造血干细胞中治疗WISKOTT-ALDRICH综合征(WAS)的慢病毒载体

有机化合物处理,合成应用技术造血干细胞中治疗wiskott-aldrich综合征(was)的慢病毒载体1.相关申请的交叉引用2.本技术要求于2019年11月11日提交的ussn 62/933,875的优先权和权益，所述申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。3.政府支持的声明4.[不适用][0005]以引用的方式并入以文本文件形式提供的序列表[0006]同此以文本文件形式“ucla-p220p_st25.txt”提供于2020年11月9日创建且大小为82.1kb的序列表。文本文件的内容以引用的方式整体并入本文。背景技术：[0007]wiskott-aldrich综合征(was)是由wiskott-aldrich综合征(was)基因中的突变引起的x连锁原发性免疫缺陷。患有was的患者在适应性和先天免疫方面均存在严重缺陷，并且极易受到威胁生命的病毒和细菌感染的影响。患者还患有极其严重的湿疹、微血小板减少症(microthrombocytopenia)，并且具有发展自身免疫和癌症的高风险。[0008]was由于其x连锁隐性遗传模式而最常发生在男性中，每百万男性中有1与10之间名男性受到影响。最初病征通常是瘀点和瘀伤，这是由血小板计数低(即血小板减少症(thrombocytopenia))引起的。自发性鼻出血和血性腹泻也是常见的，并且湿疹通常在出生后的第一个月内出现。复发性细菌感染通常在三个月内出现。大多数患有was的儿童会患上至少一种自身免疫性病症，并且多达三分之一的患者会患上癌症(主要是淋巴瘤和白血病)。免疫球蛋白m(igm)水平通常降低，iga和ige通常升高，并且igg水平可以正常、降低或升高。除了血小板减少症，was患者有异常小的血小板(即微血小板)，并且约30％的患者还具有升高的嗜酸性粒细胞计数(即嗜酸性粒细胞增多)。[0009]was的治疗通常涉及控制感染的预防性抗生素和抗病毒疗法。血小板输注和脾切除术用于治疗血小板减少症(血小板计数低)。此外，可能需要输血来治疗由过量出血导致的贫血，并且可使用防护头盔来防止可能由头部损伤导致的脑出血。免疫抑制治疗用于自身免疫性表现。[0010]因为患有was的患者具有异常的t淋巴细胞和b淋巴细胞功能，所以通常不向他们施用活病毒疫苗，因为存在病毒的疫苗株可引起疾病的可能性。水痘感染的并发症偶尔会发生，并且可以通过在暴露于抗病毒药物、高剂量免疫球蛋白替换治疗或水痘带状疱疹 免疫球蛋白(vzig)后的早期治疗来预防。其他“非活”疫苗接种可以安全地给予患有was的患者，但可能不会产生防护水平的抗体。[0011]潜在的治愈性疗法是来自hla匹配供体的同种异体造血干细胞移植。然而，由于没有合适的匹配供体，这对许多患者来说不是可行的选择。[0012]替代的治愈性疗法是使用离体基因疗法的自体造血干细胞(hsc)移植。在此方法中，患者充当他们自己的供体，这消除了免疫并发症的风险。此方法的成功实施依赖于开发基于慢病毒载体或crispr的疗法，以引入感兴趣的基因的功能拷贝或纠正患者hsc中的致病突变。[0013]先前的基于病毒的疗法利用了cmmp-wasγ-逆转录病毒载体。此疗法恢复了所有患者的功能和血小板计数。然而，7/9的患者由于插入的癌基因而患上急性白血病(参见，例如，braun(2014)sci.transl.med.6(227):227ra33)。[0014]另一种疗法使用由内源was基因的1.6kb启动子片段驱动的更安全的sin慢病毒载体。使用这种载体，约6/7的患者在基因疗法后显示出临床改善。t、b和nk细胞是功能性的，并且恢复了正常免疫细胞计数。此外，感染的严重程度和频率降低了，并且严重的湿疹得到了解决。然而，血小板计数和平均血小板大小仍然低于正常值。患者仍然存在微血小板减少，并且保留严重出血发作的风险。技术实现要素：[0015]本文描述了用于治疗wiskott-aldrich综合征(was)的新型慢病毒载体(lv)的开发。本文所述的载体在巨核细胞中显示出比现有的慢病毒载体更好(更高)的表达，并且据信能够将was患者的血小板计数恢复到正常水平。此外，据信本文所述的载体维持与在所有其他造血细胞谱系中表达was基因的先前的sin lv类似的表达水平，因此据信所述载体能够恢复t、b和nk细胞计数和功能)。[0016]因此，本文考虑的各种实施方案可以包括但不需要限于以下中的一个或多个：[0017]实施方案1：一种用于治疗wiskott-aldrich综合征(was)的重组慢病毒载体(lv)，所述载体包含：[0018]表达盒，其包含：[0019]编码was基因的内源启动子的有效片段的核酸，其中所述启动子具有600bp的最大长度并且含有hs1pro序列(seq id no:1)；和[0020]编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸，所述核酸可操作地连接至所述was基因的内源启动子的有效片段。[0021]实施方案2：如实施方案1所述的载体，其中所述was基因的内源启动子的有效片段的序列由hs1pro序列(seq id no:1)组成。[0022]实施方案3：根据实施方案1-2中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含缩短(slim)增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)或其有效片段。[0023]实施方案4：如实施方案3所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2核心子元件1(seq id no:3+seq id no:4)、增强子元件2核心子元件4(seq id no:7)、和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)或由其组成。[0024]实施方案5：如实施方案4所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段由增强子元件2核心子元件1(seq id no:3+seq id no:4)、增强子元件2核心子元件4(seq id no:7)、和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)组成。[0025]实施方案6：如实施方案3所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2核心子元件1的前一半(seq id no:3)和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)或由其组成。[0026]实施方案7：如实施方案6所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段由增强子元件2核心子元件1的前一半(seq id no:3)和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)组成。[0027]实施方案8：如实施方案3所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件1的前一半(seq id no:3)或由其组成。[0028]实施方案9：根据实施方案3和8中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件1的后一半(seq id no:4)或由其组成。[0029]实施方案10：根据实施方案3和8-9中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件2(seq id no:5)或由其组成。[0030]实施方案11：根据实施方案3和8-10中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件3(seq id no:6)或由其组成。[0031]实施方案12：根据实施方案3和8-11中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件4(seq id no:7)或由其组成。[0032]实施方案13：根据实施方案3和8-12中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件5(seq id no:8)或由其组成。[0033]实施方案14：根据实施方案1-13中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件hs3(seq id no:9)或其有效片段。[0034]实施方案15：如实施方案14所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件hs3的有效片段，其中所述片段包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成。[0035]实施方案16：如实施方案15所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件hs3的有效片段，其中所述片段由hs3核心序列(seq id no:10)组成。[0036]实施方案17：根据实施方案1-16中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件e9(seq id no:11)或其有效片段。[0037]实施方案18：如实施方案17所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件e9的有效片段，其中所述片段包含增强子元件e9核心序列(seq id no:12)或由其组成。[0038]实施方案19：如实施方案18所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件e9的有效片段，其中所述片段由增强子元件e9核心序列(seq id no:12)组成。[0039]实施方案20：根据实施方案1-2中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含：缩短增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)；和由hs1pro序列(seq id no:1)组成的was基因的内源启动子的片段。[0040]实施方案21：如实施方案20所述的载体，其中所述载体包含图18所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0041]实施方案22：如实施方案20所述的载体，其中所述载体包含seq id no:15中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0042]实施方案23：根据实施方案1-2中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含：[0043]包含e9核心序列(seq id no:12)或由其组成的增强子元件e9序列；[0044]包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成的增强子元件hs3序列；[0045]缩短增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)；以及[0046]包含hs1pro序列(seq id no:1)或由其组成的was基因的内源启动子的片段。[0047]实施方案24：如实施方案23所述的载体，其中所述载体包含图19中所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0048]实施方案25：如实施方案23所述的载体，其中所述载体包含seq id no:16中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0049]实施方案26：根据实施方案1-2中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含：[0050]包含e9核心序列(seq id no:12)或由其组成的增强子元件e9序列；[0051]包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成的增强子元件hs3序列；[0052]增强子元件2核心子元件1(seq id no:3+seq id no:4)、增强子元件2核心子元件4(seq id no:7)、和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)；以及[0053]包含hs1pro序列(seq id no:1)或由其组成的was基因的内源启动子的片段。[0054]实施方案27：如实施方案26所述的载体，其中所述载体包含图20中所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0055]实施方案28：如实施方案26所述的载体，其中所述载体包含seq id no:17中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0056]实施方案29：根据实施方案1-2中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含：[0057]包含e9核心序列(seq id no:12)或由其组成的增强子元件e9序列；[0058]包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成的增强子元件hs3序列；增强子元件2核心子元件1的前一半(seq id no:3)和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)；以及[0059]包含hs1pro序列(seq id no:1)或由其组成的was基因的内源启动子的片段。[0060]实施方案30：如实施方案29所述的载体，其中所述载体包含图21中所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0061]实施方案31：如实施方案29所述的载体，其中所述载体包含seq id no:18中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0062]实施方案32：根据实施方案1-31中任一项所述的载体，其中所述编码wasp蛋白的核酸是was cdna或密码子优化的was基因。[0063]实施方案33：如实施方案32所述的载体，其中所述编码wasp蛋白的核酸是was cdna(seq id no:13)。[0064]实施方案34：如实施方案32所述的载体，其中所述编码wasp蛋白的核酸是密码子优化的was。[0065]实施方案35：如实施方案34所述的载体，其中编码wasp的所述核酸的序列是密码子优化的was，其选自由jcat密码子优化的was、geneart优化的was和idt优化的was组成的组。[0066]实施方案36：根据实施方案1-35中任一项所述的载体，其中所述载体包含ψ区载体基因组包装信号。[0067]实施方案37：根据实施方案1-36中任一项所述的载体，其中所述载体包含有包含cmv增强子/启动子的5'ltr。[0068]实施方案38：根据实施方案1-37中任一项所述的载体，其中所述载体包含rev应答元件(rre)。[0069]实施方案39：根据实施方案1-38中任一项所述的载体，其中所述载体包含中央多聚嘌呤区。[0070]实施方案40：根据实施方案1-39中任一项所述的载体，其中所述载体包含转录后调控元件。[0071]实施方案41：如实施方案40所述的载体，其中所述转录后调控元件是修饰的土拨鼠转录后调控元件(wpre)。[0072]实施方案42：根据实施方案1-41中任一项所述的载体，其中所述载体不能够通过重组重构野生型慢病毒。[0073]实施方案43：根据实施方案1-42中任一项所述的载体，其中所述载体在巨核细胞中显示出高表达。[0074]实施方案44：根据实施方案1-43中任一项所述的载体，其中所述载体在施用于患有was的哺乳动物时恢复t、b和nk细胞计数和功能。[0075]实施方案45：一种宿主细胞，其用根据实施方案1-44中任一项的载体转导。[0076]实施方案46：如实施方案45所述的宿主细胞，其中所述细胞是干细胞。[0077]实施方案47：如实施方案46所述的宿主细胞，其中所述细胞是来源于骨髓和/或来源于脐带血和/或来源于外周血的干细胞。[0078]实施方案48：如实施方案45所述的宿主细胞，其中所述细胞是人造血祖细胞。[0079]实施方案49：如实施方案48所述的宿主细胞，其中所述人造血祖细胞是cd34+细胞。[0080]实施方案50：一种治疗受试者的wiskott-aldrich综合征(was)的方法，所述方法包括：[0081]用根据实施方案1-44中任一项所述的载体转导来自所述受试者的干细胞和/或祖细胞；以及[0082]将所述转导的细胞或衍生自其的细胞移植到所述受试者中，其中所述细胞或其衍生细胞表达所述wasp蛋白。[0083]实施方案51：如实施方案50所述的方法，其中所述细胞是干细胞。[0084]实施方案52：如实施方案50所述的宿主细胞，其中所述细胞是来源于骨髓的干细胞。[0085]实施方案53：如实施方案50所述的方法，其中所述细胞是人造血干细胞和祖细胞。[0086]实施方案54：如实施方案53所述的方法，其中所述人造血祖细胞是cd34+细胞。[0087]实施方案55：一种重组核酸，所述核酸包含以下中的一者或多者：[0088]包含was基因的最小内源启动子或由其组成的核酸序列，所述最小内源启动子包含hs1pro(seq id no:1)或由其组成；和/或[0089]包含缩短增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)或其有效片段或由其组成的核酸序列；包含增强子元件2的核心子元件1的前一半(seq id no:3)或由其组成的核酸序列；和/或[0090]包含增强子元件2的核心子元件1的后一半(seq id no:4)或由其组成的核酸序列；和/或[0091]包含增强子元件2的核心子元件2(seq id no:5)或由其组成的核酸序列；和/或[0092]包含增强子元件2的核心子元件3(seq id no:6)或由其组成的核酸序列；和/或[0093]包含增强子元件2的核心子元件4(seq id no:7)或由其组成的核酸序列；和/或[0094]包含增强子元件2的核心子元件5(seq id no:8)或由其组成的核酸序列；和/或[0095]包含增强子元件hs3(全长)(seq id no:9)或其有效片段或由其组成的核酸序列；和/或[0096]包含增强子元件hs3核心(seq id no:10)或由其组成的核酸序列；和/或[0097]包含增强子元件e9(全长)(seq id no:11)或其有效片段或由其组成的核酸序列；和/或[0098]包含增强子元件e9核心(seq id no:12)或由其组成的核酸序列。[0099]实施方案56：如实施方案55所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含was基因的最小内源启动子或由其组成，所述最小内源启动子包含hs1pro(seq id no:1)或由其组成。[0100]实施方案57：如实施方案55所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含缩短增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)或其有效片段或由其组成。[0101]实施方案58：如实施方案55所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件2的核心子元件1的前一半(seq id no:3)或由其组成。[0102]实施方案59：根据实施方案55和58中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件2的核心子元件1的后一半(seq id no:4)或由其组成。[0103]实施方案60：根据实施方案55和58-59中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件2的核心子元件2(seq id no:5)或由其组成。[0104]实施方案61：根据实施方案55和58-60中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件2的核心子元件3(seq id no:6)或由其组成。[0105]实施方案62：根据实施方案55和58-61中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件2的核心子元件4(seq id no:7)或由其组成。[0106]实施方案63：根据实施方案55和58-62中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件2的核心子元件5(seq id no:8)或由其组成。[0107]实施方案64：根据实施方案55和58-63中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件hs3(全长)(seq id no:9)或其有效片段或由其组成。[0108]实施方案65：根据实施方案55和58-64中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件hs3核心(seq id no:10)或由其组成。[0109]实施方案66：根据实施方案55和58-65中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件e9(全长)(seq id no:11)或其有效片段或由其组成。[0110]实施方案67：根据实施方案55和58-66中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列包含增强子元件e9核心(seq id no:12)或由其组成。[0111]实施方案68：根据实施方案55-67中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含表达盒。[0112]实施方案69：如实施方案68所述的核酸，其中所述表达盒在被转导到哺乳动物细胞中时有效表达wasp。[0113]实施方案70：如实施方案55所述的核酸，其中所述核酸包含根据实施方案1-44中任一项所述的载体。[0114]定义.[0115]“启动子”是指启动基因(例如，可操作地偶联至启动子的基因)转录所需的核酸的调控序列。[0116]“增强子”是指调控dna序列，该序列当被称为转录因子的特定蛋白质结合时增强相关基因的转录。[0117]当用于启动子时，“有效片段”(例如，was启动子的有效片段)是指全长启动子的片段，其足以启动与该启动子可操作地连接的基因的转录。[0118]当用于增强子时，“有效片段”(例如，was增强子的有效片段)是指全长增强子的片段，其在由转录因子结合时足以提供可操作地连接的基因的调控表达。在某些实施方案中，调控在由全长增强子提供的表达水平和/或谱系方面是可比较的。[0119]术语“可操作地连接”是指将核酸序列与另一核酸序列置于功能关系中。例如，当将启动子置于允许该启动子启动基因的转录的位置时，该启动子与该基因可操作地连接。当增强子在由适当的转录因子结合时能够调控(例如，上调)基因的表达时，该增强子与该基因可操作地连接。[0120]“重组”与其在本领域中的用法一致地使用，是指包含不作为单个序列的一部分天然一起存在或相对于天然存在的序列已重排的部分的核酸序列。重组核酸由涉及人工的过程创造和/或从由人工创造的核酸产生(例如，通过一个或多个复制、扩增、转录等的循环)。重组病毒是包含重组核酸的病毒。重组细胞是包含重组核酸的细胞。[0121]如本文所用，术语“重组慢病毒载体”或“重组lv”)是指人工创造的多核苷酸载体，其由于人为干预和操纵而由lv和多个附加区段组装而成。[0122]“有效量”意指相对于未治疗的患者而言改善或消除疾病症状所需的剂或包含所述剂的组合物的量。用于实施本文所述的用于治疗性治疗疾病的方法的组合物的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这样的量被称为“有效”量。附图说明[0123]图1，分图a示出了用于评估元件hs1、hs2、hs3和hs4的各种组合的调控活性的例示性lv构建体。分图b示出了用于评估e3元件和hs1的组合的构建体。[0124]图2示出了用was载体转导的meg-01细胞中的表达水平。[0125]图3示出了was载体在jurkat细胞(t细胞系)中的表达水平。[0126]图4示出了was载体在ramos细胞(b细胞系)中的表达水平。[0127]图5，分图a-b，说明了用于鉴定调控was基因的关键增强子元件的构建体。分图a)十个新构建体，其各自都含有内源最小was启动子(hs1pro)上游克隆的推定增强子元件。分图b)能够将血小板计数恢复到正常水平并用作对照的γ-逆转录病毒载体(cmmp-mcit)。[0128]图6示出了was载体在meg-01(巨核细胞系)中的表达水平。[0129]图7示出了was载体在jurkat细胞(t细胞系)中的表达水平。[0130]图8示出了was载体在ramos细胞(b细胞系)中的表达水平。[0131]图9示出了was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“原巨核细胞”中的表达水平。[0132]图10示出了was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“巨核细胞”中的表达水平。[0133]图11示出了was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“血小板”中的表达水平。[0134]图12cb cd34+分化的巨核细胞“原巨核细胞”中的was载体。[0135]图13示出了was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“巨核细胞”中的表达水平。[0136]图14示出了was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“血小板”中的表达水平。[0137]图15示出了包含e2的5个子元件中的每一个的was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“巨核细胞”中的表达水平。[0138]图16示出了包含5个e2片段中的每一个的was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“巨核细胞”中的表达水平。[0139]图17示出了包含5个e2片段中的每一个的was载体在cb cd34+分化的巨核细胞“血小板”中的表达水平。[0140]图18示出了e2(全缩短)载体(e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wpre)的示意图。[0141]图19示出了e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wpre载体的示意图，其中已经添加了e9(缩短)和hs3(缩短)元件。[0142]图20示出了e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(1,4,5缩短)-hs1pro-mcit-wpre(缺失元件2的核心子元件2和元件2的核心子元件3)的示意图。e9slimhs3slime2145slimhs1pro[0143]图21示出了e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(1的前一半和5缩短)-hs1pro-mcit-wpre(缺失元件2的核心子元件1的后一半、元件2的核心子元件2和元件2的核心子元件3，以及元件2的核心子元件4)的示意图。[0144]图22示出了候选载体在cb cd34+分化的巨核细胞中的表达。[0145]图23示出了候选载体在cb cd34+分化的血小板中的表达。[0146]图24示出了在永生化was患者b细胞系中对密码子优化的筛选。[0147]图25示出了在永生化was患者t细胞系中对密码子优化的筛选。[0148]图26示出了由wasvec的密码子优化版本产生的滴度。具体实施方式[0149]在各种实施方案中，提供了用于治疗(或预防)wiskott-aldrich综合征(was)的慢病毒载体。在某些实施方案中，载体被优化以减小载体尺寸、提高表达水平和滴度。此外，在各种实施方案中，载体概括了天然was基因的表达模式，例如，如本文所述。[0150]特别地，生物信息学分析(使用公开可用的数据库：project encode、ensemnbl、fantom、vista enhancer browser、genehancer)被用来阐明天然was基因的内源调控元件。鉴定得出110万个碱基对窗口内含有十三个推定的内源增强子元件。[0151]构建了慢病毒文库以在实验上验证每个推定的调控元件。针对增强子活性，在meg-01细胞(巨核细胞系)、jurkat(t细胞系)、ramos(b细胞系)中以及在脐带血cd34+分化的巨核细胞中验证每个元件。[0152]进行了进一步的实验以鉴定增强子和was内源启动子的必要(核心)区域，并且鉴定了实现was基因的合适表达所必要的最小启动子和减少的(缩短)增强子元件的组合。经验证的增强子元件将用于设计我们的用于治疗was的主要候选慢病毒载体。[0153]因此，在某些实施方案中，提供了用于治疗wiskott-aldrich综合征(was)的重组慢病毒载体(lv)，其中所述载体包含表达盒，所述表达盒包含编码was基因的内源启动子的有效片段的核酸，其中启动子具有600bp的最大长度并且含有hs1pro序列(seq id no:1)；以及编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸，所述核酸可操作地连接至was基因的内源启动子的有效片段。在某些实施方案中，was基因的内源启动子的有效片段由hs1pro序列(seq id no:1)组成。[0154]在某些实施方案中，表达盒包含缩短增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)或其有效片段。在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2核心子元件1(seq id no:3+seq id no:4)、增强子元件2核心子元件4(seq id no:7)、和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)或由其组成。在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段由增强子元件2核心子元件1(seq id no:3+seq id no:4)、增强子元件2核心子元件4(seq id no:7)、和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)组成。在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2核心子元件1的前一半(seq id no:3)和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)或由其组成。在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段由增强子元件2核心子元件1的前一半(seq id no:3)和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)组成。[0155]在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件1的前一半(seq id no:3)或由其组成；和/或增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件1的后一半(seq id no:4)或由其组成；和/或增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件2(seq id no:5)或由其组成；和/或增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件3(seq id no:6)或由其组成；和/或增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件4(seq id no:7)或由其组成；和/或增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2的核心子元件5(seq id no:8)或由其组成。[0156]在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件hs3(seq id no:9)或其有效片段。[0157]在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件hs3的有效片段，其中所述片段包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成。在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件hs3的有效片段，其中所述片段由hs3核心序列(seq id no:10)组成。[0158]在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件e9(seq id no:11)或其有效片段。[0159]在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件e9的有效片段，其中所述片段包含增强子元件e9核心序列(seq id no:12)或由其组成。在某些实施方案中，表达盒包含增强子元件e9的有效片段，其中所述片段由增强子元件e9核心序列(seq id no:12)组成。[0160]在某些实施方案中，表达盒包含缩短增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)和由hs1pro序列(seq id no:1)组成的was基因的内源启动子的片段。在某些实施方案中，此载体包含图18中所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。在某些实施方案中，此载体包含seq id no:15中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0161]在某些实施方案中，表达盒包含有包含e9核心序列(seq id no:12)或由其组成的增强子元件e9序列、包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成的增强子元件hs3序列、缩短增强子元件2(seq id no:2＝seq id no:3-8)；以及由hs1pro序列(seq id no:1)组成的was基因的内源启动子的片段。在某些实施方案中，此载体包含图19中所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。在某些实施方案中，此载体包含seq id no:16中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0162]在某些实施方案中，表达盒包含有包含e9核心序列(seq id no:12)或由其组成的增强子元件e9序列、包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成的增强子元件hs3序列、增强子元件2核心子元件1(seq id no:3+seq id no:4)、增强子元件2核心子元件4(seq id no:7)、和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)；以及由hs1pro序列(seq id no:1)组成的was基因的内源启动子的片段。在某些实施方案中，此载体包含图20中所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。在某些实施方案中，此载体包含seq id no:17中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0163]在某些实施方案中，表达盒包含有包含e9核心序列(seq id no:12)或由其组成的增强子元件e9序列、包含hs3核心序列(seq id no:10)或由其组成的增强子元件hs3序列、增强子元件2核心子元件1的前一半(seq id no:3)、和增强子元件2核心子元件5(seq id no:8)；以及由hs1pro序列(seq id no:1)组成的was基因的内源启动子的片段。在某些实施方案中，此载体包含图21中所示的特征，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。在某些实施方案中，此载体包含seq id no:18中所示的序列，其中编码mcitrine的序列被编码wiskott-aldrich综合征蛋白(wasp)的核酸替换。[0164]应当认识到，对于临床用途，mcitrine报告基因可以用编码wasp蛋白的核酸替换。在某些实施方案中，这样的核酸是was cdna或密码子优化的was基因(例如，jcat优化的was)。在某些实施方案中，编码wasp的核酸的序列是密码子优化的was，其选自由jcat密码子优化的was、geneart优化的was和idt优化的was组成的组。[0165]还应当认识到，本文描述的关于慢病毒载体的表达盒不必限于这种用途，并且实质上可以并入需要wasp表达的任何其他构建体(例如，crispr构建体)中。因此，在某些实施方案中，考虑了包含本文所述的任何表达盒组分的核酸构建体。[0166]表1.如本文所述用于治疗was的慢病毒载体的各种组分的核酸序列。[0167][0168][0169][0170][0171][0172][0173]在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体(lv)可以具有各种“安全”特征，所述特征可以包括例如绝缘子(例如，3'ltr中的fb绝缘子)的存在。此外或替代地，在某些实施方案中，hiv ltr已被替代启动子(例如，cmv)取代以在包装期间产生更高滴度的不包含hiv tat蛋白的载体。其他强启动子(例如，rsv等)也可以使用。[0174]如上所述，在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体含有通常存在于慢病毒载体中的元件中的任一种或多种。这样的元件包括但不限于ψ区载体基因组包装信号、rev应答元件(rre)、多聚嘌呤区(例如，中央多聚嘌呤区、3'多聚嘌呤区等)、转录后调控元件(例如，修饰的土拨鼠转录后调控元件(wpre))、绝缘子等，例如，如下所述。[0175]在各种实施方案中，载体是基本上不能够通过重组重构野生型慢病毒的sin载体。[0176]在各种实施方案中，本文所述的载体在meg-01细胞(巨核细胞系)和/或jurkat细胞(t细胞系)和/或ramos细胞(b细胞系)中显示出高表达。在某些实施方案中，本文所述的载体在包括“原巨核细胞”、巨核细胞和血小板的cb cd34+分化的巨核细胞中显示出高表达。[0177]如上所示，在实施例1中，本文所述的载体被认为可有效地以高滴度转导细胞并且还提供编码wasp蛋白的核酸的高水平表达。[0178]鉴于这些结果，认为本文所述的lv，例如表达编码wasp的核酸的重组tat非依赖性sin lv可用于有效治疗受试者(例如，人和非人哺乳动物)的wiskott-aldrich综合征(was)。这些载体被认为可用于修饰干细胞(例如，造血干细胞和祖细胞)，所述干细胞可被引入有需要的受试者用于治疗例如确定为患有was的受试者。此外，所得细胞被认为将产生足够的转基因wasp蛋白，以证明受试者健康状况得到显著改善。还认为载体可以直接施用于受试者以实现靶标(例如，造血干细胞或祖细胞)的体内转导，并由此也实现有需要的受试者的治疗。[0179]如上所述，在各种实施方案中，本文所述的lv可以包括各种安全特征。例如，hiv ltr已被cmv启动子取代，以在包装期间产生更高滴度的不包含hiv tat蛋白的载体。在某些实施方案中，为了安全可以将绝缘子(例如，fb绝缘子)引入3'ltr中。lv还经构建以提供有效的转导和高滴度。[0180]应当理解，前述元件是例示性的并且不必是限制性的。鉴于本文提供的教导内容，对这些元件的合适的取代将被本领域技术人员认识到并且在本文提供的教导内容的范围内被考虑。[0181]was密码子优化[0182]如上所述，在各种实施方案中，慢病毒载体可以包含was基因或cdna。然而，在某些实施方案中，编码wasp的核酸是密码子优化的。密码子优化的多种方法是本领域技术人员已知的。一种例示性方法是jcat(java codon adaptation tool)。jcat工具使基因密码子的使用适应大多数已测序的原核生物和各种真核基因表达宿主。与许多工具相比，jcat不需要手动定义高表达基因，并因此是一种非常快速和简单的方法。jcat用于密码子适应的另外的选项包括避免限制酶和rho非依赖性转录终止子的不需要的切割位点。jcat的输出既是图表形式，也作为针对输入序列和新适应序列给出的密码子适应指数(cai)值。grote等人(2005)nucleic acids res.33(增刊第2版):w526–w531)描述了jcat优化，并且jcat工具可在www.jcat.de在线获取。[0183]另一种密码子优化工具由geneart(来自thermofisher )提供。[0184]又一个密码子优化工具是idt。idt密码子优化工具被开发以通过根据在新生物体中每个密码子的使用频率重新分配密码子使用来优化来自一种生物体的dna或蛋白质序列，以用于在另一种生物体中表达。例如，缬氨酸由4种不同的密码子(gug、guu、guc和gua)编码。然而，在人细胞系中，优先使用gug密码子(分别地，46％使用对比18％、24％和12％)。密码子优化工具会考虑此信息并分配具有那些相同频率的缬氨酸密码子。此外，工具算法消除了频率低于10％的密码子，并将剩余频率重新标准化为100％。此外，优化工具减少了可干扰制造和下游表达的复杂性，诸如重复、发夹和极端gc含量。idt优化工具可从idt(integrated dna technologies,coralville,iowa)获得，并可在ww.idtdna.com/codonopt找到。[0185]其他密码子优化工具包括但不限于可在codonw.sourceforge.net找到的开放资源软件程序codonw和来自genscript的optimumgenetm算法。[0186]这些密码子优化是例示性而非限制性的。使用此处和实施例1中提供的教导内容，可以容易地针对特定应用优化was密码子使用。[0187]tat非依赖性和自失活慢病毒载体[0188]为了进一步提高安全性，在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体包含tat非依赖性自失活(sin)构型。因此，在各种实施方案中，希望在本文所述的lv中采用相对于野生型ltr具有降低的启动子活性的ltr区域。可以提供有效“自失活”(sin)的此类构建体，所述自失活提供了生物安全特征。sin载体是其中在转导细胞中全长载体rna的产生大大减少或完全除去的载体。此特征可最大限度地减小具有复制能力的重组体(rcr)将出现的风险。此外，它降低了位于载体整合位点附近的该细胞编码序列将异常表达的风险。[0189]此外，sin设计降低了ltr与驱动转基因表达的启动子之间的干扰的可能性。sin lv通常可以允许内部启动子的完全活性。[0190]sin设计增加了lv的生物安全性。大多数hiv ltr由u3序列构成。u3区域含有增强子和启动子元件，所述元件调节感染细胞中hiv基因组的基础和诱导的表达并响应细胞活化。这些启动子元件中的若干个对于病毒复制是必不可少的。增强子元件中的一些在病毒分离物中是高度保守的，并被认为是病毒发病机制中的关键毒力因子。增强子元件可能会影响病毒在不同细胞靶标中的复制率。[0191]由于病毒转录开始于5'ltr的u3区的3'端，这些序列不是病毒mrna的一部分，并且其来自3'ltr的拷贝充当模板，用于在整合的前病毒中生成两种ltr。如果在逆转录病毒载体构建体中改变了u3区域的3'拷贝，则载体rna仍由生产细胞中的完整5'ltr产生，但不能在靶细胞中再生。这样的载体的转导导致子代病毒中两种ltr的失活。因此，逆转录病毒是自失活(sin)的，并且那些载体被称为sin转移载体。[0192]在某些实施方案中，通过在载体dna(即，用于产生载体rna的dna)的3'ltr的u3区中引入缺失来实现自失活。在rt期间，这种缺失被转移到前病毒dna的5'ltr。通常，希望消除足够的u3序列以大大减少或完全除去ltr的转录活性，从而大大减少或除去转导细胞中全长载体rna的产生。然而，通常希望保留那些参与病毒rna聚腺苷酸化的ltr元件，所述功能通常分布在u3、r和u5上。因此，在某些实施方案中，希望从ltr中消除尽可能多的转录重要基序，同时保留聚腺苷酸化决定子。[0193]zufferey等人(1998)j virol.72(12):9873-9880中，以及美国专利号：5,994,136中详细描述了sin设计。然而，如其中所述，3'ltr处的缺失程度存在限制。首先，u3区的5'端在载体转移中发挥着另一个必要功能，所述功能是整合(末端二核苷酸+att序列)所需要的。因此，末端二核苷酸和att序列可以表示可缺失的u3序列的5'边界。此外，一些松散限定的区域可能影响r区中下游聚腺苷酸化位点的活性。从3'ltr中过量缺失u3序列可能会降低载体转录物的聚腺苷酸化，对生产细胞中载体的滴度和靶细胞中的转基因的表达有不利后果。[0194]另外的sin设计描述于美国专利公开号：2003/0039636中。如其中所述，在某些实施方案中，从ltr中去除的慢病毒序列被来自非慢病毒逆转录病毒的相当的序列替换，从而形成杂合ltr。特别地，ltr内的慢病毒r区可以全部或部分被来自非慢病毒逆转录病毒的r区替换。在某些实施方案中，慢病毒tar序列(与tat蛋白相互作用以增强病毒复制的序列)优选地全部从r区中去除。然后用来自非慢病毒逆转录病毒的r区的相当的部分替换tar序列，从而形成杂合r区。可以进一步修饰ltr以去除和/或用非慢病毒序列替换慢病毒u3和u5区的全部或部分。[0195]因此，在某些实施方案中，sin构型提供包含缺少其tar序列的全部或部分的杂合慢病毒r区的逆转录病毒ltr，从而消除tat的任何可能活化，其中tar序列或其部分被来自非慢病毒逆转录病毒的r区的相当的部分替换，从而形成杂合r区。在一个具体实施方案中，逆转录病毒ltr包含杂合r区，其中杂合r区包含缺少tar序列的hiv r区的一部分(例如，us 2003/0039636中包含seq id no:10所示核苷酸序列或由其组成的一部分)和与hiv r区缺少的tar序列相当的momsv r区的一部分(例如，2003/0039636中包含seq id no:9所示核苷酸序列或由其组成的一部分)。在另一个具体实施方案中，整个杂合r区包含2003/0039636中seq id no:11所示的核苷酸序列或由其组成。[0196]可以衍生r区的合适的慢病毒包括例如hiv(hiv-1和hiv-2)、eiv、siv和fiv。可以衍生非慢病毒序列的合适的逆转录病毒包括例如momsv、momlv、friend、mscv、rsv和泡沫病毒。在一个例示性实施方案中，慢病毒是hiv，并且非慢病毒逆转录病毒是momsv。[0197]在us 2003/0039636中描述的另一个实施方案中，包含杂合r区的ltr是左(5')ltr，并且还包含杂交r区上游的启动子序列。优选的启动子是非慢病毒来源的并且包含例如来自非慢病毒逆转录病毒的u3区(例如，momsv u3区)。在一个具体实施方案中，u3区包含us 2003/0039636中seq id no:12所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，左(5')ltr还包含杂交r区下游的慢病毒u5区。在一个实施方案中，u5区是包含基因组整合所必需的hiv att位点的hiv u5区。在另一个实施方案中，u5区包含us 2003/0039636中seq id no:13所示的核苷酸序列。在又一个实施方案中，整个左(5')杂合ltr包含us 2003/0039636中seq id no:1所示的核苷酸序列。[0198]在另一个例示性实施方案中，包含杂合r区的ltr是右(3')ltr，并且还包含杂合r区上游的修饰的(例如，截短的)慢病毒u3区。修饰的慢病毒u3区可以包含att序列，但缺少任何具有启动子活性的序列，从而导致载体变为sin，因为病毒转录不能越过染色体整合后的第一轮复制。在一个具体的实施方案中，杂合r区上游的修饰的慢病毒u3区由直到并包含慢病毒u3 att位点的慢病毒(例如，hiv)u3区的3'端组成。在一个实施方案中，u3区包含us 2003/0039636中seq id no:15所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，右(3')ltr还包含杂合r区下游的聚腺苷酸化序列。在另一个实施方案中，聚腺苷酸化序列包含us 2003/0039636中seq id no:16所示的核苷酸序列。在又一个实施方案中，整个右(5')ltr包含us 2003/0039636的seq id no:2或17所示的核苷酸序列。[0199]因此，在基于hiv的lv的情况下，已发现此类载体耐受显著的u3缺失，包括ltr tata框的去除(例如，从-418至-18的缺失)，而载体滴度没有显著减少。这些缺失致使ltr区域基本上没有转录活性，因为ltr的转录能力被降低至约90％或更低。[0200]还已经证明，如果转移载体构建体中的上游ltr的一部分被组成型活性启动子序列替换，则tat的反式作用功能变得可有可无(参见，例如，dull等人(1998)j virol.72(11):8463–8471)。此外，我们表明rev在反式中的表达允许从仅含有gag和pol的包装构建体产生高滴度的hiv衍生载体原种。这种设计使得以互补为条件的包装功能的表达仅在生产细胞中可用。所得的基因递送系统仅保留了hiv-1的九个基因中的三个，并依赖于四个独立的转录单元来产生转导粒子。[0201]在实施例1中说明的一个实施方案中，表达编码wasp的核酸的盒是sin载体，其中cmv增强子/启动子在5'ltr中被取代。[0202]应当认识到，cmv启动子通常提供高水平的非组织特异性表达。其他具有类似组成活性的启动子包括但不限于rsv启动子和sv40启动子。也可以使用哺乳动物启动子，诸如β-肌动蛋白启动子、泛素c启动子、延伸因子1α启动子、微管蛋白启动子等。[0203]前述sin构型是例示性而非限制性的。多种sin构型是本领域技术人员已知的。如上所述，在某些实施方案中，ltr转录减少了约95％至约99％。在某些实施方案中，ltr可以表现出至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的转录失活。[0204]绝缘子元件[0205]在某些实施方案中，为了进一步增强生物安全性，将绝缘子插入本文所述的慢病毒载体中。绝缘子是存在于整个基因组中的dna序列元件。它们结合修饰染色质并改变区域基因表达的蛋白质。在本文所述的载体中放置绝缘子提供了各种潜在的益处，尤其包括：1)通过侧翼染色体屏蔽载体避免表达的位置效应花斑(即，屏障活性)；以及2)屏蔽侧翼染色体避免载体对基因表达的插入反式活化(增强子阻断)。因此，绝缘子可以帮助保留嵌入基因组或遗传背景中的基因或转录单位的独立功能，其中它们的表达可能原本会受到基因组或遗传背景内的调控信号的影响(参见，例如，burgess-beusse等人(2002)proc.natl.acad.sci.usa,99:16433；和zhan等人(2001)hum.genet.,109:471)。在本文中，绝缘子可能有助于保护慢病毒表达序列免受整合位点影响，这可能由存在于基因组dna中的顺式作用元件介导，并导致转移序列的表达失调。在各种实施方案中，提供了lv，其中将绝缘子序列插入到一个或两个ltr或整合到细胞基因组中的载体区域中的其他地方。[0206]首先且最佳表征的脊椎动物染色质绝缘子位于鸡β-珠蛋白基因座控制区内。此元件含有dnase-i超敏位点4(chs4)，构成了鸡β-珠蛋白基因座的5'边界(prioleau等人(1999)embo j.18:4035-4048)。含有chs4元件的1.2-kb片段显示出经典的绝缘子活性，包括阻断细胞系中珠蛋白基因启动子和增强子相互作用的能力(chung等人(1993)cell,74:505-514)，以及保护在果蝇(id.)、转化的细胞系(pikaart等人(1998)genes dev.12:2852-2862)和转基因哺乳动物(wang等人(1997)nat.biotechnol.,15:239-243；taboit-dameron等人(1999)transgenic res.,8:223-235)中的表达盒免受位置效应的能力。此活性大部分包含在250-bp的片段中。在这个范围内是49-bp chs4核心(chung等人(1997)proc.natl.acad.sci.,usa,94:575-580)，其与参与增强子阻断测定的锌指dna结合蛋白ctcf相互作用(bell等人(1999)cell,98:387-396)。[0207]一种例示性并且合适的绝缘子是fb(fii/bead-a)(77bp的绝缘子元件)，其含有鸡β-珠蛋白5'hs4绝缘子的最小ctcf结合位点增强子阻断组分和来自由ramezani等人(2008)stem cell 26:3257-3266描述的人t细胞受体α/δ阻断元件α/δi(bead-i)绝缘子的同源区。fb“合成”绝缘子具有完全的增强子阻断活性。此绝缘子是例示性而非限制性的。可以使用其他合适的绝缘子，包括例如全长鸡β-珠蛋白hs4或其绝缘子子片段、锚蛋白基因绝缘子和其他合成绝缘子元件。[0208]包装信号[0209]在各种实施方案中，本文所述的载体还包含包装信号。“包装信号”、“包装序列”或“psi序列”是足以指导将序列中包含包装信号的核酸包装到逆转录病毒粒子中的任何核酸序列。此术语包括天然存在的包装序列以及其工程化变体。包括慢病毒在内的许多不同逆转录病毒的包装信号是本领域已知的。seq id no:21提供了一种例示性但非限制性的psi。[0210]rev应答元件(rre)[0211]在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体包含rev应答元件(rre)以增强未剪接rna的核输出。rre是本领域技术人员所熟知的。例示性的rre包括但不限于诸如位于hiv nl4-3基因组(genbank登录号af003887)中7622-8459位置的rre，以及来自其他hiv毒株或其他逆转录病毒的rre。此类序列可从genbank或从url hiv-web.lanl.gov/content/index数据库中轻松获得。seq id no:22示出了一种例示性但非限制性的rre)。[0212]多聚嘌呤区(cppt、3'ppt)[0213]在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体还包含多聚嘌呤区(例如，中央多聚嘌呤区(cppt)、3'多聚嘌呤区(3'ppt))。已知在慢病毒(例如hiv-1)载体构建体中插入含有3'ppt(参见例如，seq id no:24)或中央多聚嘌呤区(cppt)的片段可以提高转导效率。[0214]表达刺激转录后调控元件(pre)[0215]在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体(lv)可包含多种转录后调控元件(pre)中的任一种，其在转录物中的存在增加了异源核酸(例如，编码wasp的核酸)在蛋白质水平上的表达。pre在某些实施方案中可能特别有用，尤其是那些涉及具有适度启动子的慢病毒构建体的实施方案。[0216]pre的一种类型是位于表达盒内的内含子，其可以刺激基因表达。然而，内含子可以在慢病毒的生命周期事件期间剪接出来。因此，如果将内含子用作pre，它们通常以与载体基因组转录物相反的方向放置。[0217]不依赖剪接事件的转录后调控元件提供了在病毒生命周期期间不被去除的优势。一些实例是单纯疱疹病毒的转录后加工元件、乙型肝炎病毒(hpre)和土拨鼠肝炎病毒(wpre)的转录后调控元件。其中，wpre通常是优选的，因为它含有hpre中不存在的附加顺式作用元件。此调控元件通常位于载体内以便包含在转基因的rna转录物中，但在转基因翻译单元的终止密码子之外。[0218]wpre表征和描述在美国专利号：6,136,597中。如其中所述，wpre是介导rna从细胞核有效运输到细胞质的rna输出元件。wpre通过插入顺式作用核酸序列来增强转基因的表达，使得元件和转基因包含在单个转录物内。显示wpre在有义方向上的存在使转基因表达增加至多达7至10倍。cdna的形式而不是作为内含子的含完整内含子的基因形式的逆转录病毒载体转移序列通常在导致逆转录病毒粒子形成的事件序列期间被剪接出来。内含子介导初级转录物与剪接机制的相互作用。因为剪接机制对rna的加工促进了它们的细胞质输出，由于剪接机制与运输机制之间的偶联，cdna的表达效率通常很低。因此，载体中包含wpre(参见，例如，seq id no:23)导致转基因表达增强。[0219]转导的宿主细胞和细胞转导的方法[0220]本文所述的重组慢病毒载体(lv)和所得病毒能够将异源核酸序列(例如，编码wasp的核酸)转移到哺乳动物细胞中。在各种实施方案中，为了递送至细胞，本文所述的载体优选与合适的包装细胞系结合使用，或与含有必需的逆转录病毒基因(例如，gag和pol)的其他载体质粒一起体外共转染到细胞中以形成能够包装本发明的载体并感染细胞的复制缺陷型病毒体。[0221]在某些实施方案中，通过转染将载体引入包装细胞系。包装细胞系产生含有载体基因组的病毒粒子。转染的方法是本领域的技术人员所熟知的。在将包装载体和转移载体共转染到包装细胞系之后，通过本领域技术人员使用的标准方法从培养基中回收重组病毒并进行滴定。因此，可通常连同或不连同优势可选择标志物诸如新霉素、dhfr、谷氨酰胺合成酶通过磷酸钙转染、脂转染或电穿孔将包装构建体引入人细胞系中，接着在适当药物存在下选择克隆并分离克隆。在某些实施方案中，可选择标志物基因可以与构建体中的包装基因物理连接。[0222]其中包装功能被配置为由合适的包装细胞表达的稳定细胞系是已知的(参见，例如，描述包装细胞的美国专利号5,686,279)。一般来说，对于病毒粒子的产生，可以采用与慢病毒gag和pol基因的表达相容的任何细胞，或可以经工程改造以支持这种表达的任何细胞。例如，可以使用生产细胞诸如293t细胞和ht1080细胞。[0223]具有掺入其中的慢病毒载体的包装细胞形成生产细胞。因此，生产细胞是可以产生或释放携带感兴趣的治疗基因(例如，编码wasp的核酸)的包装的感染性病毒粒子的细胞或细胞系。这些细胞还可以是锚定依赖性的，这意味着这些细胞在附着于玻璃或塑料等表面时会以最佳方式生长、存活或维持功能。当载体具有复制能力时，用作慢病毒载体包装细胞系的锚定依赖性细胞系的一些实例是hela或293细胞和perc.6细胞。[0224]因此，在某些实施方案中，提供了将基因递送至细胞的方法，然后所述基因被整合到细胞基因组中，所述方法包括使细胞与含有本文所述的慢病毒载体的病毒体接触。可以使细胞(例如，以组织或器官的形式)与病毒体离体接触(例如，感染)，然后将其递送至其中基因(例如，编码wasp的核酸)将被表达的受试者(例如，哺乳动物、动物或人)。在各种实施方案中，细胞对于受试者可以是自体的(即，来自受试者)或其对于受试者可以是非自体的(即，同种异体的或异种的)。此外，因为本文所述的载体能够被递送至分裂细胞和非分裂细胞，所以所述细胞可以来自多种细胞，包括例如骨髓细胞、间充质干细胞(例如，从脂肪组织获得)、和其他来源于人和动物源的原代细胞。或者，可以将病毒体直接体内施用于受试者或受试者的局部区域(例如，骨髓)。[0225]在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体将特别适用于转导从骨髓、外周血或脐带血中获得的人造血祖细胞或造血干细胞，以及适用于转导cd4+t细胞、外周血b或t淋巴细胞等。在某些实施方案中，特别优选的靶标是cd34+造血干细胞和祖细胞。[0226]基因疗法[0227]在其他实施方案中，提供了用于转导人造血干细胞的方法。在某些实施方案中，所述方法涉及使包含造血干细胞的人细胞群体与前述慢病毒载体中的一种在可实现载体对所述群体中的人造血祖细胞进行转导的条件下接触。干细胞可以在体内或体外转导，这取决于最终应用。即使在人基因疗法诸如人干细胞的基因疗法的背景下，也可以在体内转导干细胞，或替代地，在体外转导然后将转导的干细胞输注到人受试者中。在此实施方案的一个方面中，可以使用本领域技术人员熟知的方法从人(例如，was患者)中去除人干细胞并如上所述对其进行转导。然后将转导的干细胞重新引入相同或不同的人中。[0228]干细胞/祖细胞基因疗法[0229]在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体特别适用于转导从骨髓、外周血或脐带血中获得的人造血祖细胞或造血干细胞(hsc)，以及适用于转导cd4+t细胞、外周血b或t淋巴细胞等。在某些实施方案中，特别优选的靶标是cd34+造血干细胞和祖细胞。[0230]当离体转导细胞(例如cd34+细胞、树突状细胞、外周血细胞或肿瘤细胞)时，通常使用大约在1至50感染复数(moi)之间的剂量将载体粒子与细胞一起孵育，所述感染复数也对应每105个细胞1×105至50×105个病毒载体转导单位。这可以包括对应于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50moi的载体量。通常，载体的量可以ht-29转导单位(tu)的形式表示。[0231]在某些实施方案中，基于细胞的治疗涉及提供干细胞和/或造血前体，用编码例如编码wasp的核酸的慢病毒转导细胞，然后将转化的细胞引入有需要的受试者(例如，具有was基因中的突变的受试者)。[0232]在某些实施方案中，所述方法涉及从受试者分离细胞(例如，干细胞)的群体，任选地在组织培养物中扩增细胞，并施用慢病毒载体，其在细胞内的存在导致体外细胞中产生正常的wasp。然后将细胞返回给受试者，其中例如，它们可以提供产生wasp的红细胞群体。[0233]在一些例示性但非限制性的实施方案中，可以使用细胞群体，所述细胞群体可以是来自细胞系或来自除受试者之外的个体的细胞。从受试者中分离干细胞、免疫系统细胞等并将它们返回给受试者的方法在本领域中是众所周知的。此类方法例如用于经历化疗的患者的骨髓移植、外周血干细胞移植等。[0234]在使用干细胞的情况下，应当认识到此类细胞可来源于多种来源，包括骨髓(bm)、脐带血(cb)、动员外周血干细胞(mpbsc)等。在某些实施方案中，考虑使用诱导多能干细胞(ipsc)。分离造血干细胞(hsc)、转导此类细胞并将它们引入哺乳动物受试者的方法是本领域技术人员熟知的。[0235]在某些实施方案中，本文所述的具有编码wasp而非mcit的核酸的慢病毒载体(参见，例如，图18至图21)，通过将编码wasp的核酸引入到was患者的骨髓干细胞中，之后进行自体移植，用于was干细胞基因疗法。[0236]直接引入载体[0237]在某些实施方案中，考虑通过直接引入本文所述的载体来直接治疗受试者。慢病毒组合物可经配制用于通过任何可用途径递送，包括但不限于肠胃外(例如，静脉内)、真皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道。常用的递送途径包括吸入、肠胃外和经粘膜。[0238]在各种实施方案中，药物组合物可以包含与药学上可接受的载剂组合的lv。如本文中使用的表述“药学上可接受的载剂”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以并入组合物中。[0239]在一些实施方案中，活性剂(即，本文所述的慢病毒或将与载体一起施用的其他剂)用将保护化合物免于从身体快速消除的载剂制备，所述载剂诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可使用可生物降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备这样的组合物的方法对于本领域技术人员是显而易见的。合适的材料也可以从阿尔扎公司(alza corporation)和诺华制药公司(nova pharmaceuticals,inc.)商购获得。脂质体也可以用作药学上可接受的载剂。这些都可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如像美国专利号4,522,811中所述。在一些实施方案中，组合物靶向特定细胞类型或靶向被病毒感染的细胞。例如，可以使用针对细胞表面标志物(例如，在感染细胞表面上表达的内源标志物或病毒抗原)的单克隆抗体靶向组合物。[0240]以便于施用和实现剂量均匀性的剂量单位形式配制组合物是有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的统一剂量的物理上不连续的单位；各单位包含与药物载剂缔合的经计算产生期望治疗效果的预定量的lv。[0241]单位剂量不需要以单次注射施用，而可以包括在设定的时间段内的连续输注。本文所述的lv的单位剂量可以方便地根据慢病毒载体的转导单位(t.u.)来描述，如通过在诸如hela或293的细胞系上滴定载体所定义的。在某些实施方案中，单位剂量可以在103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013t.u.以及更高的范围内。[0242]药物组合物可以根据需要以不同的间隔和在不同的时间段内施用，例如每周一次，持续约1至约10周；约2至约8周；约3至约7周；约4周；约5周；约6周等。可能需要无限期地施用治疗组合物。本领域技术人员应当理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，这些因素包括但不限于，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄以及存在的其他疾病。用lv治疗受试者可以包括单一治疗或在很多情况下可以包括一系列治疗。[0243]例示性但非限制性的基因疗法载体施用剂量和用于确定合适剂量的方法是本领域已知的。还应当理解，lv的适当剂量可以取决于特定的接受者和施用方式。任何特定受试者的适当剂量水平可以取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率、其他施用的治疗剂等。[0244]在某些实施方案中，本文所述的慢病毒基因疗法载体可以通过例如静脉内注射、局部施用或通过立体定位注射递送至受试者(参见，例如，chen等人(1994)proc.natl.acad.sci.usa,91:3054)。在某些实施方案中，载体可以口服或吸入递送，并且可以被封装或以其他方式被操纵以保护它们免于降解、提高组织或细胞的吸收等。药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的lv，或可以包括其中嵌入了lv的缓释基质。替代地或另外地，在可以从重组细胞完整地产生载体时，在如本文所述的逆转录病毒或慢病毒载体情况下，药物制剂可以包含一种或多种产生载体的细胞。本文所述的包含lv的药物组合物可以任选地与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。[0245]前述组合物、方法和用途旨在为例示性而非限制性的。使用本文提供的教导内容，本领域技术人员将易于获得关于组合物、方法和用途的其他改变。[0246]实施例1[0247]开发用于治疗wiskott-aldrich综合征(was)的慢病毒载体[0248]下面描述的实验目的是开发由天然was基因的内源调控元件驱动的新型慢病毒载体以治疗wiskott-aldrich综合征。特别地，希望开发在巨核细胞中具有比现有的was1.6慢病毒载体更高的表达，并因此能够将was患者的血小板计数恢复到正常水平的载体。此外，希望在所有其他造血细胞谱系中保持至少类似水平的表达，并恢复t、b和nk细胞计数和功能。[0249]生物信息学分析(使用公开可用的数据库：project encode、ensemnbl、fantom、vista enhancer browser、genehancer)被用来阐明天然was基因的内源调控元件。[0250]was1.6载体由紧靠转录起始位点上游的1600bp的启动子片段驱动。我们在此片段内鉴定出两个调控元件“hs1”和“hs2”，它们的大小分别为417bp和190bp。因此，我们在1633bp的片段中鉴定出1026bp的惰性序列，其可以被去除以减小启动子大小。[0251]我们注意到1.6kb的启动子不足以驱动巨核细胞中野生型表达水平，因此患者仍然存在微血小板减少。鉴于此，我们假设附加的内源增强子元件对于驱动巨核细胞中was的野生型表达水平是必需的。[0252]was基因的近端分析鉴定出新的增强子元件“hs4”和“hs3”，它们含有巨核细胞dnasei hs位点并且可以充当增强子以增加在巨核细胞中的表达。创建了一系列含有这些区域和报告基因的各种组合的慢病毒载体(lv)以评估这些调控元件的活性(参见，例如，图1，分图a)。此外，被提出是人类基因组中最强的增强子之一的e3元件(thurman等人(2012)nature,489:75-82)具有巨核细胞超敏性。因此，我们还构建了载体以评估在此背景下的e3增强子活性(参见，例如，图1，分图b)。[0253]用was载体转导meg-01细胞(巨核细胞系)以便确定是否有任何新鉴定的增强子元件增加巨核细胞谱系中的表达。将细胞培养14天并针对表达(mcitrine)进行流式细胞术并进行vcn分析。[0254]如图2所示，hs1最小启动子(417bp)似乎是巨核细胞中1.6kb载体中表达的主要驱动因子。此外，hs2似乎在巨核细胞系中是惰性的，但此元件可能在其他谱系中具有增强子活性。hs3似乎大大增加了巨核细胞系中的表达，并且hs4似乎也增加了巨核细胞系中的表达。组合hs3和hs4有效果，并且e3是强效的非谱系特异性增强子，其在巨核细胞中也有活性。[0255]临床1.6kb载体显示在除巨核细胞之外的所有造血细胞系中以治愈水平表达(患者不再是免疫缺陷的，但仍然存在血小板减少)。如我们所示，was1.6的例示性缩短版本是hs2-hs1，因为hs2-hs1含有was1.6具有的所有调控区域(同时节省1.0kb的序列)，这表明hs2-hs1可以用作载体骨架。添加新的hs3和hs4片段已显示可增加巨核细胞中的表达，因此hs4-hs3-hs2-hs1可以在所有造血细胞谱系中提供治疗水平的表达。一个例示性的合适载体(hs4-hs3-hs2-hs1)仅比was1.6大155bp，但显示在巨核细胞中的表达是was1.6的约2倍。[0256]然而，hs2-hs1pro在其他细胞谱系(t细胞和b细胞)中是否与was1.6表现相同仍有待确定。此外，我们希望确定hs3和hs4是否还增加其他造血细胞谱系中的表达，以及hs2增强子元件是否是必需的。就这一点而言，我们认识到hs2增强子可能在其他细胞类型中具有增强子功能，或者可能是完全惰性的。此外，我们想确定hs1pro是否可以与was1.6表现相同，以及将hs4和hs3添加到hs2-hs1中是否对其他细胞类型中的表达有负面影响？[0257]为了解决这些问题，将was载体转导到jurkat(t细胞系)和ramos(b细胞系)中。将细胞培养14天，并通过流式细胞术和vcn分析表达。[0258]was载体在jurkat细胞中的表达水平如图3所示，并且在ramos细胞中的表达水平如图4所示。如这些图所例示，裸露的最小启动子hs1pro(seq no:1)在所有细胞系测试(meg-01、cmk、jurkat和ramos)中的功能与was1.6相同。hs2增强子本身似乎是相对惰性的(190bp)。通过消除惰性的1kb序列和190bp hs2序列，我们可以节省多达约1.2kb的序列。[0259]hs3增强子似乎增加了巨核细胞系中的表达，但在b细胞和t细胞中是惰性的。hs4增强剂似乎增加了巨核细胞和b细胞中的表达，但在t细胞中是惰性的。e3增强子似乎增加了巨核细胞中的表达，但其在b细胞和t细胞中是惰性的(非内源元件)。[0260]鉴于这些发现，合适的was载体包含hs4-hs3-hs2-hs1pro。此载体仅比was1.6大200bp，但在巨核细胞和b细胞中提供比was1.6更高的表达，并且在t细胞中提供与was1.6相比类似的表达水平。[0261]我们继续重新深入分析was基因座，并鉴定了包含在跨越was基因上游850kb和下游250kb的110万个碱基对窗口内的13个推定的内源增强子元件。其中三个元件先前在我们对was基因座的近端生物信息学分析中被鉴定。为了在实验上鉴定调控was基因的关键增强子元件，将每个推定的增强子元件克隆到内源最小was启动子(hs1pro)的上游以驱动mcitrine的表达(参见图5，分图a)。将这些载体的表达与先前对照中使用的且能够将血小板计数恢复到正常水平的γ-逆转录病毒载体(cmmp-mcit，参见图5，分图b)的表达进行比较。[0262]用载体转导细胞，将其培养14天并通过流式细胞术和vcn分析表达。图6示出了meg-01(巨核细胞系)的数据，图7示出了jurkat细胞(t细胞系)的数据，并且图8示出了ramos细胞(b细胞系)的结果。如这些图中所示，所有10个新鉴定的增强子元件在meg-01细胞(巨核细胞系)中的表达增加，水平高于was1.6载体和我们先前的慢病毒载体(hs4,3,2,1)。元件1、3、7、8和9各自独立地驱动高于先前的临床γ-逆转录病毒cmmp-mcit载体的表达。所有载体在jurkat(t细胞系)中的表达均高于γ-逆转录病毒载体且与was1.6的水平类似，并且所有载体在ramos(b-细胞系)中的表达均高于γ-逆转录病毒载体且与was1.6的水平类似。此外，与was1.6和cmmp-mcit相比，元件2的表达增加至超过2倍。[0263]在分化为巨核细胞和血小板的脐带血(cb)cd34+hspc中再次筛选这10个元件，以确认来自细胞系的结果。图9-11分别示出了was载体在原巨核细胞、巨核细胞和血小板中的表达水平。如这些图所示，来自cb cd34+分化的巨核细胞的数据不同于来自meg-01细胞(巨核细胞系)的数据。特别地，似乎只有增强子元件2增加cb cd34+巨核细胞中的表达。虽然此构建体的表达是was1.6的2倍，但与γ-逆转录病毒构建体相比，它的表达较低。[0264]提出的一种主要载体包含xxx-hs2-hs1-wasp-wpre，其中xxx表示可以添加的附加增强子元件。hs2-hs1组分包含was1.6启动子内的两个功能元件，其中hs1是主要驱动因子，并且hs2提供额外的190bp。在原巨核细胞(图12)、巨核细胞(图13)和血小板(图14)中构建并评估了包含这些元件和增强子元件1-10的各种构建体。[0265]确定了最佳载体可以包含增强子区域hs3、e2、e9和e10中的一个或多个的各种组分。注意到hs3是531bp，e2是3678bp，e9是555bp，并且e10是455bp。特别是鉴于增强子区e2的长度，希望鉴定这些区域的较小的有效片段。分析增强子元件2(was下游260kb)，发现其含有5个接近约3.7kb的片段。5个e2片段：e2-1(核心子元件1的前一半+核心子元件1的后一半，分别参见例如，表1，seq id no:3和4)、e2-2(参见例如，表1，seq id no:5)、e2-3(参见例如，表1，seq id no:6)、e2-4(参见例如，表1，seq id no:7)和e2-5(参见例如，表1，seq id no:8)被克隆到5个不同的载体中，以使e2的活性最强的片段可以被鉴定以包含在载体中。确定了这些载体在原巨核细胞(图15)、巨核细胞(图16)和血小板(图17)中的表达。如图15-17所示，e2中似乎没有一个元件是表达的主要驱动因子。单独测试时，e2的子元件2和3似乎对表达没有任何影响。e2是巨核细胞表达的驱动因子，但希望可以缩短。此增强子在血小板中提供的表达是was1.6的3倍，并且在巨核细胞中提供的表达是was1.6的1.6倍。然而，与γ-逆转录病毒载体相比，e2增强子表达较低，但与was1.6相比的增加可足以将血小板计数增加到正常水平。cb cd34+分化的巨核细胞与巨核细胞系(meg-01细胞)之间增强子元件的表达存在差异，因为元件1、2、3、7、8和9各自独立地驱动表达，高于先前meg-01细胞中的临床γ-逆转录病毒cmmp-mcit载体，但与cb cd34+巨核细胞中的cmmp-mcit相比，均表达较低。[0266]鉴于这些观察，某些特别合适的载体包括但不限于：[0267]1)e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wpre(5.6kb)；[0268]2)e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wpre(6.1kb)；[0269]3)e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1,4,5(缩短)-hs1pro-mcit-wpre(5.6kb)；和[0270]4)e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1的前一半(缩短)和5(缩短)-hs1pro-mcit-wpre(5.0kb)。[0271]上面列出的大小是在开放阅读框中具有mcit报告基因。大小将随着开放阅读框中编码wasp的核酸而不同。[0272]需注意，上面的载体(3)消除了增强子元件2中的子元件2和3，同时，上面的载体(4)消除了增强子元件2的子元件1的后一半以及子元件2、3和4。[0273]还应当认识到，对于临床使用(例如，治疗was)，mcitrine开放阅读框将被编码wasp蛋白的核酸替换。例示性核酸包括但不限于was cdna和密码子优化的was核酸。[0274]实施例2[0275]主要候选载体的鉴定[0276]上面的实施例1描述生成四种主要候选载体：1)e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wrpe；2)e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wrpe；3)e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1,4,5(缩短)-hs1pro-mcit-wrpe；和4)e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1的前一半(缩短)和5(缩短)-hs1pro-mcit-wrpe。[0277]本实施例描述了在cb cd34+hspc分化的巨核细胞和血小板中筛选这些载体以确定主要候选载体。此外，评估了用wasp替换mcitrine的开放阅读框并表达实际的治疗蛋白质的wasp的密码子优化。还证明了was患者t细胞系和b细胞系中wasp表达的校正。[0278]为了确定主要候选载体，我们筛选了从健康供体(hd)脐带血(cb)cd34+造血干细胞和祖细胞(hpsc)分化的巨核细胞和血小板中的4种候选载体。还包括含有e2、e9和hs3元件的修饰边界和片段的单个元件载体，以确定用于创建主要候选载体的修饰物(较小尺寸的元件)是否仍然保留亲本元件的表达。还包括was1.6(进行临床试验的现有was载体)和先前使用的γ-逆转录病毒载体，用于比较表达。[0279]如图22所示，e9、hs3和e2的修饰的“缩短”版本保留了较大亲本元件的表达。此外，一个主要候选载体e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1,4,5(缩短)-hs1pro-mcit-wrpe与y-逆转录病毒载体相比具有类似的表达水平，并且在cb cd34+hspc分化的巨核细胞中的表达是was1.6的1.8倍(图22)。[0280]在cb cd34+分化的血小板中观察到类似的结果，e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1,4,5(缩短)-hs1pro-mcit-wrpe的表达与γ-逆转录病毒载体类似，并且是was1.6的表达的1.5倍(参见例如，图23)。[0281]鉴于这些数据，一个主要候选载体是e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1,4,5(缩短)-hs1pro-mcit-wpre(wasvec)，其：[0282]1)在cb cd34+巨核细胞中的表达等于/高于y-retro；[0283]2)表达是was1.6的1.8倍；[0284]5.6kb，在开放阅读框中具有mcitrine；[0285]6.4kb，在开放阅读框中具有wasp；以及[0286]3)在“血小板”中的表达是was1.6的1.5倍。[0287]为了筛选wasp的理想的密码子优化序列以进一步改善表达，我们将来自was患者的t细胞系和b细胞系永生化，并使用所述细胞系筛选在wasvec-(e9(缩短)-hs3(缩短)-e2的1,4,5(缩短)-hs1pro-wasp-wpre)中wasp开放阅读框的不同密码子优化版本。[0288]用不同版本的wasvec转导was b细胞系和t细胞系，所述不同版本的wasvec各自编码wasp开放阅读框的不同密码子优化版本，如下所示：[0289]cdna(未修饰的天然cdna序列，作为对照)；[0290]jcat密码子优化；[0291]geneart密码子优化；[0292]idt密码子优化；以及[0293]benchling密码子优化。[0294]如图24和25所示，与非密码子优化的天然cdna相比，wasvec中wasp的jcat密码子优化导致b细胞(图24)和t细胞(图25)中的表达分别增加至1.29倍和1.48倍。图24和25还示出，与天然cdna相比，geneart密码子优化导致b和t细胞中的表达分别增加至1.13倍和1.20倍，而idt和benchling密码子优化导致b细胞和t细胞中的表达降低。密码子优化似乎都没有显著影响滴度。此外，cat和geneart可能略微增加滴度(图26)。[0295]鉴于这些观察，一种主要候选载体是e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(1,4,5缩短)-hs1pro-wasp(jcat密码子优化)-wpre，也称为wasvec。此载体为6.4kb，在开放阅读框中具有wasp。[0296]应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是用于说明目的并且根据其的各种改动或变化将由本领域技术人员提出并且被包括在本技术的精神和权限以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利以及专利申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。[0297]序列表[0298]seq id no:1hs1pro(was基因的最小内源启动子)[0299]tcagcctcaggctacctaggtgctttagaaaggaggccacccaggcccatgactactccttgccacagggagccctgcacacagatgtgctaagctctcgctgccagccagagggaggagggtctgagccagtcagaaggagatgggccccagagagtaagaaagggggaggaggacccaagctgatccaaaaggtgggtctaagcagtcaagtggaggagggttccaatctgatggcggagggcccaagctcagcctaacgaggaggccaggcccaccaaggggcccctggaggacttgtttcccttgtcccttgtggttttttgcatttcctgttcccttgctgctcattgcggaagttcctcttcttaccctgcacccagagcctcgccagagaagacaagggcagaaagcacc[0300]seq id no:2增强子元件2(缩短)[0301]gacctgaagggtaagggggtgtggaggttgtgaaggcgggaaggggggtagccccttcaccaatgtaaacaaggatgtgggttctgcggccacactctcccccgccctccccagcggcatttccagcaagtcacatgtcctgcgcacaggctgggggccccctgctgctgcctttcttagaagccaggaccacagagcccgcacagtgagctacttggggagctatttctgtagactgagcttggggtactgggaggcagtgctgttggcgatctgggggaaaaccccctgagggtcccatttctctgccactgacccctttgcctggcagaaaggctctgctgcctcctagctgtgtagcaatggataaggcctttaacctctctaagctgaaatgtcctcatgcataaggtggagacagtaactcctcttccatctgctgggtgttgtcaaaactacacaggaggtttgccaagcacctaaggcacagtaggtggtcaagaaacaggaacacaatttgtcatgacgacaatgattccttcatatgctagttacccacgagtcagccagaatgttgccataaccacttatgaagcccttcctcatttctgttgcaattcctcagccagaggaaagccccaccacctctgtcctccagaaagccctcctcttcccagaaggctggcacacagggctgggggccaggcttgacttccctgtggaggggtctgaggttggggggatgacctgcagaggtaggggaattcagagaacttgttttgatagaaactgaaactcctcctcttgctgacgctgcacttgtgggcaatctgcacctgttctcccctcccagaggccagctggaagggggtcccccaccattctacctctgttcccatctcaaacagggctcagaaatcctcagagagcctggattatcttcctatagggtcctaccatttgctttagagacatctgagaactgcctactccccaggtagctgcctgcctcccagaagagccacagcaagttccgctaagggcaaaaaaggaagctaggtgtctacagggaacctaaaaacaaaccacactaacgtgtgtacacacagctgcagagggagacagggacctggtctgctcacagcccttgccactcccccatggcccatgtagaaacaaccatgtggccttcactctgcccacagaagctagcaccaggaccctggtcagggttagaggtttctgctgagtcaaagccacatggagggagggagcaagggagagatgcagagtcatgtttccaggaggaggttatctgagcataacagggacagggtgggccacaggatacctctgaggctcaggttcccacctccactccaccctccaactctctgctccacgttccttccactattcaacacatggcaggaagtcagcctgtagggcttcacactacagtctaagctgactgccatctgtccccatccaggcgaggctggaaacgggggcagcaaaaagcccagggacaaagtccccttcccaggcacatgtattatgcactctgcaccaaggaaacctccagataaggtctagagaccaagggccatgtacttcgggggagaggccagaggacttctgaggttttacagagaaaagccaaaggcagcccagtcaggggaaatgtgtagccatagtgccgataaggaaaggccttcaacctgccctggtcagctcttcctgtaagtagaggccccttaccgaaggccccagtgggaggaagggtcgggagta[0302]seq id no:3增强子元件2的核心子元件1的前一半[0303]gacctgaagggtaagggggtgtggaggttgtgaaggcgggaaggggggtagccccttcaccaatgtaaacaaggatgtgggttctgcggccacactctcccccgccctccccagcggcatttccagcaagtcacatgtcctgcgcacaggctgggggccccctgctgctgcctttcttagaagccaggaccacagagcccgcacagtgagctacttggggagctatttctgtagactgagcttggggtactgggaggcagtgctgttggc[0304]seq id no:4增强子元件2的核心子元件1的后一半[0305]gatctgggggaaaaccccctgagggtcccatttctctgccactgacccctttgcctggcagaaaggctctgctgcctcctagctgtgtagcaatggataaggcctttaacctctctaagctgaaatgtcctcatgcataaggtggagacagtaactcctcttccatctgctgggtgttgtcaaaactacacaggaggtttgccaagcacctaaggcacagtaggtggtcaagaaacaggaacacaatttgtcatgacgacaatgattccttcatatgctagttacccacgagtcagccagaatgttgccataaccacttatgaagcccttcctcatttctgttgcaattcctcagccagaggaaagcccca[0306]seq id no:5增强子元件2的核心子元件2[0307]ccacctctgtcctccagaaagccctcctcttcccagaaggctggcacacagggctgggggccaggcttgacttccctgtggaggggtctgaggttggggggatgacctgcagaggtaggggaattcagagaacttgttttgatagaaactgaaactcctcctcttgctgacgctgcacttgtgggcaatctgcacctgttctcccctcccagaggccagctggaagggggtcccccaccattctacctctgttcccatctcaaacagggctcagaaatcctca[0308]seq id no:6增强子元件2的核心子元件3[0309]gagagcctggattatcttcctatagggtcctaccatttgctttagagacatctgagaactgcctactccccaggtagctgcctgcctcccagaagagccacagcaagttccgctaagggcaaaaaaggaagctaggtgtctacagggaacctaaaaacaaaccacactaacgtgtgtacacacagctgcagagggagacagggacctggtctgct[0310]seq id no:7增强子元件2的核心子元件4[0311]cacagcccttgccactcccccatggcccatgtagaaacaaccatgtggccttcactctgcccacagaagctagcaccaggaccctggtcagggttagaggtttctgctgagtcaaagccacatggagggagggagcaagggagagatgcagagtcatgtttccaggaggaggttatctgagcataacagggacagggtgggccacaggatacctctgaggctcaggttcccacctccactccacc[0312]seq id no:8增强子元件2的核心子元件5[0313]ctccaactctctgctccacgttccttccactattcaacacatggcaggaagtcagcctgtagggcttcacactacagtctaagctgactgccatctgtccccatccaggcgaggctggaaacgggggcagcaaaaagcccagggacaaagtccccttcccaggcacatgtattatgcactctgcaccaaggaaacctccagataaggtctagagaccaagggccatgtacttcgggggagaggccagaggacttctgaggttttacagagaaaagccaaaggcagcccagtcaggggaaatgtgtagccatagtgccgataaggaaaggccttcaacctgccctggtcagctcttcctgtaagtagaggccccttaccgaaggccccagtgggaggaagggtcgggagta[0314]seq id no:9 增强子元件hs3(全长)[0315]ctaaaagccaccaaaaccaagacagcaatgaaagtaacctctggtcttcctaactgctcattatacactaattatgatgcactagcatgctaagagacacttccaccagcgccatgacagtgccatggcaacatcaagaagtcaccccacatggtctaaaaaggggaagaaccttcagttcccggaattgcccacccctttcctggaaaactcatgaataatccaccccttgtttagcatataattaagaaataactgtaagtatccttagtccagcagcccaagctgctgctctgcctatggagtagccattctttattcctttactttcttaataaacttgctttcacattaaaaacaacaacaacaacaccaacaaccagcaaatatatcagaggcttagcatcccctattcaaggggacagttctggaggccgagaaagaagtagaaaggtggagaataaaagacacaaaggagcagaagaattttatcttggcctccatgtggcacctcacagcttgggaacaaca[0316]seq id no:10增强子元件hs3核心[0317]ctaaaagccaccaaaaccaagacagcaatgaaagtaacctctggtcttcctaactgctcattatacactaattatgatgcactagcatgctaagagacacttccaccagcgccatgacagtgccatggcaacatcaagaagtcaccccacatggtctaaaaaggggaagaaccttcagttcccggaattgcccacccctttcctggaaaactcatgaataatccaccccttgtttagcatataat[0318]seq id no:11增强子元件e9(全长)[0319]gggatctgtgtgcagatttacctctacctacacctggctggggatcataaagaaaatcaagggatgcgctacctccatgaatccaggtttcagcagagctaagggagtgaaatttggggccattttacttgtctcaaaccttgttatctgagagaaagctagagcttccttctttcagcccccagagacaatgtggccaggctccggagggctgggaagatgagcaatgcttgtgagtcaccatgataggaagcagaagggtcaggaagtccctgggagcaaggcttagggttagggttagggagaaaacacttgggcctggaggctcggggcaggcttcctagaggggaggggtaggaagaggcagtgacagggcccacagcaatggagaggagttggactgcagggatggggtagggggacagacgacaagggacactcagaagactaatgtctgggagtgggaaaacagtgtttgctcagccaggaagctgcatccagctcttttatcatttgtagaagaccaagtacccaggcctgggaggagcccagaga[0320]seq id no:12增强子元件e9核心[0321]caaaccttgttatctgagagaaagctagagcttccttctttcagcccccagagacaatgtggccaggctccggagggctgggaagatgagcaatgcttgtgagtcaccatgataggaagcagaagggtcaggaagtccctgggagcaaggcttagggttagggttagggagaaaacacttgggcctggaggctcggggcaggcttcctagaggggaggggta[0322]seq id no:13was 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id no:14密码子优化的was[0325]atgagcggcggccccatgggcggccgccccggcggccgcggcgcccccgccgtgcagcagaacatccccagcaccctgctgcaggaccacgagaaccagcgcctgttcgagatgctgggccgcaagtgcctgaccctggccaccgccgtggtgcagctgtacctggccctgccccccggcgccgagcactggaccaaggagcactgcggcgccgtgtgcttcgtgaaggacaacccccagaagagctacttcatccgcctgtacggcctgcaggccggccgcctgctgtgggagcaggagctgtacagccagctggtgtacagcacccccacccccttcttccacaccttcgccggcgacgactgccaggccggcctgaacttcgccgacgaggacgaggcccaggccttccgcgccctggtgcaggagaagatccagaagcgcaaccagcgccagagcggcgaccgccgccagctgccccccccccccacccccgccaacgaggagcgccgcggcggcctgccccccctgcccctgcaccccggcggcgaccagggcggcccccccgtgggccccctgagcctgggcctggccaccgtggacatccagaaccccgacatcaccagcagccgctaccgcggcctgcccgcccccggccccagccccgccgacaagaagcgcagcggcaagaagaagatcagcaaggccgacatcggcgcccccagcggcttcaagcacgtgagccacgtgggctgggacccccagaacggcttcgacgtgaacaacctggaccccgacctgcgcagcctgttcagccgcgccggcatcagcgaggcccagctgaccgacgccgagaccagcaagctgatctacgacttcatcgaggaccagggcggcctggaggccgtgcgccaggagatgcgccgccaggagcccctgccccccccccccccccccagccgcggcggcaaccagctgccccgcccccccatcgtgggcggcaacaagggccgcagcggccccctgccccccgtgcccctgggcatcgccccccccccccccaccccccgcggcccccccccccccggccgcggcggccccccccccccccccccccccgccaccggccgcagcggccccctgcccccccccccccccggcgccggcggcccccccatgcccccccccccccccccccccccccccccccccagcagcggcaacggccccgcccccccccccctgccccccgccctggtgcccgccggcggcctggcccccggcggcggccgcggcgccctgctggaccagatccgccagggcatccagctgaacaagacccccggcgcccccgagagcagcgccctgcagccccccccccagagcagcgagggcctggtgggcgccctgatgcacgtgatgcagaagcgcagccgcgccatccacagcagcgacgagggcgaggaccaggccggcgacgaggacgaggacgacgagtgggacgactaa[0326]seq id no:15 e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wpre[0327]从cmv(图18中的红色箭头)顺时针开始的序列：[0328]agttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgaggacctgaagggtaagggggtgtggaggttgtgaaggcgggaaggggggtagccccttcaccaatgtaaacaaggatgtgggttctgcggccacactctcccccgccctccccagcggcatttccagcaagtcacatgtcctgcgcacaggctgggggccccctgctgctgcctttcttagaagccaggaccacagagcccgcacagtgagctacttggggagctatttctgtagactgagcttggggtactgggaggcagtgctgttggcgatctgggggaaaaccccctgagggtcccatttctctgccactgacccctttgcctggcagaaaggctctgctgcctcctagctgtgtagcaatggataaggcctttaacctctctaagctgaaatgtcctcatgcataaggtggagacagtaactcctcttccatctgctgggtgttgtcaaaactacacaggaggtttgccaagcacctaaggcacagtaggtggtcaagaaacaggaacacaatttgtcatgacgacaatgattccttcatatgctagttacccacgagtcagccagaatgttgccataaccacttatgaagcccttcctcatttctgttgcaattcctcagccagaggaaagccccaccacctctgtcctccagaaagccctcctcttcccagaaggctggcacacagggctgggggccaggcttgacttccctgtggaggggtctgaggttggggggatgacctgcagaggtaggggaattcagagaacttgttttgatagaaactgaaactcctcctcttgctgacgctgcacttgtgggcaatctgcacctgttctcccctcccagaggccagctggaagggggtcccccaccattctacctctgttcccatctcaaacagggctcagaaatcctcagagagcctggattatcttcctatagggtcctaccatttgctttagagacatctgagaactgcctactccccaggtagctgcctgcctcccagaagagccacagcaagttccgctaagggcaaaaaaggaagctaggtgtctacagggaacctaaaaacaaaccacactaacgtgtgtacacacagctgcagagggagacagggacctggtctgctcacagcccttgccactcccccatggcccatgtagaaacaaccatgtggccttcactctgcccacagaagctagcaccaggaccctggtcagggttagaggtttctgctgagtcaaagccacatggagggagggagcaagggagagatgcagagtcatgtttccaggaggaggttatctgagcataacagggacagggtgggccacaggatacctctgaggctcaggttcccacctccactccaccctccaactctctgctccacgttccttccactattcaacacatggcaggaagtcagcctgtagggcttcacactacagtctaagctgactgccatctgtccccatccaggcgaggctggaaacgggggcagcaaaaagcccagggacaaagtccccttcccaggcacatgtattatgcactctgcaccaaggaaacctccagataaggtctagagaccaagggccatgtacttcgggggagaggccagaggacttctgaggttttacagagaaaagccaaaggcagcccagtcaggggaaatgtgtagccatagtgccgataaggaaaggccttcaacctgccctggtcagctcttcctgtaagtagaggccccttaccgaaggccccagtgggaggaagggtcgggagtactcgagtcagcctcaggctacctaggtgctttagaaaggaggccacccaggcccatgactactccttgccacagggagccctgcacacagatgtgctaagctctcgctgccagccagagggaggagggtctgagccagtcagaaggagatgggccccagagagtaagaaagggggaggaggacccaagctgatccaaaaggtgggtctaagcagtcaagtggaggagggttccaatctgatggcggagggcccaagctcagcctaacgaggaggccaggcccaccaaggggcccctggaggacttgtttcccttgtcccttgtggttttttgcatttcctgttcccttgctgctcattgcggaagttcctcttcttaccctgcacccagagcctcgccagagaagacaagggcagaaagcaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaaga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id no:16 e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(全缩短)-hs1pro-mcit-wpre(添加e9(缩短)和hs3(缩短)元件)[0330]图19中从cmv(红色箭头)顺时针开始的序列：[0331]agttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagcaaaccttgttatctgagagaaagctagagcttccttctttcagcccccagagacaatgtggccaggctccggagggctgggaagatgagcaatgcttgtgagtcaccatgataggaagcagaagggtcaggaagtccctgggagcaaggcttagggttagggttagggagaaaacacttgggcctggaggctcggggcaggcttcctagaggggaggggtactaaaagccaccaaaaccaagacagcaatgaaagtaacctctggtcttcctaactgctcattatacactaattatgatgcactagcatgctaagagacacttccaccagcgccatgacagtgccatggcaacatcaagaagtcaccccacatggtctaaaaaggggaagaaccttcagttcccggaattgcccacccctttcctggaaaactcatgaataatccaccccttgtttagcatataatgacctgaagggtaagggggtgtggaggttgtgaaggcgggaaggggggtagccccttcaccaatgtaaacaaggatgtgggttctgcggccacactctcccccgccctccccagcggcatttccagcaagtcacatgtcctgcgcacaggctgggggccccctgctgctgcctttcttagaagccaggaccacagagcccgcacagtgagctacttggggagctatttctgtagactgagcttggggtactgggaggcagtgctgttggcgatctgggggaaaaccccctgagggtcccatttctctgccactgacccctttgcctggcagaaaggctctgctgcctcctagctgtgtagcaatggataaggcctttaacctctctaagctgaaatgtcctcatgcataaggtggagacagtaactcctcttccatctgctgggtgttgtcaaaactacacaggaggtttgccaagcacctaaggcacagtaggtggtcaagaaacaggaacacaatttgtcatgacgacaatgattccttcatatgctagttacccacgagtcagccagaatgttgccataaccacttatgaagcccttcctcatttctgttgcaattcctcagccagaggaaagccccaccacctctgtcctccagaaagccctcctcttcccagaaggctggcacacagggctgggggccaggcttgacttccctgtggaggggtctgaggttggggggatgacctgcagaggtaggggaattcagagaacttgttttgatagaaactgaaactcctcctcttgctgacgctgcacttgtgggcaatctgcacctgttctcccctcccagaggccagctggaagggggtcccccaccattctacctctgttcccatctcaaacagggctcagaaatcctcagagagcctggattatcttcctatagggtcctaccatttgctttagagacatctgagaactgcctactccccaggtagctgcctgcctcccagaagagccacagcaagttccgctaagggcaaaaaaggaagctaggtgtctacagggaacctaaaaacaaaccacactaacgtgtgtacacacagctgcagagggagacagggacctggtctgctcacagcccttgccactcccccatggcccatgtagaaacaaccatgtggccttcactctgcccacagaagctagcaccaggaccctggtcagggttagaggtttctgctgagtcaaagccacatggagggagggagcaagggagagatgcagagtcatgtttccaggaggaggttatctgagcataacagggacagggtgggccacaggatacctctgaggctcaggttcccacctccactccaccctccaactctctgctccacgttccttccactattcaacacatggcaggaagtcagcctgtagggcttcacactacagtctaagctgactgccatctgtccccatccaggcgaggctggaaacgggggcagcaaaaagcccagggacaaagtccccttcccaggcacatgtattatgcactctgcaccaaggaaacctccagataaggtctagagaccaagggccatgtacttcgggggagaggccagaggacttctgaggttttacagagaaaagccaaaggcagcccagtcaggggaaatgtgtagccatagtgccgataaggaaaggccttcaacctgccctggtcagctcttcctgtaagtagaggccccttaccgaaggccccagtgggaggaagggtcgggagtactcgagtcagcctcaggctacctaggtgctttagaaaggaggccacccaggcccatgactactccttgccacagggagccctgcacacagatgtgctaagctctcgctgccagccagagggaggagggtctgagccagtcagaaggagatgggccccagagagtaagaaagggggaggaggacccaagctgatccaaaaggtgggtctaagcagtcaagtggaggagggttccaatctgatggcggagggcccaagctcagcctaacgaggaggccaggcccaccaaggggcccctggaggacttgtttcccttgtcccttgtggttttttgcatttcctgttcccttgctgctcattgcggaagttcctcttcttaccctgcacccagagcctcgccag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id no:17 e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(1,4,5缩短)-hs1pro-mcit-wpre(缺失元件2的核心子元件2和元件2的核心子元件3)[0333]图20中从cmv(红色箭头)顺时针开始的序列[0334]agttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagcaaaccttgttatctgagagaaagctagagcttccttctttcagcccccagagacaatgtggccaggctccggagggctgggaagatgagcaatgcttgtgagtcaccatgataggaagcagaagggtcaggaagtccctgggagcaaggcttagggttagggttagggagaaaacacttgggcctggaggctcggggcaggcttcctagaggggaggggtactaaaagccaccaaaaccaagacagcaatgaaagtaacctctggtcttcctaactgctcattatacactaattatgatgcactagcatgctaagagacacttccaccagcgccatgacagtgccatggcaacatcaagaagtcaccccacatggtctaaaaaggggaagaaccttcagttcccggaattgcccacccctttcctggaaaactcatgaataatccaccccttgtttagcatataatgacctgaagggtaagggggtgtggaggttgtgaaggcgggaaggggggtagccccttcaccaatgtaaacaaggatgtgggttctgcggccacactctcccccgccctccccagcggcatttccagcaagtcacatgtcctgcgcacaggctgggggccccctgctgctgcctttcttagaagccaggaccacagagcccgcacagtgagctacttggggagctatttctgtagactgagcttggggtactgggaggcagtgctgttggcgatctgggggaaaaccccctgagggtcccatttctctgccactgacccctttgcctggcagaaaggctctgctgcctcctagctgtgtagcaatggataaggcctttaacctctctaagctgaaatgtcctcatgcataaggtggagacagtaactcctcttccatctgctgggtgttgtcaaaactacacaggaggtttgccaagcacctaaggcacagtaggtggtcaagaaacaggaacacaatttgtcatgacgacaatgattccttcatatgctagttacccacgagtcagccagaatgttgccataaccacttatgaagcccttcctcatttctgttgcaattcctcagccagaggaaagccccacacagcccttgccactcccccatggcccatgtagaaacaaccatgtggccttcactctgcccacagaagctagcaccaggaccctggtcagggttagaggtttctgctgagtcaaagccacatggagggagggagcaagggagagatgcagagtcatgtttccaggaggaggttatctgagcataacagggacagggtgggccacaggatacctctgaggctcaggttcccacctccactccaccctccaactctctgctccacgttccttccactattcaacacatggcaggaagtcagcctgtagggcttcacactacagtctaagctgactgccatctgtccccatccaggcgaggctggaaacgggggcagcaaaaagcccagggacaaagtccccttcccaggcacatgtattatgcactctgcaccaaggaaacctccagataaggtctagagaccaagggccatgtacttcgggggagaggccagaggacttctgaggttttacagagaaaagccaaaggcagcccagtcaggggaaatgtgtagccatagtgccgataaggaaaggccttcaacctgccctggtcagctcttcctgtaagtagaggccccttaccgaaggccccagtgggaggaagggtcgggagtactcgagtcagcctcaggctacctaggtgctttagaaaggaggccacccaggcccatgactactccttgccacagggagccctgcacacagatgtgctaagctctcgctgccagccagagggaggagggtctgagccagtcagaaggagatgggccccagagagtaagaaagggggaggaggacccaagctgatccaaaaggtgggtctaagcagtcaagtggaggagggttccaatctgatggcggagggcccaagctcagcctaacgaggaggccaggcccaccaaggggcccctggaggacttgtttcccttgtcccttgtggttttttgcatttcctgttcccttgctgctcattgcggaagttcctcttcttaccctgcacccagagcctcgccagagaagacaagggcagaaagcaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccga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e9(缩短)-hs3(缩短)-e2(1的前一半和5缩短)-hs1pro-mcit-wpre(缺失元件2的核心子元件1的后一半和元件2的核心子元件4)[0336]图21中从cmv(红色箭头)顺时针开始的序列[0337]agttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagcaaaccttgttatctgagagaaagctagagcttccttctttcagcccccagagacaatgtggccaggctccggagggctgggaagatgagcaatgcttgtgagtcaccatgataggaagcagaagggtcaggaagtccctgggagcaaggcttagggttagggttagggagaaaacacttgggcctggaggctcggggcaggcttcctagaggggaggggtactaaaagccaccaaaaccaagacagcaatgaaagtaacctctggtcttcctaactgctcattatacactaattatgatgcactagcatgctaagagacacttccaccagcgccatgacagtgccatggcaacatcaagaagtcaccccacatggtctaaaaaggggaagaaccttcagttcccggaattgcccacccctttcctggaaaactcatgaataatccaccccttgtttagcatataatgacctgaagggtaagggggtgtggaggttgtgaaggcgggaaggggggtagccccttcaccaatgtaaacaaggatgtgggttctgcggccacactctcccccgccctccccagcggcatttccagcaagtcacatgtcctgcgcacaggctgggggccccctgctgctgcctttcttagaagccaggaccacagagcccgcacagtgagctacttggggagctatttctgtagactgagcttggggtactgggaggcagtgctgttggcctccaactctctgctccacgttccttccactattcaacacatggcaggaagtcagcctgtagggcttcacactacagtctaagctgactgccatctgtccccatccaggcgaggctggaaacgggggcagcaaaaagcccagggacaaagtccccttcccaggcacatgtattatgcactctgcaccaaggaaacctccagataaggtctagagaccaagggccatgtacttcgggggagaggccagaggacttctgaggttttacagagaaaagccaaaggcagcccagtcaggggaaatgtgtagccatagtgccgataaggaaaggccttcaacctgccctggtcagctcttcctgtaagtagaggccccttaccgaaggccccagtgggaggaagggtcgggagtactcgagtcagcctcaggctacctaggtgctttagaaaggaggccacccaggcccatgactactccttgccacagggagccctgcacacagatgtgctaagctctcgctgccagccagagggaggagggtctgagccagtcagaaggagatgggccccagagagtaagaaagggggaggaggacccaagctgatccaaaaggtgggtctaagcagtcaagtggaggagggttccaatctgatggcggagggcccaagctcagcctaacgaggaggccaggcccaccaaggggcccctggaggacttgtttcccttgtcccttgtggttttttgcatttcctgttcccttgctgctcattgcggaagttcctcttcttaccctgcacccagagcctcgccagagaagacaagggcagaaagcaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagctaccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgactgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcc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no:29具有密码子优化的wasp开放阅读框的wasvec慢病毒载体转移质粒的全长序列:(序列从cmv开始)：[0359]agttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagcaaaccttgttatctgagagaaagctagagcttccttctttcagcccccagagacaatgtggccaggctccggagggctgggaagatgagcaatgcttgtgagtcaccatgataggaagcagaagggtcaggaagtccctgggagcaaggcttagggttagggttagggagaaaacacttgggcctggaggctcggggcaggcttcctagaggggaggggtactaaaagccaccaaaaccaagacagcaatgaaagtaacctctggtcttcctaactgctcattatacactaattatgatgcactagcatgctaagagacacttccaccagcgccatgacagtgccatggcaacatcaagaagtcaccccacatggtctaaaaaggggaagaaccttcagttcccggaattgcccacccctttcctggaaaactcatgaataatccaccccttgtttagcatataatgacctgaagggtaagggggtgtggaggttgtgaaggcgggaaggggggtagccccttcaccaatgtaaacaaggatgtgggttctgcggccacactctcccccgccctccccagcggcatttccagcaagtcacatgtcctgcgcacaggctgggggccccctgctgctgcctttcttagaagccaggaccacagagcccgcacagtgagctacttggggagctatttctgtagactgagcttggggtactgggaggcagtgctgttggcgatctgggggaaaaccccctgagggtcccatttctctgccactgacccctttgcctggcagaaaggctctgctgcctcctagctgtgtagcaatggataaggcctttaacctctctaagctgaaatgtcctcatgcataaggtggagacagtaactcctcttccatctgctgggtgttgtcaaaactacacaggaggtttgccaagcacctaaggcacagtaggtggtcaagaaacaggaacacaatttgtcatgacgacaatgattccttcatatgctagttacccacgagtcagccagaatgttgccataaccacttatgaagcccttcctcatttctgttgcaattcctcagccagaggaaagccccacacagcccttgccactcccccatggcccatgtagaaacaaccatgtggccttcactctgcccacagaagctagcaccaggaccctggtcagggttagaggtttctgctgagtcaaagccacatggagggagggagcaagggagagatgcagagtcatgtttccaggaggaggttatctgagcataacagggacagggtgggccacaggatacctctgaggctcaggttcccacctccactccaccctccaactctctgctccacgttccttccactattcaacacatggcaggaagtcagcctgtagggcttcacactacagtctaagctgactgccatctgtccccatccaggcgaggctggaaacgggggcagcaaaaagcccagggacaaagtccccttcccaggcacatgtattatgcactctgcaccaaggaaacctccagataaggtctagagaccaagggccatgtacttcgggggagaggccagaggacttctgaggttttacagagaaaagccaaaggcagcccagtcaggggaaatgtgtagccatagtgccgataaggaaaggccttcaacctgccctggtcagctcttcctgtaagtagaggccccttaccgaaggccccagtgggaggaagggtcgggagtactcgagtcagcctcaggctacctaggtgctttagaaaggaggccacccaggcccatgactactccttgccacagggagccctgcacacagatgtgctaagctctcgctgccagccagagggaggagggtctgagccagtcagaaggagatgggccccagagagtaagaaagggggaggaggacccaagctgatccaaaaggtgggtctaagcagtcaagtggaggagggttccaatctgatggcggagggcccaagctcagcctaacgaggaggccaggcccaccaaggggcccctggaggacttgtttcccttgtcccttgtggttttttgcatttcctgttcccttgctgctcattgcggaagttcctcttcttaccctgcacccagagcctcgccagagaagacaagggcagaaagcaccatgtctggcggacctatgggaggtagacctggtggaagaggtgcccccgccgtgcagcagaacatccccagcaccctgctgcaggaccacgagaaccagcgcctgttcgagatgctgggccgcaagtgcctgaccctggccaccgccgtggtgcagctgtacctggccctgccccccggcgccgagcactggaccaaggagcactgcggcgccgtgtgcttcgtgaaggacaacccccagaagagctacttcatccgcctgtacggcctgcaggccggccgcctgctgtgggagcaggagctgtacagccagctggtgtacagcacccccacccccttcttccacaccttcgccggcgacgactgccaggccggcctgaacttcgccgacgaggacgaggcccaggccttccgcgccctggtgcaggagaagatccagaagcgcaaccagcgccagagcggcgacagaaggcaactgcctcctccacctacaccagccaacgaggaaa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