具有优异的转化活性的细胞固定化珠及制备其的方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及细胞固定化珠及制备其的方法，更具体地，涉及其中包含在固定化珠中的细胞的转化活性优异并且其中即使在分配和储存过程期间也保持转化活性的细胞固定化珠、制备细胞固定化珠的方法，以及珠的转化活性的用途。背景技术：2.阿洛酮糖作为膳食甜味剂越来越受到关注，但它属于稀有糖类，是自然界中极少存在的单糖。因此，为了将其应用于食品工业，有必要开发一种高效生产阿洛酮糖的技术。作为生产阿洛酮糖的常规方法，已知的主要是通过化学合成过程的生产方法和使用微生物酶的生物生产方法。对于近来的食品材料，环境友好的生物生产方法比化学生产方法更优选，因此已经对在阿洛酮糖的生产方法中使用微生物进行了许多研究。3.阿洛酮糖差向异构酶是产生阿洛酮糖的微生物所具有的转化果糖的阿洛酮糖产生酶，被溶出到细胞外，并且正在工业上研究通过酶固定法的生产方法和通过固定含细胞的载体的生产方法。然而，其中工业上主要应用通过更经济的方法使用细胞固定化载体的生产方法，而无需从细胞获得酶的过程。作为用于生产阿洛酮糖的细胞固定化载体，使用适用于生产食品原料的海藻酸。海藻酸作为食品添加剂应用于如乳酸菌胶囊、饮料、医用组织工程材料和药物传输系统等各个领域。由于海藻酸容易形成水凝胶，因此多用作载体(珠)，特别是多用于酶和细胞的固定化。此外，使用海藻酸或其盐的海藻酸盐珠是可膨胀且可拉伸的多孔材料，其随机形成β-1,4键，从而可以稳定地固定细胞或酶，因此这是有利的。4.然而，当暴露于微生物在含有大量水分的状态下可以生长的环境下时，海藻酸的细胞固定化珠经过几个小时会腐烂，从而由于珠的结合力的减弱，细胞中的阿洛酮糖差向异构酶的活性也随着细胞从载体中的释放迅速降低，这降低了转化果糖的阿洛酮糖生产反应过程中的阿洛酮糖产生率。5.另外，在使用海藻酸或其盐的浸渍于珠水溶液的状态下，孔隙度的特性得以很好地保持，但在没有特殊化学品和针对污染的防治的情况下存在难以在水溶液外储存和分配的问题。即，含有水的细胞固定化海藻酸载体与制备时一样以淡水状态存在，因此在大量生产时不易储存，并且在分配过程中可能会出现如成本高、以液态储存等严格的限制。6.此外，由于适合大多数酶和细胞活性的ph主要分布在ph 7附近，因此它们具有由于在ph 7附近海藻酸珠的结合力减弱而导致膨胀和分解的特征，以及在高温下结合力减弱的特点，因此它们在工业上的应用受到限制。7.为了解决这些问题，需要通过确立除去其上固定有如细胞和酶等的生物催化剂的海藻酸载体中所含的水的生产工艺和生产条件来制备保持转化活性的储存和分配优异的干燥珠的方法。技术实现要素：8.技术问题9.本发明的一个目的是提供一种用于生产阿洛酮糖的干燥珠，其中将具有阿洛酮糖转化活性以从果糖生产阿洛酮糖的微杆菌属(microbacterium)菌株的微生物细胞固定在海藻酸或其盐上，以及一种制备用于生产阿洛酮糖的干燥珠的方法。10.本发明的另一个目的是提供一种通过用水或果糖溶液复原用于从果糖生产阿洛酮糖的干燥珠而获得的复原珠，以及使用该复原珠用于生产阿洛酮糖的组合物，或使用该复原珠由含果糖底物生产含阿洛酮糖产物的方法。11.本发明的又一个目的是提供一种包括干燥形式的细胞固定化珠的用于生产阿洛酮糖的组合物，或一种使用该组合物由含果糖底物来制备含阿洛酮糖产物的方法。12.技术方案13.本发明的一个实施方案提供干燥珠，其中将具有阿洛酮糖转化活性以由果糖生产阿洛酮糖的微杆菌属菌株的微生物细胞固定在载体上并干燥，从而使含水量低，及一种制备干燥珠的方法，通过复原干燥珠获得的复原珠及制备复原珠的方法，一种包含干燥珠和/或复原珠的用于生产阿洛酮糖的组合物，以及用于生产阿洛酮糖的方法。14.根据本发明的包含固定在载体上的微生物细胞的干燥珠具有低的含水量，以及优异的储存稳定性和热稳定性。15.进一步地，将干燥珠复原得到的复原珠的物理性质的恢复率优异，因此表现出与干燥前的珠物性相近的水平，并且具有相对相当或相似水平的阿洛酮糖转化反应活性。所述干燥珠减少珠的体积，通过增加每单位体积的柱填充量来增加阿洛酮糖的产生量。通过制备储存稳定性高的干燥珠来解决现有技术中被认为是问题的含水状态下未干燥珠由于在储存期间微生物的污染造成珠的结合力弱和分解，而导致将细胞释放到珠外和转化活性降低的问题，从而具有可以长时间稳定地提供高阿洛酮糖生产量的优点。16.本发明的一个实施方案涉及用于生产阿洛酮糖的干燥珠，其包含作为载体的海藻酸或海藻酸盐，以及固定在载体上的产生阿洛酮糖差向异构酶的微杆菌属微生物的微生物细胞，并且干燥珠的含水量为14％以下。17.本发明的另一个实施方案涉及通过使用水或果糖溶液复原干燥珠而获得的复原珠。18.根据本发明的干燥珠的水分含量或含水量为14％以下，并且基于100％的体积或重量的含水量为90％以上的未干燥珠，干燥后获得的干燥珠的体积或重量可以为50％以下。19.本发明的一个实施方案涉及干燥珠，其中将具有阿洛酮糖转化活性以由果糖生产阿洛酮糖的微杆菌属菌株的微生物细胞固定在载体上并干燥，从而使干燥珠的含水量低。20.具体地，根据本发明的干燥珠可具有至少一种或多种以下性质：21.(i)水分含量为14％以下，22.(ii)基于100％的未干燥珠的重量，干燥后的重量为35％以下，23.(iii)堆积密度为0.6kg/l至0.8kg/l，24.(iv)基于刚生产后的干燥珠的100％转化活性，在生产后在25℃的温度下储存38周后，阿洛酮糖转化活性为60％以上，25.(v)基于刚生产后的干燥珠的100％转化活性，在生产后在60℃的温度下储存38周后，阿洛酮糖转化活性为50％以上，26.(vi)基于100％的含水量为90％以上的未干燥珠的反应柱填充率(体积％)，反应柱填充率(体积％)为35％以下，以及27.(vii)从干燥珠复原的复原珠的平均粒径为1.1mm至1.9mm。28.本发明的进一步的实施方案涉及复原珠，其中使用水或果糖溶液复原干燥珠。具体地，复原珠可以具有至少一种或多种以下性质：29.(i)含水量为90％以上，30.(ii)基于100％的含水量为90％以上的未干燥珠的反应柱填充率(体积％)，反应柱填充率(体积％)为35％以上，31.(iii)珠的平均粒径为1.1mm至1.9mm，32.(iv)基于100％的干燥珠的平均粒径，复原珠的平均粒径为120％至190％，33.(v)基于100％未干燥珠，通过加入50重量％的果糖溶液使阿洛酮糖转化率保持在25％以上的底物进料流速(ml/分钟)为110至300，以及34.(vi)基于100％干燥前的珠的阿洛酮糖产生量，从含果糖原料获得的阿洛酮糖转化产物的阿洛酮糖产生量为约110％以上。35.具体地，根据本发明的实施方案的干燥珠的水分含量或含水量可以是14％以下、12％以下、10％以下、9.9％以下、9.5％以下，9.0％以下、8.9％以下、8.7％以下、8.5％以下、8％以下，含水量的下限值可以为1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、或5％以上，并且含水量的范围可以是上限值和下限值的组合范围，例如1％至14％、2％至12％、3％至10％、3％至8％、4％至8％或5％至8％。36.对于干燥珠，基于100重量％的未干燥珠，例如，含水量为90％以上的未干燥珠，干燥后珠的重量可以为35重量％以下，30重量％以下、25重量％以下、20重量％以下、17重量％以下、15重量％以下、12重量％以下、10重量％以下或8重量％以下，优选30重量％以下、25重量％以下、20重量％以下、17重量％以下、15重量％以下、12重量％以下、10重量％以下或8重量％以下。具体地，从溶液中回收所制得的珠的干燥前的100g珠中，干燥后的重量可以为50g以下，例如为10g以下。通过测量干燥前的重量和干燥后的重量，将干燥珠重量(质量)的变化表示为相对百分比值，并且干燥前和干燥后的重量具有相同的测量单位。37.根据本发明的干燥珠在复原后珠物理性质的恢复率优异，并且阿洛酮糖转化反应效率表现出与干燥前的珠相似的水平。38.进一步，基于100％的未干燥珠，例如，具有90％以上含水量的未干燥珠的反应柱填充率(体积％)，干燥珠的反应柱填充率(体积％)可以为35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、17％以下、15％以下、13％以下或11％以下，例如1.0％至35％、1.0％至30％、1.0％至25％、1.0％至20％、1.0％至20％、1.0％至17％、1.0％至15％、1.0％至13％、1.0％至11％、3.0％至35％、3.0％至30％、3.0％至25％、3.0％至20％、3.0％至20％、3.0％至17％、3.0％至15％、3.0％至13％、3.0％至11％、5.0％至35％、5.0％至30％、5.0％至25％、5.0％至20％、5.0％至20％、5.0％至17％、5.0％至15％、5.0％至13％、5.0％至11％、5.5％至35％、5.5％至30％、5.5％至25％、5.5％至20％、5.5％至20％、5.5％至17％、5.5％至15％、5.5％至13％或5.5％至11％。39.具体地，在从溶液中回收所制得的珠的干燥前的100ml珠中，干燥后的体积可以为35ml以下，例如15ml以下。通过测量干燥前的体积和干燥后的体积，将干燥珠体积变化表示为相对百分比值，并且干燥前和干燥后的体积具有相同的测量单位。40.对于干燥珠，相同重量的珠含水量减少，从而体积减小，密度增加。根据本发明的干燥珠与干燥前的珠相比体积和重量减少，这可以使其易于储存和分配。优异的物理性质恢复率，从而干燥珠表现出与干燥前的珠的物理性质水平相近的水平，并具有相对相当或相似水平的阿洛酮糖转化反应活性。所述干燥珠减少珠的体积，通过增加每单位体积的柱填充量来增加阿洛酮糖的产生量。通过制备储存稳定性高的干燥珠来解决现有技术中被认为是问题的含水状态下未干燥珠由于在储存期间微生物的污染造成珠的结合力弱和分解，而导致将细胞释放到珠外和转化活性降低的问题，从而具有可以长时间稳定地提供高阿洛酮糖生产量的优点。41.根据本发明的干燥珠具有优异的储存稳定性和热稳定性，因此具有最大限度地保持干燥前珠的阿洛酮糖转化活性的优点。制备干燥珠时，重要的是具有接近干燥前珠的物理性质和活性。42.具体地，基于刚生产后的干燥珠的100％转化活性，在制备干燥珠然后在25℃的温度下储存38小时后，干燥珠具有的干燥珠的阿洛酮糖转化活性可以为60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上，或91％以上、92％以上、93％以上，或94％以上。基于刚生产后的干燥珠的100％转化活性，在制备干燥珠然后在60℃的温度下储存38周后，干燥珠具有的干燥珠的酶转化活性可以为50％以上、60％以上、70％以上，或75％以上。43.储存稳定性测量的一个实例是在干燥珠储存在含果糖的底物溶液中的条件下进行的。将经储存的珠填充在反应柱中，且将含有50白利糖度(％)的果糖的底物调节到50℃的温度和6.5至7.2的ph值，使其流过填充有珠的反应柱，并且在保持在25％以上的阿洛酮糖转化率的流速下进行阿洛酮糖转化反应，并且对得到的转化反应产物中所含的阿洛酮糖进行定量。阿洛酮糖转化活性的测量方法与储存前的珠的测量方法相同，并且可以表示为基于储存前珠的阿洛酮糖100％转化活性的相对转化活性的百分比。含果糖底物可以是固体含量为40-60重量％、果糖纯度为30-99％(重量/重量(w/w))的含果糖原料。44.进一步，根据本发明的干燥珠在由含果糖底物生产阿洛酮糖中可以提供更高的转化率和产生量并持续更长的时间。具体地，对于干燥珠，基于干燥前珠的100％的阿洛酮糖产生量，通过使用用果糖溶液复原的复原珠，由固含量为40重量％至60重量％且果糖纯度为30％至99％(w/w)的含果糖原料获得的阿洛酮糖转化反应产物的阿洛酮糖含量可以为约110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上，或180％以上，优选150％以上、160％以上、170％以上，或180％以上，例如101％至300％、105％至300％、110％至300％、120％至300％、130％至300％，或140％至300％。优选地，珠中使用的微生物细胞可以是在30℃至70℃的温度下加热处理的细胞，并且基于使用干燥前的珠的100％的阿洛酮糖产生量，使用果糖溶液复原的复原珠的阿洛酮糖转化反应产物的阿洛酮糖含量可以为约150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上，或200％以上，上限值可以是205％以下、210％以下、220％以下、230％以下、250％以下、260％以下、270％以下、280％以下、290％以下、300％以下，并且范围可以是下限值和上限值的组合值。45.对于复原珠，通过加入果糖溶液将阿洛酮糖转化率保持在25％以上的复原珠的底物进料流速(ml/分钟)可以为0.15以上、0.17以上、0.20以上、0.22以上，或0.24以上，例如0.15至0.5、0.17至0.5、0.20至0.5、0.22至0.5，或0.24至0.5。46.当根据本发明的一个实施方案的用水或果糖溶液复原干燥珠时，例如，在将干燥珠填充到用于生产阿洛酮糖的反应柱时，干燥珠可以在水或果糖溶液中复原到原来的球形。47.具体地，基于100％的未干燥珠的反应柱填充率(体积％)，根据本发明通过复原干燥珠获得的复原珠具有的反应柱填充率(体积％)可以为35％以上、40％以上，或45％以上。48.根据本发明的一个实施方案，干燥珠在用于从果糖转化阿洛酮糖的反应之前需要将它们复原回其原始形状的过程。复原方法可以通过将干燥珠加入水或含有果糖的反应底物中来将其复原回原始形状。具体地，将10g干燥珠放入烧杯中后，在室温下加入200ml水，然后以100rpm的速度搅拌30分钟以上，以将形状复原到接近原始球形。49.根据本发明的一个实施方案，将复原前的干燥珠放入反应柱中，然后通过在反应温度50℃下以0.2至0.5sv的供应流量将用于生产阿洛酮糖的用于转化反应的底物加入或循环的方法使干燥珠水合以将其复原回原始形状。50.通过复原干燥珠获得的复原珠的平均粒径可以是1.1mm至1.9mm、1.15mm至1.9mm、1.2mm至1.9mm、1.25mm至1.9mm、1.3mm至1.9mm、1.1mm至1.8mm、1.15mm至1.8mm、1.2mm至1.8mm、1.25mm至1.8mm、1.3mm至1.8mm、1.1mm至1.7mm、1.15mm至1.7mm、1.2mm至1.7mm、1.25mm至1.7mm、1.3mm至1.7mm、1.1mm至1.6mm、1.15mm至1.6mm、1.2mm至1.6mm、1.25mm至1.6mm或1.3mm至1.6mm。51.基于100％的干燥珠的平均粒径(mm)，从干燥珠复原的复原珠的平均粒径(mm)可以是120％以上，或130％以上，例如，120％以上至190％、130％以上至190％、120％以上至180％、130％以上至180％、120％以上至170％、130％以上至170％、120％以上至160％，或130％以上至160％。52.具体地，基于100％的初始反应柱填充体积，体积可以恢复到40％以上，例如，40％至70％，因此与未干燥珠相比，反应柱填充率增加，因此与未干燥珠相比，提供的每单位体积的生产率更高。53.根据本发明的一个实施方案，提供了一种制备干燥珠的方法，其中具有阿洛酮糖转化活性以产生阿洛酮糖的微杆菌属菌株的细胞被固定在载体上并干燥，从而使含水量低。54.干燥珠的特性与上述干燥珠的描述相同。55.更具体地，制备干燥珠的方法包括将细胞固定在载体上的珠形成步骤和干燥步骤，并且任选地可以进行选自用于珠形成细胞的热处理步骤、珠的低温固化和珠涂覆步骤的一个或多个附加步骤。56.在根据本发明的制备方法中，可以通过将含有阿洛酮糖产生细胞或酶和作为载体的海藻酸或其盐的混合溶液滴加到含有二价阳离子的氯化物的反应溶液中来进行珠形成步骤。57.在珠形成步骤之后，该方法可以包括选自以下步骤的一个或多个处理步骤：固化包含细胞或酶的珠的步骤、洗涤二价阳离子的氯化物的步骤和用含果糖底物处理含细胞或含酶的珠步骤。珠形成后进行的附加步骤可以通过本领域技术人员已知的方法进行，并且没有特别限制。58.在珠形成步骤的实例中，将菌株的微生物细胞、包含由菌株产生的酶的培养物或菌株的裂解物添加到所述菌株的微生物细胞、含有由菌株产生的酶的培养物或菌株的裂解物的1至2倍体积的量的海藻酸钠水溶液中，并混合，然后将得到的混合溶液用注射泵和真空泵滴加到约0.2m的钙离子溶液中，从而能够产生珠。酶可以通过常用方法，例如透析、沉淀、吸附、电泳、亲和层析、离子交换色谱等方法从菌株、菌株培养物或菌株裂解物中纯化。59.在本发明中，使用海藻酸或其盐作为载体，其中海藻酸盐没有特别限制，其实例包括海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸镁、海藻酸铵等。例如，作为载体的海藻酸、海藻酸钠或海藻酸钾盐可以具有2,000cps至50,000cps的粘度。此外，考虑到结块的形成和制备方法的便利性，在珠形成步骤中海藻酸盐溶液的浓度为1重量％至10重量％，优选1重量％至8重量％，更优选2重量％至5重量％，但不限于此。60.产生阿洛酮糖的微生物细胞可以是产生阿洛酮糖差向异构酶的野生型菌株或引入有编码阿洛酮糖的基因的重组菌株。或者，获得产生阿洛酮糖差向异构酶的菌株或者引入有编码阿洛酮糖差向异构酶的基因的重组菌株，并且可以是菌株的细胞、从该菌株获得的酶。61.待固定在珠上的微生物细胞可以是已经在30℃至70℃、或30℃至65℃、40℃至65℃、50℃至63℃，例如，60℃的温度下热处理过的细胞，其中热处理可以进行0.1小时至2小时。产生阿洛酮糖的细胞可以是从培养基中回收的细胞或通过对培养液进行热处理而获得的细胞。与热处理前的细胞相比，经热处理的细胞本身(用细胞而不是珠测量的阿洛酮糖转化活性)具有101％以上、105％以上、110％以上，例如101％至160％的相对阿洛酮糖转化活性。此外，当热处理前在25℃下对具有2％(w/w)细胞浓度和2％(w/w)海藻酸的含细胞混合物进行测量时，与含有未经热处理的细胞的混合溶液相比，在珠形成步骤中细胞和海藻酸或其盐的混合溶液的粘度可以为90％以下，例如，4,000cps至6,000cps。62.在热处理方法的实例中，将与海藻酸和细胞混合的固定化珠在20℃至70℃下干燥以将珠的含水量去除至14％以下，从而可以制备基于100％的干燥前初始珠的体积或重量为约50％以下的干燥珠。63.在本发明的一个具体实施方案中，产生阿洛酮糖差向异构酶的菌株可以是能够以高产率产生阿洛酮糖差向异构酶同时具有高稳定性的菌株。优选地，该菌株可以是微杆菌属菌株，例如，叶状微杆菌(microbacterium foliorum)、氧化微杆菌(microbacterium oxydans)，或叶球形微杆菌(microbacterim phyllosphaerae)，但不限于此。、64.在用于阿洛酮糖生产的干燥珠的制备方法中，优选不进行冷冻过程，冷冻过程会导致在冷冻过程中细胞活性降低，以及当大量进行冷冻干燥过程时，生产成本迅速上升的问题。具体地，干燥珠使用空气或风进行干燥，可以通过使用温度为20℃至70℃、例如40℃至50℃的空气使空气循环数小时的方法进行干燥。65.具体地，在珠形成步骤中，单独进行用二价金属离子处理珠的步骤，或者可以在用二价金属离子处理珠的步骤之后进行用溶胀抑制剂涂覆珠的步骤。66.在用二价金属处理的步骤中，可以用选自mn2+、zn2+、co2+、mg2+、ni2+、fe2+和cu2+的一种或多种二价金属离子处理珠。具体地，可以通过将含有酶或细胞的珠承载在含有二价金属离子的水溶液或含有果糖的底物溶液上，或将含有二价金属离子的水溶液或含果糖的底物溶液倾倒到装满珠的柱子上来进行该步骤。含有二价金属离子的水溶液或含果糖的底物溶液中所含的二价金属离子的含量可以为1mm至15mm，但为了使珠具有充分的压缩效果，优选用5mm至10mm进行处理。67.用溶胀抑制剂涂覆珠的步骤可以通过将珠浸入或添加到含有溶胀抑制剂的溶液中来进行。溶胀抑制剂可以为选自壳聚糖、甲壳质、聚乙二醇(peg)、聚乙烯亚胺(pei)、壳寡糖和聚赖氨酸中的至少一种。当壳寡糖用作溶胀抑制剂时，重均分子量可以在700至9,000的范围内，但没有特别限制。涂覆步骤中溶胀抑制剂溶液的浓度可为0.1重量％至10重量％，优选0.1重量％至5重量％，但不限于此。68.本发明的另一个实施方案提供了一种包含含有微生物细胞和载体的干燥珠的用于生产阿洛酮糖的组合物，或一种使用干燥珠使用含果糖底物生产阿洛酮糖的方法。69.优选地，根据本发明的用于生产阿洛酮糖的方法可以通过用含有酶或细菌细胞的珠填充柱并使含果糖底物溶液流过来进行，并且本领域技术人员根据所使用的酶、细胞或固定化载体可以容易地选择并进行适当的操作。70.在本发明的一个具体实施方案中，当将一定浓度的果糖溶液供应至填充有含有阿洛酮糖差向异构酶的细胞的填充柱时，通过固定化的细胞进行差向异构化反应，并且果糖转化为阿洛酮糖。转化的阿洛酮糖经分离柱分离纯化后可作为纯阿洛酮糖使用。71.本文所用的固定化反应器是指通过固定在载体上的细胞或酶，或者通过填充有固定在载体上的细胞或酶的柱，发生产生阿洛酮糖的反应的反应器。即，固定化是指提供生物活性的材料，在这种情况下是阿洛酮糖差向异构酶或葡萄糖差向异构酶，或包含它们的细胞，被固定在载体上。72.本文使用的操作稳定性是指生物反应器可以在相对于初始活性保持适当水平的生产率的同时操作，以连续生产目标产物如阿洛酮糖，通常表示为操作周期。当使用根据本发明的压缩比生产阿洛酮糖时，例如，从40至50白利糖度的浓度的含果糖底物获得的反应物的阿洛酮糖含量可以以20重量％以上的量持续15天以上提供。此外，填充有干燥珠的柱以具有由在50℃的温度条件下供应的底物获得的反应产物的90至100的最大转化率的流速供应，并且在以恒定流速供应至阿洛酮糖含量降低至20重量％以下的点的条件下可以确保操作稳定性。73.在生产阿洛酮糖的方法中，基于反应物的总量，用作有效阿洛酮糖生产的底物的果糖的浓度可以是40％至75％(重量/体积(w/v))，例如50％至75％(w/v)。当果糖的浓度低于上述范围时，经济效率降低，而当浓度高于上述范围时，果糖不能很好地溶解。因此，果糖的浓度优选在上述范围内。果糖可以缓冲溶液或溶于水(例如蒸馏水)中的溶液的形式使用。74.在制备阿洛酮糖的方法中，可以在ph 6至9.5，例如ph 7至9、ph7至8或ph 8至9的条件下进行反应。此外，可以在30℃以上，例如40℃以上的温度条件下进行反应。75.当温度升高到80℃以上时，可能会出现作为底物的果糖的褐变现象。因此，可以在40℃至80℃，例如50℃至75℃、60℃至75℃或68℃至75℃的条件下进行反应。76.此外，反应时间越长，阿洛酮糖转化率越高。例如，可以考虑工业和经济方面来适当调整反应时间，并且可以选择将果糖转化为阿洛酮糖的效率最大化的条件。77.通过本发明的方法从果糖获得的阿洛酮糖可以通过常规方法纯化，并且这种确定在本领域技术人员的普通技术范围内。例如，可以通过选自离心、过滤、结晶、离子交换色谱及其组合的一种或多种方法进行纯化。78.有益效果79.与干燥前的珠相比，根据本发明的实施方案的干燥珠、复原珠和使用干燥珠和复原珠的阿洛酮糖生产在体积和重量上减少，从而易于储存和分配。它们增加了每单位体积的柱填充量，因此增加了阿洛酮糖产生量并且储存稳定性高。从而解决了常规储存过程中因微生物污染导致珠结合力减弱和分解，导致细胞外流到珠外，转化活性降低的问题，还能够长期稳定地提供高的阿洛酮糖生产量。附图说明80.图1示出了干燥前的珠和干燥后获得的珠的照片，其中固定化珠根据本发明的一个实施方案被干燥。81.图2为表示实施例1-3中干燥前得到的珠和实施例2中得到的干燥珠的水分蒸发量的图。82.图3示出了根据本发明的一个实施方案的干燥珠复原前和复原后获得的复原珠的照片。83.图4示出了根据本发明的一个实施方案的固定有氧化微杆菌和叶球形微杆菌细胞的干燥珠的照片、立体显微照片(放大倍数×40)和珠的直径。84.图5是固定有表达clostridium syndance的阿洛酮糖差向异构酶的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutaricum)重组菌株的细胞的干燥珠的照片、立体显微照片(放大倍数×40)和珠的直径。85.图6为示出通过使用根据本发明的一个实施方案的细胞固定化珠进行阿洛酮糖转化反应的珠的生产力提高率和相对转化率的图。具体实施方式86.将参考以下实施例更详细地描述本发明，但这些实施例并非旨在限制本发明的范围。87.实施例1:细胞固定化珠的制备88.1-1：微生物细胞的制备89.对于韩国专利第10-1944103号中所描述的叶状微杆菌的高浓度培养，根据下表1的组成制备每种种子培养基，然后在121℃下进行高温高压蒸汽灭菌15分钟以上以制备每种种子培养基。考虑到价格竞争力和生产率，如下表2所示选择每种种子培养基和主培养基(初始培养基)的组成，并用阿洛酮糖诱导d-阿洛酮糖3-差向异构酶(dpease)以增加dpease活性。90.[表1][0091][0092][0093]为了制备种子，将储存在-70℃的叶状微杆菌亲本菌株接种到3ml种子培养基中。一级种子培养在30℃温度下进行24小时，然后接种在100ml种子培养基中，二级种子培养在30℃温度下进行24小时。最后将二级种子培养基接种到使用5l发酵罐的2l主培养生产培养基中，并在30℃的培养温度下进行培养。使用0.2μm的空气过滤器在无菌状态下使用供应到发酵罐的空气，并且按照下表2的发酵罐培养条件进行培养。在下表2中，供气单位为vvm(每分钟每液体体积的空气体积，l/分钟)。[0094]每个ph稳态(ph-stat)的供应方法将碳源输入一次时的培养基(发酵罐)中碳源浓度的增加量(g/l)定义为f值，调整碳源的输入时间，使f值为0.25。对于附加培养基的组成，即补料(feeding)溶液，使用了400g/l的阿洛酮糖、40g/l的酵母提取物和1mm的mncl2。根据ph稳态的基本原理，当ph超过6.95时，加入糖使ph降低，用9％氨水和ph在6.8-6.95范围内的糖溶液调节ph。结果，如上表所示，细胞浓度和酶活性增加。[0095][表2][0096]培养步骤一级种子培养二级种子培养主培养培养设备试管烧瓶5l发酵罐培养体积0.003l0.1l2l接种量3％(v/v)6％(v/v)5％(v/v)培养时间24小时24小时30-40小时rpm200200500-800空气(vvm)‑‑2[0097]1-2：细胞固定化珠的制备[0098]将培养的细胞以固定在海藻酸上的细胞的形式制备成珠，以具有能够长期使用的特性。具体而言，通过以下方法进行。将培养完成的细胞离心回收细胞，用蒸馏水混合调节细胞浓度至4％(w/w)，然后与溶解在水中的4％(w/w)海藻酸以1：1的比例混合。由此，制备具有2％(w/w)最终细胞浓度和2％(w/w)海藻酸的混合溶液。[0099]使混合溶液移至与缓慢运行的泵相连的硅胶管中，混合溶液通过连接在管端的注射器(内径0.20mm至0.30mm)逐滴落下，与100mm氯化钙溶液混合并搅拌溶液以形成固化的球形或椭圆形珠(直径1.8mm至2.2mm)。[0100]制备好的珠可以用于下一个工序，但为了进一步增加内部海藻酸结合力，将制备好的珠在冷藏保存4-6小时的同时搅拌，并用新配制的100mm氯化钙溶液替换，更进一步在5℃至15℃以下的低温下固化约6小时。由此，制备并使用其中收集了最终细胞的固定化珠。[0101]1-3：细胞固定化珠的涂覆处理[0102]含有制备细胞的海藻酸珠通过网(mesh)筛去除表面上的水。加入2倍珠体积的水后，搅拌10分钟。该过程重复3次以去除剩余的氯化钙溶液。[0103]将已除去氯化钙的细胞固定化珠加入到两倍珠体积的0.5％(w/v)壳寡糖水溶液中，将混合物在室温下搅拌30分钟，壳寡糖被涂覆在海藻酸珠上。经壳寡糖涂覆的珠通过网筛除去表面上的水，然后用两倍珠体积的水洗涤珠，并通过筛子去除剩余的壳寡糖。[0104]实施例2：细胞固定化珠的干燥[0105]作为具体的说明例，将实施例1中制备、涂覆和洗涤的珠平放在盘子上，以便在干燥烘箱中很好地进行干燥，然后通过在45℃(±5℃)下热空气循环的方法干燥几个小时。继续干燥直到珠中所含的水降至约14％以下的水平。图1示出了干燥前的珠和干燥后获得的珠的照片，其中固定化珠根据本发明的一个实施方案被干燥。[0106]干燥珠与干燥前的珠一起分别测量体积、重量、珠直径、含水量和珠堆积密度。具体测量方法和结果如下。珠测量结果如下表3所示，表3中的相对数值是指基于干燥前珠的数值100，干燥后珠的体积、重量、直径、水分含量和堆积密度的相对测量值。[0107](1)珠体积变化的测量(反应柱填充率)[0108]为了通过特定方法测量干燥前后珠的体积减少的变化，如图1的照片所示，在量筒中称取100ml体积的实施例1-3的已除去水分的珠，然后测量热风干燥后的体积时，量筒中示出10ml的体积，表明体积相对于干燥前的100体积减少了10％左右。[0109](2)珠的重量变化的测量[0110]就干燥前和干燥后的重量变化而言，100g的从溶液中回收所述制得的珠的干燥前的珠在热风干燥后重量变化为7.5g，相对于干燥前重量减少约7.5％。[0111](3)珠的堆积密度的测量[0112]为了测量珠的堆积密度，当填充有100ml体积的干燥前除去水分的珠时，其重量为62.2g，显示出0.62kg/l的数值的堆积密度，通过相同的方法填充100ml体积的干燥珠时，其重量为69.9g，显示出0.7kg/l的堆积密度。[0113](4)珠的直径分布的测量[0114]对于热风干燥前后所得珠的直径的测量，当用测量仪器(mitutoyo m530-123)分别测量20颗珠的长度时，干燥前珠的平均直径为2.08mm，但干燥后珠平均直径为1.05mm。将干燥前的珠平均直径设为100％时，干燥后的珠平均直径相对于干燥前为50.5％，表明减少了49.5％。[0115](5)珠的含水量的测量[0116]对于含水量的测量，使用测量设备(a&d mx-50moisture analyzer)在125℃的红外线照射30分钟条件下，测量10g干燥前的珠和10g干燥后的珠的重量变化，干燥前的珠的含水量为95.9％(w/w)，但干燥后的珠的含水量为9.93％(w/w)，得到基于干燥前珠的含水量100，干燥后的珠的含水量为约10％。[0117][表3][0118][0119]实施例3：干燥珠的复原[0120]3-1：珠的复原[0121]实施例2中获得的干燥珠在用于将果糖转化为阿洛酮糖的反应之前需要将它们复原回其原始形式的步骤。该复原方法通过将干燥珠加入50白利糖度(％)结晶果糖或水(一种含有果糖的反应底物)中，可以将其复原回原始形状。[0122]具体而言，将复原前的干燥珠装入反应柱，然后将用于生产阿洛酮糖的转化反应底物(50白利糖度(％)的结晶果糖调节至50℃的温度和6.5至7.2的ph)在50℃的反应温度下以0.2至0.5sv的进料流速进料或循环。通过这种方法使干燥珠水合并复原回原始形状。干燥珠复原前的状态照片和复原后得到的复原珠的状态照片如图3所示。[0123]3-2：复原珠的特点分析[0124]如图3复原前后的珠照片所示，复原后的珠形状从复原前的干燥珠形状恢复为与干燥前的珠相似的球形或椭圆形珠。由此，复原珠填充到反应柱后，与底物的反应可以顺利进行，珠被均匀地填充在反应柱中，从而成为不发生反应底物在特定方向流动的通道作用(channeling)问题的适合于反应的珠状。[0125]如表4所示，对于制得的珠的分析，当用测量仪器(mitutoyo m530-123)分别测量20颗珠的长度时，复原前珠的平均直径为1.05mm，但复原后珠的平均直径为1.43mm。将干燥前的珠平均直径设为100％时，复原珠的平均直径相对于干燥前的珠为约68.8％的水平，表明减少率为31.2％。[0126]在初始相同的珠体积为100ml时，将经过干燥和水合复原步骤的珠和未经过干燥步骤的干燥前的珠分别填充到反应柱中时，干燥后的复原珠的反应柱填充率(体积％)填充为52ml，确认了复原珠的反应柱填充率(体积％)为52％。[0127][表4][0128]项目干燥前(湿珠)干燥后(干燥珠)复原后体积变化(ml)100-52珠平均直径(mm)2.081.051.43反应柱填充率(体积％)100-52[0129]3-3：复原珠的浸泡处理[0130]为了使实施例3-2中完成复原的干燥珠能够用于转化反应，加入体积为2倍珠体积的含果糖底物(ph 6.5-7.5)，然后将混合物搅拌10分钟。该过程重复两次，并用50白利糖度(％)结晶果糖溶液替换珠的内部。[0131]去除珠表面的果糖溶液后，加入至少两倍于珠体积的用锰离子处理的含果糖底物(含有50白利糖度的结晶果糖的10mm mncl2·4h2o)用于珠的充分反应，然后将混合物在50℃恒温水浴中缓慢搅拌30分钟至60分钟，并用锰离子处理珠。然后，通过筛子去除珠表面上的含果糖底物，以至少两倍于珠体积的量添加用于阿洛酮糖转化的含果糖底物(含有50白利糖度的结晶果糖的1mm mncl2·4h2o)用于充分洗涤珠，将混合物搅拌10分钟，并用新的底物替换。通过这样的过程，将珠反复洗涤至少两次以上以最终制备用于转化反应的珠。[0132]实施例4：干燥珠的制备(2)[0133]4-1：细胞热处理[0134]在实施例1-1中完成培养的微杆菌属菌株在培养状态下进行热处理以提高细胞活性，从而进行提高细胞活性的过程。具体而言，在发酵罐中完成培养后，将发酵罐的温度从30℃逐渐升高到60℃，同时以150rpm搅拌细胞浓度为18.5(od600nm)的培养液，然后保持在60℃下1小时以进行细胞热处理。接着，通过从60℃冷却至30℃的工序，得到热处理后的细胞培养液。[0135]4-2：热处理后的细胞特性分析[0136]为了测量细胞热处理前后的转化活性(u/g_细胞)值，将包括最终浓度为1mm的mncl2·4h2o的35白利糖度的结晶果糖溶液，溶解在50mm pipes缓冲液(ph 7.0)中，并且将包括最终干细胞浓度为5mg/ml的反应溶液调整到1ml的体积。然后，将含有细胞的反应底物溶液在70℃反应1小时，然后离心回收上清液，然后进行高效液相色谱(hplc)分析。[0137]使用配备有aminex hpx-87c柱(bio-rad)的hplc(agilent，美国)的rid(折射率检测器(refractive index detector)，agilent 1260rid)进行液相色谱分析。在以水为流动相溶剂、温度为80℃，并且流速为0.6ml/分钟的条件下，通过由果糖转化反应的阿洛酮糖的转化浓度来分析细胞活性。此外，将用于测量细胞活性的5mg/ml的干细胞重量稀释，以使培养液的吸光度变为od600nm 12.5。接着回收1ml，离心除去上清液，再乘以剩余细胞的干细胞转化系数0.4，干细胞浓度变为5mg。将1ml用于转化反应的反应底物加入到5mg的去除了上清液的干细胞浓度中，最终将最终干细胞浓度调节至5mg/ml并用于反应。[0138]细胞热处理前后细胞浓度变化和细胞活性的比较结果如下表5所示。[0139][表5][0140][0141]如表5的结果所示，热处理后的细胞浓度比热处理前的细胞浓度稍低，显示与热处理前相比，细胞浓度降低至约88％。这被认为是在60℃的细胞热处理过程中，部分发生高温引起的细胞的裂解，从而引起细胞浓度的降低。[0142]此外，假设热处理前的细胞阿洛酮糖转化活性为100％，通过对与热处理前相同数量的细胞进行热处理来测量转化活性，结果是与热处理前相比增加了115％。这被认为是因为当细胞在60℃下进行热处理时，由于高温导致细胞的细胞壁裂解，形成了允许底物更顺利地转移到细胞质中的多孔细胞壁，从而提高了细胞的阿洛酮糖转化活性。[0143]由以上结果证实，通过对细胞进行热处理，细胞浓度的降低和细胞转化活性的提高实际上使细胞的投入量增加了约12％，在制备细胞固定化海藻酸珠的过程中，细胞活性增加了约15％，最终使得在珠生产时相对于热处理前的生产率增加约25％。[0144]4-3：细胞固定化珠的制备[0145]将培养的细胞制备成细胞固定在海藻酸上的形式的珠，以具有可长期使用的特性。[0146]具体而言，将热处理过的培养基离心回收细胞，然后将其与蒸馏水混合以将细胞浓度调节至4％(w/w)。将溶于水的4％(w/w)海藻酸和回收的细胞以1：1的重量比混合，以制备具有2％(w/w)最终细胞浓度和2％(w/w)海藻酸的混合溶液。[0147]与实施例1-2中使用未热处理细胞的混合溶液相比，在使用热处理后的细胞的情况下，混合溶液倾向于具有较低的粘度。使用布氏(brookfield)粘度计在25℃的温度下测量使用本实施例中得到的热处理过的细胞的海藻酸混合物的粘度和使用实施例1-2中得到的未热处理细胞的海藻酸混合物的粘度。粘度测量结果是，实施例1-2的海藻酸混合物的粘度为5580cps，并且本实施例得到的海藻酸混合物的粘度为4900cps，是热处理前的87.8％，降低了约12％的水平。这被认为是细胞中所含的多糖通过热处理被部分去除，因此粘度降低。[0148]使用热处理过的细胞和未经热处理的细胞的海藻酸混合物的粘度(cps)示于下表6中。[0149][表6][0150]类别粘度(cps)变化率(％)实施例1-2的海藻酸混合溶液5,580100％实施例4-2的海藻酸混合溶液4,90087.8％[0151]干燥珠与干燥前的珠一起分别测量体积、重量、珠直径、含水量和珠堆积密度。具体测量方法与实施例2相同，结果见下表7。表7所示的相对数值是指基于干燥前珠的数值100，干燥后珠的体积、重量、直径、水分含量和堆积密度的相对测量值。[0152][表7][0153][0154]4-4：干燥珠的复原[0155]这与实施例3-1的干燥珠复原方法和实施例3-3的浸泡方法相同。复原实施例4-2中得到的热处理后的细胞固定化的珠，将复原后的干燥珠用含有果糖的底物(ph 6.5-7.5)浸泡，使其可用于转化反应。[0156]如表8所示，对于制得的珠的分析，当用测量仪器(mitutoyo m530-123)分别测量20颗珠的长度时，复原前珠的平均直径为1.02mm，但复原后珠的直径为1.41mm。将干燥前的珠平均直径设为100％以计算相对尺寸时，干燥后珠的平均直径为52.7％，并且复原珠的平均直径为70.1％。[0157]在初始相同的珠体积为100ml时，将经过干燥和水合复原步骤的珠和未经过干燥步骤的干燥前的珠分别填充到反应柱中时，干燥后的复原珠填充体积为52ml，确认珠体积恢复率为48％。[0158][表8][0159]项目干燥前(湿珠)干燥后(干燥珠)复原后体积变化(ml)100-48珠平均直径(mm)2.011.021.41反应柱填充率(体积％)100％-48％[0160]实施例5：干燥珠的制备(3)[0161]5-1：细胞固定化珠和干燥珠的制备[0162]为了确保氧化微杆菌和叶球形微杆菌作为除叶状微杆菌之外的属于同一属的其他种，以与实施例1-1相同的方式培养细胞，并将经培养的细胞离心以回收细胞。氧化微杆菌和叶球形微杆菌细胞与韩国专利第10-1944104号中描述的相同。[0163]将经培养的细胞离心以回收细胞，然后按照与实施例1-2的制备细胞固定化珠的方法和实施例1-3的细胞固定化珠的涂覆方法相同的方式处理回收的细胞以制备细胞固定形式的珠。珠的干燥以与实施例2中相同的方式进行。[0164]5-2：干燥的细胞固定化珠的复原[0165]将10g含有干燥的氧化微杆菌(microbacterium oxydans)或叶球形微杆菌(microbacterim phyllosphaerae)细胞的固定化珠置于烧杯中，然后在室温下加入200ml水，然后将混合物以100rpm的速度搅拌30分钟以进行复原过程。图4中逐步示出了用蒸馏水水合以复原干燥前的珠形状的过程。对于每种菌株制得的干燥前的珠、干燥后的珠和复原的干燥珠，分别选择20颗珠，并分别用测量装置(mitutoyo m530-123)测量珠长度，结果如下表9所示。可以确认，针对每种菌株制备的珠在干燥前后的直径显示相似的结果，并且通过该复原方法可以在相同的直径水平上进行复原。[0166]此外，如图4复原珠的照片所示，可见与叶状微杆菌(microbacterium foliorum)细胞类似，可以复原成接近球形的形状。[0167][表9][0168][0169]实施例6：干燥珠的制备(4)[0170]6-1：细胞的制备[0171]将源自闪烁梭菌(clostridium scindens)atcc 35704的阿洛酮糖差向异构酶编码基因(dpe基因；基因库：eds06411.1)合成为针对大肠杆菌优化的修饰形式的多核苷酸(命名为cdpe)，并使用限制酶noti和xbai(neb)将多核苷酸插入至表达载体pces208的相同的限制酶位点(j.microbiol.biotechnol.,18:639-647,2008)，以制备重组载体pces208/阿洛酮糖差向异构酶(pces_sodcdpe)。将上述制备的重组载体(pces_sodcdpe)质粒通过电穿孔转化谷氨酸棒杆菌，制备表达cdpe酶的谷氨酸棒杆菌重组菌株。表达cdpe酶的谷氨酸棒杆菌重组菌株的制备方法参见韩国专利第10-1607633号所描述的制备方法。[0172]6-2：细胞固定化珠的制备[0173]培养含有实施例6-1中得到的生产阿洛酮糖差向异构酶的重组菌株的菌株，然后从培养液中离心以回收细胞。将回收的细胞按照与实施例1-2的细胞固定化珠的制备方法和实施例1-3的细胞固定化珠的涂覆方法相同的方式处理，以制备细胞固定化形式的珠，并且以与实施例2相同的方式进行珠的干燥。[0174]6-3：干燥珠的复原[0175]将10g实施例6-2制备的干燥珠放入烧杯中，在室温下加入200ml水，然后将混合物以100rpm的速度搅拌30分钟以进行复原步骤，并静置6小时。干燥珠和水化6小时得到的复原珠的照片、立体显微照片(放大倍数×40)和珠的直径范围如图5所示。通过干燥珠的水合复原的复原珠的平均直径为1.05mm。[0176]如图5的照片所示，谷氨酸棒杆菌的细胞固定化珠即使在水合6小时后也不能复原回原来的珠状，并且即使随着时间的流逝也看不到进一步的变化。[0177]如下表10所示，当用测量仪器(mitutoyo m530-123)分别测量20颗珠的长度时，复原前的干燥珠的平均直径为0.93mm，但复原后的珠直径为1.05mm。当将干燥前的平均珠直径设为100％时，复原珠的平均直径相对于干燥前的珠为约54％的水平，显示出46％的减少率。[0178]在初始相同的珠体积为100ml时，将经过干燥和水合复原步骤的珠和未经过干燥步骤的干燥前的珠分别填充到反应柱中时，干燥后的复原珠填充体积为16ml，确认珠体积恢复率为16％。结果是，确认了在图5的照片的复原步骤中，谷氨酸棒杆菌的细胞固定化的干燥珠的恢复率低，因此珠的形状无法复原到干燥前的形状。[0179][表10][0180]项目干燥前(湿珠)干燥后(干燥珠)复原后体积变化(ml)1009.116ml珠平均直径(mm)1.920.931.05反应柱填充率(体积％)100％-16％[0181]实施例7：使用固定化生物催化剂的转化反应[0182]7-1：珠转化活性的评价[0183]为了比较实施例2中固定有细胞的干燥珠和实施例3中固定有热处理后的细胞的干燥珠的阿洛酮糖转化活性，在反应柱中进行了生产率比较实验。制备了如根据实施例1制得的涂覆珠，未进行细胞热处理和干燥工序的珠(珠1)、根据实施例2制得的未进行热处理但进行了干燥工序的珠(珠2)、将根据实施例4-2制得的热处理过的细胞固定在其上且未进行干燥工序的珠(珠3)，以及根据实施例4-3制得的热处理过的细胞固定在其上的干燥珠(珠4)。[0184]将珠1原样填充到反应柱中，通过以与实施例3中基本相同的方式对珠2、珠3和珠4进行复原处理并将珠2、珠3和珠4填充到反应柱中。使调节到50℃的温度和6.5至7.2的ph值的含有50白利糖度(重量％)果糖的底物，通过填充有珠的反应柱进料。在保持25％以上的阿洛酮糖转化率的流速下进行阿洛酮糖转化活性和产率实验，并且实验结果如下表11所示。在生产率评价中，在填充相同的体积的反应柱的珠填充体积中，将根据相对于珠1的流速增加的流速的生产率提高率与从初始反应底物的果糖的阿洛酮糖的转化率为25％以上的底物流速进行比较。即，使用珠1至珠4，反应柱的珠填充体积(ml)相同，并且在阿洛酮糖转化率维持在25％以上的条件下进行反应，因此通过底物液体的流速(ml/分钟)评价了生产率。[0185]如表11所示，将未进行干燥处理的珠(珠1)的生产率设为100％，将珠2至珠4的珠以与珠1相同的体积填充到反应柱中。根据反应条件进料含果糖底物。此时，获得了珠2至珠4的结果。[0186]如表11所示，虽然反应柱的珠填充体积(ml)对于所有珠1至珠4都相同，但证实了由于通过细胞的干燥和/或热处理提高了阿洛酮糖转化活性，使阿洛酮糖转化率保持在25％以上的流速按珠1、珠3、珠2和珠4的顺序增加。也就是说，在反应柱的珠填充体积(ml)相同的条件下，阿洛酮糖转化率保持在25％以上的高流速意味着填充在反应柱中的珠的阿洛酮糖转化率较高。因此，确认了未进行细胞热处理和干燥工序的珠1表现出最低的阿洛酮糖转化活性，未进行细胞热处理但进行了干燥工序的珠2的阿洛酮糖转化活性比珠1高，固定有热处理过的细胞的干燥珠4具有最高的转化活性。[0187][表11][0188]珠底物进料流速(ml/分钟)生产率提高率(％)珠10.13100珠20.24185珠30.19146珠40.35270[0189]根据表11中的结果，查看基于未经历干燥工序和细胞热处理工序的珠1的生产率为100设置的相对生产率值，珠3和珠4的生产率分别为146％和270％，呈现显著增长。这种提高生产率的因素是通过热处理去除了细胞所具有的多糖等，显示出的细胞中所含的阿洛酮糖转化酶与细胞外含果糖底物的反应性增加，以及热处理使得粘度的降低，对海藻酸珠的含果糖底物的流动性显示出更平滑的效果，从而提高生产率。[0190]此外，通过干燥使用热处理过的细胞制得的海藻酸珠而制得的珠4在与未干燥珠(珠3)相同的填充体积下将填充率提高了约200％，最后将珠4填充在相对于珠1相同的体积，在相同的反应条件下，珠4的生产率提高了270％。[0191]7-2：珠的反应稳定性的分析[0192]如实施例7-1中所述，固定有根据实施例4-3制得的热处理过的细胞的干燥珠(珠4)和根据实施例1生产的作为涂覆珠的未经过细胞热处理和干燥工序的珠(珠1)，按照与实施例7-1相同的方式处理并填充到反应柱中。将温度调整为50℃，ph为6.5-7.2的0白利糖度(％)结晶果糖溶液进料通过填充有珠的反应柱，并且通过设置从果糖到阿洛酮糖的转化率保持在25％以上的初始流速来进行反应。将此时的值设为100％时，各反应日的反应液相对于初始阿洛酮糖转化率的减少率值如图6所示。[0193]根据与本实施例的图6的相对于初始阿洛酮糖转化率的减少率的结果，当珠1的100％的初始转化率经过约35天时，相对于初始转化率的减少达到约55％，而在100％的初始转化率下，经过约35天，经过热处理和干燥的珠4的稳定性是不变的。可以看出，相对于初始转化率的减少率保持在约70％以上。因此，证实热处理后干燥的珠的稳定性高于珠1的稳定性。[0194]这是因为在珠干燥处理后复原时与珠1的压缩率相比，珠的压缩率变得更高，根据50℃的反应温度和加入na+离子调节底物的ph使珠结合力降低的效果，通过赋予相对于通过常规方法制得的珠1相对高的结合力，在珠稳定性方面获得了更有利的结果。[0195]实施例8：干燥珠的储存稳定性[0196]将使用实施例4中制得的热处理过的细胞的干燥珠储存在25℃、30℃、37℃、45℃和60℃的储存温度下，以根据储存的周数评估阿洛酮糖珠的转化活性的减少率。[0197]具体来说，根据珠的储存周数取一些珠。在圆瓶中将5ml反应底物(ph调至6.5-7.25的50白利糖度结晶果糖溶液)的温度保持在60℃，加入0.5g干燥珠，反应2小时，得到阿洛酮糖转化率。储存的干燥珠的阿洛酮糖转化活性的减少率与实施例7-1以同样的方式进行。根据储存的周数测量和确定阿洛酮糖转化率。[0198]根据珠的储存期和储存温度，珠的阿洛酮糖转化活性的减少率如下表12所示。[0199][表12][0200][0201]如表12所示，查看相对于刚制备干燥珠后的转化率根据储存周数的减少率的结果，证实了相对活性随着储存温度的升高而略微降低，但在37℃或更低的温度下，阿洛酮糖转化活性38周保持在80％以上，特别是在60℃的高温下，酶的稳定性甚至38周保持在75％以上。









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