包含作为活性成分的Prox1抑制剂的用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物组合物的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术包含作为活性成分的prox1抑制剂的用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物组合物[技术领域][0001]本发明涉及能够通过再生哺乳动物视网膜中的视网膜神经来治疗视网膜神经变性疾病的技术，更具体地，涉及包含作为活性成分的prox1表达或迁移抑制剂的用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物组合物，以及包含所述组合物的药物制剂。[背景技术：][0002]视网膜是覆盖眼球最内侧部分的透明神经组织，进入眼球的光穿过视网膜的内层并由视网膜的视觉细胞检测。视觉细胞将光信息转换回电信息，其通过视网膜内层的神经元和视神经，允许我们通过该过程看见事物。眼球的最外侧部分是无血管纤维层(角膜，巩膜)，并且中间层是血管组织，葡萄膜(虹膜，睫状体，脉络膜)，并且覆盖中间层(脉络膜)内部的透明神经组织是视网膜。视网膜是具有变化厚度的薄的透明膜，并且视网膜的中央部分根据位置被细分为中心凹，近窝区和近中心凹。中心凹在临床上被称为黄斑。[0003]同时，视网膜神经变性疾病可能由于视网膜的先天性或获得性损伤或慢性疾病(例如高血压和糖尿病)的并发症而发生。其具体实例包括先天性视网膜变性疾病，例如色素性视网膜炎(其表现出作为初始症状的不能在黑暗中很好地看见的夜盲症)，以及leber先天性黑朦(lca)(其为遗传性视网膜营养不良)、视网膜脱离(其中视网膜撕裂并脱落)、黄斑变性、由糖尿病引起的糖尿病性视网膜病、中心浆液性视网膜病、老年性视网膜变性等。由于这些疾病，出现了诸如视力下降，包括视野紊乱在内的夜盲症，色弱视，色盲，闪光(当移动眼睛时，光看起来闪亮)，飞蚊症(东西看起来浮在眼睛前面，像蜉蝣)，视物变形症(物体看起来是弯曲的)和中央暗点(视野中心看起来是黑色的)的症状。然而，与能够再生视网膜神经元的低级脊椎动物不同，哺乳动物不能再生视网膜神经元，并且视网膜神经元不能被移植，因此一旦被破坏，视网膜就不能恢复，因此可能导致失明。[0004]尽管这种视网膜神经变性疾病的发病率迅速增加，但目前很少有有效的治疗剂或治疗方法。近年来，已经进行了使用各种干细胞替代和保护视网膜细胞的细胞治疗剂的研究，但是还没有对其进行临床应用(韩国专利号10-1268741)，并且靶向视网膜色素上皮细胞的斯特格氏病基因疗法已经被临床应用，但是仅限于具有一些遗传突变的患者，并且没有能够通过再生变性的视网膜来恢复视觉功能的技术。[0005]因此，迫切需要开发一种可广泛应用于哺乳动物(包括根本不能再生视网膜神经的人)中由视网膜变性引起的各种疾病的安全的、经济的治疗剂。[0006][公开][0007][技术问题][0008]作为开发能够诱导在上述背景下的视网膜神经再生的技术的深入研究的结果，本发明人发现了一种机制，通过该机制，在哺乳动物的视网膜神经元中表达的prox1蛋白在视网膜损伤后第一次迁移至穆勒胶质细胞，并且基于此，证实了作为视网膜神经再生的第一阶段的穆勒胶质细胞的细胞分裂可以通过抑制prox1在视网膜中的表达或prox1从视网膜神经元迁移到穆勒胶质细胞来诱导，从而基于此完成本发明。[0009]因此，本发明的一个目的是提供了一种用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的普洛斯彼罗同源框1(prox1)抑制剂。[0010]此外，本发明的另一个目的是提供了用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物制剂，其包含所述组合物。[0011]然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员可以从以下描述中清楚地理解未提及的其他问题。[0012][技术方案][0013]为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的普洛斯彼罗同源框1(prox1)抑制剂。[0014]作为本发明的示例性实施方案，所述抑制剂可以抑制视网膜神经元中prox1基因的表达。[0015]作为本发明的另一个示例性实施方案，所述抑制剂可以抑制prox1蛋白从视网膜神经元向穆勒胶质细胞的迁移。[0016]作为本发明的另一个示例性实施方案，prox1基因可以包括seq id no:1的碱基序列。[0017]作为本发明的另一个示例性实施方案，prox1蛋白可以包括seq id no:2的氨基酸序列。[0018]作为本发明的另一个示例性实施方案，抑制prox1基因表达的抑制剂可以是选自以下的任何一种：与prox1基因的mrna互补结合的反义核苷酸、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、核酶和crispr/cas9。[0019]作为本发明的另一个示例性实施方案，抑制prox1蛋白迁移的抑制剂可以是选自以下的任何一种：特异性结合prox1蛋白或竞争性抑制prox1和穆勒胶质细胞膜结合的抗体、肽、肽类似物、适体和化合物。[0020]作为本发明的另一个示例性实施方案，视网膜神经变性疾病可以是选自以下的任何一种：色素性视网膜炎、leber先天性黑朦(lca)、视网膜脱离、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、青光眼、中心浆液性视网膜病和老年性视网膜变性。[0021]作为本发明的另一个示例性实施方案，所述组合物可以通过抑制诱导吞噬作用和炎症反应的小神经胶质细胞的增殖来促进视网膜神经元的再生。[0022]作为本发明的另一个示例性实施方案，所述组合物可以与促进神经元分化的制剂联合施用。[0023]此外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物制剂，其包含所述组合物。[0024]作为本发明的示例性实施方案，药物制剂可以是注射制剂、输注制剂、喷雾制剂或液体制剂。[0025]作为本发明的另一个示例性实施方案，药物制剂可以用于局部眼部施用。[0026]此外，本发明提供了一种预防或治疗视网膜神经变性疾病的方法，所述方法包括：向个体施用包含作为活性成分的普洛斯彼罗同源框1(prox1)抑制剂的药物组合物。[0027]此外，本发明提供了药物组合物用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的用途。[0028][有益效果][0029]本发明人首次发现了在视网膜损伤期间prox1蛋白向穆勒胶质细胞的迁移，并基于此，证实了通过抑制prox1的表达或迁移，穆勒胶质细胞的分裂是可能的。穆勒胶质细胞的分裂是视网膜再生的前兆，因为在哺乳动物视网膜中穆勒胶质细胞的分裂被抑制，在该方面，根据本发明的包含prox1抑制剂的药物组合物可以诱导哺乳动物中受损视网膜的再生，并且因此可以普遍用于治疗引起失明的各种视网膜神经变性疾病，因为在相关技术中没有有效的治疗方法，并且此外，当所述药物组合物与选择性视网膜神经分化方法等组合时，预期所述药物组合物可用于开发仅能选择性再生特定变性的视网膜神经元的新颖的视网膜再生方法。[附图说明][0030]图1a左列所示的结果是显示使用其中将egfp基因插入到prox1基因位点的载体产生的转基因小鼠的视网膜中的egfp和prox1蛋白表达的结果，图1a右列所示的结果是通过原位rna杂交(ish)和免疫荧光染色同时检测prox1 mrna和prox1蛋白的结果，并且理论上说，prox1蛋白是通过prox1 mrna的翻译而产生的，提示只有prox1蛋白而没有prox1 mrna的细胞可以从外部引入。[0031]图1b显示了egfp表达的结果，而不是使用cre-loxp系统从小鼠穆勒胶质细胞中特异性去除prox1基因，这意味着通过使用r26-tdtomato转基因小鼠在进行遗传重组的细胞中表达r26-tdtomato红色荧光蛋白，已经从用r26-tdtomato标记的穆勒胶质细胞中去除了prox1基因，并显示了确认这些细胞中显示的prox1蛋白是来自外部的结果。[0032]图2a显示了使用n-甲基-n-亚硝基脲(mnu)诱导小鼠视网膜损伤，然后直到第7天后确认通过tunel染色检测的凋亡细胞和新产生的标记有edu的细胞的结果。[0033]图2b显示了用iba1标记的小神经胶质细胞在被mnu损伤的小鼠视网膜中的分布。[0034]图2c显示了在与图2b相同的条件下进行视网膜损伤实验后，通过免疫荧光染色比较其中存在用sox2标记的穆勒胶质细胞和prox1的细胞的结果。[0035]图2d显示了在包括mnu施用的每种视网膜损伤条件下，比较组成视网膜的穆勒胶质细胞(mg)，双极细胞(bp)和无长突细胞(ac)中的prox1蛋白的量的结果。[0036]图2e显示了通过向斑马鱼施用mnu诱导视网膜损伤后，证实用gfap-egfp转基因标记的穆勒胶质细胞和prox1的分布的结果。[0037]图2f显示了通过用n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)处理诱导视网膜损伤后，比较其中存在用sox2标记的穆勒胶质细胞和prox1的细胞的结果。[0038]图2g显示了通过将视网膜暴露于强光1小时来诱导视网膜损伤后，证实prox1在穆勒胶质细胞中的分布的结果。[0039]图2h显示了证实prox1在rd10小鼠的穆勒胶质细胞中分布的结果，所述rd10小鼠是先天性视网膜变性疾病模型。[0040]图2i显示了证实prox1在rd1小鼠的穆勒胶质细胞中分布的结果，所述rd10小鼠是先天性视网膜变性疾病模型。[0041]图3a显示了证实通过减少受损小鼠视网膜中的外部prox1对穆勒胶质细胞的细胞分裂促进作用的结果，并且显示了这样的结果，其同时显示表达egfp和sox2的穆勒胶质细胞和prox1蛋白在具有视网膜损伤的prox1(fg/fg)正常小鼠和prox1(fg/fg)；chx10-creer小鼠(其中prox1以双极细胞特异性方式被去除，并且egfp可替代地被表达)的视网膜组织中的分布的结果。[0042]图3b显示了显示在与图3a中相同的每只小鼠的视网膜组织的中心和外周部分中的egfp、穆勒胶质细胞(sox2)和新生细胞(edu)的结果。[0043]图3c显示了显示用iba1标记的小神经胶质细胞在与图3a中相同的每只小鼠的视网膜中的分布的结果。[0044]图4显示了显示在通过将mnu注射到小鼠中而损伤视网膜后，分别玻璃体内施用非免疫小鼠抗体或prox1中和小鼠单克隆抗体的眼组织的穆勒胶质细胞中prox1蛋白的水平的结果。[0045][本发明的模式][0046]本发明人已经发现穆勒神经胶质中的外部prox1作为能够治疗哺乳动物中由视网膜损伤或变性引起的疾病的靶标，并且证实了通过抑制外部prox1的流入的治疗潜力，由此基于此完成了本发明。[0047]因此，本发明提供了用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的普洛斯彼罗同源框1(prox1)抑制剂。[0048]在本发明中，由prox1基因编码的prox1蛋白包含同源框结构域，所述同源框结构域作为同源蛋白的一种类型包含与dna和rna结合的60个氨基酸的螺旋-转角-螺旋结构。所述蛋白在脊椎动物中是保守的，并且已知在肝脏，视网膜，淋巴系统等的发育中起各种作用。特别地，已经报道了具有调节细胞增殖，允许细胞迁移到适当位置，和分化细胞使得细胞具有独特功能的所有功能。此外，已经报道了在组织如结肠，脑，血液，乳腺，胰腺，肝脏和食道中发生的癌症中该蛋白水平的变化。prox1蛋白在哺乳动物视网膜的视网膜神经元中表达，并且已知prox1以非常少量存在于穆勒胶质细胞中。[0049]在本发明中，prox1基因可以包括由seq id no:1或3所示的碱基序列。在这种情况下，可以包括与seq id no:1或3所示的碱基序列具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，且最优选95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性的碱基序列。[0050]在本发明中，prox1蛋白包括含有seq id no:2或4所示的氨基酸序列的prox1蛋白和所述蛋白的功能等同物。“功能等同物”是指这样的蛋白质，其作为氨基酸的添加，取代或缺失的结果，与seq id no:2或4所示的氨基酸序列具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，并且甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性，并且表现出与seq id no:2或4所示的蛋白质基本上相同的生理活性。“基本上相同的生理活性”是指在哺乳动物视网膜中的活性。[0051]在本发明中，穆勒胶质细胞是heinrich muller首次发现的一种视网膜胶质细胞，并且是脊椎动物视网膜中最常见的一种胶质细胞，其作为神经元如其它神经胶质细胞的支持细胞。穆勒胶质细胞的细胞体位于视网膜的内核层中，但跨越整个视网膜。穆勒胶质细胞维持视网膜细胞的结构和功能稳定性，并且特别已知其发挥诸如神经递质吸收，细胞碎片去除，k+水平调节，糖原储存以及受体和视网膜神经的机械支持的作用。在低级脊椎动物如鱼(如斑马鱼)，两栖动物和爬行动物中，已知当视网膜受损时，同一视网膜中的穆勒胶质细胞可再生受损的视网膜神经元，同时转化成视网膜神经元祖细胞以增殖和分化成新的视网膜细胞。然而，已知视网膜神经元的再生在哺乳动物视网膜中不会发生，因为穆勒胶质细胞的细胞分裂被抑制。[0052]然而，本发明人通过下面的具体实施方案证实，当在视网膜损伤期间抑制prox1从哺乳动物视网膜神经元向穆勒胶质细胞的迁移和积累时，可以通过促进穆勒胶质细胞的分裂来诱导视网膜神经元的再生过程。此外，证实了当prox1向穆勒胶质细胞的迁移和积累被抑制时，可以通过抑制诱导吞噬作用和炎症反应的小神经胶质细胞的增殖来显示这种效果。[0053]具体地，在本发明的一实施方案中，作为分析视网膜中prox1蛋白的表达模式的结果，证实了prox1蛋白存在于水平细胞，双极细胞，无长突细胞和穆勒胶质细胞中，并且具体地，首次证实了穆勒胶质细胞中的prox1蛋白不是在穆勒胶质细胞内表达的而是从外部引入的(参见实施例1)。[0054]在本发明的另一个实施方案中，作为分析由于哺乳动物的各种原因导致的视网膜损伤期间是否发生视网膜中prox1蛋白水平的变化的结果，仅在穆勒胶质细胞中观察到prox1蛋白的快速增加，而在水平细胞，双极细胞和无长突细胞没有观察到任何变化(参见实施例2-1和2-2)。[0055]在本发明的另一个实施方案中，由于选择性地去除了双极细胞(其是与穆勒胶质细胞相邻的视网膜神经元)中的prox1基因表达的结果，由于证实了受损视网膜中的穆勒胶质细胞中的prox1蛋白水平降低，可以再次证实穆勒胶质细胞中的prox1在包括双极细胞的视网膜神经元中表达并被引入。此外，发现在这种情况下，在受损的视网膜中促进了穆勒胶质细胞的细胞分裂。由此可以看出，穆勒胶质细胞中prox1蛋白的很大一部分来源于双极细胞，并且在双极细胞中prox1基因表达的降低通过降低穆勒胶质细胞中的prox1和导致的prox1分泌量的降低以及导致prox1向穆勒胶质细胞迁移的降低的一系列过程而在视网膜损伤期间诱导穆勒胶质细胞的分裂。此外，证实了在相同条件下诱导吞噬作用和炎症反应的小神经胶质细胞的增殖被抑制。因此，可以看出穆勒胶质细胞中的prox1也用于促进视网膜中小神经胶质细胞的增殖(参见实施例3)。[0056]在本发明的另一个实施方案中，作为施用prox1中和抗体以抑制视网膜损伤后prox1向穆勒胶质细胞的迁移的结果，证实了穆勒胶质细胞中prox1的水平没有增加。通过这一点，证实了通过眼内注射prox1中和抗体来抑制prox1蛋白向穆勒胶质细胞的迁移诱导了穆勒胶质细胞的分裂，并因此可以通过将来穆勒胶质细胞分化为视网膜神经元来诱导神经再生(参见实施例4)。[0057]在本发明中，抑制剂包括抑制视网膜神经元中prox1基因表达的抑制剂和抑制prox1蛋白从视网膜神经元向穆勒胶质细胞迁移的抑制剂。[0058]本文所用的抑制prox1基因表达的表达抑制剂是指引起靶基因蛋白表达降低的表达抑制剂。在本发明中，表达抑制剂包括抑制在穆勒胶质细胞周围的视网膜神经元，优选双极细胞中的prox1蛋白表达的表达抑制剂，并且可以特异性地选自以下的任一种，但不限于此：与prox1基因的mrna互补结合的反义核苷酸，小干扰rna(sirna)，短发夹rna(shrna)，核酶和crispr/cas9。[0059]在本发明中，抑制prox1蛋白迁移的抑制剂可以特异性地选自特异性结合prox1蛋白或竞争性抑制prox1和穆勒胶质细胞细胞膜结合的抗体，肽，肽类似物，适体和化合物，并且可以优选是抗体，但不限于此。[0060]在本发明中，抗体不限于，但通常可以是多克隆抗体，包括针对不同表位(抗原决定簇)的不同抗体或针对抗原上单一决定簇的单克隆抗体，并且更具体地可以是millipore生产的兔多克隆抗体(cat#abn278)或santacruz生产的小鼠单克隆抗体(cat#sc81983)。[0061]如本文所用的，术语“预防”是指通过施用根据本发明的药物组合物来抑制视网膜神经变性疾病或延迟视网膜神经变性疾病的发作的所有动作。[0062]如本文所用的，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物来改善或有益地改变由视网膜神经变性疾病引起的症状的所有动作。[0063]在本发明中，视网膜神经变性疾病包括由视网膜神经的损伤或变性引起的相关疾病，并且可以通过视网膜神经的再生来治疗。优选地，视网膜神经变性疾病可以是选自以下的任一种，但不限于此：色素性视网膜炎、leber先天性黑朦(lca)、视网膜脱离、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、青光眼、中心浆液性视网膜病和老年性视网膜变性。[0064]根据本发明的药物组合物可以单独使用或与手术，放射疗法，化学疗法和生物反应调节剂组合使用，用于治疗视网膜神经变性疾病，并且可以优选与促进神经细胞分化的药物组合使用。[0065]此外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的药物制剂，其包含所述药物组合物。[0066]根据本发明的药物组合物包括作为活性成分的prox1迁移抑制剂，并且可以进一步包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不限于此，并且如果需要，可以进一步包括其它典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，通过另外添加稀释剂，分散剂，表面活性剂，粘合剂，润滑剂等，可以将药学上可接受的载体配制成可注射制剂，例如水溶液，悬浮液和乳液，输注剂例如输液袋，喷雾剂例如气溶胶制剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，组合物可优选根据每种成分通过使用remington参考文献中公开的方法来配制。本发明的药物组合物在制剂方面没有特别限制，但可以配制成注射剂，输注剂，喷雾剂，液体制剂，皮肤外用制剂等。[0067]本发明的药物组合物可以口服施用或可以肠胃外施用(例如，静脉内，皮下，腹腔内或局部包括眼球应用)，并且施用剂量可以根据患者的病况和体重，疾病的严重程度，药物形式和施用途径和时间，根据目标方法而变化，但是施用剂量可以由本领域技术人员适当选择。[0068]本发明的药物组合物以药学上的有效量施用。如本文所用的，“药学上的有效量”是指足以以可应用于医学治疗或诊断的合理益处/风险比治疗或诊断疾病的量，并且有效剂量水平可以根据包括患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物的活性、药物敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物的因素，以及医学领域中熟知的其它因素来确定。根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合施用，可以与相关领域中的治疗剂相继或同时施用，并且可以以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以能够在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，并且该量可以容易地由本领域技术人员确定。[0069]具体地，本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、病况和体重、活性成分在体内的吸收、失活速率和排泄率、疾病类型和联合使用的药物而变化，并且通常，每1kg体重可以每天或每隔一天施用0.001至150mg，优选0.001至100mg的本发明的药物组合物，或者可以分开施用，一天一次至三次。然而，由于有效量可以根据施用途径，肥胖的严重程度，性别，体重，年龄等而增加或减少，因此剂量并非预期以任何方式限制本发明的范围。[0070]作为本发明的另一方面，本发明提供了预防或治疗视网膜神经变性疾病的方法，所述方法包括向个体施用所述药物组合物。[0071]如本文所用的，“个体”是指需要治疗疾病的受试者，并且更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。[0072]此外，本发明提供了药物组合物用于预防或治疗视网膜神经变性疾病的用途。[0073]在下文中，将提出用于帮助理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅仅是为了更容易地理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。实施例[0074]实施例1.实验材料和实验方法[0075]1-1.转基因小鼠的产生[0076]prox1::egfp bac tg mouse,stock tg(prox1-egfp)ky221gsat/mmucd(prox1::egfp)获自mmrrc。[0077]prox1fg、chx10-creert2和glast-creert2小鼠分别获自riken cdb(prox1fg)、riken brc(chx10-creert2)和美国约翰霍普金斯大学(johns hopkins university)(glast-creert2)。在没有特异性病原体的小鼠设施中维持和饲养这些小鼠。使prox1fg小鼠与mg细胞特异性glast-creert2小鼠或bp细胞特异性chx10-creert2小鼠交配以获得在穆勒胶质细胞(mg)或双极细胞(bp)中缺乏prox1的小鼠。在这些小鼠中，它莫西芬(tam)(75mg/kg)的重复腹腔内施用激活了glast阳性mg或chx10阳性bp中的creert2重组酶，并且随后诱导了mg细胞特异性的或bp细胞特异性的prox1缺失和互补egfp的表达。[0078]同时，在这些实施例中进行的所有动物实验根据韩国科学技术院(kaist)的机构动物护理和使用委员会(iacuc)批准的方案进行。[0079]1-2.免疫组织化学[0080]将冷冻的小鼠眼组织切片(20μm)在封闭溶液(含有10％驴血清和0.1％triton x-100的pbs)中在室温下培养1小时。接着，用含有一抗的未补充有triton x-100的封闭溶液处理组织切片，并在4℃下培养16小时。随后，用荧光团缀合的二抗处理组织切片，然后培养，然后在olympus fv1000共聚焦显微镜下观察和分析组织切片的荧光信号。[0081]1-3.原位杂交[0082]使用在pgem-t载体中的小鼠prox1的全长cdna通过t7和sp6 rna聚合酶制备有义和反义rna探针。在小鼠视网膜组织切片中，用标记有洋地黄毒苷(dig)的rna探针进行prox1 mrna的ish。随后，组织切片用与兔抗prox1抗体缀合的抗dig fab片段(roche)和检测dig标记探针的碱性磷酸酶(ap)共染色。与dig标记的rna探针结合的抗dig fab片段用标记有荧光团的二抗(其检测抗-prox1抗体)染色，并且然后通过hnpp荧光检测装置(roche)观察。随后，在olympus fv1000共焦显微镜下获得ish信号的荧光图像。[0083]实施例1.对穆勒胶质细胞中存在外部prox1蛋白的确认[0084]本发明人试图研究prox1基因在小鼠视网膜中的表达模式，并使用了其中将增强的绿色荧光蛋白(egfp)插入prox1基因位点(如图1所示)的转基因小鼠用于此目的。通过这种方式，可以观察到egfp荧光，并且同时可以确认prox1基因表达所产生的prox1蛋白的分布。因此，作为研究存在于视网膜中的细胞中的prox1蛋白的表达模式的结果，理论上，prox1蛋白(以红色表示)应该仅在其中观察到egfp荧光的细胞，如图1a所见的，即水平细胞(hz)和双极细胞(bp)中被检测到，但出现了特殊的现象，其中在未观察到egfp荧光的细胞，即，无长突细胞(ac)和穆勒胶质细胞(mg)中也观察到prox1蛋白。[0085]因此，尽管在穆勒胶质细胞中未观察到egfp荧光，但是为了研究穆勒胶质细胞中的prox1蛋白，本发明人进行了基因操作方法，其使用了如图1b所示的cre-loxp系统选择性地破坏穆勒胶质细胞中的prox1基因。具体地，通过实验实施例1-1中描述的方法产生转基因小鼠，使得表达egfp而不是prox1基因消失的位点，并且在这种情况下，由于prox1通过glast-creer9(其通过雌激素类似物它莫西芬(tam)显示活性)的作用被从穆勒胶质细胞中选择性地去除，egfp荧光仅出现在穆勒胶质细胞中。此外，用cre重组酶以及egfp荧光标记进行遗传重组的细胞也可以用r26-tdtomato红色荧光蛋白标记，以证实该基因是否通过绿色荧光在prox1基因位点表达，以及prox1基因是否通过红色荧光去除。即，如图1b的示意图所示，当去除prox1基因后在相应的位点发生表达时，相应的细胞表达绿色和红色以显示黄色荧光，并且当只去除prox1基因而在prox1基因位点没有任何表达时，可以看到红色荧光。[0086]作为实验的结果，在穆勒胶质细胞中仅观察到红色荧光，并且通过该结果，可以看出穆勒胶质细胞表达prox1蛋白而没有任何prox1基因位点的表达。换句话说，证实了存在于穆勒胶质细胞中的prox1蛋白不在穆勒胶质细胞中表达，而是从外部引入。[0087]实施例2.对受损小鼠视网膜的穆勒胶质细胞中prox1蛋白积累的确认[0088]2-1.通过mnu处理确认prox1蛋白积累[0089]基于上述实施例1的结果，本发明人进行了实验以研究在视网膜受损时是否在穆勒胶质细胞中诱导了prox1蛋白水平的变化。具体而言，如图2a所示，通过将媒介物(含有0.05％乙酸的pbs)或dna-损伤因子n-甲基-n-亚硝基脲(mnu)(在媒介物中60mg/kg)注射到小鼠中以选择性地使成年小鼠视网膜中的感光细胞(pr)变性并以与实验实施例1-2相同的方式使用小鼠的眼球组织切片每天进行免疫组织化学直至注射后第7天来进行分析。在这种情况下，用tunel标记凋亡细胞，并用edu标记新产生的细胞。[0090]作为分析的结果，如图2b所示，发现新产生的细胞是小神经胶质细胞，其从眼球外引入以去除凋亡细胞，这在哺乳动物中是众所周知的。此外，如图2c所示，证实了在暴露于mnu后变性的小鼠视网膜中，由sox2蛋白的表达所指示的，prox1蛋白在穆勒胶质细胞(sox2+)中的表达水平增加。此外，从这些结果，如图2d所示，可以看出prox1的增加仅集中在穆勒胶质细胞中，而在视网膜中的其它细胞，即双极细胞(bp)和无长突细胞(ac)中没有任何变化。相比之下，如图2e所示，由斑马鱼视网膜中的gfap-egfp(其能够在视网膜损伤时再生神经)所指示的，穆勒胶质细胞中prox1蛋白的量的变化，甚至在mnu使感光细胞变性之后也没有观察到。[0091]即，通过该结果，预测了在哺乳动物视网膜中，穆勒胶质细胞中的prox1通过抑制穆勒胶质细胞的分裂和诱导小神经胶质细胞的增殖而起到防止视网膜神经再生的作用。因此，本发明人预测，当prox1蛋白的积累不象斑马鱼的情况那样在穆勒胶质细胞中出现时，穆勒胶质细胞可以在细胞分裂后分化成神经元以再生神经。[0092]2-2.对nmda、光处理和视网膜变性疾病模型小鼠中的prox1蛋白积累的确认[0093]使用与实施例2-1中证实prox1蛋白累积的方法相同的方法，证实了由各种因素损伤的视网膜中prox1蛋白的积累。[0094]①通过将媒介物(pbs)或n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)注射到小鼠的眼球中来诱导视网膜神经节细胞(gc)和无长突细胞(ac)的细胞凋亡。用无菌pbs将nmda稀释至20mm的浓度，然后将1μl的nmda/pbs溶液装载到配备有钝33号针的hamilton注射器中并注射到小鼠眼睛的玻璃体空间中。7天后，取出小鼠眼球并通过免疫组织化学研究用sox2标记的穆勒胶质细胞中的prox1水平。结果，如图2f中所示，证实了由sox2蛋白的表达所指示的，prox1蛋白在穆勒胶质细胞(sox2+)中的表达水平增加。此外，可以看出，prox1的增加仅集中在穆勒胶质细胞中，而在视网膜中的其它细胞，即双极细胞(bp)和无长突细胞(ac)中没有任何变化。[0095]②在暴露于100,000lux的非常强的光1小时的同时繁殖小鼠以诱导对视网膜感光细胞(pr)的损伤。7天后，取出小鼠眼球并通过免疫组织化学研究用sox2标记的穆勒胶质细胞中的prox1水平。结果，如图2g中所示，证实了由sox2蛋白的表达所指示的，prox1蛋白在穆勒胶质细胞(sox2+)中的表达水平增加。此外，可以看出，prox1的增加仅集中在穆勒胶质细胞中，而在视网膜中的其它细胞，即双极细胞(bp)和无长突细胞(ac)中没有任何变化。[0096]③通过取出rd10小鼠的眼球，通过免疫组织化学检测用sox2标记的穆勒胶质细胞中的prox1水平，所述rd10小鼠是视网膜神经变性疾病的动物模型(其中感光细胞(pr)先天性变性)，在出生后第14天，出生后第21天和出生后第30天，这时认为感光细胞完全受损。结果，如图2h中所示，证实了由sox2蛋白的表达所指示的，prox1蛋白在穆勒胶质细胞(sox2+)中的表达水平增加。此外，可以看出，prox1的增加仅集中在穆勒胶质细胞中，而在视网膜中的其它细胞，即双极细胞(bp)和无长突细胞(ac)中没有任何变化。[0097]④通过取出rd10小鼠的眼球，通过免疫组织化学检测用sox2标记的穆勒胶质细胞中的prox1水平，在所述rd10小鼠中，在出生后第14天和出生后第21天(这时认为感光细胞完全受损)，发生的感光细胞(pr)的先天性变性的进展比上述rd10小鼠中更快。如图2i中所示，证实了由sox2蛋白的表达所指示的，prox1蛋白在穆勒胶质细胞(sox2+)中的表达水平增加。此外，可以看出，prox1的增加仅集中在穆勒胶质细胞中，而在视网膜中的其它细胞，即双极细胞(bp)和无长突细胞(ac)中没有任何变化。[0098]实施例3.对受损小鼠视网膜中减少外部prox1促进穆勒胶质细胞分裂的确认[0099]本发明人证实，在实施例2-1和2-2中，穆勒胶质细胞中的prox1是从外部引入的，因此预测穆勒胶质细胞中的外部prox1来源于邻近穆勒胶质细胞的视网膜神经元。因此，为了通过实验证实这一点，如图3a中所示，使用chx10-creer从双极细胞中选择性地去除prox1基因，并修饰去除prox1的细胞的基因，从而代替表达egfp。结果，与具有视网膜损伤的正常prox1(fg/fg)小鼠不同，prox1的量不仅在去除了prox1和代替表达egfp的双极细胞中减少，而且在没有egfp的穆勒胶质细胞中也减少。这些结果意味着穆勒胶质细胞中prox1的很大一部分来源于双极细胞。[0100]此外，如可以在图3b和3c中看到的，在正常小鼠的损伤的视网膜中，指示细胞分裂的edu出现在iba1标记的小神经胶质细胞中，而没有出现在sox2标记的穆勒胶质细胞中，而在prox1(fg/fg)；chx10-creer小鼠(其表达通过去除prox1基因而降低)的视网膜中(fg/fg)，发现用edu标记的新产生的细胞是用sox2标记的穆勒胶质细胞。这些结果意味着，在视网膜损伤过程中，穆勒胶质细胞根据穆勒胶质细胞中prox1的降低而分裂，并且意味着穆勒胶质细胞中的prox1起到促进小神经胶质细胞增殖的作用。[0101]实施例4.对使用中和抗体抑制prox1迁移的确认[0102]基于上述实施例的结果，本发明人使用了针对prox1的中和抗体来基本上抑制小鼠眼球中prox1向穆勒胶质细胞的迁移。将两种市售抗体(cat#abn278兔多克隆抗体(millipore)和cat#sc81983小鼠单克隆抗体(santa cruz))用作实验的prox1中和抗体。[0103]更具体地，通过将mnu注射到小鼠中来使视网膜损伤，并且一天后，将未免疫的小鼠抗体(migg，50ng)或prox1中和抗体(α-prox1，50ng)注射到小鼠眼球中。在这种情况下，将抗体用无菌pbs稀释，将1μl(50ng)抗体/pbs溶液装载到配备有钝33号针的hamilton注射器中并注射到小鼠眼睛的玻璃体空间中。3天后，取出小鼠眼球并通过免疫组织化学研究用tdtomato标记的穆勒胶质细胞或穆勒胶质细胞来源的细胞中的prox1水平。[0104]结果，如图4所示，即使在注射有prox1中和抗体的眼球的穆勒胶质细胞来源的细胞中mnu引起的损伤后，prox1水平也不会增加。这意味着prox1蛋白向穆勒胶质细胞的迁移可以通过将prox1中和抗体注射到眼球中来抑制。此外，如实施例3所证实的，基于只有当穆勒胶质细胞中prox1的量减少时才诱导穆勒胶质细胞的分裂的事实，已经建立了prox1中和抗体可用于诱导哺乳动物视网膜中穆勒胶质细胞的分裂的基础。此外，同时注射各种促进神经元分化的药物以及prox1中和抗体可以诱导新的视网膜神经元再生以替代受损的视网膜神经元。[0105]本发明的上述描述是为了说明的目的而提供的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改成其它特定形式。因此，应当理解，上述实施方案仅在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。[0106][工业实用性][0107]本发明涉及一种用于治疗各种视网膜神经变性疾病的药物组合物，所述视网膜神经变性疾病由于在相关技术中没有有效的治疗方法而导致视力丧失，并且具体地，本发明的药物组合物的发明人证实了，穆勒胶质细胞可以通过抑制在视网膜损伤期间发生的prox1蛋白在穆勒胶质细胞中的积累而分裂。在这一方面，由于包含本发明的prox1的迁移抑制剂的药物组合物可以诱导哺乳动物中受损视网膜的再生，因此预期所述药物组合物可以广泛用于治疗各种视网膜神经变性疾病，其由于在相关技术中和在开发特定的视网膜再生方法中没有有效的治疗方法而导致视力丧失。









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