褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA

有机化合物处理,合成应用技术褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsrna技术领域1.本发明涉及昆虫的生长发育调控和基因工程技术领域，特别涉及一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsrna。背景技术：2.褐色橘蚜aphis citricidus是柑桔衰退病病毒citrus tristeza virus的主要传播媒介，该病毒对世界柑桔产业造成严重的经济损失。褐色橘蚜应对逆境胁迫时出现典型的翅型可塑性，如：拥挤条件下，褐色橘蚜分化出有翅型，正常条件下褐色橘蚜为无翅型。翅型可塑性作为褐色橘蚜重要的生态对策与其爆发成灾及传播植物病毒密切相关。褐色橘蚜田间营孤雌生殖、加之有翅率高(约20％)、翅型可塑性强，世代历期短、繁殖率高等特点，使用化学药剂防治较为困难并且极易引起抗药性等问题(shilts et al.,2018；gao et al.,2021)。阐明褐色橘蚜翅型可塑性的分子调控机制，探索蚜虫防控的新靶标、寻获新型高效的蚜虫绿色防控技术是国内外的重大科技需求。3.rna干扰(rna interference，rnai)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(dsrna，double-stranded rna，双链核糖核酸)诱发的、同源rna高效特异性降解的现象，是通过dsrna的介导特异性的降解对应序列的mrna。由于使用rnai技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。4.β-胡萝卜素调控昆虫黑化、视觉体色、抗逆胁迫等重要生理进程(heath et al.,2013；tougeron et al.,2021)。β-胡萝卜素是昆虫体内含量最高的类胡萝卜素(含40碳的碳氢化合物和氧化衍生物)(ding et al.,2020；maoka,2020)。β-胡萝卜素参与粉纹夜蛾trichoplusia ni的黑化反应，并调节其生长速率(clark and lampert,2018)。此外，β-胡萝卜素通过酶催化作用转变成维生素a，并调控昆虫的视觉功能，缺乏β-胡萝卜素会导致家蚕五龄幼虫单眼和成虫复眼对由光刺激产生的电反应能力丧失(shimizu and kato,1981)。β-胡萝卜素响应逆境胁迫因子诱导昆虫体色可塑性(tsuchida,2016；wybouw et al.,2019；孙明霞等,2020)。豌豆蚜红色型与绿色型间β-胡萝卜素含量差异较大，随着寄主营养条件变差，β-胡萝卜素含量显著降低，种群适合度降低(ding et al.,2020)；东亚飞蝗locusta migratoria散居型呈现均匀绿色，群居型则呈现黑色背板和棕色腹面。进一步解析发现，飞蝗主要通过β-胡萝卜素与其结合蛋白的分离与结合调控体色变化(yang et al.,2019)。申请人前期研究发现，胰岛素信号通路调控褐色橘蚜翅可塑性(ding et al.,2017)，并发现其上游调控因子mir-9b(shang et al.,2020)。5.蚜虫通过真菌水平基因转移(horizontal gene transfer)自身合成β-胡萝卜素。研究发现，大多数昆虫不能从头合成β-胡萝卜素，只能从食物中摄取或由体内共生微生物提供(jeremy et al.,2013)。如家蚕bombyx mori取食桑叶获得β-胡萝卜素，色素物质被中肠吸收后先进入血液，随后透过丝腺被丝胶蛋白吸收，从而使蚕茧着色；烟粉虱bemisia tabaci初级共生菌candidatus portiera aleyrodidarum基因组中包含β-胡萝卜素生物合成关键基因，调控自身和共生宿主β-胡萝卜素的生物合成(santos-garcia et al.,2012；sloan and moran,2012)。近年来研究发现，部分刺吸式昆虫(螨)通过水平基因转移从真菌中获得相关基因合成β-胡萝卜素(altincicek et al.,2012；novákováꢀand moran,2012；cobbs et al.,2013；bryon et al.,2017)。在豌豆蚜acyrthosiphon pisum基因组中发现真菌水平转移的编码脱氢酶和合成/环化酶的基因，均是β-胡萝卜素生物合成所必需的基因(moran and jarvik,2010)，该发现为昆虫β-胡萝卜素生物合成与功能研究开辟了新领域。随后在其它蚜虫、二斑叶螨tetranychus urticae和黑森瘿蚊mayetiola destructor基因组中也发现了真菌转移β-胡萝卜素生物合成相关基因的现象(altincicek et al.,2012；cobbs et al.,2013；bryon et al.,2017)。6.β-胡萝卜素通路关键酶系在不同物种中差异巨大(miziorko et al.,2011；sun et al.,2018；ma et al.,2022)。两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)分子在合成酶的作用下生成八氢番茄红素。在植物、藻类和细菌中，该酶仅具有合成酶功能(sieiro et al.,2003)。而在真菌中，合成酶为双功能酶，既具有合成酶功能，又具有环化酶功能(velayos et al.,2000；arrach et al.,2001)。八氢番茄红素在脱氢酶的作用下脱氢生成番茄红素。在真菌和真细菌中，这一过程由一个脱氢酶基因催化生成，而在植物和藻类生物中这一过程则由不同的酶系分工完成(sandmann et al.,2009)。环化酶可使番茄红素的一端或者两端发生环化作用，生成β-胡萝卜素、α-胡萝卜素和γ-胡萝卜素(maoka et al.,2020)，β-胡萝卜素则在加氧酶(ninab)和β-胡萝卜素结合蛋白(β-cbp)的作用下形成复合物并进一步代谢成其他色素或能量物质(clark et al.,2018；chai et al.,2019；yang et al.,2019)。分析34种蚜虫相关序列发现，脱氢酶、合成酶和环化酶基因是在蚜虫进化早期获得，经过不断的复制、重组和筛选，从而在不同种类的蚜虫中扩张或收缩出不同的基因，呈现多样化的β-胡萝卜素通路(novákováꢀand moran,2012；takemura et al.,2021)。7.类胡萝卜素加氧酶(carotenoid oxygenase)能够氧化裂解类胡萝卜素产生维生素a(vitamin a,va)类物质。该酶作为一种可溶于细胞质中的重要酶类，在肠黏膜尤其空肠黏膜细胞中的活性最高。目前针对褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶蛋白的相关研究较少，也未见针对褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna的报道。技术实现要素：8.本发明针对褐色橘蚜β-胡萝卜素通路解析及其对翅型可塑性的调控作用这一关键科学问题，在系统鉴定褐色橘蚜β-胡萝卜素通路基因的基础上，运用rnai在活体水平上构建褐色橘蚜β-胡萝卜素的通路；解析褐色橘蚜β-胡萝卜素通路响应逆境胁迫的表达模式；分析β-胡萝卜素对褐色橘蚜翅型可塑性的影响及胰岛素对β-胡萝卜素通路的调控。9.本发明经过研究验证首次鉴定到了褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因(acninab基因)，并设计合成其dsrna，通过实验验证，该dsrna基因沉默效率高。基于此，本发明保护如下技术方案：10.一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因，其核苷酸序列如seq id no:3所示。11.上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因或褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因编码的蛋白作为靶标在如下任一中的应用：12.1)在调控褐色橘蚜翅型可塑性或制备调控褐色橘蚜翅型可塑性的产品中的应用；13.2)在调控褐色橘蚜生长发育或制备调控褐色橘蚜生长发育调控剂中的应用；14.3)在防治褐色橘蚜或制备防治褐色橘蚜的产品中的应用。15.本发明还保护扩增上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。16.本发明还保护上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的pcr扩增方法，包括如下步骤：以褐色橘蚜总rna反转录得到的cdna为模板，以序列为seq id no:1的上游引物和以序列为seq id no:2的下游引物进行pcr扩增。17.在上述的pcr扩增方法中，当pcr扩增的反应体系为25μl时，25μl的pcr反应体系包括：浓度为200-700ng/μl的cdna模板1μl，浓度为0.15-0.25μm的上下游引物各1μl，dna聚合酶la taq mix 0.25μl，10×buffer(mg2+plus)3μl，dntp 4μl以及去核酸酶水14.75μl；18.pcr条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。19.本发明还保护一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna，以如seq id no:3所示的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因片段为模板转录获得。20.优选地，所述dsrna的核苷酸序列如seq id no:6所示。21.上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna在如下任一中的应用：22.1)在调控褐色橘蚜翅型可塑性或制备调控褐色橘蚜翅型可塑性的产品中的应用；23.2)在调控褐色橘蚜生长发育或制备调控褐色橘蚜生长发育调控剂中的应用；24.3)在防治褐色橘蚜或制备防治褐色橘蚜的产品中的应用。25.本发明还保护一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna的合成方法，包括如下步骤：以褐色橘蚜总rna反转录得到的cdna为模板，以序列为seq id no:4的上游引物和以序列为seq id no:5的下游引物进行pcr扩增，pcr扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna。26.在上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna的合成方法的技术方案中，dsrna合成反应体系为20μl，其中包括：胶回收得到的片段模板4μl(约1μg)、5×transcrptaid reaction buffer 4μl、浓度为100mm的atp/ctp/gtp/utp mix 8μl、transcriptaid enzyme mix 2μl和depc-treated water 2μl；反应条件为：37℃孵育4h。27.本发明的有益效果是：本发明首次鉴定得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因序列，并通过实验验证该基因参与调控褐色橘蚜翅型可塑性，根据该序列得到类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna，可以应用于对褐色橘蚜进行rna干扰从而起到防治褐色橘蚜的效果。通过实验验证，该dsrna基因沉默效率高，基因干扰后褐色橘蚜有明显表型变化，解决了褐色橘蚜目前没有有效的类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。附图说明28.图1为褐色橘蚜acninab基因在ncbi中protein blast比对图。29.图2为褐色橘蚜acninab基因氨基酸序列与其它昆虫acninab蛋白系统发育树图。30.图3为本发明实施例中的饲喂dsrna的装置。buffer 4μl，primescriptrt enzyme mix i 1μl，oligo dt primer(50μm)1μl，random 6mers(100μm)1μl，rnase free ddh2o 12μl。70.3)对步骤2)得到的cdna进行pcr扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35个循环；72℃条件下延伸10min；pcr反应体系共25μl，包括：浓度为400-500ng/μl的cdna模板0.5μl，浓度为0.15-0.25μm的上下游引物(t7-acninab-a1、t7-acninab-s1)各1μl，primestar max premix 12.5μl以及去核酸酶水10μl。71.4)将步骤3)中的pcr产物用胶回收纯化试剂盒按照说明书纯化回收之后作为合成dsrna的转录模板，用体外合成rna试剂盒transcript aid t7 high yield transcription kit按照使用说明转录合成并纯化得到褐色橘蚜acninab基因的dsrna(如seq id no:6所示)溶液，将dsrna溶液浓度稀释到200-300ng/μl备用。dsrna合成反应体系为20μl，其中包括：胶回收得到的片段模板4μl(约1μg)、5×transcrptaid reaction buffer 4μl、浓度为100mm的atp/ctp/gtp/utp mix 8μl、transcriptaid enzyme mix 2μl和depc-treated water 2μl；反应条件为：37℃孵育4h。72.同时按照上述方法合成并纯化得到gfp(绿色荧光蛋白)的dsrna溶液作为阴性对照，反转录得到的cdna进行pcr扩增时使用的上下游引物序列分别为gfp-ds-t7f(如seq id no:7所示)、gfp-ds-t7r(如seq id no:8所示)，序列为：gfp-ds-t7f：73.taatacgactcactatagggcagttcttgttgaattagatg；74.gfp-ds-t7r：75.taatacgactcactatagggtttggtttgtctcccatgatg。76.实施例三、褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna导入褐色橘蚜77.利用如图3所示的装置对褐色橘蚜饲喂dsrna，按照如下步骤操作：78.1)取干净的50ml离心管，用剪刀将离心管1圆锥形底部剪去，取250μl pcr管2将管底剪掉，用双面胶将pcr管2的管口与离心管1管盖的内壁粘在一起，使得pcr管2套在离心管1内；79.2)从pcr管2剪掉的管底处伸入移液枪注入上述制得的dsrna溶液，将离心管1管底朝上地竖立放置；80.3)取新鲜的柑橘嫩梢3，用无核酸酶水清洗干净吸干多余水分后插入pcr管2的dsrna溶液中，然后用封口胶缠住pcr管2剪掉管底后留下的缺口，防止随后放入的褐色橘蚜进入pcr管2中；81.4)将20头褐色橘蚜挑入离心管1中，用5cm*5cm的80目纱网4盖住离心管1的管底，并用橡皮筋捆紧纱网4，保证褐色橘蚜正常呼吸同时防止其逃出离心管1；将该整个饲喂dsrna的装置放入培养箱中，在25±1℃、湿度75±5％和光照:黑暗为14h:10h的条件下培养72h。82.每20头褐色橘蚜为一个生物重复，设置4个饲喂acninab基因dsrna溶液的生物重复作为实验组。同时设置饲喂gfp的dsrna溶液的处理作为对照组。83.实施例四、acninab影响褐色橘蚜翅型分化研究84.翅型可塑性是翅二型昆虫应对不良栖息环境的反应(vellichirammal et al.,2017；parker and brisson,2019；reyes et al.,2019；hammelman et al.,2020)，如飞虱和蟋蟀的长翅型与短翅型，蚜虫的有翅型和无翅型等(袁一杨等,2020；parker et al.,biosynthetic pathway of aphids at the gene level and arthropodal food chain involving aphids and the red dragonfly.bmc zoology.6:1-13.和sun et al.,2021,biosynthesis of aphid alarm pheromone is modulated in response to starvation stress under regulation by the insulin,glycolysis and isoprenoid pathways.journal of insect physiology.128,104174.)的方法。使用rna干扰关键基因inr2作为胰岛素活性的指示因子。合成inr2的dsrna并用无核酶水稀释至800ng/ml。将柑桔嫩梢分别插入装有以上的1.5ml离心管中，持续饲喂24和48h后收集试虫，检测基因表达量和β-胡萝卜素含量变化，以饲喂dsgfp为对照，每组4个生物重复。93.成功干扰褐色橘蚜胰岛素受体基因2(inr2)发现，β-胡萝卜素通路基因表达量发生变化，ninab和β-cbp显著上调，导致β-胡萝卜素代谢加快，含量降低(图6)，说明β-胡萝卜素通路确实受胰岛素活性的调控。94.实施例五、沉默效率以及表型的检测95.实施例三中饲喂dsrna的装置在培养箱中培养72小时后，收集上述acninab基因的dsrna溶液处理过的实验组，以及gfp的dsrna溶液处理的对照组的褐色橘蚜，使用trizol法分别提取rna之后利用perfect real time rt reagent反转录得到相应的cdna，反转录体系为20μl，其中包括：总rna 1μl(约1μg)，5×primescript buffer 4μl，primescriptrt enzyme mix i 1μl，oligo dt primer(50μm)1μl，random 6mers(100μm)1μl，rnase free ddh2o 12μl。反应条件为：37℃15min，85℃5s。96.利用qrt-pcr技术，检测acninab基因在实验组、对照组中的相对表达量。qpcr中实验组的上下游引物为acninab-l(如seq id no:9所示)和acninab-r(如seq id no:10所示)，对照组的上下游引物为gfp-ds-f(如seq id no:11所示)和gfp-ds-r(如seq id no:12所示)，引物序列如下：97.acninab-l：ccattaagtgtcggtggcct；98.acninab-r：tgctccgttatgccgaaaga；99.gfp-ds-f：cagttcttgttgaattagatg；100.gfp-ds-r：tttggtttgtctcccatgatg。101.qrt-pcr反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s、60℃退火30s，共40个循环。pcr反应体系为20μl，包括：cdna模板1μl(250ng)，前述上下游qpcr引物各1μl，去核酸酶水7μl和荧光染料qpcr master mix 10μl。选用褐色橘蚜的ef1a基因为内参基因进行相对定量分析，分析方法则采用国际上惯用的2-δδct法。内参基因ef1a的qpcr引物序列：102.ef1a-s:gatgcacctggtcacagaga，如seq id no:13所示；103.ef1a-a:ccatcttgttcacaccaacg，如seq id no:14所示。104.qrt-pcr检测结果显示，褐色橘蚜的类胡萝卜素加氧酶基因(acninab基因)在饲喂相应的dsrna的实验组中的相对表达量相对于对照组(gfp)显著下调，而且下调高达50％左右，如图7所示。同时，通过观察发现，类胡萝卜素加氧酶基因的dsrna处理的实验组的褐色橘蚜后代有翅率降低至3.75％，而对照组有翅率则为43％(结果如图8所示)，β-类胡萝卜素含量上升3倍左右(结果如图9所示)。图10中1为对照组(dsgfp)的褐色橘蚜后代有翅情况，2为dsninab处理组的褐色橘蚜后代有翅情况，实验验证了实验组的褐色橘蚜的类胡萝卜素加氧酶基因的表达受到抑制，且acninab基因参与蚜虫的翅型分化。实验结果也说明利用本发明方法对褐色橘蚜进行acninab基因的dsrna饲喂，能够有效导入dsrna，达到rna干扰的效果。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!