一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物及其制备方法与应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及医药，特别是一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物及其制备方法与应用。背景技术：2.山橿系樟科(lauraceae)山胡椒属植物山橿(lindera reflexa hemsl.)的干燥根，在河南主要分布于大别山区，是民间用于治疗慢性胃炎、胃溃疡的常用药。山橿的化学成分主要包括挥发油类、生物碱类、黄酮类、二苯乙烯类等。银松素为山橿中含量较高的二苯乙烯类化合物之一，研究表明其有良好的抗炎和抗氧化活性。随着山橿化学成分研究的不断深入，如何从山橿中分离出更多新的化合物，扩大山橿的用药范围，明确山橿发挥药效的物质基础是本领域技术人员所关心的重要问题，而本发明首次从山橿中发现的reflexanbene d(二苯乙烯类化合物3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene g(3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene j(3,5-二羟基-2,6-二-[(3”r4”r3”’r4”’s)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene h(3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和reflexanbene k(3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)具有显著的抗炎作用，迄今为止未见有公开报道。技术实现要素：[0003]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物及其制备方法与应用，可有效解决从山橿中制备新的化合物，并用于制备抗炎的新药物，解决山橿药用新用途的问题。[0004]本发明解决的技术方案是，一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物，包括化合物reflexanbene d(3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene g(3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene j(3,5-二羟基-2,6-二-[(3”r4”r3”’r4”’s)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene h(3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和reflexanbene k(3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)，分子结构式分别为：[0005][0006]其制备方法，包括以下步骤：[0007](1)制备山橿总黄酮提取物：用乙醇对山橿进行提取，大孔吸附树脂湿法装柱，山橿乙醇提取物上样吸附，纯水冲洗除去杂质，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；[0008](2)硅胶色谱分离：称取纯化山橿总黄酮，用甲醇进行超声溶解，经硅胶柱色谱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇体系进行洗脱，结合薄层色谱合并相同流份，得到7个组份fr.1-fr.7；[0009](3)定向分离目标化合物：用石油醚-二氯甲烷体系对组份fr.1和fr.3进行硅胶柱层析，然后利用mci中压制备柱和半制备液相进行分离纯化，减压回收溶剂，得到化合物reflexanbene d(3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene g(3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene j(3,5-二羟基-2,6-二-[(3”r4”r3”’r4”’s)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene h(3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和reflexanbene k(3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)。[0010]本发明方法制备的二苯乙烯类化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k在制备抗炎药物中的应用。[0011]本发明提取分离过程简单，易于操作，可有效从山橿中提取具有抗炎作用的二苯乙烯类化合物reflexanbene d(3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene g(3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene j(3,5-二羟基-2,6-二-[(3”r4”r3”’r4”’s)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene h(3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和reflexanbene k(3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)，具有显著的抗炎作用，可用于制备抗炎药物，开拓了山橿的药用新用途，具有实际的临床意义，经济和社会效益显著。附图说明[0012]图1为本发明提取的山橿化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k分子结构式图。[0013]图2为本发明reflexanbene d的1h-nmr图。[0014]图3为本发明reflexanbene d的13c-nmr图。[0015]图4为本发明reflexanbene d的dept135图。[0016]图5为本发明reflexanbene d的hsqc图。[0017]图6为本发明reflexanbene d的hmbc图。[0018]图7为本发明reflexanbene d的1h-1h cosy图。[0019]图8为本发明reflexanbene d的noesy图。[0020]图9为本发明reflexanbene d的hr-esi-ms图。[0021]图10为本发明reflexanbene d的ecd图。[0022]图11为本发明reflexanbene g的1h-nmr图。[0023]图12为本发明reflexanbene g的13c-nmr图。[0024]图13为本发明reflexanbene g的hsqc图。[0025]图14为本发明reflexanbene g的hmbc图。[0026]图15为本发明reflexanbene g的1h-1h cosy图。[0027]图16为本发明reflexanbene g的noesy图。[0028]图17为本发明reflexanbene g的hr-esi-ms图。[0029]图18为本发明reflexanbene g的ecd图。[0030]图19为本发明reflexanbene j的1h-nmr图。[0031]图20为本发明reflexanbene j的13c-nmr图。[0032]图21为本发明reflexanbene j的dept135图。[0033]图22为本发明reflexanbene j的hsqc图。[0034]图23为本发明reflexanbene j的hmbc图。[0035]图24为本发明reflexanbene j的1h-1h cosy图。[0036]图25为本发明reflexanbene j的noesy图。[0037]图26为本发明reflexanbene j的hr-esi-ms图。[0038]图27为本发明reflexanbene j的ecd图。[0039]图28为本发明reflexanbene h的1h-nmr图。[0040]图29为本发明reflexanbene h的13c-nmr图。[0041]图30为本发明reflexanbene h的hsqc图。[0042]图31为本发明reflexanbene h的hmbc图。[0043]图32为本发明reflexanbene h的noesy图。[0044]图33为本发明reflexanbene h的hr-esi-ms图。[0045]图34为本发明reflexanbene h的ecd图。[0046]图35为本发明reflexanbene k的1h-nmr图。[0047]图36为本发明reflexanbene k的13c-nmr图。[0048]图37为本发明reflexanbene k的hr-esi-ms图。[0049]图38为药物对巨噬细胞活力的影响。[0050]图39为药物对巨噬细胞no释放量的影响。[0051]图40为药物对巨噬细胞il-6释放量的影响。具体实施方式[0052]以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。[0053]实施例1[0054]本发明一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k的制备方法，所述化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k分子结构式分别为：[0055][0056]其制备方法，包括以下步骤：[0057](1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取3～5次，每次提取0.8～1.2h，每次加入70％乙醇的量为山橿重量的10～14倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得到浓缩液，浓缩液加入水稀释成质量浓度0.04～0.06mg/ml(相当于每1ml含生药0.04～0.06mg)的山橿提取物溶液，备用；[0058](2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡10-14h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；[0059](3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤(1)制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的3～5倍，上样流速为0.5～1.5ml/min，上样完成后静置1.9～2.1h，用大孔吸附树脂3～5倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂3～5倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；[0060](4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5l、16.8l、20l、28l、100l、70.8l、67.5l和65.5l，流速为18～22ml/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46l、48.5l、97l、70.5l、71l、69l、38l和49l，流速为90～110ml/min，每500ml为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用gf254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分fr.1-fr.7的7个组分；[0061]将组分fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2～5ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为22.30min的峰，得化合物reflexanbene g(3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)；[0062]将组分fr.3经中压mci柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4l洗脱液，流速12～17ml/min，每250ml为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用gf254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份fr.3-1、fr.3-2、fr.3-3，将亚组份fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2～5ml/min，检测波长297nm，分别收集洗脱时间为10.44min和20.00min的峰，得化合物reflexanbene h(3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和化合物reflexanbene j(3,5-二羟基-2,6-二-[(3”r4”r3”’r4”’s)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比95:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2～5ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为17.90min的峰，得化合物reflexanbene d(3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯)；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2～5ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为15.37min的峰，得化合物reflexanbene k(3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)。[0063]实施例2[0064]本发明一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k的制备方法，包括以下步骤：[0065](1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取3次，每次提取1h，每次加入70％乙醇的量为山橿重量的12倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得到浓缩液，浓缩液加入水稀释成质量浓度0.05mg/ml的山橿提取物溶液，备用；[0066](2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡12h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；[0067](3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤(1)制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4倍，上样流速为1ml/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂4倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂4倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；[0068](4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5l、16.8l、20l、28l、100l、70.8l、67.5l和65.5l，流速为20ml/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46l、48.5l、97l、70.5l、71l、69l、38l和49l，流速为100ml/min，每500ml为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用gf254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分fr.1-fr.7的7个组分；[0069]将组分fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为22.30min的峰，得化合物reflexanbene g；[0070]将组分fr.3经中压mci柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4l洗脱液，流速15ml/min，每250ml为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用gf254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份fr.3-1、fr.3-2、fr.3-3，将亚组份fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3ml/min，检测波长297nm，分别收集洗脱时间为10.44min和20.00min的峰，得化合物reflexanbene h和化合物reflexanbene j；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比95:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为17.90min的峰，得化合物reflexanbene d；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为15.37min的峰，得化合物reflexanbene k。[0071]实施例3[0072]本发明一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k的制备方法，包括以下步骤：[0073](1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取3次，每次提取0.8h，每次加入70％乙醇的量为山橿重量的10倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得到浓缩液，浓缩液加入水稀释成质量浓度0.04mg/ml的山橿提取物溶液，备用；[0074](2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡10h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；[0075](3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤(1)制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的3倍，上样流速为0.5ml/min，上样完成后静置1.9h，用大孔吸附树脂3倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂3倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；[0076](4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5l、16.8l、20l、28l、100l、70.8l、67.5l和65.5l，流速为18ml/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46l、48.5l、97l、70.5l、71l、69l、38l和49l，流速为90ml/min，每500ml为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用gf254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分fr.1-fr.7的7个组分；[0077]将组分fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为22.30min的峰，得化合物reflexanbene g；[0078]将组分fr.3经中压mci柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4l洗脱液，流速12ml/min，每250ml为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用gf254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份fr.3-1、fr.3-2、fr.3-3，将亚组份fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2ml/min，检测波长297nm，分别收集洗脱时间为10.44min和20.00min的峰，得化合物reflexanbene h和化合物reflexanbene j；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比95:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为17.90min的峰，得化合物reflexanbene d；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为15.37min的峰，得化合物reflexanbene k。[0079]实施例4[0080]本发明一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k的制备方法，包括以下步骤：[0081](1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取5次，每次提取1.2h，每次加入70％乙醇的量为山橿重量的14倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得到浓缩液，浓缩液加入水稀释成质量浓度0.06mg/ml的山橿提取物溶液，备用；[0082](2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡14h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；[0083](3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤(1)制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的5倍，上样流速为1.5ml/min，上样完成后静置2.1h，用大孔吸附树脂5倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂5倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；[0084](4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5l、16.8l、20l、28l、100l、70.8l、67.5l和65.5l，流速为22ml/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46l、48.5l、97l、70.5l、71l、69l、38l和49l，流速为110ml/min，每500ml为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用gf254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分fr.1-fr.7的7个组分；[0085]将组分fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为22.30min的峰，得化合物reflexanbene g；[0086]将组分fr.3经中压mci柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4l洗脱液，流速17ml/min，每250ml为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用gf254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份fr.3-1、fr.3-2、fr.3-3，将亚组份fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5ml/min，检测波长297nm，分别收集洗脱时间为10.44min和20.00min的峰，得化合物reflexanbene h和化合物reflexanbene j；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比95:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为17.90min的峰，得化合物reflexanbene d；将亚组份fr.3-3经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5ml/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为15.37min的峰，得化合物reflexanbene k。[0087]本发明实施例1-4任一所述方法制备的二苯乙烯类化合物reflexanbene d(3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene g(3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene j(3,5-二羟基-2,6-二-[(3”r4”r3”’r4”’s)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)、reflexanbene h(3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和reflexanbene k(3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)经结构鉴定，化合物reflexanbene d的结构均是相同的，reflexanbene g的结构也均是相同的，reflexanbene j的结构也均是相同的，reflexanbene h的结构也均是相同的，reflexanbene k的结构也均是相同的，具有抗炎作用，有效用于制备抗炎药物，并经过多次反复试验均取得了相同或近似的结果，有关资料如下：[0088]一、化合物的结构鉴定[0089]经核磁共振光谱(1h-nmr、13c-nmr)及高分辨质谱(hr-esi-ms)光谱技术鉴定，其中：[0090]化合物reflexanbene d3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯)为棕褐色油状，高分辨质谱hr-esi-ms给出的准分子离子峰m/z367.2267[m+h]+(calculated for c24h31o3，367.2268)，推测该化合物的分子式为c24h30o3，不饱和度为10。紫外光谱显示化合物reflexanbene d在甲醇中的最大吸收波长(λmax)为212nm，237nm和314nm。红外光谱ir显示有羟基(3431cm-1)和苯环(1422,1505,1579,1616cm-1)的吸收。[0091]化合物reflexanbene d的1h-nmr(500mhz，cdcl3)谱显示了1个苯环单取代的信号：δh7.47(2h,d,j＝7.3hz,h-3’和h-5’)，7.35(2h,t,j＝7.5，7.8hz,h-2’和h-6’)，7.30(1h,m,h-4’)；1对反式双键的氢信号：δh 7.03(2h,dd,j＝16.3,16.3hz,h-α和h-β)；1个1，3，4，5位4取代苯环的氢信号δh 6.62(1h,d,j＝1.3hz,h-6)，6.45(1h,d,j＝1.4hz,h-2)；3组甲基氢原子信号：δh 1.36(3h,s,h-7”)，1.10(3h,d,j＝6.5hz,h-10”)，0.97(3h,d,j＝6.5hz,h-9”)。13c-nmr(125mhz，cdcl3)谱和dept-135谱给出了24个碳信号，6个季碳，3个仲碳，3个伯碳和12个叔碳，其中14个为烯碳信号：δc136.6(c-1)，104.2(c-2)，152.6(c-3)，114.5(c-4)，157.9(c-5)，106.3(c-6)，128.3(c-α)，128.5(c-β)，137.4(c-1’)，128.6(c-2’和c-6’)，126.5(c-3’和c-5’)，127.5(c-4’)；3个为甲基信号：δc 29.3(c-7”)，22.1(c-9”)，21.1(c-10”)。根据以上碳氢核磁数据和参考文献，确定合物reflexanbene d是一个以3,5-二羟基-反式-二苯乙烯为母核，同时连接一个含有10个碳的取代基，其中3个碳为甲基碳。[0092]化合物reflexanbene d的结构及各基团的连接位置是通过二维核磁共振谱(2d-nmr)进行确定的。在hmbc谱中h-9”和h-10”互相相关，并且同时与c-8”相关，确定其为异丙基结构片段，h-9”，h-10”，h-8”都与c-4”相关，说明异丙基结构片段连接在c-4”上，在取代基的10个碳中，去掉异丙基片段的3个碳和δc 29.3(c-7”)的甲基碳，还有6个碳原子，其中h-5”与c-4”，c-6”和c-1”相关，h-3”与c-2”，c-4”和c-1”相关，1h-1h cosy显示h-3”与h-2”和h-4”有相关信号，h-5”与h-4”和h-6”有相关信号，说明剩余的六个碳是一个六元环；h-7”与c-1”，c-6”和c-2”相关，说明δc 29.3(c-7”)的甲基碳与c-1”连接，dept-135谱显示δc 74.7(c-1”)是一个季碳，其化学位移值向低场移动，判断其连接一个羟基，结合参考文献确定这10个碳的取代基是一个对薄荷醇的结构片段；结合hmbc谱中h-3”与c-4相关，h-2和h-6与c-α相关的信号进行分析，确定对薄荷醇的c-3”与苯环上的c-4连接。noesy谱显示，h-3”与h-4”和h-7”均存在noe关系，说明h-3”、h-4”、h-7”处于同侧，根据ecd的理论值与实际值进行比对发现，该化合物为1”s3”s4”s构型。综上，确定该化合物的结构为3,5-二羟基-4-[(1”s3”s4”s)对薄荷醇基]-反式-二苯乙烯，经scifinder数据库检索未发现该结构相同的报道，因此确定其为新化合物，命名为reflexanbene d，分子结构式为：[0093][0094]表1化合物reflexanbene d的1h-nmr和13c-nmr数据(in cdcl3)[0095][0096]化合物reflexanbene g(3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)为浅黄色油状物，易溶于氯仿，高分辨质谱hr-esi-ms给出的准分子离子峰m/z 377.2476[m+h]+(calculated for c26h33o2，377.2475)，推测其分子式为c26h32o2。紫外光谱uv显示化合物reflexanbene g在甲醇溶液中的最大吸收波长(λmax)为214nm和299nm。红外光谱ir显示有羟基(3420cm-1)和苯环(1459,1576cm-1)的吸收。[0097]化合物reflexanbene g的1h-nmr(cdcl3，500mhz)显示了一对反式双键氢信号：δh7.84(1h,d,j＝15.6hz,h-α)，6.84(1h,d,j＝16.2hz,h-β)；1个单取代苯环上的5个氢信号：δh7.43(2h,d,j＝7.5hz,h-2’和h-6’)，7.35(2h,t,j＝7.5,7.8hz,h-3’和h-5’)，7.25(1h,t,j＝6.0,7.3hz,h-4’)；两组甲氧基氢信号：δh 3.85(3h,s,5-och3)，3.77(3h,s,3-och3)；3组甲基氢信号：δh1.75(3h,s,h-7”)，0.78(6h,dd,j＝6.7,6.7hz,h-9”和h-10”)；13c-nmr(125mhz，cdcl3)谱显示26个碳信号，结合hsqc和hmbc谱确定了δc 128.1(c-β)和127.5(c-α)是反式双键上的碳信号；δc 138.1(c-1’)，126.3(c-2’和c-6’)，128.7(c-3’和c-5’)和127.3(c-4’)是单取代苯环上的碳信号；δc 55.8(3-och3)和55.3(5-och3)是甲氧基上的碳信号；δc 23.6(c-7”)，21.7(c-9”)，16.2(c-10”)是三个甲基碳信号；其中δc 133.0(c-1”)，127.4(c-2”)，36.2(c-3”)，45.3(c-4”)，22.9(c-5”)，31.3(c-6”)，3.6(c-7”)，27.9(c-8”)，221.7(c-9”)，16.2(c-10”)是一组典型的对薄荷烯基碳信号；剩余的δc 138.6(c-1)，111.3(c-2)，159.2(c-3)，102.7(c-4)，158.5(c-5)，97.8(c-6)是一组苯环上的碳信号；hmbc谱显示，δh 3.85(3h,s)与c-5存在远程相关，δh3.77(3h,s)与c-3存在远程相关，说明两个甲氧基分别连接在c-5和c-3位；h-6与c-5和c-α存在远程相关信号，h-4与c-α不存在远程相关信号，h-2”和h-4”与c-2存在远程相关信号，说明对薄荷烯基片段与c-2连接，noesy谱显示h-3”和h-4”不存在noe关系，说明两者处于对侧，通过ecd数据与计算值进行比对发现该化合物为3”r4”r构型，综合上述数据，鉴定其结构为3,5-二甲氧基-2-[(3”r4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯。通过检索scifinder数据库，发现该化合物未报道过，由此确定该化合物为新化合物，命名为reflexanbene g，分子结构式为：[0098][0099]表2化合物reflexanbene g的1h-nmr和13c-nmr数据(in cdcl3)[0100]6”’)，23.6(c-7”’)，29.2(c-8”’)，21.7(c-9”’)，16.6(c-10”’)与文献报道的对薄荷烯基的信号基本一致，确定该化合物含有两个对薄荷烯基片段。芳香区剩余的14个碳中，δc 126.3，128.8是aa’bb’系统上的碳信号，说明其为单取代苯环上的碳，结合hsqc确定δh 7.19(1h,d,j＝16.5hz)和6.34(1h,d,j＝16.7hz)分别连接在c-α和c-β上，表明δc 129.9，134.0是反式双键上的碳；δh 6.30(1h,s)与δc 105.2连接，表明剩余的6个碳是一个五取代的苯环，δc 155.2，156.7表明该苯环上连接两个羟基，结合文献确定这是一个反式二苯乙烯的片段。[0104]化合物reflexanbene j的结构及各基团的连接位置是通过二维核磁共振谱(2d-nmr)进行确定的。在hmbc谱中h-4与c-3、c-5相关，说明两个羟基分别连接在c-3和c-5上；h-α与c-1、c-2和c-6相关，h-3”和h-4”与c-2相关，h-3”’和h-4”’与c-6相关，说明两个对薄荷烯基对称取代在苯环的c-2和c-6上。noesy谱显示，h-3”’和h-4”’存在noe关系，h-3”’和h-4”’处于同侧，同理h-3”和h-4”没有noe关系，说明处于对侧，根据ecd的理论值与实际值进行比对发现，该化合物为3”r4”r3”’r4”’s构型。综上，确定该化合物的结构为3,5-二羟基-2,6-二-[(3”r4”r3”’r4”’s)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯，经scifinder数据库检索未发现该结构相同的报道，因此确定其为新化合物，命名为reflexanbene j，分子结构式为：[0105][0106]表2-8化合物reflexanbene j的1h-nmr和13c-nmr数据(in cdcl3)[0107][0108][0109]化合物reflexanbene h(3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)为红棕色油状物，易溶于氯仿，高分辨质谱hr-esi-ms给出的准分子离子峰m/z349.2160[m+h]+(calculated for c24h29o2，349.2162)，推测该化合物的分子式为c24h28o2，不饱和度为11。紫外光谱显示化合物reflexanbene h在甲醇中的最大吸收波长(λmax)为211nm和314nm。红外光谱ir显示有羟基(3417cm-1)和苯环(1439，1449，1567，1577，1620cm-1)的吸收。[0110]化合物reflexanbene h的1h-nmr(500mhz，cdcl3)谱显示了1个苯环单取代的信号：δh7.48(2h,d,j＝7.4hz,h-3’和h-5’)，7.35(2h,t,j＝7.5,7.8hz,h-2’和h-6’)，7.26(1h,m,h-4’)；1对反式双键的氢信号：δh 7.03(2h,dd,j＝16.3,16.3hz,h-α和h-β)；2个1，3，4，5位4取代苯环的氢信号δh6.62(1h,m,h-6)，6.52(1h,m,h-2)；3个甲基氢原子信号：δh 1.79(3h,s,h-7”)，0.88(6h,dd,j＝6.9,7.0hz,h-9”和h-10”)。13c-nmr(125mhz，cdcl3)谱显示，有一组δc 140.4，124.4,43.6,35.7,30.7,23.7，27.9,22.1,21.7，16.4的10个碳信号，结合文献发现这是一组对薄荷烯基片段信号，δc 128.7和126.5为aa’bb’系统上的碳信号，δc155.1和157.0是苯环上连接羟基的碳信号，这与文献报道的3,5-二羟基-反式-二苯乙烯的信号基本一致。hmbc谱中显示δh6.62(1h,m,h-6)与δc 116.7，157.0，104.2和128.1相关，6.52(1h,m,h-2)与δc 116.7，155.1，106.2和128.1相关，这说明对薄荷烯基片段与c-4连接。noesy谱显示h-3”和h-4”有noe关系，说明h-3”和h-4”处于同侧，根据ecd的理论值与实际值进行比对发现，该化合物为3”s4”r构型。综上，确定该化合物的结构为3,5-二羟基-4-[(3”s4”r)对薄荷烯基]-反式二苯乙烯，经scifinder数据库检索未发现该结构相同的报道，因此确定其为新化合物，命名为reflexanbene h，分子结构式为：[0111][0112]表2-6化合物reflexanbene h的1h-nmr和13c-nmr数据(in cdcl3)[0113][0114][0115]化合物reflexanbene k(3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)为白色杆状结晶，高分辨质谱hr-esi-ms给出的准分子离子峰m/z241.1218[m+h]+(calculated for c16h17o2，241.1223)，推测该化合物的分子式为c16h16o2，不饱和度为9。紫外光谱显示化合物reflexanbene k在甲醇中的最大吸收波长(λmax)为211nm，299nm和306nm。红外光谱ir显示有苯环(1423,1455,1497,1592cm-1)的吸收。[0116]化合物reflexanbene k的1h-nmr(500mhz，cdcl3)谱显示了1个苯环单取代的信号：δh 7.51(2h,d,j＝7.85hz,h-2’和h6’)，7.36(2h,t,j＝7.7,7.5hz,h-3’和h-5’)，7.25(1h,m,h-4’)；1对反式双键的氢信号：δh 7.10(2h,dd,j＝16.25,16.25hz,h-α和h-β)；1个1，3，5位3取代苯环的氢信号δh6.67(2h,d,j＝2.0hz,h-2和h-6)，6.39(1h,m,h-4)；2个甲氧基氢原子信号：δh3.82(6h,s,3-och3和5-och3)。13c-nmr(125mhz，cdcl3)谱和dept-135谱给出了16个碳信号：4个季碳，2个伯碳和10个叔碳，其中两个伯碳的信号为δc 55.4。芳香区共有14个碳，除去反式双键上的2个碳后剩余12个碳，推测存在两个苯环，δc 161.0有两个季碳信号，说明苯环上有两个甲氧基对称取代，δc 128.7和126.6为aa’bb’系统上的碳信号。结合参考文献确定该化合物为3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯(3,5-dimethoxystilbene)，命名为reflexanbene k，分子结构式为：[0117][0118]表2-10化合物reflexanbene k的1h-nmr和13c-nmr数据(in cdcl3)[0119][0120][0121]二、活性实验[0122]本发明制备的化合物reflexanbene d、reflexanbene g、reflexanbene j、reflexanbene h和reflexanbene k经实验发现具有抗炎作用，有关实验资料如下：[0123]1.实验材料[0124]小鼠单核巨噬细胞raw264.7购买自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清购买自gibco公司。[0125]2.细胞培养[0126]raw264.7细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基中，将培养皿置于37℃，5％co2饱和湿度培养箱培养，每1-2天换培养液一次，当细胞融合度达到80％以上时，用胰蛋白酶进行消化传代。[0127]3.药物对巨噬细胞活力的影响(mtt)[0128]取对数生长期细胞培养于96孔板内，每孔100μl(含2000个细胞)，置于37℃、5％co2培养箱中培养12h，小心移除培养基，然后加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设置5个剂量组，每组设置3个复孔，每孔200μl。对照组加入与给药组等体积的溶剂，置于37℃、5％co2培养箱中培养24h，小心移除培养基，每孔加入20μl(1mg/ml)mtt溶液和100μl不含血清的培养基。37℃、5％co2培养箱中孵育4h，弃去上清液，每孔加入150μl的dmso溶解甲瓒颗粒，轻度振荡溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光度值(od)，以溶剂对照处理的细胞作为对照，并计算细胞存活率。[0129]4.药物对lps诱导的raw264.7细胞no和il-6释放量的影响[0130]4.1.样品的收集[0131]取对数生长期细胞培养于96孔板内，每孔100μl(含1×105个细胞)，置于37℃、5％co2培养箱中培养12h，小心移除培养基，然后加入200μl含1μg/ml lps的培养基稀释的药物，设置3个剂量组，每组设置3个复孔，每孔200μl。空白组加入200μl不含胎牛血清的dmem培养基，对照组加入200μl含1μg/ml lps的培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养24h，将细胞培养上清液转移至离心管中，于-80℃冰箱中保存备用。[0132]4.2.griess试剂的配制[0133](1)将85％的磷酸溶液用蒸馏水配置成5％的磷酸溶液100ml。[0134](2)精密称取0.05g的盐酸萘乙二胺，溶解于50ml的5％的磷酸溶液中，即为0.1％的盐酸萘乙二胺溶液，精密称取0.50g的磺胺，溶解于50ml的5％的磷酸溶液中，即为1％的磺胺溶液，4℃避光保存，临用前按1:1混合。[0135](3)精密称取0.13799g的nano2，溶于10ml的双蒸水中，即得到200mm的nano2溶液，4℃避光保存。[0136]4.3.no释放量的测定[0137](1)标准品：用dmem培养基将标准品稀释为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.15625μm的溶液。[0138](2)样品：收集得到的细胞培养液。[0139](3)每孔加入100μl的标准品溶液或待测样品后，再加入100μl griess试剂。[0140](4)室温静置15分钟后，用酶标仪测定540nm各孔的吸光度。[0141]4.4.il-6释放量的测定[0142]采用双抗夹心法(sandwich)法检测样品中il-6的浓度。分别将样品和不同浓度的标准品按照100μl/孔加入到相应的酶标板孔中，封板膜封板，室温孵育90分钟，洗板6次，每次都置于吸水纸上拍干。每孔加入100μl的检测抗体，封板膜封板，室温孵育30分钟，洗板6次。加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素100μl，封板膜封板，室温孵育30分钟，洗板6次。加入信号增强剂100μl，封板膜封板，室温孵育15分钟，洗板6次。再次加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素100μl，封板膜封板，室温孵育15分钟。加入显色剂tmb溶液100μl，封板膜封板，避光，室温孵育15分钟。加入终止液100μl，混匀后立即测量450nm最大吸收波长和570nm参考波长下的od值，校准后的od值为450nm的测定值减去570nm的测定值。[0143]5.实验结果[0144]5.1.药物对巨噬细胞活力的影响[0145]药物与raw264.7细胞共培养24h后，reflexanbene k(《100μm)对细胞活力的影响较小，当各化合物的浓度低于25μm时，细胞的存活率均在80％以上，细胞毒性较小(图38)。[0146]5.2.药物对lps诱导的raw264.7细胞no和il-6释放量的影响[0147]实验结果显示，不同浓度的reflexanbene j和reflexanbene h作用于炎症细胞模型24h后，no的释放量显著降低，并且表现出一定的剂量依赖性，随着浓度的增加，no的释放量减少(图39)。分离的5个化合物作用于细胞炎症模型24h后，il-6的释放量均有所降低，在浓度达到20μm时与模型组相比有极显著性差异(p《0.01)，其中reflexanbene d在浓度达到20μm后，下调il-6的作用与阳性对照药地塞米松(dex)接近，表现出良好的抗炎效果(图40)。[0148]综上，本发明从山橿中分离得到的具有抗炎作用的二苯乙烯类化合物，实验发现，本发明的化合物reflexanbene j和reflexanbene h能够有效抑制lps诱导raw264.7细胞no的释放水平，所分离的5个化合物，特别是化合物reflexanbene d能够有效抑制炎症因子il-6的释放水平。因此，本发明具有制备抗炎作用药物的应用价值，开拓了山橿药材的新用途，并为制备抗炎作用药物提供了技术支持，具有非常好的应用前景。原料丰富，制备方法易操作，易于推广应用，是制备抗炎作用药物上的一大创新，经济和社会效益显著。









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