一种与黑鲷耐低温性状相关的SNP标记及其应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术一种与黑鲷耐低温性状相关的snp标记及其应用技术领域1.本发明属于水产动物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与黑鲷耐低温性状相关的snp标记及其应用。背景技术：2.黑鲷(acanthopagrus schlegelii)隶属鲈形目(perciformes)鲷科(sparidae)棘鲷属，因其具有广温、广盐等特性，在我国沿海地区均有分布，是我国沿海重要的海水养殖经济鱼类。黑鲷适宜的生存水温为15～25℃，当水温低于5℃则无法长期生存。因此，在江苏等地区进行养殖时，大部分黑鲷无法进行自然越冬。为了促进黑鲷养殖业的发展，增强黑鲷的越冬能力，对黑鲷耐低温品种进行选育就显得非常重要。3.传统的耐低温黑鲷的选育方法依赖于表型选择，具有周期长、不稳定等不利因素。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用dna分子标记对育种材料进行选择的技术，分子育种方法根据有效的分子标记进行后备亲本选择，能更快速地提升子代的经济性状。snp(single nucleotide polymorphism)是指基因组上单核苷酸的多态性，是目前应用最广、最新的分子标记。目前，有关黑鲷耐低温的分子标记开发的研究较少，并且产业中缺乏可应用于辅助育种的分子标记。因此，开发耐低温性状相关分子标记对培育黑鲷耐低温品系和健康养殖具有重要的意义。4.硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(stearoyl-coa desaturase-1,scd1)作为单不饱和脂肪酸合成的限速酶，是调节细胞膜中不饱和脂肪酸比例的关键基因之一。在对scd1基因的进一步研究中发现，scd1基因在大黄鱼和鲤中存在两种亚型scd1a和scd1b，在不同的低温胁迫条件下，两种亚型呈现出不同的调节方式，说明不同刺激下可能存在不同的调节机制。目前，本课题组在前期实验的过程中已在黑鲷的肝脏中成功克隆出scd1a基因、scd1b基因的cdna序列，并通过q-pcr研究发现scd1a基因在黑鲷低温耐受群体和非耐受群体中的表达存在显著差异。本发明旨在运用发现的scd1a基因在黑鲷的低温耐受群体和非耐受群体中出现的单碱基差异，筛选出黑鲷低温耐受个体，为培育黑鲷耐低温品种提供一种简便、可行的方法。技术实现要素：5.本发明的目的在于解决采用传统耐低温黑鲷的选育方法存在的不足，提供一种与黑鲷耐低温性状相关的snp标记，可以通过鉴定该snp标记来筛选具有耐低温性状的黑鲷，有助于黑鲷耐低温新品系的培育及养殖业发展。6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：7.一种与黑鲷耐低温性状相关的snp标记，所述snp标记为黑鲷scd1-a基因序列的第3125位碱基，该碱基为a或t；所述scd1-a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述snp标记位点的aa基因型个体在相同养殖条件下的低温耐受时间显著高于tt基因型个体。8.上述snp标记作为检测靶标在鉴定或筛选具有耐低温性状的黑鲷品种中的应用。9.一种用于检测上述与黑鲷耐低温性状相关的snp标记的引物对，包括scd1-a-3125-f和scd1-a-3125-r，所述scd1-a-3125-f的序列如seq id no.2所示，所述scd1-a-3125-r的序列如seq id no.3所示。10.scd1-a-3125-f：5’‑gtcgacagcctgtataatctccgta-3’；11.scd1-a-3125-r：5’‑tgtatgtgaaagagaaacacgact-3’。12.上述引物对在鉴定或筛选具有耐低温性状的黑鲷品种中的应用。13.一种检测黑鲷耐低温性状的方法：提取待测的黑鲷的基因组dna，并以基因组dna为模板，利用上述引物对进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；对pcr扩增产物进行测序，根据测序结果确定snp标记的基因型，当snp标记的基因型为aa基因型时，则待测的黑鲷品种具有耐低温性状。14.进一步，所述pcr扩增的条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，30s，重复32个循环；循环外延伸72℃，7min。15.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：16.(1)本发明通过转录组测序和生物信息学分析方法筛选得到了scd1-a基因第3125位碱基为snp位点，并设计其扩增引物scd1-a-3125-f和scd1-a-3125-r，能够筛选出具有耐低温性状黑鲷品种，进而明显加快黑鲷品种的选育进程以及快速选育出具备低温耐受优良性状的黑鲷新品种。17.(2)利用本发明提供的分子标记scd1-a-3125及其检测引物可检测黑鲷耐低温的性状，该方法准确可靠、操作简单，能够有效、快速的筛选出符合要求的性状，辅助早期实现短时间、低成本的选育出耐受低温的黑鲷的个体，进而增加优良品质的黑鲷数量，培育黑鲷耐低温品种，提高黑鲷的养成率，缩短养殖周期，进而提高黑鲷产量，促进其可持续健康养殖，具有广阔的应用前景。附图说明18.图1为snp标记位点的基因型测序峰图；19.图2为低温耐受组和低温不耐受组的低温耐受时间统计结果。具体实施方式20.以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。21.实施例122.实验所用的黑鲷均来自江苏省海洋渔业种质创新中心。体长为11.3±1.7cm、体重为39.6±5.3g，放置于3个养殖池(3.9m×2.6m×0.9m)中暂养7d，暂养期间水温保持在15±0.5℃，持续供氧，每天早上8点更换新鲜海水。7d后挑选活力好、体表完整的黑鲷进行后续实验。23.通过慢性降温的方式，以5±0.5℃为应激条件，对1000尾黑鲷进行低温耐受性实验，统计个体的耐受时间，将首先死亡的100尾黑鲷作为低温不耐受组(ut)，将最后仍然存活的100尾黑鲷作为低温耐受组(t)。24.通过低温胁迫，将15℃、10℃、5℃下的黑鲷的组织样品(腮、肌肉以及肝脏等)混样后，进行转录组测序并筛选出与耐低温相关的候选snp标记，用pcr产物直接测序的方法在低温耐受群体和低温不耐受群体里对耐低温性状相关候选分子标记进行验证：25.(1)利用动物组织基因组提取试剂盒(生工，上海)分别从低温不耐受组和低温耐受组的黑鲷的尾鳍样品中提取基因组dna，各100尾。26.(2)scd1-a基因的全长序列如seq id no.1所示。设计检测引物scd1-a-3125-f和scd1-a-3125-r：27.scd1-a-3125-f：5’‑gtcgacagcctgtataatctccgta-3’(seq id no.2)；28.scd1-a-3125-r：5’‑tgtatgtgaaagagaaacacgact-3’(seq id no.3)；29.分别以低温耐受群体t和低温不耐受群体ut的dna材料为模板，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；30.所述pcr扩增的条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，30s，重复32个循环；循环外延伸72℃，7min。31.pcr体系见表1：32.表1[0033][0034][0035](3)对pcr扩增产物进行测序，根据测序结果统计每个个体的基因型，并通过spss软件分析标记与耐低温性状是否相关。[0036]图1为snp标记位点的基因型测序峰图，通过峰图可以判断单碱基处的单峰或者双峰用以确定检测个体的基因型：单峰为纯合型，双峰为杂合型。其中，图1a为a/a纯合基因型，为低温耐受个体，图1b为a/t杂合基因型，为低温耐受与非耐受个体，图1c为t/t纯合基因型，为低温非耐受个体。[0037]图2为低温耐受组和低温不耐受组的低温耐受时间统计结果，黑鲷scd1-a基因snp位点与耐低温性状的关联分析见表2：[0038]表2黑鲷scd1-a基因snp位点与耐低温性状的关联分析[0039][0040]由图2和表1可以看出，第3125碱基位置的aa基因型个体在相同的养殖条件下低温耐受时间显著的高于tt基因型个体。[0041]序列表[0042]seq id no.1[0043]scd1-a基因序列[0044]actgtagtttttggataagcgaacctgcttcatctccgttaaacacccccccaaaatatctactactcgtctcgtctttggtgagtaatttacccgctatgttttcactccacaggtgtggtgccagcgtgaacacggcgcagcaaacgtcttatgtcagctctaaactcagcatcatcgttacatgaccatcctcttcttcaccagcggcgcccgctagctaacggttgctaggctagcgagcacgaacaataattaacggtcagcgcgagaaggtgtgttaaggctccgtgacgttagctcgacacgaaaacaccgagacaaaccgaattttctctcattttctctgcccgctccagagcatcaccaaaccgctgccacgatgacggaggcggaggcgttggagaagaagcagcacaagtccagtaaccaaaatggggatgttcttccagaggccaccagagaagacgtgttcgatcacacatacaaagagaaagagggcccaaaacctggcacgataatcgtctggaagaatgtcatgttgatgactgtattacatataggtgccctgtacgccatctccctcatcccttccgcatctcctttgaccttgctttggtgtaagtacaaaaaatcctacctgttactgcatttcttttttttttttctttttttttcaaatttttttctctgttagtggaattacataaaaatgttttccctcagtcacatctgttatgtcagtagcccggcccactctctcaccactggtgcatgcataaatctgcatgatcctcccagtagcctgggtgttgtgggattaaagctcactcatactgtatatcataaagagatttaatgtcacagcacccgtcctggagctgcgaactgctcagtgcatgcttgtcaggaaaataacttgaacttgaacagcagaggccatgctttcctgatcaagtaacagcgacaatatagtagggatgcagacaaaggaagagtggccagttaattacataaactgcatgctacttttggtacattatgttcatttggatgagtgttttctaatgaaatcaaaaccacagaggttgcacttctgcgtcttatcacacatgcaatcacctaatggctttttcggatgttatatgatgtaatgacatcatcatataacatgcatccgcttccttcatcttggttatccttgtgaaacaagtaggccagtacaaaccaacaaaacactacaaaatacaccatcataaaaaaacatatatagttgatgagacttcagttaataatcagggaattttaaaaatgtttaaatgctttatatattttaatttagcaatcatagaggtttatacacatcaagtgcaactttataatgaccttctgattctgagtatttcgtaatcatttataaagaactgcaaacatcagttgcaactataaatgttaaaggtgcagtatgtaatttaaaggaagaacaagcaatttcaaccagaggtgaaaaactttattggttgattttcattactgagtaaactgaataaattaacttcctttcacagtcaacataatttcatactgtttaacttagttgatatgcggcggactctgccacctttggaccttattttcctctgagtacggcttgcttgtgaagttatggaataaagagttctgagtttgccttatgtaaattatacatttacagagtttgaatttcttattccaaaactatatagtgcccctttaaacaaataatgttttaatatctgttttgtacagcatttcattatttgttaacagtgaagtagctataaactgaaattagttattaagtaattatttactaatgacagttattataaagtgttagctaaagtagttaagtcaaaggcaaaattgaatgattttcaagaaatattgtataagagagctaatctaattcatgtaattgtaatgtgtatattccaccttttatacaaatgaaaatgttgaacatgattaatttatgcttttttgaaaaactattttgtggttctgagaggatgctctccccttcatttacacataaattataacatgacatagagtattttcttgtgatgaatcatttcttgcaggacgatgttttcaggcagatttctcataaacaattttaagaatgtgttacttcagttgttatgcagccgcctatgtctgtctgtagtcaccatagcactggttacacgtcatgagtaacagcctgacaacactgaataatcagagtctgaatcacttgttgctggattaccctcccagtacttagtcttggaaaatctaatgtcctcagagtggcaacaagacatatagacatatttaaaacacacatcagacagacaataaaaaaacaacagcttaagatcaccggtagtcatcaatgtcatcacagtccaggcaggtatttaaagtgcatgtcaacaattgtcatgacaaagaatagttagtatactgcatatcgattatgtacccatttattataatcccctggttcatataacactgacagtacaaaaactgtctgatgcataaacattgcaatgtgaattactgcaataaagtattgatgacaggacgagatgagtaggaaatggtccgactaatttgttgatgcatttctctccccacagccgtactttgttttttgataagtgctttaggagtcactgcaggagctcatcgcctgtggagtcacagatcctacaaggcctcattacctctgaggatctttcttggtgttgctaactccatggcatttcaggtaccttaaaaaatgacagatagtacagatctgcacacttaacgttgagataatagcagttttcattactgtgtaagtaccacgttgtgtcgacagcctgtataatctccgtatttacttgaacccacagaatgatatctttgaatgggcccgggaccacagggttcaccacaaatattcagagacagatgctgaccctcacaacgccgtgcggggcttcttctttgctcacatcggctggctgctggtgcgcaaacaccccgacgtcatcgagaaaggacgcaagctggaactcactgacctgctgtctgacaaagttgtaatgtttcaaaggaagtaagtggcctcagccattggttgattttacatcttatgttgtcttacatggaacaggaagtaggctggggaagtcttccattctatttcagtcgtgtttctctttcacatacaaatattcaacccaaacaagttcagccctaacactatttgtcaagggcactgtcaatgcatcctgggcttagagccgcccaagacaattatgactagttaagaaaatcgagcgagtcaaaatgtttgttcccctttaaagcataactgtgaggttccataagtaaccatttcattcatattctgaatcaaggatggtgattgtaaaccattatgttgtagccatccgtagctatgagattaaaacaatgataaatgctcccgtagaagccacaggtccatatgatatccatcacattcctgaagtgtgtcagcgatgtcactgattggtagcacagacatgaaagtcaggtcggccagagagtttctgccaccatgattggaccgtttatgtgacatttaccagagagaaaccataatttttctttctaggatgcatgttgcattcaatgcaggggttatttgtaatgatttaagagacaagtacttctttagtctttgtataattgttttacaactgttttgtagtcaagactcattttcttcctggcttcgtttccaggcttaaaattctttatacaaggattttcttatacatgaacatgaatgaatgaaatgaaaaaaaatggagccatccaaaaaatgggcactaaaccagagtgataagggggttatatggaacagcactaaaacagagtgtcaggatagatctggctacaaatacatagcaaagaaagaaaagataaactgttaagttttggccacactgctgcagagttgtgcttgcagtgcaggctgtatgagtcattgtatttaaacaaggtgacagttaccaacatgttattcatgtatgtccagattgactcactgttggcttctgggagaactgtgtcatgtgaaagaaagtgaaagagagtgaacaatcaggtgtctgatatgcagtgaattaggtcaagaccggtgttgtaccgtgtaaacagcttcattccttctgctgtccacccactttatgtcctcgacaggtattacaagctgtctgtgctgctcatgtgcttcttcgtccccatgtctgtgccttggtacctgtggggggagtccctgtgggtggcctacttcgtcccggccctgctgaggtacaccctggtgttgaacgccacctggctggtcaacagcgccgctcacatgtgggggaaccgtccctatgacaagaacatcaacccacgggagaacaagtttgtcacgttcagtgccataggtatggataatgtgcacatgttatcgttttaacaaaagaaaaaatgaagacagattaaaaacaggaatggcagacaaacagtcgtggcacgtataaacaacgtgacgttaacgttttgcatgatcgctcagaagttcaccttttgcctacatttggcagcacagtgagttcaagttcaagttcagtgcgtgtcgaagaagttacgcctaaatgaatctggcagcagatagcaaagataggaaaacaccattaaatactatctccacctaattgcagagaatatgaaatctctcctgttgtggcatttacacatctgtttgaattgaccgctaccgtaagtctctgcattggttacaagaactcacctgttgcaccatgatgaagtgctacaagctaacacatcaaataaacagggatctttacataccaaagctaatatttgctggcgcctgtcttaactgtctccgac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