一种负载HPV复合抗原的DC疫苗及其应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术一种负载hpv复合抗原的dc疫苗及其应用技术领域1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种负载hpv复合抗原的dc疫苗及其应用。背景技术：2.人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)是一种普遍存在的dna病毒，主要通过直接身体接触传播，感染人的皮肤和粘膜。hpv是大小约7～8kb的环状双链dna病毒，在感染周期的所有阶段可通过宿主的组蛋白组装成染色质。hpv基因组有三个区域：上游调控区-包括启动子、增强子和复制子；早期编码区-编码早期蛋白e1～e8；晚期编码区-编码主要衣壳蛋白l1和次要衣壳蛋白l2，表1介绍了hpv的相关蛋白及功能。3.表1 hpv蛋白及功能[0004][0005]一些hpv亚型表现为无症状感染或仅仅导致良性病变，另一些hpv亚型导致病变并在持续感染时发展为肿瘤，hpv诱导肿瘤需要多种蛋白参与。[0006]e7蛋白与抑癌基因rb家族成员结合并靶向其降解，驱动转录因子e2f释放激活，驱动s期基因表达。虽然e7与rb结合会导致p53介导的生长抑制和细胞凋亡，但e6蛋白能靶向p53降解。e6和e7协同作用导致细胞周期检查点失效，伴随hpv持续感染，细胞突变逐渐积累，进而发展为癌症。[0007]hpv高危亚型e5蛋白能和e6/e7蛋白协同促进感染细胞过度增殖，并可能促进恶性进展。此外，e5蛋白能降低mhc i类蛋白的表达水平。[0008]hpv附加体表达e1/e2蛋白能激活已整合到结合宿主基因组的病毒复制起始位点并启动dna复制，诱导宿主细胞染色体异常。病毒复制起始位点的扩增也会激活dna修复和重组，增加了基因组的不稳定性，促进了细胞突变，最终导致恶性进展。[0009]目前已鉴别出约450种hpv，根据l1蛋白的基因序列差异分为α、β、γ、μ和ν五个属。α属包含多种高危亚型，如hpv-16、hpv-18、hpv-31、hpv-33、hpv-35、hpv-39、hpv-45、hpv-51、hpv-52、hpv-56、hpv-58、hpv-59等。高危亚型hpv是宫颈、肛门、下生殖道(外阴、阴道、阴茎)和口咽部的公认致癌物。[0010]宫颈癌几乎100％与持续性感染hpv相关，其中由hpv16或hpv18引起的占73％。浸润性宫颈癌的治疗由分期决定，治疗方式包括手术、体外放疗、近距离放疗和基于顺铂的化疗，目前尚无有效的免疫疗法。患者生存率与宫颈癌分期以及肿瘤体积密切相关，5年存活率从ia期的93％到ivb期的15％不等。[0011]肛门癌中约87％与持续性感染hpv相关，其中由hpv16/hpv18引起的占80％。肛门癌的主要组织病理学类型为鳞状肛门癌。肛门癌的根治性手术涉及造瘘，通常采用与晚期宫颈癌治疗方案类似的放疗和同步化疗的方案，目前尚无获批的晚期、转移性肛门癌的靶向疗法。[0012]阴茎癌中约29％由hpv引起。目前尚无最佳治疗模式，针对晚期阴茎癌的系统治疗的主要方法是顺铂为基础的化疗方案，但存在反应差、疗效不持久和毒性反应高等缺点。[0013]hpv引起的头颈鳞癌基本是口咽鳞状细胞癌，占所有头颈鳞癌的20％。与hpv阴性患者相比，阳性患者生存率更高，原因可能包括对手术治疗或放疗的敏感性增加、突变负担较低和具有较多肿瘤浸润淋巴细胞等。针对晚期口咽癌，可同时使用放化疗或手术辅助治疗。[0014]hpv相关肿瘤的发病机制与e6和e7等致癌蛋白持续表达密切相关，因此常作为靶点。目前已开展多种靶向hpv抗原的免疫治疗的临床试验，主要包括基于肽/载体/dna的疫苗和过继性细胞疗法。[0015]基于肽的疫苗直接提供编码hpv致癌蛋白的短肽或长肽。短肽具有hla限制性，长肽没有hla限制，但要先经抗原呈递细胞处理再呈现在hla分子上，目前基于肽的疫苗免疫原性较弱，需要佐剂来提高细胞免疫和体液免疫的效力。[0016]基于载体的疫苗是基因编辑后表达靶抗原的减毒活疫苗或非活性活疫苗，其风险在于载体可能引发相关的疾病。adxs11-001是分泌重组李斯特菌素-o的减毒李斯特菌，能诱导hpv相关癌症的免疫反应，由于adxs11-001治疗hpv阳性口咽癌的i期临床期间出现全身性李斯特菌病的病例，目前该临床试验已终止。[0017]基于dna的疫苗将抗原编码基因直接导入体内，dna疫苗的免疫原性弱，需要不断增强其免疫原性，此外引入外缘hpv dna可能导致宿主细胞发生癌变转化。[0018]针对hpv相关肿瘤开展的过继性细胞疗法有肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,til)、t细胞受体工程化t细胞疗法(t cell receptor engineered t cell therapy,tcr-t)和嵌合抗原受体t细胞疗法(chimeric antigen receptor t cell therapy,car-t)。til需要从手术切除的标本中分离淋巴细胞并体外扩增，难度大且耗时；tcr-t和car-t需要基因编辑，应用到人体的安全性有待观察。[0019]树突状细胞(dendritic cell,dc)是目前发现的功能最强大的专职抗原递呈细胞，也是唯一能激活初始t细胞产生抗原特异性免疫应答的抗原递呈细胞，在机体免疫系统中发挥着重要的作用。[0020]dc高表达mhc分子，并将其摄取处理的肿瘤抗原与mhc分子结合形成肽-mhc复合物，dc将肽-mhc复合物呈递给t细胞并被特异性tcr识别，tcr-cd3复合物将抗原识别信号转导到t细胞中，启动t细胞活化的第一信号；dc高表达cd40、cd80、cd86等共刺激分子与t细胞相应受体结合，启动t细胞活化的第二信号；dc大量分泌il-12等多种细胞因子，调节t细胞的增殖分化与免疫记忆，启动t细胞活化的第三信号。活化的t细胞离开外周淋巴器官，进入癌症病灶，发挥抗肿瘤功能。[0021]鉴于dc在机体免疫的重要作用，目前开发出多项体外诱导hpv肿瘤特异性dc疫苗的专利。例如，专利cn201510395794.0提出了一种基于dc细胞的hpv病毒疫苗的制备方法，从血液中分离得到cd14+细胞；将cd14+细胞在培养基中加以诱导得到未成熟的dc细胞；在培养基再加入hpv16的嵌合性病毒样颗粒，促使未成熟的dc细胞增殖，并且使hpv16的嵌合性病毒样颗粒与未成熟的dc细胞共培养一段时间，以进行抗原的负载；然后，再促使已负载抗原的未成熟的dc细胞成熟。专利cn201010547391.0提供了一种tlr激动剂用于制备hpv多肽/dc混合疫苗，由一份hpv11e77-15，一份体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞，一份tlr9激动剂作为佐剂组成，通过从小鼠骨髓提取树突状细胞，进一步体外培养，先与免疫原性最强的一段hpv11e7ctl表位肽共孵育，再分别与tlr配体cpg等共孵育，以促进dc成熟，检测孵育后dc表面标志变化以确认其成熟度，上述刺激成熟的dc疫苗可用于免疫小鼠，该发明将tlr配体与hpv11e7多肽联合使用可促进dc的成熟度，尤其联用cpg后可提高t细胞分泌细胞因子tnf-α和ifn-γ的水平，可用于尖锐湿疣和宫颈癌的防治。多种专利主要以hpv-16/18的e6/e7蛋白或几种表位限制性多肽作为抗原负载dc，抗原组合有限，只能靶向hpv-16/18的e6/e7等抗原，而对hpv-16/18的e2、e5等其他潜在致癌蛋白或其他亚型的hpv无效，进而导致hpv相关肿瘤发生免疫逃逸。已有研究表明hpv相关肿瘤，例如宫颈癌能干扰dc的nf-κb活化，导致dc趋化因子受体ccr7表达受抑制，阻断其向淋巴结归巢。一旦hpv相关肿瘤细胞发生免疫逃逸，dc疫苗的抗肿瘤效果将受到很大限制。因此针对hpv相关肿瘤，需要开发肿瘤复合抗原的dc疫苗。技术实现要素：[0022]针对现有技术的限制，本发明的目的是提供一种负载hpv复合抗原的dc疫苗及其应用。本发明通过在体外刺激源自患者血液制备的dc，负载靶向不同hpv亚型的阳性细胞系的超强免疫原性的多种细胞裂解物(如hela，hela 229，hela s3，caski，siha，me-180，ms751，c-4i等)，并在不同激动剂和细胞因子诱导下得到成熟dc，制备出具有靶向hpv相关肿瘤抗原的dc疫苗，回输给患者后刺激患者先天免疫和适应性免疫，产生细胞毒性t细胞杀伤肿瘤细胞，实现个性化治疗；相较于现有的标准治疗，安全性高、副作用极小、制备周期短、成本低。[0023]为实现上述目的，本发明的技术方案如下：[0024]一方面，本发明提供了一种hpv复合抗原，所述的hpv复合抗原包括不同亚型的hpv阳性肿瘤细胞系的细胞裂解物。[0025]具体地，所述的不同亚型的hpv阳性肿瘤细胞系为hela，hela 229，hela s3，caski，siha，me-180，ms751和c-4i等细胞系中的一种或多种组合。[0026]另一方面，本发明提供了上述hpv复合抗原在制备dc疫苗中的应用。[0027]又一方面，本发明提供一种dc疫苗，所述dc疫苗负载有上述hpv复合抗原。[0028]具体地，所述的dc疫苗为dc单价疫苗或dc多价疫苗。[0029]具体地，所述的dc疫苗负载一种、两种或两种以上的hpv阳性肿瘤细胞系细胞裂解物。[0030]进一步具体地，所述的hpv阳性肿瘤细胞系为hela，hela 229，hela s3，caski，siha，me-180，ms751和c-4i等细胞系中的一种或多种组合。[0031]具体地，所述的每种细胞的用量为2.5×107-2.5×109个。[0032]具体地，所述dc疫苗还包含第一佐剂或其他辅助治疗的细胞因子。[0033]进一步具体地，所述的第一佐剂为cpg dna、toll-like receptors、poly(i:c)、lps或ok432中任一种；所述的其他辅助治疗的细胞因子为tnf-α或il-12。[0034]又一方面，本发明提供了上述hpv复合抗原或dc疫苗在制备预防和/或治疗hpv相关肿瘤的药物中的应用。[0035]具体地，所述的hpv相关肿瘤包括但不限于宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、头颈鳞癌、外阴癌、阴道癌以及其他hpv相关肿瘤。[0036]本发明提供的能激活机体的固有免疫和适应性免疫来治疗hpv相关肿瘤的dc疫苗，特别是针对宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、头颈鳞癌、外阴癌、阴道癌以及其他hpv相关肿瘤，具有疗效良好，副作用极小，能长期高效抑制hpv相关肿瘤细胞的分裂增殖和减轻疾病进程，甚至达到完全缓解状态。[0037]在一些实施方案的抗原致敏的dc群属免疫原性组合物，所述dc群已被相应抗原负载。具体的抗原包含hela，hela 229，hela s3，caski，siha，me-180，ms751，和c-4i等细胞系的细胞裂解物，每种细胞具体用量在2.5×107-2.5×109个。在本发明的另一些方面中，载有hpv复合抗原的dc疫苗，可以是只负载一种hpv阳性肿瘤细胞系细胞裂解物的dc单价疫苗，或是负载两种hpv阳性肿瘤细胞系细胞裂解物的dc多价疫苗，也可同时负载三种，甚至多种hpv阳性肿瘤细胞系细胞裂解物的dc多价疫苗。[0038]在某些方面，本发明所述的dc疫苗可以包含第一佐剂(cpg dna、toll-like receptors、poly(i:c)、lps或ok432等)或其他辅助治疗的细胞因子如tnf-α、il-12等。dc疫苗以经静脉内、皮内、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、结内、皮下或局部施用被给予2-30次，每次间隔一周或两周；dc疫苗每次回输细胞量在1×106-5×108个。[0039]又一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗hpv相关肿瘤的药物，所述的药物包含上述dc疫苗。[0040]与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：[0041]dc疫苗是一种通过激活患者自身的免疫系统达到对抗疾病目的的疫苗。与hpv相关肿瘤的标准治疗相比有以下优点：[0042]1、本发明所述的dc疫苗治疗hpv相关肿瘤更加安全，提高生存质量。[0043]hpv相关肿瘤的标准治疗主要基于手术、化疗和放疗，肿瘤治疗时除了杀伤肿瘤细胞外，也会误伤患者的正常细胞，降低患者的免疫力；hpv相关肿瘤的肿瘤细胞更容易累积突变，通过突变发生免疫逃逸而产生耐药性，导致药效下降。相对于标准治疗，dc疫苗是一种新的治疗方式。dc直接作用于患者体内的免疫细胞，通过激活患者的免疫系统杀伤肿瘤细胞，不会误杀正常细胞，而且能增强患者的免疫力，副作用显著小于传统抗肿瘤药或新型靶向药；dc疫苗与人体本身的dc激活免疫系统的机制一致，副作用极小，最常见的副作用仅为临床i/ii级不良反应，如发热、乏力、头晕、全身肌肉酸痛、嗜睡等。[0044]2、本发明所述的dc多价疫苗制备所用的抗原对治疗hpv相关肿瘤有潜力。[0045]目前治疗hpv相关肿瘤的dc疫苗主要以hpv-16/18的几种特定表位限制性多肽作为抗原，而本发明的dc多价疫苗选用了多种hpv阳性肿瘤细胞系的细胞裂解物，包含肿瘤细胞的全部抗原，能最大程度地负载hpv的抗原信息，加强了dc呈递抗原的多样性，最大限度激活免疫系统、诱导更强的t细胞反应、提高治疗效果。[0046]3、本发明所述的dc多价疫苗制备所用的抗原来源于稳定表达hpv的细胞系，无需耗时耗力筛选患者特异性抗原，没有hla限制性，属于通用抗原，简化了dc多价疫苗的制备工艺，整个制备周期仅需1周，在降低成本、节约时间方面显示了突出的优势。[0047]4、本发明所述的dc多价疫苗治疗效果更为持久，能长期有效抑制hpv相关肿瘤的复发和转移。dc多价疫苗在回输患者体内后，能刺激产生数量庞大的有hpv复合抗原信息的记忆t细胞，存在时间长达几年至几十年。当再次遇到相应刺激后，可迅速在体内活化，杀伤hpv相关肿瘤细胞，防止复发和转移。附图说明[0048]图1为dc细胞形态图。[0049]图2为dc细胞表面标志分子表达量流式图。[0050]图3为dc细胞il-12p70的表达量检测结果图。[0051]图4为dc疫苗刺激的t细胞对靶细胞的杀伤活性检测结果图。[0052]图5为干扰素γ分泌量检测结果图。具体实施方式[0053]下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0054]实施例1：外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)分离[0055]外周血主要含有pbmc、血小板、粒细胞、红细胞等细胞；其中pbmc密度为1.075-1.090kg/m3，血小板密度为1.030-1.035kg/m3，粒细胞密度为1.092kg/m3，红细胞密度为1.093kg/m3；本实施例基于外周血中各细胞成分密度的差异性，在外周血样品中加入密度为1.075-1.089kg/m3的paque plus(ge healthcare)溶液，进行密度梯度离心，使不同细胞成分分层，能快速从人体外周血中分离得到pbmc。[0056](1)采集hpv阳性宫颈癌患者外周血20ml(该患者为hpv16+，hpv52+，hpv53+)。使用移液管在两个新的离心管中分别加入4.5ml的paque plus溶液。[0057](2)使用移液管吸取血样并沿着离心管管壁缓慢地注入paque plus溶液上层，每管10ml。室温，800g离心20min，缓慢制动。[0058](3)取出离心管，样品分为四层，从上到下依次为血浆、pbmc、paque plus溶液、红细胞与粒细胞。[0059](4)小心吸取pbmc转移至一个15ml离心管中，加入pbs/1％fbs溶液补齐至14ml，吸打混匀。室温，800g离心5min。[0060](5)去上清，轻弹管底部使细胞松散，加入14ml pbs/1％fbs溶液重悬细胞吸打混匀，室温，700g离心5min。[0061](6)去上清，轻弹管底部使细胞松散。加入14ml rpmi1640/10％fbs溶液重悬细胞吸打混匀，室温，400g离心5min。[0062](7)去除上清，轻弹管底部使细胞松散。加入10ml rpmi1640/10％fbs溶液重悬细胞，吹打混匀。[0063](8)吸取10μl细胞液至一个新的1.5ml离心管，加入90μl rpmi1640/10％fbs溶液稀释10倍；吸取10μl稀释细胞液，加入10μl trypan blue染色后加至血球计数板，在倒置显微镜下计数。[0064](9)室温，700g离心5min，去除上清，加入适量rpmi1640用于后续试验。[0065]实施例2：肿瘤细胞裂解物的制备[0066]反复冻融法，是一种常用的机械裂解方式，通常由冷冻和解冻两部分组成。原理是由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎，使细胞死亡，但是又保留有细胞的免疫原性。冷冻通常在液氮或-20℃冰上进行，解冻可以在37℃、50℃、65℃或100℃水浴中进热休克，比化学裂解温和。[0067](1)预先设置水浴温度为37℃。[0068](2)分别收集hela，hela 229，hela s3，caski，siha，me-180，ms751和c-4i等细胞(至少3×107个)。室温，700g离心5min收获细胞。[0069](3)去除上清液并重悬于rpmi1640/10％fbs中。[0070](4)用trypan blue计数细胞。[0071](5)室温，700g离心5min，缓慢制动，去除上清液。[0072](6)用rpmi1640/10％fbs重新悬浮细胞于1ml冻存管中，密度为5×106/ml。[0073](7)将细胞置于液氮中冷冻20s。[0074](8)立刻将细胞在37℃水浴中快速完全解冻。[0075](9)重复4次步骤(7)和步骤(8)，共5次。[0076](10)使用前将肿瘤细胞裂解物储存在液氮中。[0077]实施例3：未成熟树突状细胞(immature dc，imdc)的制备[0078]1、pbmc诱导产生imdc[0079]在体外，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,gm-csf)能促进imdc的存活，诱导imdc大量增殖。白细胞介素4(interleukin-4,il-4)能抑制巨噬细胞的过度生长，降低细胞表面表达cd14分子，诱导单核细胞向imdc分化。[0080](1)在超净工作台内将实施例1中的pbmc细胞重悬于rpmi1640/10％fbs中，密度为7x 106个/ml，接种于六孔板中，每孔2ml置于37℃二氧化碳培养箱中培养6小时。1640/10％fbs，用于封口，37℃静置孵育2h；[0097](3)用rpmi 1640/10％fbs清洗尼龙毛柱，流速大约为l ml/min，收集最初冼下的10ml细胞悬液，富含t细胞和nk细胞；[0098](4)室温700g离心5min，收集底层细胞。计数并调整细胞浓度至1×l07个/ml，置于含80iu/ml il-2的rpmi1640完全培养基中备用。[0099]或者可采用磁珠分离法，利用cd3+磁珠分离t淋巴细胞。细胞先与抗表面抗原的单抗孵育12min，107个细胞用50μl抗cd3单抗，细胞经洗涤后与生物素标记的100μl羊抗鼠二抗孵育10min，洗涤后加入fitc标记的链霉亲和素25μl，反应8min，洗涤后加生物素标记的磁颗粒(加抗cd3单抗管加100μl磁颗粒)反应8min。上述每步反应后，均加入1ml的含1％牛血清白蛋白的pbs洗涤，2000r/min离心10min。使用磁化细胞分离器(macs)作免疫磁性分离，得到t淋巴细胞。[0100]实验例6：体外刺激诱导ctl细胞[0101]用rpmi1640完全培养基分别重悬实施例4制备的dc单价疫苗、dc多价疫苗与未负载抗原的dc，分别调整密度到2×105个/ml；将上述步骤分离得到的自体t淋巴细胞悬液，用rpmi1640完全培养基调整密度到1.6×106个/ml。每组各加入1ml相应的dc和t淋巴细胞。[0102]以上实验组均加入同样的辅助细胞因子，il-2含量为1000u/ml、il-12含量为1500u/ml、poly(i:c)含量为10mg/ml和tnf-α含量为1000u/ml等。在37℃、5％co2恒温恒湿培养箱中培养2周后，加入终浓度为30u/ml的il-2，以及各组再加入2×105个相应的dc疫苗进行二次刺激，继续培养一周，于第21天收集细胞，得到ctl细胞。[0103]实验例7：dc疫苗刺激的t细胞对靶细胞的杀伤活性检测[0104]将上述实施例6制备得到的ctl细胞离心后用rpmi1640完全培养基悬浮，调整细胞浓度，分三个不同效靶比实验组，每组分别每孔4×105、2×105、1×105加入96孔培养板作效应细胞；向每孔中加入2×104个该患者hpv阳性宫颈癌细胞作为靶细胞，终体积为200μl。同时设置无细胞的空白培养液对照组，均设5复孔。24h后吸去各孔中游离的效应细胞，pbs洗涤2次，每孔各加入含20μlcck8试剂100μl，继续培养2h，酶标仪检测450nm处吸光度值(od)，计算特异性淋巴细胞杀伤率(％)。检测结果如图4所示，在体外，接受dc多价疫苗刺激的t淋巴细胞(poly-dc组)与只接受负载caski细胞裂解物的dc单价疫苗刺激的t淋巴细胞(ag-dc组)或对照组(control组)相比，poly-dc组和ag-dc组都能有效的杀伤靶细胞，抑制靶细胞的增殖，且poly-dc组dc多价疫苗刺激的t淋巴细胞在针对靶细胞时表现出更强的杀伤能力，t淋巴细胞越多，杀伤效果越明显。[0105]实验例8：体外检测干扰素γ的分泌[0106]将没有经过dc刺激的t淋巴细胞(空白组)、上述实施例6制备得到的各组ctl效应细胞和靶细胞，按照效靶比20：1混合于u型底96孔板中培养72h后，使用干扰素γ酶联免疫试剂盒，按照说明书流程检测培养上清中ifn-γ的含量。检测结果如图5所示。[0107]dc单价疫苗刺激的t淋巴细胞(ag-dc组)与dc多价疫苗刺激的t淋巴细胞(poly-dc组)，均可产生大量干扰素γ，显著高于空白组和dc组，且poly-dc组的t细胞分泌的干扰素γ含量高于ag-dc组，说明负载有hpv阳性细胞裂解物的dc多价疫苗能更为强烈地刺激t淋巴细胞的分化，分泌干扰素γ，促进机体的抗病毒感染能力。[0108]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!