一种PERK激活剂在制备抑制脑胶质瘤发展药物中的应用及该药物

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术一种perk激活剂在制备抑制脑胶质瘤发展药物中的应用及该药物技术领域1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种perk激活剂在制备抑制脑胶质瘤发展药物中的应用及该药物。背景技术：2.随着社会经济发展和饮食结构的改变，肿瘤的发病率明显上升。目前脑肿瘤发病及致死均已位居我国恶性肿瘤的前十位，且全球发病率逐年递增。脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，生长迅速、侵袭性强、极易复发。据报道，脑胶质瘤已经成为15岁以下和15～34岁成年人群癌症死亡的第二大原因。近20年间，虽然临床诊断不断推进，但胶质瘤在治疗方面仍面临5年生存率不足5％、耐药和高复发率等严峻挑战。由于胶质瘤浸润前沿通常与正常脑组织并无显著界限，导致手术很难完全切除。3.目前用于治疗胶质瘤的药物只有2005年上市的替莫唑胺(temozolomide，tmz)和2009年fda批准的贝伐单抗，但更为严峻的事实是tmz正面临耐药、复发率高和非靶向性的困境。近年car-t和pd-1治疗gbm的研究如火如荼，但临床实验效果参差；而idh突变的激活剂治疗idh突变的胶质瘤未获fda批准。因此，寻找新型分子药靶显然成为有效研发胶质瘤靶向药物的前沿难点。技术实现要素：4.本发明提供了一种perk激活剂在制备抑制脑胶质瘤发展药物中的应用及该药物，以提供靶向治疗、高效抑制脑胶质瘤发展的药物。5.为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种perk激活剂在制备抑制脑胶质瘤发展药物中的应用。6.作为优选方案，所述perk激活剂为cct020312或mk-28。7.作为优选方案，所述perk激活剂为cct020312。8.为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种抑制脑胶质瘤发展的药物，包括有perk激活剂。9.作为优选方案，所述perk激活剂为cct020312或mk-28。10.作为优选方案，所述perk激活剂为cct020312。11.作为优选方案，所述药物用于离体施用或体内施用。12.作为优选方案，所述药物的用药剂量为20mg/kg﹒d，用药对象为小鼠。13.作为优选方案，所述药物还包括佐剂，所述佐剂为颗粒剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或多种。14.作为优选方案，所述药物为显微注射剂型或适于转染的剂型。15.相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：16.本技术发明人通过大量的实验数据证明，perk激活剂能够显著抑制脑胶质瘤细胞的发展，具有通过血脑屏障能力，可以升高肿瘤细胞内质网应激而引发死亡，细胞活性会伴随着perk激活剂的浓度增加而递减，诱导肿瘤细胞内的perk发生磷酸化，激活perk的生物功能，可望成为新的靶向制备防治脑胶质瘤的药物。附图说明17.图1-为本技术中perk激活剂ctt020312的分子结构式；18.图2-为本技术3个病人源脑胶质瘤组织体外培养2-3代获得体外培养和传代的脑胶质瘤类器官；19.图3-为本技术实施例一中胶质瘤细胞活性检测结果(注：a-u87胶质瘤细胞活性随cct020312不同处理浓度的变化曲线；b-a172胶质瘤细胞活性随cct020312不同处理浓度的变化曲线；c-sf295胶质瘤细胞活性随cct020312不同处理浓度的变化曲线)；20.图4-为本技术实施例二中胶质瘤细胞用不同浓度cct020312处理的蛋白质印迹检测结果；21.图5-为本技术实施例三中小鼠脑内胶质瘤细胞荧光活体成像结果；22.图6-为本技术实施例四中不同浓度cct020312药物体外抑制胶质瘤类器官体积72h的图像结果(左)和5天的尺寸统计数据(右)。具体实施方式23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。24.本技术发明人发现idh突变促使胶质瘤细胞暴露在长期内质网应激(ers)环境获得易凋亡的脆弱性，而ers分子开关mir-183可增强胶质瘤起始细胞(glioma-initiating cells)对tmz的敏感性。25.细胞应激反应是细胞在遭受环境变化或药物刺激导致生物大分子损伤时，产生的一系列适应性变化，进而导致基因表达的改变，试图恢复细胞稳态或在无法营救的状态下，诱导细胞死亡以清除无法修复的细胞。细胞应激应答反应过程涉及内质网、线粒体等多个细胞器。肿瘤细胞在疯狂增殖侵袭的过程中，会受到诸如葡萄糖或氨基酸等营养物质不足、肽链折叠受阻、分泌蛋白质超负荷、病毒感染、基因突变、代谢紊乱以及钙离子失调等刺激，打破糖、脂、蛋白稳态的固有平衡，造成内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ers)，并激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,upr)。ers/upr机制恰是细胞在有害刺激来袭之时，迅速启动的、试图扭转危局的、恢复细胞稳态的有效手段。ers/upr既是天然的分子标志物“产地”，也是肿瘤靶向治疗的重要研究方向。参与ers的关键基因在许多癌症中都存在显著变化，如ire1α和xbp1在结直肠癌、胶质瘤和原发性肝瘤等10多种癌症中表达量上调。内质网应激应答体系ers或可在相当大的程度上决定肿瘤细胞的存亡命运，并参与塑造免疫微环境表型，最终调控肿瘤恶性进程。我们发现脑胶质细胞中ers异常，perk水平的异常升高，提示perk可能起着致癌基因的作用，但perk与脑胶质瘤发生的关系还未曾有报道。26.cct020312是一种选择性eif2ak3/perk激活剂，cct020312在细胞中可以引发eif2a磷酸化，同时cct020312治疗可以有效抑制细胞增殖，其分子结构式如图1所示。本技术进一步成功筛选了具有通过血脑屏障能力的小分子perk激活剂ctt020312,并证实其在体内外均具有胶质瘤靶向杀伤能力，同时发现perk激活剂mk-28具有类似诱导perk磷酸化并激活perk生物功能的作用，perk小分子激活剂有望成为新的脑胶质瘤的小分子药物。27.本技术抑制脑胶质瘤发展的药物包括有perk激活剂，还可以加入一种或多种药学上可接受的佐剂，包括但不限于颗粒剂、缓冲剂、表面活性剂等公知的药物佐剂，该药物可以按照药学领域常规的方法制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的机型等。28.癌症临床样品采集：3个病人的脑胶质瘤(非肿瘤细胞系)及癌旁正常组织由中山大学附属第七医院提供，整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，迅速切成小块于冻存管中置于液氮中保存备用，一部分胶质瘤组织被用于胶质瘤类器官的体外培养和长期传代，3个病人源脑胶质瘤组织体外培养获得的脑胶质瘤类器官细胞系如图2所示。29.体外培养的具体培养方式为：将剪碎至1mm3大小的病人源脑胶质瘤组织悬浮在含有glutamax(1x)、neaa(1x)、n2(1x)、b27(1x)、2-mercaptoethanol(1x)以及2.5μg/ml胰岛素的dmem/f12和neurobasal(体积比：1:1)混合培养基内，置于37℃培养箱、5％co2条件下进行长期培养，具体培养方式参考文献：jacob et al.,2020,cell(https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.036)。30.实施例一31.验证perk激活剂ctt020312对胶质瘤细胞细胞活性的影响，具体步骤如下：32.1)在96孔板中分别接种等量u87、a172和sf295细胞悬液后，放入培养箱中预培养24小时(37℃,5％co2)；33.2)向培养板各孔中加入不同浓度的cct020312培养箱中孵育48小时后，向每孔中加入10μl cck-8溶液，培养环境下孵育1h；34.3)用酶标仪测定450nm处的吸光度(od)，通过标准曲线计算相对细胞数目，检测结果如图3所示。35.如图3所示，体外培养的u87、a172和sf295细胞的细胞活性(cck-8)伴随着cctc020312的浓度增加递减。36.实施例二37.perk激活剂ctt020312有效抑制胶质瘤细胞增殖的验证，包括以下步骤：38.1.细胞培养：39.将人脑胶质瘤细胞系sf295在dmem培养基(thermo,usa)中进行培养，培养基中含有10％胎牛血清(gibco,usa)、青霉素(100u/ml)和链霉素(100u/ml)，所有细胞置于37℃培养箱、5％co2条件下培养，当细胞达到70-80％汇合度或胶质瘤类器官达到1mm3时加入实验规定浓度的ctt020312，人脑胶质瘤细胞设置浓度梯度为0μm、1.25μm、2.5μm、5μm的多个样品。40.2.细胞内ers相关基因表达水平的检测：41.a、将步骤1中人脑胶质瘤细胞sf295培养48小时后，消化、离心收集细胞，加100μl细胞裂解液裂解细胞，在13400g、4℃离心15分钟，提取细胞总蛋白；42.b、检测蛋白浓度后，每组样本取20μg样本与4×sds-page loading buffer混合，95℃加热处理5min用10％的sds-page胶分离蛋白，进行凝胶电泳测试；43.c、电泳结束后，在transfer buffer中转膜60分钟，使用5％脱脂牛奶封闭印迹膜1小时，tbst洗涤3次后加稀释的一抗，4℃温育过夜，tbst洗涤3次后，加入适当的二抗稀释液，室温孵育1小时；44.d、tbst再次洗涤3次，经显影定影处理后，凝胶成像系统拍照，使用image j软件对条带进行灰度分析处理，结果如图3所示。45.结果显示：如图4所示，perk小分子激活剂激活后会升高肿瘤细胞内质网应激相关蛋白perk和atf4，胶质瘤细胞内磷酸化的perk和atf4伴随cctc020312浓度增加呈现显著性的增强，说明perk激活剂cctc020312可以有效激活perk通路以抑制胶质瘤细胞的细胞活性，从而抑制肿瘤类器官的生长。46.实施例三47.人脑胶质瘤的原代细胞到裸鼠(nod)脑内构建异种移植脑胶质瘤小鼠模型验证perk激活剂cct020312对于肿瘤生长的影响，包括以下步骤：48.(1)造模：从确诊为胶质瘤的患者中获得新鲜的、手术切除的肿瘤组织，剔除组织和血管等结构，取肿瘤组织块，用眼科剪将肿瘤组织剪成1mm3的小块后，再用无血清培养液洗涤2～3次，加入胰酶消化30min，100孔目钢网过滤，制成肿瘤细胞悬液，以1500rpm/min离心10min后弃上清，加入完全培养基重悬细胞并进行原代培养；将50μl浓度为2x107细胞/毫升荧光素酶标记的人源脑胶质瘤细胞注射到裸鼠(nod)脑内，构建人脑胶质瘤小鼠原位移植瘤模型。49.(2)分组及给药：将上述小鼠模型植入细胞2周后开始进行下列两组实验：1、无药对照组；2、cct020312给药处理组；给药方式为腹腔注射，剂量为20mg/kg，每两天给药一次，持续一个月。50.(3)观察：药物治疗中，通过萤光素酶对于肿瘤大小进行活体分析，cct020312给药一个月后的活体分析检测结果如图5所示，说明cct020312可以抑制脑胶质瘤的生长，减小肿瘤体积。51.实施例四52.cct020312体外肿瘤杀伤实验：53.在药物测试中，将剪碎至1mm3大小的病人源脑胶质瘤组织悬浮在含有glutamax(1x)、neaa(1x)、n2(1x)、b27(1x)、2-mercaptoethanol(1x)以及2.5μg/ml胰岛素的dmem/f12和neurobasal(体积比：1:1)的混合培养基内，置于37℃培养箱、5％co2条件下培养生长两个月，获得脑胶质瘤类器官，然后添加cct020312(设置浓度梯度为0μm、2.5μm、10μm、40μm的多个样品)治疗5天(最长可至30天)，以无小分子药物治疗作为对照，比较两组间类器官生长的大小以及细胞生存情况，结果如图6所示。54.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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