一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用与流程

有机化合物处理,合成应用技术一种nmdar的nr1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用技术领域1.本发明属于自身抗体检测技术领域，具体涉及一种nmdar的nr1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用。背景技术：2.nmdar是配体门控的阳离子通道，在突触的传递和可塑性中起着至关重要的作用。nmdar是由glun1和glun2(a-d)亚基组成的异构体，分别结合甘氨酸和谷氨酸。glun1和其中一种glun2结合形成具有不同药理特性的受体。glun1单亚基不能在中枢神经系统组织中形成功能受体，需要与其他亚基结合才能在神经元细胞表面表达。3.2008年，dalmau等人提出了抗nmdar脑炎的概念，这是一种由 nmdar自身抗体介导的严重的、潜在致命的自身免疫性疾病。由于副肿瘤性抗nmdar脑炎在肿瘤切除和免疫治疗后有更好的预后，因此有必要建立快速检测系统，以检测针对nmdar抗原表位的自身抗体。一般认为，nmda 受体是由两个nr1亚单位和两个nr2亚单位构成的异四聚体。因此，建立识别nmdar自身抗体的检测体系，就需要建立稳定表达每个nmda受体亚基的细胞。然而，培养基中的谷氨酸和甘氨酸激活的nmdar ca2+内流对非神经元是有毒的，当nmdar的nr1和nr2亚基同时在非神经元细胞中过表达时，会产生细胞毒性，造成靶细胞死亡。已有学者探究出可同时过表达nmdarnr1和nr2亚基的方法，tanaka等人通过在培养基中添加拮抗剂mk-801以保护过表达nr1和nr2亚基的hek293细胞(tanaka k, kitagawa y,hori k,et al.evaluation of the concordance between glun1-glun2heteromer live-cell-based assay and glun1 monomer biochip kit assay onanti-nmdar autoantibody detection[j].journal of immunological methods, 2021,499:113150.)；thouin等人通过在培养基中添加拮抗剂500μm ketamine 以保护过表达nr1和nr2亚基的hek293细胞(thouin a,gastaldi m, woodhall m,et al.comparison of n-methyl-d-aspartate receptor antibodyassays using live or fixed substrates[j].journal of neurology,2021,268(5): 1818-1826)。虽然拮抗剂的加入会改善靶细胞的死亡情况，但是拮抗剂过多会造成细胞毒性，降低过表达蛋白的表达量；过少则达不到改善细胞死亡的效果，荧光染色时“球状”信号偏多，对结果的正常判断造成干扰。[0004]自2012年gleichman等人发现抗nmdar患者中的自身抗体主要识别 glun1的n368/g369区域后，过表达nmdar单亚基glun1的hek293细胞被用来检测患者样本中nmdar自身抗体，但仍有不少学者持续比较不同方法检出情况与临床信息的一致性。欧蒙的一项研究结果是商业化的单亚基检测系统虽然特异度为99％，但其在血清和脑脊液中的检测灵敏度分别是 86％和92％，其高特异度是以降低检测的灵敏度为代价的，相对于glun1单亚基的检测系统，nr1和nr2亚基检测系统的检出率略高。因此，有必要建立一套简单、稳定、灵敏度高的过表达nmdarnr1和nr2双亚基系统以辅助当前nmdar脑炎患者样本中自身抗体的检测。技术实现要素：[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种nmdar的nr1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用，尤其是提供了一种简单、不需要拮抗剂、“球状”背景信号少且灵敏度较高的检测系统以检测样本中nmdar自身抗体。[0006]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0007]本发明提供了一种nmdar的nr1亚基缺失突变体，所述nr1亚基缺失突变体缺失nr1亚基的627-630位氨基酸或581-624位氨基酸。[0008]本发明还提供了上述nr1亚基缺失突变体的构建方法，包括以下步骤：[0009]以包含seq id no.1所示核苷酸序列的质粒为模板，利用引物对进行 pcr扩增，得所述nr1亚基缺失突变体；[0010]其中，针对627-630位氨基酸缺失设计的引物包括627-630-f和 627-630-r，627-630-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，627-630-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；[0011]针对581-624位氨基酸缺失设计的引物包括581-624-f和581-624-r， 581-624-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，581-624-r的核苷酸序列如seq id no.5所示。[0012]优选的，所述模板包括将seq id no.1所示核苷酸序列插入pcdna3.1 的nhei和noti酶切位点之间。[0013]优选的，所述pcr扩增的体系以50μl计，包括模板50ng、引物f 2μl、引物r 2μl、fast pfu dna polymerase 1μl、5×fast pfu buffer 10μl、2.5mmdntp 4μl、dmso 1μl和余量的nuclease-free water。[0014]优选的，所述pcr扩增的程序，包括：98℃预变性2min；98℃变性15s， 59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸5～10min。[0015]本发明还提供了一种结合nmdar自身抗体的nmdar突变体细胞，所述nmdar突变体细胞包括上述nr1亚基缺失突变体和nr2亚基。[0016]本发明还提供了上述nmdar突变体细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述nr1亚基缺失突变体和nr2亚基共转细胞，得所述nmdar突变体细胞。[0017]优选的，所述nr1亚基缺失突变体和nr2亚基的质量比为(0.2～5)： 1。[0018]本发明还提供了上述nr1亚基缺失突变体或上述nmdar突变体细胞在制备检测nmdar脑炎患者自身抗体的试剂中的应用。[0019]本发明还提供了一种检测nmdar脑炎患者自身抗体的系统，包括利用上述nr1亚基缺失突变体或上述nmdar突变体细胞制备得到的细胞爬片和血清免疫荧光染色试剂。[0020]有益效果：本发明提供了一种nmdar的nr1亚基缺失突变体，对nr1 亚基的特定位点进行缺失，并由缺失了nmdar nr1亚基部分氨基酸的突变体与nmdarnr2亚基共转，从而建立了在不需要拮抗剂的情况下稳定表达nr1和nr2亚基的细胞检测系统，以检测待检样本中nmdar自身抗体。本发明得到的所述突变体细胞可与抗nmdar脑炎患者中的自身抗体结合，一方面建立了不需要添加拮抗剂、可稳定表达识别nmdar自身抗体的检测体系；另一方面得到了“球状”背景低的识别nmdar自身抗体的检测体系。附图说明[0021]图1为实施例2的nmdar自身抗体阳性血清染色结果图，图中a： nr1△581-624与nr2a共转阳性血清染色结果，b：nr1△627-630与nr2a 共转阳性血清染色结果，c：nr1△581-624与nr2b共转阳性血清染色结果， d：nr1△627-630与nr2b共转阳性血清染色结果；[0022]图2为实施例2的阴性血清染色结果，图中a：nr1△581-624与nr2a 共转阴性血清染色结果，b：nr1△627-630与nr2a共转阴性血清染色结果， c：nr1△581-624与nr2b共转阴性血清染色结果d：nr1△627-630与nr2b 共转阴性血清染色结果；[0023]图3为对比例2中野生型nmdarnr1亚基分别与nr2a和nr2b共转后，加入不同含量拮抗剂(ifenprodil)培养后阳性血清的染色结果，图中a-c：野生型nmdarnr1亚基与nr2a共转后，加入0μm、10μm、100μm ifenprodil 后阳性血清的染色结果；d-f：野生型nmdarnr1亚基与nr2b共转后，加入0μm、10μm、100μm ifenprodil后阳性血清的染色结果；[0024]图4为对比例2中野生型nmdarnr1亚基分别与nr2a和nr2b共转后，加入不同含量拮抗剂(ifenprodil)培养后阴性血清的染色结果，图中a-c：野生型nmdar nr1亚基与nr2a共转后，加入0μm、10μm、100μm ifenprodil后阴性血清的染色结果；d-f：野生型nmdarnr1亚基与nr2b共转后，加入0μm、10μm、100μm ifenprodil后阴性血清的染色结果；[0025]图5为对比例3中nmdar自身抗体阳性血清染色结果，图中a-c分别表示：nr1△410-559、nr1△625-626以及nr1△837-838与nr2a的共转染色结果；d-f分别表示：nr1△410-559、nr1△625-626以及nr1△837-838 与nr2b的共转染色结果；[0026]图6为对比例3中nmdar自身抗体阴性血清染色结果，图中a-c分别表示：nr1△410-559、nr1△625-626以及nr1△837-838与nr2a的共转染色结果；d-f分别表示：nr1△410-559、nr1△625-626以及nr1△837-838 与nr2b的共转染色结果。具体实施方式[0027]本发明提供了一种nmdar的nr1亚基缺失突变体，所述nr1亚基缺失突变体缺失nr1亚基的627-630位氨基酸或581-624位氨基酸。[0028]在本发明中，所述nmdar的nr1亚基的核苷酸序列优选如seq idno.1所示，氨基酸序列优选如seq id no.12所示。在缺失627-630位氨基酸或581-624位氨基酸后，将其过表达至293t细胞中，表达后的nr1亚基缺失突变体可识别患者样本中的自身抗体；或nr1亚基缺失突变体(缺失 627-630位氨基酸或581-624位氨基酸)与nr2亚基(nr2a或nr2b)共转至293t细胞中，共转后的缺失突变体可识别患者样本中的自身抗体；所述 nmdar的nr1亚基缺失突变体与nr2亚基(nr2a或nr2b)共转至293t 细胞中，过表达细胞可在dmem完全培养基中正常生长，未出现死亡情况。原因可能是nr1亚基缺失突变体与nr2亚基(nr2a或nr2b)共表达后未形成与野生型相同的受体通道，即便培养基中含有谷氨酸和甘氨酸，也不能促进nmdar受体通道开放，因此不会导致大量ca2+内流，进而不会导致细胞死亡。[0029]本发明还提供了上述nr1亚基缺失突变体的构建方法，包括以下步骤：[0030]以包含seq id no.1所示核苷酸序列的质粒为模板，利用引物对进行 pcr扩增，得所述nr1亚基缺失突变体；[0031]其中，针对627-630位氨基酸缺失设计的引物包括627-630-f和 627-630-r，627-630-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，627-630-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；[0032]针对581-624位氨基酸缺失设计的引物包括581-624-f和581-624-r， 581-624-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，581-624-r的核苷酸序列如 seq id no.5所示。[0033]本发明所述模板优选包括将seq id no.1所示核苷酸序列插入质粒中作为模板，如在实施例中，将seq id no.1所示的序列插入pcdna3.1的 nhei和noti酶切位点之间，作为模板，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。[0034]本发明优选利用pcr扩增的方法得到对应的nr1亚基缺失突变体，且两个nr1亚基缺失突变体的pcr扩增体系和程序均相同。本发明所述pcr 扩增的体系以50μl计，优选包括模板50ng、引物f(0.2μm)2μl、引物r(0.2μm)2μl、fast pfu dna polymerase(2.5units)1μl、5×fast pfu buffer10μl、2.5mm dntp 4μl、dmso 1μl和余量的nuclease-free water。本发明所述pcr扩增的体系，优选包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸5～10min。[0035]本发明在构建nr1亚基缺失突变体所应用的引物信息如表1所示。[0036]表1 nr1亚基缺失突变体构建引物[0037][0038]在本发明实施例中，优选还包括对得到的pcr产物分别使用dmt酶于 37℃处理1h，去除模板质粒，然后将处理后的pcr产物转化至感受态细胞 (dmt chemically competent cell)中；将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的lb液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序，并将测序正确的质粒大提保存。[0039]本发明还提供了一种结合nmdar自身抗体的nmdar突变体细胞，所述nmdar突变体细胞包括上述nr1亚基缺失突变体和nr2亚基。[0040]本发明对所述突变体细胞的制备方法并没有特殊限定，可以通过瞬时转染或稳定转染获得，整个制备过程无需添加抑制剂，制备过程简单。本发明所述突变体细胞可以在不加抑制剂的dmem完全培养基中生长而不出现死亡的情况。本发明所述突变体细胞应用于样本检测时，具有较低的非特异性信号，“球状”信号较少。[0041]本发明所述突变体细胞优选以现有真核生物的细胞系为基础细胞，实施例中以293t细胞为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述突变体细胞可在不需要拮抗剂的情况下稳定表达nr1和 nr2亚基，可作为细胞检测系统检测待检样本中nmdar自身抗体。[0042]本发明还提供了上述nmdar突变体细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述nr1亚基缺失突变体和nr2亚基共转细胞，得所述nmdar突变体细胞。[0043]本发明所述nr1亚基缺失突变体和nr2亚基两种亚基的质粒总量优选为3～24μg，共转时细胞生长在直径10cm的皿中，细胞密度为30～40％，且所述的两种亚基的质粒总量可根据培养皿的规格进行等比例调整，如在本发明中，所述所述nr1亚基缺失突变体和nr2亚基(nr2a的登录号： nm_000833.4、nr2b的登录号：nm_000834.4)的质量比优选为(0.2～5)： 1，更优选为1：1。本发明所述构建方法，优选包括以下步骤：将上述nmdarnr1亚基缺失突变体和nmdarnr2亚基以1:1的比例混合，使用pei转染试剂将混合质粒转入hek293细胞中，进行洗涤、固定，得到可结合nmdar自身抗体的细胞爬片。本发明得到的所述nmdar突变体细胞或细胞爬片，可应用于识别nmdar自身抗体，检测的“球状”信号少，背景低，可作为检测系统。[0044]本发明还提供了上述nr1亚基缺失突变体或上述nmdar突变体细胞在制备检测nmdar脑炎患者自身抗体的试剂中的应用。[0045]在本发明实施例中，优选对上述细胞爬片固定和烘干后，依次进行一抗孵育和二抗孵育，洗涤后在显微镜下观察，从而完成对nmdar脑炎患者自身抗体的检测。本发明对所述固定和烘干的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述一抗孵育，优选包括将nmdar脑炎患者的血清使用pbst按照1:10的体积比稀释后进行孵育，孵育时间40min。本发明在所述一抗孵育后，优选还包括利用pbst洗涤3次，而后再进行二抗孵育。本发明所述二抗孵育优选包括使用荧光基团标记的抗人igg进行孵育，实施例中优选利用fitc标记的抗人igg进行孵育(jackson二抗，使用pbst按照1:200稀释后使用)，孵育时间40min。本发明在所述二抗孵育后进行洗涤，所述洗涤优选包括使用pbst洗涤3次。本发明实施例证实，缺失了nr1亚基的581-624位氨基酸或缺失了nr1亚基627-630位氨基酸的突变体与nr2亚基(nr2a/2b)共转后细胞几乎铺满了细胞爬片，可检测出阳性血清中的nmdar自身抗体，同时在阴性样本上表现出较好的背景，“球状”信号少，获得了信号好，背景低的nmdar自身抗体检测系统。[0046]本发明还提供了一种检测nmdar脑炎患者自身抗体的系统，包括利用上述nr1亚基缺失突变体或上述nmdar突变体细胞制备得到的细胞爬片和血清免疫荧光染色试剂。[0047]本发明所述系统优选与上述相同，在此不再赘述。[0048]下面结合实施例对本发明提供的一种nmdar的nr1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0049]实施例1[0050]nmdarnr1亚基缺失突变体的构建[0051]1、通过人工合成的方法，将nmdar的1α亚基dna序列(seqidno.1)合成至pcdna3.1上，作为模板，插入酶切位点为nhei和noti。[0052]2、委托生物公司合成表1所示引物。[0053]3、分别使用表1的引物进行pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。[0054]pcr扩增体系为：模板50ng、引物f(0.2μm)2μl、引物r(0.2μm)2μl、fastpfudnapolymerase(2.5units)1μl、5×fastpfubuffer10μl、2.5mmdntp4μl、dmso1μl，最后用nuclease-freewater将体系补足50μl；[0055]pcr扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，变性到延伸33个循环；72℃再延伸5～10min。[0056]4、分别将步骤3得到的pcr产物使用dmt酶于37℃处理1h，去除模板质粒，然后将处理后的pcr产物转化至感受态细胞(dmtchemicallycompetentcell)中；将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的lb液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序。测序正确的质粒大提保存。[0057]实施例2[0058]制备各缺失突变体的细胞爬片及血清免疫荧光染色[0059]1、293t细胞培养：dmem高糖培养基与fbs按9:1比例配制成10％fbs-dmem高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代至含有载玻片的 10cm2培养皿，置37℃，5％co2的细胞培养箱中过夜培养；[0060]2、pei转染：将实施例1提取的2种nr1亚基缺失突变体质粒分别与两种nr2(nr2a的登录号：nm_000833.4、nr2b的登录号：nm_000834.4； nr2a和nr2b的核酸序列相似度为61.17％，氨基酸序列的相似度为52.06％) 亚基的质粒按照1:1混合后，转染时每种质粒各1.5μg，使用pei转染试剂分别转染至步骤(1)培养获得的细胞，转染完4小时候更换为完全培养基，继续培养36～48h进行固定；[0061]3、爬片的固定及烘干：用pbs将细胞爬片冲洗2次，然后置于预冷的丙酮中，固定5～10min，取出于42℃烘干，得到了四种缺失突变体细胞的爬片。[0062]4、用pbs洗涤步骤3制备得到的各爬片；[0063]5、一抗孵育：将nmdar脑炎患者的血清使用pbst按照1:10的比例稀释后进行孵育，孵育时间40min；[0064]6、洗涤：使用pbst洗涤3次；[0065]7、二抗孵育：使用fitc标记的抗人igg进行孵育(jackson二抗，使用pbst按照1:200稀释后使用)，孵育时间40min；[0066]8、洗涤：使用pbst洗涤3次；[0067]9、显微镜下观察结果，并记录各突变体与自身抗体的结合情况。[0068]实施例3[0069]实施例3与实施例2的不同之处在于实施例3使用如下质粒单独转染：野生型nr1(核酸序列见seq id no.1)、nr2a(nr2a的登录号： nm_000833.4)、nr2b(nr2b的登录号：nm_000834.4)进行转染，转染质粒量各为1.5μg，制得过表达野生型nr1、过表达nr2a、过表达nr2b的细胞爬片；使用如下质粒进行共转：野生型nr1和nr2a共转、野生型nr1 和nr2b共转。同时选取实施例2制备得到的nr1△627-630和nr2a、 nr1△581-624和nr2a、nr1△627-630和nr2b、nr1△581-624和nr2b 爬片对疑似nmdar脑炎患者的血清进行筛选，比较各种细胞爬片的检出情况。[0070]对比例1[0071]1、通过人工合成的方法，将nmdar的1α亚基dna序列(seq id no.1) 合成至pcdna3.1上，插入酶切位点为nhei和noti。[0072]2、根据突变位点设计表2所示的引物。[0073]表2对比例设计缺失引物[0074][0075]3、分别使用表2的引物进行pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。[0076]构建突变体nr1△410-559，nr1△625-626时，以nmdar1α亚基的dna序列为模板，进行pcr扩增；[0077]构建突变体nr1△837-838时，以缺失了864-937位氨基酸的nmdar1α亚基的dna序列为模板，进行pcr扩增。[0078]pcr扩增体系为：模板50ng、引物f(0.2μm)2μl、引物r(0.2μm)2μl、fastpfudnapolymerase(2.5units)1μl、5×fastpfubuffer10μl、2.5mmdntp4μl、dmso1μl，最后用nuclease-freewater将体系补足50μl；[0079]pcr扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，变性到延伸33个循环；72℃再延伸5～10min。[0080]4、将步骤3得到的pcr产物进一步处理，分别用dmt酶于37℃处理1h，去除模板质粒，进行胶回收。将胶回收的产物使用t4polynucleotidekinase进行处理(按照neb说明书进行操作)，处理后的产物加入t4连接酶室温连接2小时，然后将连接产物转化至感受态细胞(dmtchemicallycompetentcell)中；将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的lb液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序。测序正确的质粒大提保存。[0081]对比例2[0082]对比例2与实施例2的不同之处在于对比例2的步骤2使用野生型nmdarnr1质粒分别与nr2a(nr2a的登录号：nm_000833.4)或nr2b(nr2b的登录号：nm_000834.4)共转，转染完4小时候更换为含有不同含量拮抗剂(ifenprodil)完全培养基，继续培养36～48h进行固定，制得细胞爬片进行与实施例2相同的免疫荧光染色。[0083]对比例3[0084]对比例3与实施例2的不同之处在于对比例2分别使用如下质粒：nr1△410-559、nr1△625-626以及nr1△837-838分别与nr2a(nr2a的登录号：nm_000833.4)或nr2b(nr2b的登录号：nm_000834.4)共转，制得细胞爬片进行与实施例2相同的免疫荧光染色。[0085]结果显示，实施例2nmdar自身抗体阳性血清染色结果如图1所示，阴性血清染色结果如图2所示，缺失了nr1亚基的581-624位氨基酸或缺失了nr1亚基627-630位氨基酸的突变体与nr2亚基(nr2a/2b)共转后细胞几乎铺满了细胞爬片，可检测出阳性血清中的nmdar自身抗体，同时在阴性样本上表现出较好的背景，“球状”信号少；与对比例3相比，实施例1获得了信号好，背景低的nmdar自身抗体检测系统。[0086]实施例3的结果是野生型nr1抗体的检出率为7.99％；nr2a抗体的检出率较低(在854例样品中，未检测出nr2a抗体的阳性，但是在更早之前的检测当中筛出了1例nr2a抗体的阳性，可能是某一段时间检测人群的差异导致或需要扩大样本基数)；nr2b抗体的检出率为0.93％；野生型nr1 和nr2a共转、nr1△627-630和nr2a共转、nr1△581-624和nr2a共转后的细胞爬片可检出nr2a的阳性(截止目前为止，尚未检测到nr1抗体和 nr2a抗体的双阳性)；野生型nr1和nr2b共转、nr1△627-630和nr2b 共转、nr1△581-624和nr2b共转后的细胞爬片既能检出nr1抗体阳性的样本，又能检出nr2b抗体阳性的样本，还能筛出nr1和nr2b双阳的样本 (在854例样品中，nr1抗体和nr2b抗体双阳性检出率为0.7％)。另外，本发明还发现nmdar nr1的两个缺失突变体nr1△627-630、nr1△581-624分别和nr2a、nr2b共转后，其阳性信号明显高于野生型nr1 和nr2a、nr2b共转后的阳性信号。[0087]对比例2的试验结果如图3和图4所示，野生型nmdar nr1亚基分别与nr2a和nr2b共转后，加入不同含量拮抗剂(ifenprodil)培养后阳性血清的染色结果如图3所示，阴性染色结果如图4所示，野生型nmdar nr1 亚基分别与nr2a和nr2b共转后，细胞会出现死亡现象，即细胞未铺满细胞爬片(图3中a和d、图4中a和d)；当加入10μm ifenprodil后，细胞死亡现象明显改善(图3中b和e、图4中b和e)且在图3中e的阳性信号数目明显多于图3中b；当加入100μm ifenprodil后，细胞死亡现象明显加重(图3中c和f、图4中c和f)。因此，适量抑制剂的加入会降低nmdarnr1亚基和nr2亚基共转后对细胞造成的毒性，但是在阴性样本上，表现出了较为明显的“球状”背景。[0088]对比例3的nmdar自身抗体阳性血清染色结果如图5所示，nmdar 自身抗体阴性血清染色结果如图6所示。nr1△410-559、nr1△625-626以及 nr1△837-838与nr2a/2b亚基共转后，只有nr1△625-626共转后的突变体细胞可以检出阳性信号，但阴性血清上“球状”信号较多，其余两种突变体细胞未见明显阳性信号；nr1△837-838共转后的突变体细胞死亡较多； nr1△410-559共转后的突变体细胞死亡数量略少于，但阴性血清上“球状”信号较多。三组突变体不适用于nmdar自身抗体的检测。[0089]综上可知，本发明提供了一种简单、不需要拮抗剂、“球状”背景信号少且灵敏度较高的检测系统以检测样本中nmdar自身抗体。[0090]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。









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