ch25密码子改变的核苷酸序列(seq id no:11)(“ch25-fl-na”)。[0072]图13示出根据一些实施方案的野生型人因子viii氨基酸序列(seq id no:12)(“fviii-fl-aa”)。[0073]图14说明通过将合成refacto型bdd-fviii dna序列经由asci和noti限制位点插入载体骨架pch-bb01中克隆pcs40、pcs04、pcs08、pcs10、pcs11和pch25构建体的流程。[0074]图15示出如通过琼脂糖凝胶电泳所分析的aav载体基因组制剂的完整性。泳道1，dna标记物；泳道2，vcs40；泳道4，vcs04。aav载体均具有相同大小的基因组，迁移于大约5kb处(右侧箭头)。左侧的刻度指示以千碱基(kb)为单位的dna片段的大小。[0075]图16示出通过page和银染色对aav载体制剂进行的蛋白质分析。泳道1，蛋白质标记物(m)；泳道2，vcs40；和泳道4，vcs04。构建体均具有相同的由vp1、vp2和vp3(右侧箭头)组成的aav8衣壳。左侧的刻度指示以千道尔顿(kda)为单位的蛋白质标记物的大小。[0076]图17示出全身性施用如实施例3中所描述的含有cs04因子viii密码子优化构建体的基于(r)aav8的基因疗法载体后的fviii活性。cp，载体衣壳颗粒；fviii，因子viii；lloq，定量下限。14、28、42和56天时间点于图示中从左到右示出。[0077]图18示出在尾尖出血测定中，在全身性施用如实施例3中所描述的含有cs04因子viii密码子优化构建体的基于(r)aav8的基因疗法载体之后失血量减少。cp，载体衣壳颗粒。[0078]图19a、图19b和图19c示出在全身性施用之后含有cs04因子viii密码子优化构建体dna的基于(r)aav8的基因疗法载体的生物分布。1902＝肝脏；1904＝淋巴结；1906＝骨胳肌；1908＝心脏；1910＝肾脏；1912＝脾脏；1914＝肺；1916＝睪丸；1918＝脑部。具体实施方式[0079]i.引言[0080]基于aav的基因疗法为血友病治疗带来极大的希望。对于b型血友病，最早的临床数据是令人鼓舞的，因为至少在有些患者中fix水平可在约10％保持1年以上。然而，对于a型血友病，由于各种原因，用aav载体实现5％-10％的治疗剂表达水平仍然是具有挑战性的。首先，因子viii编码序列对于常规的基于aav的载体来说太大。其次，工程化的b结构域缺失或截短的因子viii构建体在体内具有不良表达，即使在密码子优化时也是如此。第三，这些b结构域缺失或截短的因子viii变体构建体在体内的半衰期短，从而加剧了不良表达的影响。第四，如同诸如因子ix等其他凝血因子，即使在表达时，fviii也不能高效地从细胞分泌。因此，需要改善fviii表达的策略以使fviii基因疗法成为a型血友病患者的可行治疗选择。[0081]本公开涉及对解决这些问题和与因子viii基因疗法相关的其他问题的密码子改变的因子viii变体编码序列的发现。举例来说，本文所公开的多核苷酸在哺乳动物细胞中提供显著改善的表达，并且因稳定的堆积相互作用而展示改善的病毒体包装。在一些实施方案中，通过使用与密码子改变的cs04构建体具有高序列同一性(例如与cs04-hc重链编码序列具有高序列同一性且与cs04-lc轻链编码序列具有高序列同一性)的因子viii的重链和轻链的编码序列实现了这些优点。[0082]在一些实施方案中，已通过使野生型b结构域截短、缺失或替换来缩短由本文所描述的多核苷酸编码的因子viii分子。因此，所述多核苷酸更适合于经由常规基因疗法载体表达因子viii，所述常规基因疗法载体表达诸如野生型因子viii等较大多肽的效率低。[0083]有利地，本文显示cs04密码子改变的因子viii变体编码序列在体内提供b结构域缺失的因子viii构建体的优良表达。举例来说，在实施例2和表4中证实在因子viii敲除小鼠中，静脉内施用具有cs04(seq id no:1)编码序列的基于aav的基因疗法载体使得因子viii表达相对于用野生型多核苷酸序列(seq id no:10)编码的相应cs40构建体增加74倍(表4)。[0084]此外，本文还显示cs04密码子改变的因子viii变体编码序列提供优良的病毒体包装和病毒产量。举例来说，实施例1中证实当从相同量的细胞沉淀分离时，含有cs04构建体的aav载体构建体提供相对于用野生型多核苷酸序列编码的相应cs40构建体高5至7倍的病毒产量。[0085]ii.定义[0086]除非另外指明，否则如本文所用，以下术语具有属于它们的含义。[0087]如本文所用，术语“因子viii”和“fviii”可互换使用，并且指具有因子viii活性的任何蛋白质(例如活性fviii，通常称为fviiia)或具有因子viii活性，特别是因子ixa辅因子活性的蛋白质的蛋白质前体(例如前蛋白或前蛋白原)。在一个示例性实施方案中，因子viii多肽是指具有与野生型因子viii多肽的重链和轻链具有高序列同一性(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高)的序列的多肽。在一些实施方案中，因子viii多肽的b结构域为缺失的、截短的或用接头多肽替换以减小编码因子viii多肽的多核苷酸的尺寸。在一个示例性实施方案中，cs04-fl-aa的氨基酸20-1457构成因子viii多肽。[0088]野生型因子viii多肽的非限制性实例包括人前因子viii原(例如genbank登录号aaa52485、caa25619、aaa58466、aaa52484、aaa52420、aav85964、baf82636、bag36452、cai41660、cai41666、cai41672、cai43241、cao03404、eaw72645、aah22513、aah64380、aah98389、aai11968、aai11970或aab61261)、相应前因子viii及其天然变体；猪前因子viii原(例如uniprot登录号f1rz36或k7gsz5)、相应前因子viii及其天然变体；小鼠前因子viii原(例如genbank登录号aaa37385、cam15581、cam26492或edl29229)、相应前因子viii及其天然变体；大鼠前因子viii原(例如genbank登录号aaq21580)、相应前因子viii及其天然变体；大鼠前因子viii原；以及其他哺乳动物因子viii同源物(例如猴、猿、仓鼠、豚鼠等)。[0089]如本文所用，因子viii多肽包括具有因子ix辅因子活性的天然变体和人工构建体。如本公开中所用，因子viii涵盖保留一定的基础因子ix辅因子活性(例如相应野生型活性的至少5％、10％、25％、50％、75％或更多)的任何天然变体、替代序列、同种型或突变蛋白。存在于人类群体中的因子viii氨基酸变异(相对于fviii-fl-aa(seq id no:12))的实例包括但不限于s19r、r22t、y24c、y25c、l26p/r、e30v、w33g、y35c/h、g41c、r48c/k、k67e/n、l69p、e72k、d75e/v/y、p83r、g89d/v、g92a/v、a97p、e98k、v99d、d101g/h/v、v104d、k108t、m110v、a111t/v、h113r/y、l117f/r、g121s、e129v、g130r、e132d、y133c、d135g/y、t137a/i、s138r、e141k、d145h、v147d、y155h、v159a、n163k、g164d/v、p165s、c172w、s176p、s179p、v181e/m、k185t、d186g/n/y、s189l、l191f、g193r、l195p、c198g、s202n/r、f214v、l217h、a219d/t、v220g、d222v、e223k、g224w、t252i、v253f、n254i、g255v、l261p、p262l、g263s、g266f、c267y、w274c、h275l、g278r、g280d、e284k、v285g、e291g/k、t294i、f295l、v297a、n299i、r301c/h/l、a303e/p、i307s、s308l、f312s、t314a/i、a315v、g323e、l326p、l327p/v、c329f、i331v、m339t、e340k、v345a/l、c348r/s/y、y365c、r391c/h/p、s392l/p、a394s、w401g、i405f/s、e409g、w412g/r、k427i、l431f/s、r437p/w、i438f、g439d/s/v、y442c、k444r、y450d/n、t454i、f455c、g466e、p470l/r/t、g474e/r/v、e475k、g477v、d478n、t479r、f484c、a488g、r490g、y492c/h、y492h、i494t、p496r、g498r、r503h、g513s/v、i522y、k529e、w532g、p540t、t541s、d544n、r546w、r550c/g/h、s553p、s554c/g、v556d、r560t、d561g/h/y、i567t、p569r、s577f、v578a、d579a/h、n583s、q584h/k/r、i585r/t、m586v、d588g/y、l594q、s596p、n601d/k、r602g、s603i/r、w604c、y605h/s、n609i、r612c、n631k/s、m633i、s635n、n637d/i/s、y639c、l644v、l650f、v653a/m、l659p、a663v、q664p、f677l、m681i、v682f、y683c/n、t686r、f698l、m699t/v、m701i、g705v、g710w、n713i、r717l/w、g720d/s、m721i/l、a723t、l725q、v727f、e739k、y742c、r795g、p947r、v1012l、e1057k、h1066y、d1260e、k1289q、q1336k、n1460k、l1481p、a1610s、i1698t、y1699c/f、e1701k、q1705h、r1708c/h、t1714s、r1715g、a1720v、e1723k、d1727v、y1728c、r1740g、k1751q、f1762l、r1768h、g1769r、l1771p、l1775f/v、l1777p、g1779e/r、p1780l、i1782r、d1788h、m1791t、a1798p、s1799h、r1800c/g/h、p1801a、y1802c、s1803y、f1804s、l1808f、m1842i、p1844s、t1845p、e1848g、a1853t/v、s1858c、k1864e、d1865n/y、h1867p/r、g1869d/v、g1872e、p1873r、l1875p、v1876l、c1877r/y、l1882p、r1888i、e1894g、i1901f、e1904d/k、s1907c/r、w1908l、y1909c、a1939t/v、n1941d/s、g1942a、m1945v、l1951f、r1960l/q、l1963p、s1965i、m1966i/v、g1967d、s1968r、n1971t、h1973l、g1979v、h1980p/y、f1982i、r1985q、l1994p、y1998c、g2000a、t2004r、m2007i、g2013r、w2015c、r2016p/w、e2018g、g2022d、g2028r、s2030n、v2035a、y2036c、n2038s、2040y、g2045e/v、i2051s、i2056n、a2058p、w2065r、p2067l、a2070v、s2082n、s2088f、d2093g/y、h2101d、t2105n、q2106e/p/r、g2107s、r2109c、i2117f/s、q2119r、f2120c/l、y2124c、r2135p、s2138y、t2141n、m2143v、f2145c、n2148s、n2157d、p2162l、r2169c/h、p2172l/q/r、t2173a/i、h2174d、r2178c/h/l、r2182c/h/p、m2183r/v、l2185s/w、s2192i、c2193g、p2196r、g2198v、e2200d、i2204t、i2209n、a2211p、a2220p、p2224l、r2228g/l/p/q、l2229f、v2242m、w2248c/s、v2251a/e、m2257v、t2264a、q2265r、f2279c/i、i2281t、d2286g、w2290l、g2304v、d2307a、p2319l/s、r2323c/g/h/l、r2326g/l/p/q、q2330p、w2332r、i2336f、r2339t、g2344c/d/s和c2345s/y。因子viii蛋白还包括含有翻译后修饰的多肽。[0090]一般来说，编码因子viii的多核苷酸编码无活性单链多肽(例如前蛋白原)，所述无活性单链多肽经历翻译后加工以形成活性因子viii蛋白(例如fviiia)。举例来说，参考图1，首先使野生型人因子viii前蛋白原裂解以释放编码的信号肽(未显示)，从而形成第一单链前蛋白(显示为“人野生型fviii”)。然后，使前蛋白在b结构域与a3结构域之间裂解以形成包括因子viii重链(例如a1和a2结构域)和b结构域的第一多肽，以及包括因子viii轻链(例如包括a3、c1和c3结构域)的第二多肽。使第一多肽进一步裂解以去除b结构域，并且还分离a1结构域和a2结构域，这些结构域在成熟因子viiia蛋白中保持与因子viii轻链缔合。关于因子viii成熟过程的综述，参见graw等人,nat rev genet.,6(6):488-501(2005)，该文献的内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。[0091]然而，在一些实施方案中，因子viii多肽为单链因子viii多肽。对单链因子viii多肽进行工程化以去除天然裂解位点，并且任选地去除、截短或替换因子viii的b结构域。因此，它们不会因裂解而成熟(除了任选的信号和/或前导肽的裂解)，并且作为单链具有活性。zollner等人(thromb res,134(1):125-31(2014))和donath等人(biochem j.,312(1):49-55(1995))中描述了单链因子viii多肽的非限制性实例，这些文献的公开内容出于所有目的特此以引用的方式整体并入。[0092]如本文所用，术语“因子viii重链”或简单地“重链”是指因子viii多肽的a1和a2结构域的聚集体。在一个示例性实施方案中，cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸20-759构成因子viii重链。[0093]如本文所用，术语“因子viii轻链”或简单地“轻链”是指因子viii多肽的a3、c1和c2结构域的聚集体。在一个示例性实施方案中，cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸774-1457构成因子viii轻链。在一些实施方案中，因子viii轻链不包括在成熟期间在体内释放的酸性a3肽。[0094]一般来说，因子viii重链和轻链例如与任选的b结构域或b结构域取代的接头一起表达为单一多肽链。然而，在一些实施方案中，因子viii重链和因子viii轻链表达为单独的多肽链(例如共表达)，并且重构以形成因子viii蛋白(例如体内或体外)。[0095]如本文所用，术语“b结构域取代的接头”和“因子viii接头”可互换使用，并且是指野生型因子viii b结构域的截短型式(例如fviii-fl-aa(seq id no:12的氨基酸760-1667))或经工程化以替换因子viii多肽的b结构域的肽。如本文所用，根据一些实施方案，在因子viii变体多肽中，因子viii接头定位于因子viii重链的c端与因子viii轻链的n端之间。b结构域取代的接头的非限制性实例公开于美国专利第4,868,112号、第5,112,950号、第5,171,844号、第5,543,502号、第5,595,886号、第5,610,278号、第5,789,203号、第5,972,885号、第6,048,720号、第6,060,447号、第6,114,148号、第6,228,620号、第6,316,226号、第6,346,513号、第6,458,563号、第6,924,365号、第7,041,635号和第7,943,374号；美国专利申请公布第2013/024960号、第2015/0071883号和第2015/0158930号；以及pct公布第wo 2014/064277号和第wo 2014/127215号中，这些专利的公开内容出于所有目的特此以引用的方式整体并入。[0096]除非本文另外指明，否则因子viii氨基酸的编号是指在图13中以seq id no:12呈现的全长野生型人因子viii序列(fviii-fl-aa)中的相应氨基酸。因此，当提到本文所公开的因子viii变体蛋白中的氨基酸取代时，所叙述的氨基酸编号是指在全长野生型因子viii序列中类似的(例如，结构上或功能上等同的)和/或同源的(例如，在一级氨基酸序列中进化保守的)氨基酸。举例来说，t2105n氨基酸取代是指全长野生型人因子viii序列(fviii-fl-aa；seq id no:12)的位置2105处的t到n的取代以及由cs04编码的因子viii变体蛋白(cs04-fl-aa；seq id no:2)的位置1211处的t到n的取代。[0097]如本文所描述，因子viii氨基酸编号系统取决于是否包括因子viii信号肽(例如全长野生型人因子viii序列的氨基酸1-19)。在包括信号肽的情况下，编号被称为“信号肽包括性的”或“spi”。在不包括信号肽的情况下，编号被称为“信号肽排除性的”或“spe”。举例来说，f328s为与spe编号中的f309s相同的氨基酸的spi编号。除非另外指示，否则所有氨基酸编号是指在图13中以seq id no:12呈现的全长野生型人因子viii序列(fviii-fl-aa)中的相应氨基酸。[0098]如本文所描述，与由天然编码的因子viii构建体(例如使用野生型人密码子编码相同因子viii构建体的多核苷酸)提供的因子viii表达水平相比，密码子改变的多核苷酸在体内(例如当作为基因疗法载体的一部分施用时)提供增加的转基因因子viii表达。如本文所用，术语“增加的表达”是指与施用天然编码的因子viii构建体的动物的血液中的转基因因子viii活性水平相比，施用编码因子viii的密码子改变的多核苷酸的动物的血液中的转基因因子viii活性水平增加。可使用本领域中已知的任何因子viii活性来测量活性水平。用于测定因子viii活性的示例性测定为technochrome fviii测定(technoclone,vienna,austria)。[0099]在一些实施方案中，增加的表达是指与施用天然编码的因子viii多核苷酸的动物的血液中的转基因因子viii活性水平相比，施用密码子改变的因子viii多核苷酸的动物的血液中的转基因因子viii活性高至少25％。在一些实施方案中，增加的表达是指与施用天然编码的因子viii多核苷酸的动物的血液中的转基因因子viii活性水平相比，施用密码子改变的因子viii多核苷酸的动物的血液中的转基因因子viii活性高至少50％、高至少75％、高至少100％、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高至少10倍、高至少15倍、高至少20倍、高至少25倍、高至少30倍、高至少40倍、高至少50倍、高至少60倍、高至少70倍、高至少80倍、高至少90倍、高至少100倍、高至少125倍、高至少150倍、高至少175倍、高至少200倍、高至少225倍或高至少250倍。[0100]如本文所描述，与由天然编码的因子viii构建体(例如使用野生型人密码子编码相同因子viii构建体的多核苷酸)提供的载体产量水平相比，密码子改变的多核苷酸提供增加的载体产量。如本文所用，术语“增加的病毒产量”是指与接种了天然编码的因子viii构建体的细胞培养物中的载体产量(例如每升培养物的效价)相比，接种了编码因子viii的密码子改变的多核苷酸的细胞培养物中的载体产量增加。可使用本领域中已知的任何载体效价测定来测量载体产量。用于测定载体(例如aav载体)产量的示例性测定为靶向aav2反向末端重复序列的qpcr(aurnhammer,human gene therapy methods:b部分23:18-28(2012))。[0101]在一些实施方案中，增加的病毒产量是指与相同类型培养物中的天然编码的因子viii构建体的产量相比，密码子改变的载体的产量高至少25％。在一些实施方案中，增加的载体产量是指与相同类型培养物中的天然编码的因子viii构建体的产量相比，密码子改变的载体的产量高至少50％、高至少75％、高至少100％、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高至少10倍、高至少15倍或高至少20倍。[0102]如本文所用，术语“血友病”是指普遍特征为血液凝结或凝固减少的一组疾病状态。血友病可指a型、b型或c型血友病，或指所有三种疾病类型的复合疾病。a型血友病(type a hemophilia/hemophilia a)是由因子viii(fviii)活性降低或丧失造成的，并且在血友病亚型中是最突出的。b型血友病(type b hemophilia/hemophilia b)是由因子ix(fix)凝结功能丧失或降低引起的。c型血友病(type c hemophilia/hemophilia c)是因子xi(fxi)凝结活性丧失或降低的结果。a型血友病和b型血友病为x连锁型疾病，而c型血友病是常染色体病。血友病的常规治疗包括预防性施用和按需施用凝结因子(诸如fviii、fix(包括–vh)和fxi，以及feiba-vh)、去氨加压素以及血浆输注。[0103]如本文所用，术语“fviii基因疗法”包括向患者提供编码因子viii的核酸以缓解、减少或预防与血友病相关的一种或多种症状(例如临床因素)的再次发生的任何治疗方法。该术语涵盖施用包含编码因子viii分子，包括任何修饰形式的因子viii(例如因子viii变体)的核酸的任何化合物、药物、程序或方案以维持或改善患有血友病的个体的健康。本领域技术人员将了解，可例如基于根据本公开所获得的结果改变fviii疗法的过程或fviii治疗剂的剂量。[0104]如本文所用，术语“旁路疗法”包括向患者提供非因子viii止血剂、化合物或凝血因子以缓解、减少或预防与血友病相关的一种或多种症状(例如临床因素)的再次发生的任何治疗方法。非因子viii化合物和凝血因子包括但不限于因子viii抑制剂旁路活性(feiba)、重组活化因子vii(fviia)、凝血酶原复合物浓缩物和活化的凝血酶原复合物浓缩物。这些非因子viii化合物和凝血因子可为重组的或血浆源性的。本领域技术人员将了解，可例如基于根据本公开所获得的结果改变旁路疗法的过程或旁路疗法的剂量。[0105]如本文所用，包括施用编码因子viii分子的核酸和常规a型血友病治疗剂的“组合疗法”包括向患者提供编码因子viii分子的核酸与因子viii分子和/或非因子viii止血剂(例如旁路治疗剂)以缓解、减少或预防与血友病相关的一种或多种症状(例如临床因素)的再次发生的任何治疗方法。该术语涵盖施用包括编码因子viii分子(包括任何修饰形式的因子viii)的核酸的可用于维持或改善患有血友病的个体的健康并且包括任何本文所描述的治疗剂的任何化合物、药物、程序或方案。[0106]术语“治疗有效量或剂量”或“治疗充足量或剂量”或“有效或充足量或剂量”是指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。举例来说，可用于治疗血友病的药物的治疗有效量可为能够预防或缓解与血友病相关的一种或多种症状的量。精确的剂量将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知的技术确定(参见，例如,lieberman,pharmaceutical dosage forms(1-3卷,1992)；lloyd,the art,science and technology of pharmaceutical compounding(1999)；pickar,dosage calculations(1999)；和remington:the science and practice of pharmacy,第20版,2003,gennaro编,lippincott,williams和wilkins)。[0107]如本文所用，术语“基因”是指编码多肽链的dna分子区段(例如编码区)。在一些实施方案中，基因是按照紧接在产生多肽链时所涉及的编码区之前、之后和/或插入其中的区域进行定位(例如调控元件，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、5’‑非翻译区、3’‑非翻译区或内含子)。[0108]如本文所用，术语“调控元件”是指在细胞中提供编码序列的表达的核苷酸序列，诸如启动子、增强子、终止子、聚腺苷酸化序列、内含子等。[0109]如本文所用，术语“启动子元件”是指帮助控制编码序列的表达的核苷酸序列。一般来说，将启动子元件定位于基因的翻译起始位点的5’。然而，在某些实施方案中，可将启动子元件定位于内含子序列内或编码序列的3’。在一些实施方案中，可用于基因疗法载体的启动子是来源于靶蛋白的天然基因(例如因子viii启动子)。在一些实施方案中，可用于基因疗法载体的启动子关于在靶生物体的特定细胞或组织中的表达具特异性(例如肝特异性启动子)。在又其他实施方案中，将多种充分表征的启动子元件中的一种用于本文所描述的基因疗法载体中。充分表征的启动子元件的非限制性实例包括cmv早期启动子、β-肌动蛋白启动子和甲基cpg结合蛋白2(mecp2)启动子。在一些实施方案中，启动子为组成型启动子，驱动靶蛋白的基本上恒定的表达。在其他实施方案中，启动子为诱导型启动子，响应于特定刺激(例如暴露于特定治疗或剂)而驱动靶蛋白的表达。关于设计用于aav介导的基因疗法的启动子的综述，参见gray等人(human gene therapy22:1143-53(2011))，该文献的内容出于所有目的以引用的方式整体明确并入。[0110]如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸(例如编码因子viii基因疗法构建体的核酸)转移到宿主细胞中的任何媒介物。在一些实施方案中，载体包括用于复制媒介物以及靶核酸的复制子。可用于基因疗法的载体的非限制性实例包括在体内用作自主复制单元的质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体和病毒。在一些实施方案中，载体为用于引入靶核酸(例如编码因子viii变体的密码子改变的多核苷酸)的病毒媒介物。许多可用于基因疗法的修饰的真核病毒为本领域中已知的。举例来说，腺相关病毒(aav)特别适合用于人基因疗法，因为人是病毒的天然宿主，已知天然病毒不会导致任何疾病，并且这些病毒引起轻度免疫应答。[0111]如本文所用，术语“cpg岛”是指多核苷酸内具有统计学上升高的cpg二核苷酸密度的区域。如本文所用，多核苷酸(例如编码密码子改变的因子viii蛋白的多核苷酸)的区域为cpg岛，条件是在200个碱基对窗口中：(i)所述区域的gc含量高于50％，并且(ii)如通过以下关系所定义，每单位预期cpg二核苷酸观测到的cpg二核苷酸的比率为至少0.6：[0112][0113]关于鉴定cpg岛的方法的额外信息，参见gardiner-garden m.等人,j mol biol.,196(2):261-82(1987)，该文献的内容出于所有目的以引用的方式整体明确并入。[0114]如本文所用，术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，以及其互补物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键联的核酸，所述核酸为合成的、天然存在的以及非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与参考核酸相似的方式进行代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(pna)。[0115]术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，包括以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸包括由遗传密码编码的那些氨基酸以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、y-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。天然存在的氨基酸可包括例如d-氨基酸和l-氨基酸。本文所用的氨基酸还可包括非天然氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即结合至氢、羧基、氨基和r基团的任何碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有修饰的r基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸可以由其普遍接受的单字母码表示。[0116]关于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到，改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或较小百分比的氨基酸的对核酸或肽序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域中是众所周知的。此类保守修饰的变体是除了本公开的多态变体、种间同系物和等位基因以外的变体并且不排除本公开的多态变体、种间同系物以及等位基因。[0117]提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域中是众所周知的。取决于特定氨基酸的功能性，例如催化性、结构性或空间上重要的氨基酸，不同的氨基酸分组可被认为是彼此的保守取代。表1提供了基于氨基酸的电荷和极性、氨基酸的疏水性、氨基酸的表面暴露/结构性质以及氨基酸的二级结构倾向而视为保守取代的氨基酸的分组。[0118]表1.基于蛋白质中残基的功能性的保守氨基酸取代的分组.[0119][0120]在两个或更多个核酸或肽序列的情形下，术语“同一”或“同一性”百分比是指如例如使用blast或blast 2.0序列比较算法用下文所描述的默认参数或通过人工比对和目视检查所测量，两个或更多个序列或子序列为相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即当比较和比对相对于比较窗或指定区的最大对应性时，在指定区内具有约60％的同一性，优选为65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。[0121]如本领域中已知的，可使用许多不同程序来鉴定蛋白质(或如下文所论述的核酸)是否与已知序列具有序列同一性或相似性。使用本领域已知的标准技术来测定序列同一性和/或相似性，所述标准技术包括包括但不限于smith和waterman,adv.appl.math.,2:482(1981)的局部序列同一性算法、通过needleman和wunsch,j.mol.bio l.,48:443(1970)的序列同一性比对算法、通过pearson和lipman,pr oc.natl.acad.sci.u.s.a.,85:2444(1988)的检索相似性方法、通过这些算法的计算机实施方式(wisconsin genetics遗传学软件包中的g ap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group,575science drive,madison,wi)、由devereux等人,nucl.acid res.,12:387-395(1984)描述的best fit序列程序，优选使用默认设置或通过检查来进行。优选地，通过fastdb基于以下参数来计算同一性百分比：错配罚分为1；空位罚分为1；空位尺寸罚分为0.33；并且连接罚分为30，“current methods in sequence comparison and analy sis,”macromolecule sequencing and synthesis,selected methods an d applications,第127-149页(1988),alan r.liss,inc，所有这些文献都以引用的方式并入。[0122]可用算法的一个实例是pileup。pileup使用渐进性成对比对从一组相关序列形成多重序列比对。它还可绘制示出用于形成比对的聚类关系的树形图。pileup使用feng和doolittle,j.mol.evol.35:351-360(1987)的渐进性比对方法的简化型式；所述方法与higgins和sharp cabios 5:151-153(1989)所描述的方法相似，两个文献均以引用的方式并入。可用的pileup参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。[0123]可用算法的另一实例为以下文献中描述的blast算法：altschul等人,j.mol.biol.215,403-410,(1990)；altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997)；和karlin等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5873-5787(1993)，这些文献均以引用的方式并入。尤其可用的blast程序为从altschul等人,methods in enzymology,266:460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/readme.html]获得的wu-blast-2程序。wu-blast-2使用若干检索参数，其中大部分被设置为默认值。可调节参数被设置为以下数值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字串阈值(t)＝11。hsp s和hsp s2参数为动态值并且通过程序自身根据特定序列的组成和在其中检索目标序列的特定数据库的组成来建立；然而，可对所述值进行调节以增加灵敏度。[0124]另一可用算法为如由altschul等人,nucl.acids res.,25:3389-3402所报道的带空位的blast，该文献以引用的方式并入。带空位的blast使用blosum-62取代评分；阈值t参数设置为9；引发无空位延伸的双击法；使空位长度k承担10+k的代价；xu设置为16，并且对于数据库检索阶段，xg设置为40，并且对于算法的输出阶段设置为67。通过对应于约22位的评分来引发带空位的比对。[0125]通过用匹配的相同残基数目除以比对区中“较长”序列的残基总数目来测定氨基酸序列同一性％值。“较长”序列为具有比对区中的大部分实际残基的序列(忽略由wu-blast-2为使比对评分最大化而引入的空位)。以类似方式，将关于所鉴定多肽的编码序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与细胞周期蛋白的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。优选方法利用设置为默认参数的wu-blast-2的blastn模块，其中重叠跨度和重叠分数分别设置为1和0.125。[0126]比对可包括在所要比对的序列中引入空位。另外，对于含有比由图2的序列(seq id no:1)编码的蛋白质更多或更少的氨基酸的序列，应了解，在一个实施方案中，序列同一性百分比将是基于相对于氨基酸或核苷酸总数目的相同氨基酸或核苷酸数目来确定。因此，举例来说，在一个实施方案中，如下文所论述比图2中所示的序列(seq id no:1)更短的序列的序列同一性将使用较短的序列中的核苷酸数目来确定。在同一性百分比计算中，未将相对权重分配给序列变异的不同表现形式，诸如插入、缺失、取代等。[0127]在一个实施方案中，仅同一性为正评分(+1)并且为所有形式的序列变异(包括空位)分配值“0”，这排除了对如下文关于序列相似性计算所描述的加权标度或参数的需要。可例如通过用匹配的相同残基的数目除以比对区内“较短”序列的残基总数目并且乘以100来计算序列同一性百分比。“较长”序列为具有比对区内大部分实际残基的序列。[0128]术语“等位基因变体”是指特定遗传基因座处的基因的多态形式，和来源于所述基因的mrna转录物的cdna和由其编码的多肽。术语“优选的哺乳动物密码子”是指如选自以下列表的在哺乳动物细胞中表达的蛋白质中最常用的编码氨基酸的密码子集合中的密码子的子集：gly(ggc，ggg)；glu(gag)；asp(gac)；val(gtg，gtc)；ala(gcc，gct)；ser(agc，tcc)；lys(aag)；asn(aac)；met(atg)；ile(atc)；thr(acc)；trp(tgg)；cys(tgc)；tyr(tat，tac)；leu(ctg)；phe(ttc)；arg(cgc，agg，aga)；gln(cag)；his(cac)；和pro(ccc)。[0129]如本文所用，术语密码子改变的是指编码多肽(例如因子viii变体蛋白)的多核苷酸序列，其中编码多肽的天然多核苷酸中的至少一个密码子已被改变以改善多核苷酸序列的性质。在一些实施方案中，改善的性质促使编码多肽的mrna的转录增加、mrna的稳定性增加(例如改善的mrna半衰期)、多肽的翻译增加和/或多核苷酸于载体内的包装增加。可用于实现改善的性质的改变的非限制性实例包括改变用于特定氨基酸的密码子的使用和/或分布、调整全局和/或局部gc含量、去除富含at的序列、去除重复的序列元件、调整全局和/或局部cpg二核苷酸含量、去除隐蔽的调控元件(例如tata盒和ccaat盒元件)、去除内含子/外显子剪接位点、改善调控序列(例如引入kozak共有序列)和去除能够在转录的mrna中形成二级结构(例如茎环)的序列元件。[0130]如本文所论述，存在各种名称来指本文所公开的组分。“cs编号”(例如“cs04”)是指编码fviii多肽的密码子改变的多核苷酸和/或所编码的多肽，包括变体。举例来说，cs04-fl是指全长(full length)密码子改变的cs04多核苷酸序列或由cs04多核苷酸序列编码的氨基酸序列(对于氨基酸(amino acid)序列在本文中有时称为“cs04-fl-aa”，而对于核酸(nucleic acid)序列则为“cs04-fl-na”)。类似地，“cs04-lc”是指编码fviii多肽的轻链的密码子改变的核酸序列(“cs04-lc-na”)或由cs04多核苷酸序列编码的fviii轻链的氨基酸序列(在本文中有时也称为“cs04-lc-aa”)。同样地，cs04-hc、cs04-hc-aa和cs04-hc-na对于fviii重链来说也是一样的情况。如本领域技术人员将了解，对于仅发生密码子改变(例如与refacto相比不含额外氨基酸取代)的诸如cs04等构建体，氨基酸序列将为相同的，因为氨基酸序列不因密码子优化而改变。因此，本公开的序列构建体包括但不限于cs04-fl-na、cs04-fl-aa、cs04-lc-na、cs04-lc-aa、cs04-hc-aa和cs04-hc-na。[0131]iii.密码子改变的因子viii变体[0132]在一些实施方案中，本公开提供编码因子viii变体的密码子改变的多核苷酸。这些密码子改变的多核苷酸当在基于aav的基因疗法构建体中施用时提供显著改善的因子viii表达。与常规密码子优化构建体相比，密码子改变的多核苷酸还展示改善的aav-病毒体包装。如实施例2和表4中所证实，申请人已通过发现编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸(cs04-fl-na)实现了这些优点，所述因子viii多肽具有人野生型因子viii重链和轻链以及短的14氨基酸的b结构域取代的接头(“sq”接头)，所述接头含有弗林蛋白酶裂解位点以促进活性fviiia蛋白质在体内成熟。[0133]在一个实施方案中，本文所提供的密码子改变的多核苷酸具有至少与cs04(seq id no:1)内编码因子viii重链和因子viii轻链的序列具有高序列同一性的核苷酸序列。如本领域中已知的，因子viii的b结构域对于体内活性来说不是必需的。因此，在一些实施方案中，本文所提供的密码子改变的多核苷酸完全缺乏因子viii b结构域。在一些实施方案中，将天然因子viii b结构域替换为含有弗林蛋白酶裂解位点的短氨基酸接头，例如由cs04(seq id no 2)构建体的氨基酸760-773组成的“sq”接头。“sq”接头也称为bdlo04(对于氨基酸序列为bdlo04-aa，而对于核苷酸序列为bdlo04-na)。[0134]在一个实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子viii重链和轻链分别为人因子viii重链和轻链。在其他实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子viii重链和轻链为来自另一种哺乳动物(例如猪因子viii)的重链和轻链序列。在又其他实施方案中，因子viii重链和轻链为嵌合重链和轻链(例如人和第二哺乳动物序列的组合)。在又其他实施方案中，因子viii重链和轻链为来自另一种哺乳动物的重链和轻链的人源化型式，例如其中人残基在所选位置被取代以降低在向人施用时所得肽的免疫原性的来自另一种哺乳动物的重链和轻链序列。[0135]人基因的gc含量变化很大，从低于25％到高于90％。然而，一般来说，具有更高gc含量的人基因以更高的水平表达。举例来说，kudla等人(plos biol.,4(6):80(2006))证实增加基因的gc含量会增加所编码多肽的表达，这主要是通过增加转录和实现mrna转录物的更高稳态水平来实现。一般来说，密码子优化的基因构建体的所需gc含量等于或高于60％。然而，天然aav基因组的gc含量约为56％。[0136]因此，在一些实施方案中，本文所提供的密码子改变的多核苷酸的cg含量更接近于天然aav病毒体的gc含量(例如约56％gc)，所述gc含量低于针对在哺乳动物细胞中表达而进行常规密码子优化的多核苷酸的优选cg含量(例如等于或超过60％gc)。如实施例1中所概述，gc含量为约56％的cs04-fl-na(seq id no:1)与gc含量更高的类似密码子改变的编码序列相比具有改善的病毒体包装。[0137]因此，在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量低于60％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量低于59％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量低于58％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量低于57％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量不超过56％。[0138]在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为54％至59％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为55％至59％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56％至59％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为54％至58％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为55％至58％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56％至58％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为54％至57％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为55％至57％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56％至57％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为54％至56％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为55％至56％。[0139]在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56±0.5％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56±0.4％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56±0.3％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56±0.2％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56±0.1％。在一些实施方案中，编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸的总gc含量为56％。[0140]a.因子viii b结构域取代的接头[0141]在一些实施方案中，进一步改变fviii重链与轻链之间的键联(例如野生型因子viii中的b结构域)。由于aav包装容量的尺寸限制，b结构域缺失、截短和/或接头取代的变体会改善fviii基因疗法构建体的功效。最常用的b结构域取代的接头是sq fviii的接头，它仅保留b结构域的14个氨基酸作为接头序列。猪viii的另一变体(美国专利第6,458,563号中所描述的“obi-1”)在cho细胞中很好地表达，并且具有稍长的24个氨基酸的接头。在一些实施方案中，由本文所描述的密码子改变的多核苷酸编码的因子viii构建体包括sq型b结构域接头序列。在其他实施方案中，由本文所描述的密码子改变的多核苷酸编码的因子viii构建体包括obi-1型b结构域接头序列。[0142]在一些实施方案中，本文所描述的所编码的因子viii多肽包括sq型b结构域接头(sfsqnppvlkrhqr；bdl-sq-aa；seq id no:13)，所述sq型b结构域接头包括野生型人因子viii b结构域(fviii-fl-aa；seq id no:12)的氨基酸760-762/1657-1667(sandberg等人thromb.haemost.85:93(2001))。在一些实施方案中，sq型b结构域接头相对于相应野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，sq型b结构域接头相对于相应野生型序列具有两个氨基酸取代。[0143]在一些实施方案中，本文所描述的所编码的因子viii多肽包括greengene型b结构域接头，所述greengene型b结构域接头包括野生型人因子viii b结构域(fviii-fl-aa；seq id no:12)的氨基酸760/1582-1667(oh等人,biotechnol.prog.,17:1999(2001))。在一些实施方案中，greengene型b结构域接头相对于相应野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，greengene型b结构域接头相对于相应野生型序列具有两个氨基酸取代。[0144]在一些实施方案中，本文所描述的所编码的因子viii多肽包括延长的sq型b结构域接头，所述延长的sq型b结构域接头包括野生型人因子viii b结构域(fviii-fl-aa；seq id no:12)的氨基酸760-769/1657-1667(thim等人,haemophilia,16:349(2010))。在一些实施方案中，延长的sq型b结构域接头相对于相应野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，延长的sq型b结构域接头相对于相应野生型序列具有两个氨基酸取代。[0145]在一些实施方案中，本文所描述的所编码的因子viii多肽包括猪obi-1型b结构域接头，所述猪obi-1型b结构域接头包括来自野生型猪因子viii b结构域的氨基酸sfaqnsrppsasapkppvlrr hqr(seq id no:14)(toschi等人,curr.opin.mol.ther.12:517(2010))。在一些实施方案中，猪obi-1型b结构域接头相对于相应野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，猪obi-1型b结构域接头相对于相应野生型序列具有两个氨基酸取代。[0146]在一些实施方案中，本文所描述的所编码的因子viii多肽包括人obi-1型b结构域接头，所述人obi-1型b结构域接头包括野生型人因子viii b结构域(fviii-fl-aa；seq id no:12)的氨基酸760-772/1655-1667。在一些实施方案中，人obi-1型b结构域接头相对于相应野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，人obi-1型b结构域接头相对于相应野生型序列具有两个氨基酸取代。[0147]在一些实施方案中，本文所描述的所编码的因子viii多肽包括o8型b结构域接头，所述o8型b结构域接头包括来自野生型猪因子viii b结构域的氨基酸sfsqnsrhqayryrrg(seq id no:15)(toschi等人,curr.opin.mol.ther.12:517(2010))。在一些实施方案中，猪obi-1型b结构域接头相对于相应野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，猪obi-1型b结构域接头相对于相应野生型序列具有两个氨基酸取代。[0148]b.编码具有可裂解接头的因子viii变体的密码子改变的多核苷酸[0149]cs04密码子改变的多核苷酸[0150]在一个实施方案中，本文所提供的密码子改变的多核苷酸包括编码具有在体内可裂解的接头的因子viii变体多肽的核苷酸序列。因子viii多肽包括因子viii轻链、因子viii重链和将重链的c端连接至轻链的n端的多肽接头。因子viii多肽的重链由与cs04-hc-na(seq id no:3)具有高序列同一性的第一核苷酸序列编码，所述cs04-hc-na(seq id no:3)为编码因子viii重链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。因子viii多肽的轻链由与cs04-lc-na(seq id no:4)具有高序列同一性的第二核苷酸序列编码，所述cs04-lc-na(seq id no:4)为编码因子viii轻链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。多肽接头包括弗林蛋白酶裂解位点，所述弗林蛋白酶裂解位点允许体内成熟(例如在前体多肽在体内表达或施用之后)。[0151]在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.5％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.9％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)同一。[0152]在一些实施方案中，因子viii构建体的多肽接头由与bdlo04(seq id no:5)具有高序列同一性的第三核苷酸序列编码，所述bdlo04(seq id no:5)编码对应于cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸760-773的14氨基酸接头。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)同一。[0153]在一些实施方案中，密码子改变的多核苷酸具有与cs04-fl-na(seq id no:1)具有高序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)同一。[0154]在一些实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子viii变体具有与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)同一。[0155]c.因子viii表达载体[0156]在一些实施方案中，将本文所描述的密码子改变的多核苷酸整合至表达载体中。表达载体的非限制性实例包括病毒载体(例如适合于基因疗法的载体)、质粒载体、噬菌体载体、粘粒、噬菌粒、人工染色体等。[0157]病毒载体的非限制性实例包括：逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，mmlv)、哈维鼠肉瘤病毒(harvey murine sarcoma virus)、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)；腺病毒、腺相关病毒；sv40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；和脊髓灰质炎病毒。[0158]在一些实施方案中，将本文所描述的密码子改变的多核苷酸整合至基因疗法载体中。在一些实施方案中，基因疗法载体为逆转录病毒，并且特别地为复制缺陷型逆转录病毒。用于制备复制缺陷型逆转录病毒的方案是本领域中已知的。关于综述，参见kriegler,m.,gene transfer and expression,a laboratory manual,w.h.freeman co.,new york(1990)和murry,e.j.,methods in molecular biology,第7卷,humana press,inc.,cliffton,n.j.(1991)。[0159]在一个实施方案中，基因疗法载体为基于腺相关病毒(aav)的基因疗法载体。aav系统先前已有描述，并且总体上是本领域中众所周知的(kelleher和vos,biotechniques,17(6):1110-17(1994)；cotten等人,proc natl acad sci usa,89(13):6094-98(1992)；curiel,nat immun,13(2-3):141-64(1994)；muzyczka,curr top microbiol immunol,158:97-129(1992)；以及asokan a,等人,mol.ther.,20(4):699-708(2012)，这些文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文中)。关于raav载体的产生和使用的细节描述于例如美国专利第5,139,941号和第4,797,368号中，这些专利各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。在特定实施方案中，aav载体为aav-8载体。[0160]在一些实施方案中，将本文所描述的密码子改变的多核苷酸整合至逆转录病毒表达载体中。这些系统先前已有描述，并且总体上是本领域中众所周知的(mann等人,cell,33:153-159,1983；nicolas和rubinstein,vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,rodriguez和denhardt编,stoneham:butterworth,第494-513页,1988；temin,gene transfer,kucherlapati(编),new york:plenum press,第149-188,1986)。在特定实施方案中，逆转录病毒载体为慢病毒载体(参见例如naldini等人,science,272(5259):263-267,1996；zufferey等人,nat biotechnol,15(9):871-875,1997；blomer等人,j virol.,71(9):6641-6649,1997；美国专利第6,013,516号和第5,994,136号)。[0161]可使用多种载体用于在细胞培养物中由密码子改变的多肽表达因子viii多肽，这些载体包括真核和原核表达载体。在某些实施方案中，考虑将质粒载体用于在细胞培养物中表达因子viii多肽。一般来说，将含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体可带有复制位点，以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。质粒将包括可操作地连接至一个或多个控制序列(例如启动子)的编码因子viii多肽的密码子改变的多核苷酸。[0162]用于原核表达的载体的非限制性实例包括质粒，诸如prset、pet、pbad等，其中用于原核表达载体中的启动子包括lac、trc、trp、reca、arabad等。用于真核表达载体的实例包括：(i)对于在酵母中表达，诸如pao、ppic、pyes、pmet的载体，使用诸如aox1、gap、gal1、aug1等的启动子；(ii)对于在昆虫细胞中表达，诸如pmt、pac5、pib、pmib、pbac等的载体，使用诸如ph、p10、mt、ac5、opie2、gp64、polh等的启动子，以及(iii)对于在哺乳动物细胞中表达，诸如psvl、pcmv、prc/rsv、pcdna3、pbpv等的载体，和来源于病毒系统(诸如牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等)的载体，使用诸如cmv、sv40、ef-1、ubc、rsv、adv、bpv和β-肌动蛋白的启动子。[0163]d.给药[0164]本发明提供向已诊断患有a型血友病的人患者(“a型血友病患者”或“患者”)施用本发明的密码子优化的构建体。一般来说，如本文所概述，施用是使用含有本发明的密码子优化的构建体的aav颗粒进行。此外，如下文所更全面地描述，施用本发明的构建体可通过同样施用泼尼松龙或泼尼松扩充。[0165]2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克体重[0166]在一方面，本公开提供一种用于治疗a型血友病的方法，所述方法包括向a型血友病患者静脉内输注(例如通过外周静脉内输注)2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量，其中aav颗粒包括编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸。[0167]在一个实施方案中，以2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量向人患者施用的与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸编码具有在体内可裂解的接头的因子viii变体多肽。因子viii多肽包括因子viii轻链、因子viii重链和将重链的c端连接至轻链的n端的多肽接头。因子viii多肽的重链由与cs04-hc-na(seq id no:3)具有高序列同一性的第一核苷酸序列编码，所述cs04-hc-na(seq id no:3)为编码因子viii重链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。因子viii多肽的轻链由与cs04-lc-na(seq id no:4)具有高序列同一性的第二核苷酸序列编码，所述cs04-lc-na(seq id no:4)为编码因子viii轻链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。多肽接头包括弗林蛋白酶裂解位点，所述弗林蛋白酶裂解位点允许体内成熟(例如在前体多肽在体内表达或施用之后)。[0168]在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.5％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.9％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-hc-aa和cs04-lc-aa同一。[0169]在一些实施方案中，因子viii构建体的多肽接头由与bdlo04(seq id no:5)具有高序列同一性的第三核苷酸序列编码，所述bdlo04(seq id no:5)编码对应于cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸760-773的14氨基酸接头。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸760-773同一。在一些实施方案中，以2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量向人患者施用的密码子改变的多核苷酸具有与cs04-fl-na(seq id no:1)具有高序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-fl-aa同一。[0170]在一些实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子viii变体具有与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)同一。[0171]因此，在一个实施方案中，本公开提供一种用于治疗a型血友病的方法，所述方法包括向a型血友病患者静脉内输注2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量，其中aav颗粒包括具有seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。[0172]在一些实施方案中，通过静脉内输注(例如输注到患者手臂的静脉中)以单次剂量施用aav颗粒。在一些实施方案中，施用单次剂量的一部分，在短时间内(例如30分钟)监测患者对施用的不良反应体征，并且随后(例如如果未出现不良反应体征)向患者施用单次剂量的剩余部分。[0173]在一些实施方案中，施用aav颗粒的人患者患有严重a型血友病。举例来说，在一些实施方案中，当未接受因子viii替代疗法时，患者血流中的因子viii活性水平低于参考血液样品(例如，具有正常因子viii活性的血液样品(例如来自确定未患有a型血友病的受试者的血液样品))中存在的因子viii活性量或多个确定未患有a型血友病的受试者的血液样品中存在的平均因子viii活性的2％。在一些实施方案中，当未接受因子viii替代疗法时，受试者血流中的因子viii活性水平低于参考血液样品中存在的因子viii活性量的2％。[0174]在一些实施方案中，施用aav颗粒的人患者不具有fviii抑制剂(例如因子viii抑制剂抗体)、不具有除严重a型血友病以外的止血缺陷、不具有慢性肝功能障碍和/或不具有严重肾损伤。[0175]因此，在一些实施方案中，本文所描述的方法包括鉴定患者以便施用2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量的步骤，其中aav颗粒包括编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸。所述方法包括在患者未接受因子viii替代疗法时测定患者血流中的因子viii活性水平，以及鉴定患者以便在患者血流中的因子viii活性水平低于参考样品中的因子viii水平的约2％或低于约1％时施用aav颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括确定患者是否具有一种或多种fviii抑制剂(例如因子viii抑制剂抗体)、除严重a型血友病以外的止血缺陷、慢性肝功能障碍和严重肾损伤，以及如果患者具有所列举疾患中的任一者则淘汰所述患者。[0176]6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克体重[0177]在一方面，本公开提供一种用于治疗a型血友病的方法，所述方法包括向a型血友病患者静脉内输注(例如通过外周静脉内输注)6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量，其中aav颗粒包括编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸。[0178]在一个实施方案中，以6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量向人患者施用的与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸编码具有在体内可裂解的接头的因子viii变体多肽。因子viii多肽包括因子viii轻链、因子viii重链和将重链的c端连接至轻链的n端的多肽接头。因子viii多肽的重链由与cs04-hc-na(seq id no:3)具有高序列同一性的第一核苷酸序列编码，所述cs04-hc-na(seq id no:3)为编码因子viii重链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。因子viii多肽的轻链由与cs04-lc-na(seq id no:4)具有高序列同一性的第二核苷酸序列编码，所述cs04-lc-na(seq id no:4)为编码因子viii轻链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。多肽接头包括弗林蛋白酶裂解位点，所述弗林蛋白酶裂解位点允许体内成熟(例如在前体多肽在体内表达或施用之后)。[0179]在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.5％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.9％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-hc-aa和cs04-lc-aa同一。[0180]在一些实施方案中，因子viii构建体的多肽接头由与bdlo04(seq id no:5)具有高序列同一性的第三核苷酸序列编码，所述bdlo04(seq id no:5)编码对应于cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸760-773的14氨基酸接头。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸760-773同一。[0181]在一些实施方案中，以6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量向人患者施用的密码子改变的多核苷酸具有与cs04-fl-na(seq id no:1)具有高序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-fl-aa同一。[0182]在一些实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子viii变体具有与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)同一。[0183]因此，在一个实施方案中，本公开提供一种用于治疗a型血友病的方法，所述方法包括向a型血友病患者静脉内输注6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量，其中aav颗粒包括具有seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。[0184]在一些实施方案中，通过静脉内输注(例如输注到患者手臂的静脉中)以单次剂量施用aav颗粒。在一些实施方案中，施用单次剂量的一部分，在短时间内(例如30分钟)监测患者对施用的不良反应体征，并且随后(例如如果未出现不良反应体征)向患者施用单次剂量的剩余部分。[0185]在一些实施方案中，施用aav颗粒的人患者患有严重a型血友病。举例来说，在一些实施方案中，当未接受因子viii替代疗法时，患者血流中的因子viii活性水平低于参考血液样品(例如，具有正常因子viii活性的血液样品(例如来自确定未患有a型血友病的受试者的血液样品))中存在的因子viii活性量或多个确定未患有a型血友病的受试者的血液样品中存在的平均因子viii活性的2％。在一些实施方案中，当未接受因子viii替代疗法时，受试者血流中的因子viii活性水平低于参考血液样品中存在的因子viii活性量的2％。[0186]在一些实施方案中，施用aav颗粒的人患者不具有fviii抑制剂(例如因子viii抑制剂抗体)、不具有除严重a型血友病以外的止血缺陷、不具有慢性肝功能障碍和/或不具有严重肾损伤。[0187]因此，在一些实施方案中，本文所描述的方法包括鉴定患者以便施用6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量的步骤，其中aav颗粒包括编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸。所述方法包括在患者未接受因子viii替代疗法时测定患者血流中的因子viii活性水平，以及鉴定患者以便在患者血流中的因子viii活性水平低于参考样品中的因子viii水平的约2％或低于约1％时施用aav颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括确定患者是否具有一种或多种fviii抑制剂(例如因子viii抑制剂抗体)、除严重a型血友病以外的止血缺陷、慢性肝功能障碍和严重肾损伤，以及如果患者具有所列举疾患中的任一者则淘汰所述患者。[0188]1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克体重[0189]在一方面，本公开提供一种用于治疗a型血友病的方法，所述方法包括向a型血友病患者静脉内输注(例如通过外周静脉内输注)1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量，其中aav颗粒包括编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸。[0190]在一个实施方案中，以1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量向人患者施用的与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸编码具有在体内可裂解的接头的因子viii变体多肽。因子viii多肽包括因子viii轻链、因子viii重链和将重链的c端连接至轻链的n端的多肽接头。因子viii多肽的重链由与cs04-hc-na(seq id no:3)具有高序列同一性的第一核苷酸序列编码，所述cs04-hc-na(seq id no:3)为编码因子viii重链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。因子viii多肽的轻链由与cs04-lc-na(seq id no:4)具有高序列同一性的第二核苷酸序列编码，所述cs04-lc-na(seq id no:4)为编码因子viii轻链的cs04-fl-na(seq id no:1)的一部分。多肽接头包括弗林蛋白酶裂解位点，所述弗林蛋白酶裂解位点允许体内成熟(例如在前体多肽在体内表达或施用之后)。[0191]在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.5％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)具有至少99.9％序列同一性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别与cs04-hc-na和cs04-lc-na(seq id no 3和4)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-hc-aa和cs04-lc-aa同一。[0192]在一些实施方案中，因子viii构建体的多肽接头由与bdlo04(seq id no:5)具有高序列同一性的第三核苷酸序列编码，所述bdlo04(seq id no:5)编码对应于cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸760-773的14氨基酸接头。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与bdlo04(seq id no:5)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸760-773同一。在一些实施方案中，以1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量向人患者施用的密码子改变的多核苷酸具有与cs04-fl-na(seq id no:1)具有高序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少95％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与cs04-fl-na(seq id no:1)同一。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与cs04-fl-aa同一。[0193]在一些实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子viii变体具有与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与cs04-fl-aa(seq id no:2)同一。[0194]因此，在一个实施方案中，本公开提供一种用于治疗a型血友病的方法，所述方法包括向a型血友病患者静脉内输注1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量，其中aav颗粒包括具有seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。[0195]在一些实施方案中，通过静脉内输注(例如输注到患者手臂的静脉中)以单次剂量施用aav颗粒。在一些实施方案中，施用单次剂量的一部分，在短时间内(例如30分钟)监测患者对施用的不良反应体征，并且随后(例如如果未出现不良反应体征)向患者施用单次剂量的剩余部分。[0196]在一些实施方案中，施用aav颗粒的人患者患有严重a型血友病。举例来说，在一些实施方案中，当未接受因子viii替代疗法时，患者血流中的因子viii活性水平低于参考血液样品(例如，具有正常因子viii活性的血液样品(例如来自确定未患有a型血友病的受试者的血液样品))中存在的因子viii活性量或多个确定未患有a型血友病的受试者的血液样品中存在的平均因子viii活性的2％。在一些实施方案中，当未接受因子viii替代疗法时，受试者血流中的因子viii活性水平低于参考血液样品中存在的因子viii活性量的2％。[0197]在一些实施方案中，施用aav颗粒的人患者不具有fviii抑制剂(例如因子viii抑制剂抗体)、不具有除严重a型血友病以外的止血缺陷、不具有慢性肝功能障碍和/或不具有严重肾损伤。[0198]因此，在一些实施方案中，本文所描述的方法包括鉴定患者以便施用1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克人患者体重的剂量的步骤，其中aav颗粒包括编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸。所述方法包括在患者未接受因子viii替代疗法时测定患者血流中的因子viii活性水平，以及鉴定患者以便在患者血流中的因子viii活性水平低于参考样品中的因子viii水平的约2％或低于约1％时施用aav颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括确定患者是否具有一种或多种fviii抑制剂(例如因子viii抑制剂抗体)、除严重a型血友病以外的止血缺陷、慢性肝功能障碍和严重肾损伤，以及如果患者具有所列举疾患中的任一者则淘汰所述患者。[0199]与泼尼松龙或泼尼松共同施用[0200]在一些实施方案中，上文所描述的通过以任一剂量施用aav颗粒来治疗a型血友病的方法还包括向人患者施用泼尼松龙或泼尼松的疗程(例如)以例如通过降低受试者的细胞因子和/或趋化因子产生来降低炎症反应水平。与基因疗法共施用泼尼松龙或泼尼松的实例方法描述于例如国际专利申请公布第wo 2008/069942号中，所述专利的内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。[0201]在一些实施方案中，在施用具有编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的多核苷酸的腺相关病毒(aav)颗粒之前向人患者施用泼尼松龙或泼尼松。举例来说，在一些实施方案中，在向患者施用aav颗粒之前约一周或约一或两天施用泼尼松龙或泼尼松。在一些实施方案中，在施用aav颗粒之前约一周或约一或两天开始施用泼尼松龙或泼尼松的疗程，并且在施用aav颗粒之后继续。[0202]在一些实施方案中，在施用具有编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的多核苷酸的腺相关病毒(aav)颗粒时向人受试者共同施用泼尼松龙或泼尼松。举例来说，在一些实施方案中，在同一天(例如在施用aav颗粒之前或之后立即)施用泼尼松龙或泼尼松。在一些实施方案中，在施用aav颗粒的同一天施用泼尼松龙或泼尼松的疗程，并且在施用aav颗粒之后继续。[0203]在一些实施方案中，在施用具有编码因子viii多肽且与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的多核苷酸的腺相关病毒(aav)颗粒之后向患者施用泼尼松龙或泼尼松。举例来说，在一些实施方案中，在向患者施用aav颗粒之后约一或两天第一次施用泼尼松龙或泼尼松。[0204]应注意泼尼松龙或泼尼松为经口施用(但其还可静脉内施用)的小分子药物，并且因此在此情形下“共同施用”不要求含有两种药物的单一溶液。[0205]在一些实施方案中，在至少两周的时间段内(例如)每天或每两天向患者施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。在一些实施方案中，在至少三周的时间段内施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。在一些实施方案中，在疗程期间泼尼松龙或泼尼松的剂量减少。举例来说，在一个实施方案中，疗程以施用约60mg泼尼松龙或泼尼松/天开始，并且随着疗程进行而减少。[0206]在一个实施方案中，疗程包括在疗程的第一周期间向人患者施用约60mg泼尼松龙或泼尼松/天，在疗程的第二周期间向患者施用约40mg泼尼松龙或泼尼松/天，以及在输注aav颗粒后紧接着第三周期间向患者施用约30mg泼尼松龙或泼尼松/天。[0207]在一些实施方案中，疗程包括在第三周之后进一步逐渐减少泼尼松龙或泼尼松的施用，例如施用逐渐减少剂量的泼尼松龙或泼尼松。在一个实施方案中，逐渐减少剂量的泼尼松龙或泼尼松包括依次施用约20mg泼尼松龙或泼尼松/天、约15mg泼尼松龙或泼尼松/天、约10mg泼尼松龙或泼尼松/天和约5mg泼尼松龙或泼尼松/天的剂量(例如一个或多个各浓度的剂量)。[0208]在一个实施方案中，逐渐减少剂量的泼尼松龙或泼尼松包括在完成泼尼松龙或泼尼松的初始疗程后(例如紧接着)连续5天向患者施用约20mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用20mg泼尼松龙或泼尼松5天后(例如紧接着)连续3天向患者施用约15mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用15mg泼尼松龙或泼尼松3天后(例如紧接着)连续3天向患者施用约10mg泼尼松龙或泼尼松/天，以及在向患者施用10mg泼尼松龙或泼尼松3天后(例如紧接着)连续3天向患者施用约5mg泼尼松龙或泼尼松/天。[0209]在一个实施方案中，逐渐减少剂量的泼尼松龙或泼尼松包括在完成泼尼松龙或泼尼松的初始疗程后紧接着连续7天向患者施用约30mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用30mg泼尼松龙或泼尼松7天后紧接着连续7天向患者施用约20mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向人受试者施用20mg泼尼松龙或泼尼松7天后紧接着连续5天向患者施用约15mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用15mg泼尼松龙或泼尼松5天后紧接着连续5天向患者施用约10mg泼尼松龙或泼尼松/天，以及在向患者施用10mg泼尼松龙或泼尼松5天后紧接着连续5天向患者施用约5mg泼尼松龙或泼尼松/天。[0210]在一些实施方案中，向患者施用逐渐减少剂量的泼尼松龙或泼尼松的时长是基于，在泼尼松龙或泼尼松的初始疗程结束时，患者是否仍然显示肝脏炎症体征(例如，如由因子viii水平(例如因子viii效价或因子viii活性)降低或肝酶增加所指示)而确定。[0211]举例来说，在一个实施方案中，在向患者施用包括编码因子viii蛋白的多核苷酸的腺相关病毒(aav)颗粒后，测定患者的血流中(例如从患者收集的血液样品中)的第一因子viii水平(例如效价或活性)且同时患者接受糖皮质激素类固醇治疗的初始疗程。在完成糖皮质激素类固醇治疗的初始疗程之后，测定患者血流中的第二因子viii水平(例如效价或活性)。随后将第二因子viii水平与第一因子viii水平比较。当第二因子viii水平未降低时(例如，当第二因子viii水平不低于第一因子viii水平或不低于第一因子viii水平之下的阈值量时)，在不超过三周的时间段内向患者施用第一逐渐减少剂量的糖皮质激素类固醇。当第二因子viii水平降低时(例如，当第二因子viii水平低于第一因子viii水平或低于第一因子viii水平之下的阈值量时)，在超过三周的时间段内向患者施用第二逐渐减少剂量的糖皮质激素类固醇。[0212]相似地，在一些实施方案中，在向患者施用包括编码因子viii蛋白的多核苷酸的腺相关病毒(aav)颗粒之前(例如，或之后不久)测定患者血流中的第一肝酶水平(例如肝酶效价或活性)。在完成糖皮质激素类固醇治疗的初始疗程之后，测定患者血流中的肝酶水平的第二水平(例如肝酶效价或活性)。随后将第二肝酶水平与第一肝酶水平比较。当第二肝酶水平未增加时(例如，当第二肝酶水平不超过第一肝酶水平或不超过第一肝酶水平之上的阈值量时)，在不超过三周的时间段内向患者施用第一逐渐减少剂量的糖皮质激素类固醇。当第二肝酶水平增加时(例如，当第二肝酶水平超过第一肝酶水平或超过第一肝酶水平之上的阈值量时)，在超过三周的时间段内向患者施用第二逐渐减少剂量的糖皮质激素类固醇。[0213]在一些实施方案中，第一逐渐减少剂量的泼尼松龙或泼尼松包括在完成泼尼松龙或泼尼松的初始疗程后(例如紧接着)连续5天向患者施用约20mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用20mg泼尼松龙或泼尼松5天后(例如紧接着)连续3天向患者施用约15mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向人受试者施用15mg泼尼松龙或泼尼松3天后(例如紧接着)连续3天向患者施用约10mg泼尼松龙或泼尼松/天，以及在向患者施用10mg泼尼松龙或泼尼松3天后(例如紧接着)连续3天向患者施用约5mg泼尼松龙或泼尼松/天。[0214]在一些实施方案中，第二逐渐减少剂量的泼尼松龙或泼尼松包括在完成泼尼松龙或泼尼松的初始疗程后紧接着连续7天向患者施用约30mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用30mg泼尼松龙或泼尼松7天后紧接着连续7天向患者施用约20mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用20mg泼尼松龙或泼尼松7天后紧接着连续5天向患者施用约15mg泼尼松龙或泼尼松/天，在向患者施用15mg泼尼松龙或泼尼松5天后紧接着连续5天向患者施用约10mg泼尼松龙或泼尼松/天，以及在向患者施用10mg泼尼松龙或泼尼松5天后紧接着连续5天向患者施用约5mg泼尼松龙或泼尼松/天。[0215]在一些实施方案中，在施用aav颗粒后在患者中检测到免疫应答的迹象之后施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。在一些实施方案中，在患者中检测到肝脏炎症的迹象之后施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。举例来说，在一些实施方案中，在施用aav颗粒后监测患者的肝脏炎症，并且在检测到肝脏炎症后向患者施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。[0216]在一些实施方案中，患者血流中的因子viii表达或因子viii活性的迅速或大幅降低指示受试者的肝脏炎症。在一些实施方案中，有可能可观察到因子viii活性的早期峰值，随后少量和/或逐渐降低，其后在稍微更低水平下形成因子viii蛋白，不需要施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。举例来说，在一些实施方案中，在施用aav颗粒后监测患者血流中的因子viii的量(例如因子viii效价或因子viii活性水平)，并且如果检测到因子viii的量迅速或大幅降低(例如，相较于施用aav颗粒后患者血流中的水平超过因子viii效价或因子viii活性水平的阈值降低)，则向受试者施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。[0217]在一些实施方案中，患者的肝酶水平增加指示受试者的肝脏炎症。举例来说，在一些实施方案中，在施用aav颗粒后监测患者的肝酶水平，并且如果检测到肝酶水平的增加(例如，(例如)相较于施用aav颗粒之前或施用aav颗粒之后不久患者中的肝酶基线水平，超过肝酶量的阈值增加)，则向患者施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。[0218]施用后监测[0219]在一些实施方案中，提供用于在施用腺相关病毒(aav)颗粒后监测患者的不良反应和/或治疗功效的方法，所述腺相关病毒(aav)颗粒具有编码因子viii多肽的多核苷酸，例如与seq id no:1(cs04-fl-na)具有高序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，针对以下中的一或多者监测患者：(a)肝脏炎症的迹象(例如，经由因子viii水平(例如效价或活性)的迅速或大幅降低和/或肝酶(例如效价或活性)的增加)，(b)患者血流中的因子viii抑制剂抗体的增加，(c)患者血流中的衣壳蛋白的增加，(d)患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的增加，以及(e)患者血流中的编码因子viii多肽的多核苷酸或其片段的增加。在一些实施方案中，在检测到一个或多个不良反应和/或治疗无效后进一步治疗受试者。[0220]举例来说，在一个实施方案中，提供用于监测使用腺相关病毒(aav)颗粒的a型血友病的因子viii基因疗法的功效的方法，所述腺相关病毒(aav)颗粒包括编码因子viii多肽的多核苷酸。所述方法包括在向患者施用aav颗粒之后，确定在患者的血流中(例如在从患者收集的血液样品中)是否存在因子viii抑制剂抗体。在一些实施方案中，当在患者的血流中检测到因子viii抑制剂抗体时(例如，当与施用aav颗粒之前患者中的水平相比，检测到因子viii抑制剂抗体水平的增加时)，所述方法包括向患者施用替代性剂用于治疗a型血友病。[0221]在一些实施方案中，用于治疗a型血友病的替代性剂为因子viii的替代形式(例如不包括或掩蔽被所检测到的因子viii抑制剂抗体靶向的表位中的一者或多者的一种替代形式)。在一些实施方案中，因子viii的替代形式为化学修饰的因子viii蛋白(例如化学修饰的人或猪因子viii蛋白)。在一些实施方案中，因子viii的替代形式为来源于非人因子viii蛋白的因子viii蛋白，例如猪因子viii蛋白。在一些实施方案中，用于治疗a型血友病的替代性剂为因子viii旁路疗法，例如包括因子ii、因子ix和因子x的治疗剂。举例来说，在一些实施方案中，因子viii旁路疗法为因子viii抑制剂旁路活性(feiba)复合物、重组活化因子vii(fviia)、凝血酶原复合浓缩物或活化凝血酶原复合浓缩物。[0222]在一个实施方案中，提供用于在施用aav颗粒后监测患者的血流中编码因子viii多肽的多核苷酸或其片段的水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括编码因子viii蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中编码因子viii蛋白的多核苷酸或其片段的水平，其中所述稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括具有seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中seq id no:1的核酸或其片段的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括具有seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中seq id no:1的核酸或其片段的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括具有seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中seq id no:1的核酸或其片段的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在所述方法的一些实施方案中，稍后时间点为稍后至少14天或稍后至少21天。在一些实施方案中，稍后时间点为施用aav颗粒之后7天、14天或21天时。[0223]在一个实施方案中，提供用于在施用aav颗粒后监测患者的血流中衣壳蛋白水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克所述患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和多核苷酸，所述多核苷酸包括seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。所述方法还包括在稍后时间点测量所述患者的血流中的衣壳蛋白水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和多核苷酸，所述多核苷酸包括seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。所述方法还包括在稍后时间点测量所述患者的血流中的衣壳蛋白水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和多核苷酸，所述多核苷酸包括seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。所述方法还包括在稍后时间点测量所述患者的血流中的衣壳蛋白水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用腺相关病毒(aav)颗粒/千克所述患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和编码因子viii蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量所述患者的血流中的衣壳蛋白水平，其中稍后时间点为7天或更久。在所述方法的一些实施方案中，稍后时间点为稍后至少14天或稍后至少21天。在一些实施方案中，稍后时间点为施用aav颗粒之后7天、14天或21天时。[0224]在一个实施方案中，提供用于在施用aav颗粒后监测患者的血流中因子viii抑制剂抗体的水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括包含seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中抗因子viii抗体的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括包含seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中抗因子viii抗体的水平，其中所述稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括包含seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中抗因子viii抗体的水平，其中所述稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用腺相关病毒(aav)颗粒的剂量，其中aav颗粒包括编码因子viii蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中抗因子viii抗体的水平，其中所述稍后时间点为7天或更久。在所述方法的一些实施方案中，稍后时间点为稍后至少14天或稍后至少21天。在一些实施方案中，稍后时间点为施用aav颗粒之后7天、14天或21天时。[0225]在一个实施方案中，提供用于在施用aav颗粒后监测受试者的血流中抗衣壳蛋白抗体的水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用2x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克所述患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和多核苷酸，所述多核苷酸包括seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。所述方法还包括在稍后时间点测量患者的血流中抗衣壳蛋白抗体的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用6x1012个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和多核苷酸，所述多核苷酸包括seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。所述方法还包括在稍后时间点测量所述患者的血流中抗衣壳蛋白抗体的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用1.8x1013个腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和多核苷酸，所述多核苷酸包括seq id no:1(cs04-fl-na)的核酸序列。所述方法还包括在稍后时间点测量所述患者的血流中抗衣壳蛋白抗体的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向a型血友病患者施用腺相关病毒(aav)颗粒/千克患者体重的剂量，其中aav颗粒包括衣壳蛋白和编码因子viii蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后时间点测量所述患者的血流中抗衣壳蛋白抗体的水平，其中稍后时间点为7天或更久。在所述方法的一些实施方案中，稍后时间点为稍后至少14天或稍后至少21天。在一些实施方案中，稍后时间点为施用aav颗粒之后7天、14天或21天时。[0226]iv.实施例[0227]实施例1-密码子改变的因子viii变体表达序列的构建[0228]为了形成对于a型血友病的基因疗法有效的因子viii编码序列，必须克服两个障碍。第一，由于常规基因疗法递送载体(例如aav病毒体)的基因组尺寸限制，必须使所编码的因子viii多肽明显缩短。第二，必须改变编码序列以：(i)稳定递送载体内的包装相互作用，(ii)稳定mrna中间形态，并且(iii)改善mrna转录/翻译的稳健性。[0229]为了实现第一个目标，申请人从在本文中称为“fviii-bdd-sq”的b结构域缺失的因子viii变体构建体入手。在此构建体中，将b结构域用被称为“sq”序列的14氨基酸序列替换。重组fviii-bdd-sq是以商品名出售，并且已显示对于a型血友病的控制是有效的。然而，包括因子viii重链和轻链的人野生型核酸序列的fviii-bdd-sq的天然编码序列在基因疗法载体中无效地表达。[0230]为解决天然fviii-bdd-sq的不良表达，将如在ward等人(blood,117:798(2011))和mcintosh等人(blood,121,3335-3344(2013))中所描述而改良的在fath等人(plos one,6:e17596(2011))中所描述的密码子优化算法应用于fviii-bdd-sq序列以形成第一中间编码序列cs04a。然而，申请人认识到可通过对序列进一步修饰来改进使用改良算法所形成的cs04a序列。因此，申请人重新引入了cpg二核苷酸，重新引入了用于精氨酸的cgc密码子，改变了亮氨酸和丝氨酸密码子分布，重新引入了高度保守的密码子对，并且去除了隐蔽的tata盒、ccaat盒和剪接位点元件，同时避免cpg岛和富含at和富含gc的序列段(stretch)的局部过表达。[0231]首先，改良的算法用非cpg二核苷酸密码子系统地替换含有cpg二核苷酸的密码子(例如精氨酸密码子)，并且消除/避免由相邻密码子形成的cpg二核苷酸。通常这样严格避免cpg二核苷酸以防止在肌肉内注射dna疫苗后tlr诱导的免疫性。然而，这样做限制了密码子优化的可能性。举例来说，改良的算法排除使用完整的cgx精氨酸密码子集合。这在用于在人细胞中表达的基因的编码中特别具有破坏性，因为cgc是高度表达的人基因中最常使用的精氨酸密码子。此外，避免由相邻密码子形成cpg进一步限制了优化可能性(例如限制了可一起使用的密码子对的数目)。[0232]因为预期tlr诱导的免疫性不是与肝脏定向的基于aav的基因疗法相关的问题，所以将包括cpg的密码子和形成cpg的相邻密码子优先在编码因子viii轻链的序列中(例如在fviii-bdd-sq编码序列的3’末端)重新引入中间编码序列cs04a中。这允许更频繁地使用优选的人密码子，特别是那些用于精氨酸的密码子。然而，谨慎避免形成cpg岛，所述cpg岛为编码序列中具有高cpg位点频率的区域。这与krinner等人(nucleic acids res.,42(6):3551-64(2014))的教示不同，所述文献表明转录起始位点下游的cpg结构域促进高水平的基因表达。[0233]其次，改良算法排他性地应用于某些密码子，诸如用于亮氨酸的ctg、用于缬氨酸的gtg和用于谷氨酰胺的cag。然而，这违反了例如如haas等人(current biology,6(3):315-24(1996))中所提出的平衡密码子使用的原则。为了说明改良算法对优选密码子的过度使用，在适用于密码子改变的其他规则(例如cpg频率和gc含量)允许的情况下，重新引入替代亮氨酸密码子。[0234]第三，当某些准则(例如存在cg二核苷酸)得到满足时，改良算法替换密码子对而不考虑它们在自然界中有多保守。为了说明通过进化可能保守的有益性质，对由算法替换的最保守的密码子对和例如如tats等人(bmc genomics 9:463(2008))中所描述的最保守的优选密码子对进行分析，并且在适用于密码子改变的其他规则(例如cpg频率和gc含量)允许的情况下进行调整。[0235]第四，还对中间编码序列中所用的丝氨酸密码子进行重新工程化。具体地说，将agc、tcc和tct丝氨酸密码子以更高的频率引入修饰的编码序列中，以总体上更好地匹配人密码子使用(haas等人,同上)。[0236]第五，筛查tata盒、ccaat盒元件和内含子/外显子剪接位点并且从修饰的编码序列中去除。当修饰编码序列时，应谨慎避免富含at或富含gc的序列段的局部过表达。[0237]最后，除了优化编码序列内的密码子使用之外，当进一步精制中间编码序列cs04a时，还考虑基础aav病毒体的结构要求。将aav载体(例如aav病毒体的核酸部分)以单链dna分子形式包装到它们的衣壳中(关于综述，参见daya和berns,clin.microbiol rev.,21(4):583-93(2008))。因此，载体的gc含量可能影响基因组的包装，并且因而影响制备期间的载体产量。像许多算法一样，在此所用的改良算法形成gc含量为至少60％的优化基因序列(参见fath等人,plos one,6(3):e17596(2011)(于plos one,(6)3(2011)中更正)。然而，aav8衣壳蛋白由具有约56％的较低gc含量的核苷酸序列编码。因此，为了更好地模拟天然aav8衣壳蛋白编码序列，使中间编码序列cs04a的gc含量降至56％。[0238]图2中所示的所得cs04编码序列的总gc含量为56％。该序列的cpg二核苷酸含量为适度的。然而，cpg二核苷酸主要存在于编码序列的下游部分，例如编码因子viii轻链的部分。cs04序列与野生型因子viii(genbank登录号m14113)中的相应编码序列具有79.77％的核苷酸序列同一性。[0239]出于比较的目的，制备了若干其他密码子优化的refacto构建体。如radcliff p.m.等人,gene therapy,15:289-97(2008)所述对cs08refacto构建体进行密码子优化，该文献的内容出于所有目的特此以引用的方式明确整体并入本文中。从eurofins genomics(ebersberg,germany)获得cs10密码子优化的refacto构建体。从integrated dna technologies,inc.(coralville,usa)获得cs11密码子优化的refacto构建体。从thermofischer scientific的geneart服务中心(regensburg,germany)获得ch25密码子优化的refacto构建体。cs40 refacto构建体由野生型因子viii编码序列组成。下表2中示出了各个refacto编码序列之间拥有的序列同一性。[0240]表2-密码子改变的因子viii构建体的同一性百分比矩阵.[0241] cs04cs08cs10cs11cs40ch25cs04100％ꢀꢀꢀꢀꢀcs0882.2.％100％ꢀꢀꢀꢀcs1079.4％78.4％100％ꢀꢀꢀcs1178.3％78.1％77.5％100％ꢀꢀcs4079.8％76.7％77.6％75.4％100％ ch2585.1％85.0％79.9％79.4％75.8％100％[0242]通过将不同的合成dna片段克隆至相同的载体骨架质粒(pch-bb01)中来构建各构建体的质粒。通过thermofischer scientific(regensburg,germany)来进行具有侧接的asci和noti酶限制位点的refacto型bdd-fviii片段的dna合成。载体骨架含有涵盖来源于肝脏特异性鼠转甲状腺素蛋白基因的启动子/增强子序列的两个侧接的aav2源性的反向末端重复序列(itr)、用于插入对应refacto型bdd-fviii的asci和noti酶限制位点和合成的polya位点。在经由asci和noti位点连结所制备的载体骨架与插入物之后，以毫克规模对所得质粒进行扩增。通过直接测序(microsynth,balgach,switzerland)来验证构建体的refacto型bdd-fviii序列。克隆产生命名为pcs40、pcs04、pcs08、pcs10、pcs11和pch25的七种不同的质粒构建体(图14)。这些构建体具有相同的载体骨架并且编码相同的b结构域缺失的fviii蛋白(refacto型bdd-fviii)，但它们的fviii编码序列有所不同。[0243]如以下文献中所描述通过三种质粒转染方法制备基于aav8的载体：grieger jc等人(virus vectors using suspension hek293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for gmp fix and flt1 clinical vector,mol ther.,oct 6.(2015)doi:10.1038/mt.2015.187.[印刷版之前的电子版])，该文献的内容出于所有目的特此以引用的方式整体明确并入本文中。使用hek293悬浮液细胞采用对应fviii载体质粒、辅助质粒pxx6-80(携带腺病毒辅助基因)和包装质粒pgsk2/8(贡献rep2和cap8基因)进行质粒转染。为了分离aav8构建体，如grieger等人(2015，同上)中所描述，使用碘克沙醇(iodixanol)梯度对1升培养物的细胞沉淀进行加工。该程序产生称为vcs04、vcs08、vcs10、vcs11和vch25的载体制剂。通过qpcr使用靶向aav2反向末端重复序列的通用qpcr程序对载体进行定量(aurnhammer,human gene therapy methods:b部分23:18–28(2012))。携带aav2反向末端重复序列的对照载体质粒用于制备标准曲线。所得vcs04构建体在图7a至图7c中以seq id no:8形式呈现。[0244]通过aav琼脂糖凝胶电泳分析载体基因组的完整性。如fagone等人,human gene therapy methods 23:1-7(2012)中所描述进行电泳。简言之，将aav载体制剂在0.5％sds存在下在75℃下孵育10分钟，然后冷却至室温。在1％1xtae琼脂糖凝胶上每个泳道加载约1.5e10个载体基因组(vg)并且在每厘米凝胶长度7v下电泳60min。然后将凝胶在2x gelred(biotium目录号41003)溶液中染色并通过chemidoctmmp(biorad)成像。图15中所示的结果证实vcs04和vcs40病毒载体具有由5kb范围内的独特条带(图15，泳道2-4)指示的相同尺寸的基因组。尽管载体尺寸为约5.2kb，但基因组为均匀条带，证实尺寸有些过大的基因组(相对于4.7kb的aav野生型基因组)的恰当包装。所有其他vcs载体制剂显示相同的基因组尺寸(数据未显示)。[0245]为了确认预期衣壳蛋白模式，用载体vcs04和vcs40进行sds page，随后进行银染色(图16)。如图中所示，下游纯化程序产生展示vp1、vp2和vp3的预期蛋白模式的高度纯化的材料(图16，泳道2-4)。在所有其他病毒制剂(未显示)情况下观察到相同的模式。根据标准程序来完成aav制剂的sds-page程序。各泳道含有1e10 vg的对应病毒构建体，并且根据制造商的说明书在4-12％bis-tris(novex,life technologies)凝胶上进行分离。根据制造商的说明书用silverquesttm试剂盒(novex,life technologies)进行银染色。[0246]令人惊讶地，与vcs40野生型编码构建体和其他密码子优化构建体相比，aav载体vcs04具有由在aav病毒制备中的更高产量度量的更高程度的病毒体包装。如表3中所示，vcs04载体基本上比vcs40更好地复制，从而在aav效价中提供5-7倍的产量增加。[0247]表3-使用如从细胞沉淀纯化的aav载体构建体vcs04和vcd40获得的每升细胞培养物的产量.[0248][0249]实施例2-密码子改变的因子viii变体表达序列的体内表达[0250]为了测试密码子改变的因子viii变体序列的生物效力，将实施例1中所描述的refacto型fviii构建体施用至缺乏因子viii的小鼠。简言之，在c57bl/6fviii敲除(ko)小鼠中(每组6-8个动物)通过尾部静脉注射4e12个载体基因组(vg)/千克小鼠体重来进行测定。注射后14天时通过眶后穿刺取血，并且使用标准程序制备血浆并冷冻。选择第14天的表达水平，因为此时抑制性抗体的影响极小，所述抑制性抗体在稍后时间在此小鼠模型的一些动物中可被观察到。使用如制造商(technoclone,vienna,austria)建议所进行的technochrome fviii测定来确定小鼠血浆中的fviii活性，仅进行少量修改。对于该测定，将血浆样品适当稀释并与含有凝血酶、活化的因子ix(fixa)、磷脂、因子x和钙的测定试剂混合。fviii在由凝血酶活化之后，形成与fixa、磷脂和钙的复合物。此复合物将fx活化为活化的fx(fxa)，活化的fx进而从显色底物上裂解对硝基苯胺(pna)。在405nm下测量pna形成的动力学。速率与样品中的fviii浓度成正比。从参考曲线读取fviii浓度，并且以iu fviii/毫升的形式给出结果。[0251]下表4中所呈现的结果证实使用商业算法设计的密码子改变的序列(cs10、cs11和ch25)与野生型bdd-因子viii构建体(cs40)相比仅提供bdd-因子viii的适度增加(3-4倍)。类似地，如radcliffe等人(cs08)中所描述制备的密码子改变的bdd-因子viii构建体仅提供bdd-fviii表达的3-4倍的增加。此结果与radcliff等人中报告的结果一致。令人惊讶地，cs04构建体在体内生物效力测定中提供高得多的bdd-fviii表达(例如74倍)。[0252]表4-在fviii敲除小鼠的血浆中由不同的aav载体构建体诱导的fviii表达.[0253][0254]实施例3-小鼠中人fviii基因疗法载体的非临床功效和毒理学评估[0255]a型血友病为由缺少因子viii(fviii)或缺陷性因子viii(fviii)所引起的遗传性出血病症，采用血浆源性或重组因子浓缩物治疗。这些浓缩物需要定期输注以维持适当fviii水平来控制和预防出血事件。鉴于蛋白替代疗法的难题，基因疗法可提供用于患有a型血友病的患者的替代性治疗方法。通过将功能性f8基因拷贝引入目标肝细胞中以诱导内源性fviii表达，可不再需要频繁输注凝血因子。[0256]基于腺相关病毒(aav)的基因疗法可能在患有a型血友病的患者中提供临床益处。设计含有cs04因子viii密码子优化构建体的基于重组(r)aav8的基因疗法载体以在肝脏特异性转甲状腺素蛋白启动子的控制下递送人密码子优化b结构域缺失的fviii(bddfviii)转基因。此构建体用于检验f8敲除(ko)小鼠中fviii活性的剂量-反应关系，并且用于评估单次静脉内施用后的毒性。[0257]简言之，为了测试治疗的功效，向每组12只雄性fviii敲除小鼠施用3.0×1011、1.2×1012或3.0×1012个载体衣壳颗粒(cp)/kg或10ml/kg缓冲液的单次静脉内剂量。在8周内每隔一周采集眶后血液样品并使用显色测定来分析所述血液样品的fviii。获自最终生命中血液取样的血浆样品还用于fviii结合和中和抗体的分析。在观察周期结束时，使用尾尖出血测定评估止血控制。[0258]在研究结束时，除4只动物(用3.0×1012个cp/kg载体处理)的结合和中和抗体测试为阳性外，所有样品的抗bdd-fviii结合抗体均为阴性。将这些动物从尾尖出血测定中的fviii活性水平和失血量的统计分析中排除。施用1.2×1012或3.0×1012cp/kg载体引起平均血浆fviii活性的剂量依赖性增加，分别增加至在研究周期内所计算的0.6和1.9iu/ml，但在用缓冲液或3.0×1011个cp/kg载体处理的小鼠中fviii活性低于定量下限(lloq)(图17)。[0259]在第63天在尾尖出血测定中评估功效。以mg/g体重为单位的60分钟内的失血量呈现于图18中。用缓冲液或3.0×1011个cp/kg基因疗法载体处理的动物示出相似失血量(分别为6.1mg/g和7.5mg/g)，与不存在可检测fviii活性相同。更高剂量的基因疗法载体以剂量依赖性方式显著减少失血量(1.2×1012：0.6mg/g；3.0×1012：0.4mg/g；琼克希尔-特普斯特拉(jonckheere-terpstra)测试：1-侧p值《0.001)。[0260]为了测试构建体的毒理学，向雄性c57bl/6j小鼠(n＝20/组)静脉内注射1×1013、3×1013或5×1013个cp/kg载体的单次推注剂量或制剂缓冲液(表5)。基于临床体征、体重、食物摄取、眼科学以及临床和解剖病理学评估毒性。对5只来自各组的动物执行完整尸体剖检，并且记录肉眼可见结果、器官重量和显微检验结果。从另外5只来自各组的动物收集组织用于通过定量聚合酶链反应评估生物分布。在给药之前和尸体解剖时收集血液。分析fviii活性、bdd-fviii抗原、结合抗bdd-fviii抗体、中和抗bdd-fviii抗体和结合抗aav8抗体。[0261]表5-毒性研究的设计.[0262][0263]发现以至多5×1013个cp/kg单次静脉内推注施用基因疗法载体具有良好耐受性。在研究期间未发生死亡且无临床体征或给药后观察结果视为与施用载体相关。未观察到阴性眼科结果。未观察到对体重或食物摄取的影响。未观察到临床化学、血液学或尿分析参数的改变。且无毒理学相关肉眼可见或显微结果与施用基因疗法载体相关。[0264]fviii活性和bdd-fviii抗原评估有广泛变异倾向，最可能是由于生成了针对人bdd-fviii的中和抗体。然而，在第3天以及第3周和第18周所有载体组中的各个动物均具有高于一般基线水平的活性(数据未示出)。在所采集的组织样品中，主要在肝脏中检测到载体dna。肝脏和其他组织的生物分布为剂量相关的，并且一般在最早时间点最高并随时间推移而降低。脑部和睪丸中载体dna的存在度随时间推移显著降低，并且在第18周在许多动物中低于测定的lloq(图19)。[0265]综合而言，结果示出当以≥1.2×1012cp/kg的剂量向fviii敲除小鼠施用时密码子优化的bdd-fvii基因疗法是有效的。无观察到的不良影响水平视为5.0×1013个cp/kg，这是毒性研究中测试的最高剂量。[0266]在一些实施方案中，向小鼠施用的剂量可根据“成年健康志愿者的治疗剂初始临床试验中的最大安全起始剂量的行业估算指南(guidance for industry-estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)”，美国卫生和公共服务部(u.s.department of health and human services)，食品与药物管理局(food and drug administration)，药物评估和研究中心(center for drug evaluation and research，cder)，2005年7月，药理学和毒理学(pharmacology and toxicology)中所提供的指导转化为人剂量，其内容出于所有目的特此以引用的方式整体并入。[0267]应理解，本文中所描述的实施例和实施方案仅为了举例说明的目的，并且本领域技术人员将想到根据本发明的各种修改或变化，这些修改或变化均包括在本技术的精神和权限以及所附权利要求书的范围之内。本文所引用的所有公布、专利和专利申请出于所有目的特此以引用的方式整体并入。









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