超长效胰岛素-Fc融合蛋白及其使用方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术超长效胰岛素-fc融合蛋白及其使用方法1.优先权及相关申请2.本技术与2019年12月19日提交的美国临时专利申请序列号62/950,803和2020年3月12日提交的序列号为美国临时专利申请序列号62/988,441相关，并要求其优先权。上述专利申请中的每一个的内容在此通过援引整体并入本文。技术领域3.本技术涉及胰岛素-fc融合蛋白的组合物及其用于治疗人糖尿病的用途。背景技术：4.以下对本技术的背景的描述只是为了辅助理解本技术而提供，并不认可描述或构成本技术的现有技术。5.糖尿病是一种以胰岛素缺乏和/或胰岛素无效使用为特征的慢性病症。胰岛素绝对缺乏的糖尿病患者被归类为患有1型或胰岛素依赖型糖尿病(iddm)。认为1型糖尿病患者具有遗传预先倾向性以及胰腺中产生胰岛素的β细胞的免疫性破坏。相比之下，仍然可以产生一些胰岛素但由于胰岛素抵抗或其他功能障碍而相对缺乏的糖尿病患者被归类为患有2型或非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)。2型糖尿病与遗传预先倾向性、肥胖及某些药物治疗有关。女性在怀孕期间也可以产生暂时的胰岛素抵抗，即所谓的妊娠糖尿病。一些成年人被诊断为患有成人隐匿性自身免疫性糖尿病(lada)，其为一种缓慢进展形式的自身免疫性糖尿病。与1型糖尿病相似，在lada中，胰腺中产生胰岛素的β细胞被破坏，但速度较慢。一小部分人被诊断为患有青少年发病的成人型糖尿病(mody)，其指由常染色体显性基因突变破坏胰岛素产生而引起的若干种遗传性糖尿病中的任何一种。6.当1型糖尿病、lada或mody患者的胰腺不能产生足够的胰岛素时，患者通常会表现出以高血糖为特征的非典型血糖表型。在这些情况下，采用长期胰岛素注射疗法对患者进行治疗。在2型糖尿病和妊娠糖尿病中，患者也经常表现出高血糖症，因为他们无法适当地利用胰腺产生的胰岛素。在这些情况下，可以用口服药物对患者进行治疗，改变或者不改变饮食和运动；然而，许多受试者最终发展成类似于1型糖尿病的病症(胰腺炎性疾病，β细胞量显著减少)并变得依赖外源胰岛素。如果未及时治疗，糖尿病可导致体重减轻、食欲不振、呕吐、脱水、运动功能问题、昏迷甚至死亡。7.美国有约3000万人，即9.4％的人口，患有糖尿病。1型糖尿病占所有确诊糖尿病病例的约5％，影响约150万人。现行糖尿病疗法包括多种短效胰岛素产品(例如(eli lilly,indianapolis,in)和(novo nordisk,denmark))和长效胰岛素产品(例如(sanofi,paris,france))和(novo nordisk,denmark))，每天经由皮下注射多次或者通过可穿戴的皮下输注泵给药。频繁注射的负担导致缺乏治疗方案依从性和剂量不足，从而导致长期健康结果欠佳。事实上，据报道，每年有超过700万例美国成年人因与糖尿病相关的心血管事件、截肢和酮酸中毒而出院。此外，据报道，每年有超过1400万例美国成年人因与糖尿病相关的低血糖和高血糖危象等病患而急诊就诊。在被诊断为糖尿病的20岁或以上的美国成年人中，肾病的估计患病率超过36％。糖尿病是美国第七大致死原因，估计每年的总支出超过2450亿美元。因此，需要有成本效益且负担较轻的治疗选择用于该疾病。技术实现要素：8.一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含胰岛素多肽和fc片段，其中胰岛素多肽和fc片段通过接头连接，其中该融合蛋白包含如下序列：9.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggaggggaggggagggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:87)。10.在一些实施方式中，本公开提供了包含胰岛素多肽和fc片段的融合蛋白，其中胰岛素多肽和fc片段通过接头连接，其中fc片段是人源的并且包含如下序列：11.dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyx1styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:77)其中x1是s、d、a或r，并且其中胰岛素多肽由经由c链与胰岛素a链类似物连接的胰岛素b链类似物组成，其中从胰岛素多肽的胰岛素b链类似物的n端起的第16个氨基酸(即，b16)是丙氨酸(即，b16a)。12.在一些实施方式中，胰岛素多肽包含如下序列：fvnqhlcgsx1lvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqccx2stcsldqlenyc(seq id no:9)，其中x1不是d并且x2不是h。在一些实施方式中，胰岛素多肽包含如下序列：13.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenyc(seq id no:10)。14.在一些构型中，接头包含如下序列：gggggqggggqggggqggggg(seq id no:13)。在一些构型中，接头包含如下序列：gggggaggggaggggaggggg(seq id no:67)。在一些构型中，接头包含序列ggggagggg(seq id no:11)。15.在一些实施方式中，该融合蛋白包含如下序列：16.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycggggaggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:89)。17.在一些实施方式中，该融合蛋白包含如下序列：18.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:78)。19.在一些实施方式中，该融合蛋白包含如下序列：20.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqydstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:80)。21.在一些实施方式中，该融合蛋白包含如下序列：22.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:82)。23.在一些实施方式中，该融合蛋白包含如下序列：24.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyrstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:84)。25.在一些实施方式中，该融合蛋白沿如下从n端到c端的方向包含结构域：(n端)-胰岛素多肽-接头-fc片段-(c端)。26.在一些实施方式中，该融合蛋白是同二聚体。在一些实施例中，该融合蛋白的同二聚体百分比大于90％。在一些实施例中，该融合蛋白使用hek293细胞或cho细胞制备，使用蛋白质a珠或蛋白质a柱纯化后得到的同二聚体效价大于150mg/l。在一些实施方式中，该融合蛋白的胰岛素受体ic50小于或等于5000nm。在一些实施方式中，该融合蛋白的胰岛素受体ic50小于或等于2400nm。27.在一些实施方式中，该融合蛋白的人fcrn受体ec50小于或等于1000ng/ml。在一些实施例中，在该融合蛋白的3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri的浓度下人fc(γ)ri受体测定od450比率小于或等于0.50。在一些实施方式中，在1000ng/ml的生物素化c1q浓度下人c1q测定od450比率小于或等于0.35。在一些实施方式中，将该融合蛋白配制成药物组合物。在一些实施例中，该融合蛋白在药物组合物中的浓度为约3mg/ml或更高。在一些实施方式中，该药物组合物适于皮下给药。28.在一些实施方式中，可以将生理有效量的该融合蛋白或其药物组合物给药与患者作为降低患者血糖水平的方法。在一些实施例中，患者被诊断为患有糖尿病。在一些实施方式中，该融合蛋白皮下给药。该融合蛋白可以每天、每周两次或每周一次给药与患者。在一些实施例中，该融合蛋白以0.025至0.500mg/kg/周之间的剂量每周一次给药与患者。29.在一些实施方式中，可以对细胞进行改造以表达该融合蛋白。可以用编码该融合蛋白的核酸转染细胞。在一些实施例中，所述细胞是hek293细胞或cho细胞。30.在一些实施方式中，编码seq id no:87的融合蛋白的核酸(cdna)包含如下核酸序列：31.atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtgcaggaggcggtggagccggtggaggtggggctggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacagcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:88)。32.在一些实施方式中，编码seq id no:89的融合蛋白的核酸(cdna)包含如下核酸序列：33.atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtgccggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacagcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:90)。34.在一些实施方式中，编码seq id no:78的融合蛋白的核酸(cdna)包含如下核酸序列：35.atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggno:83)。40.在一些实施方式中，编码seq id no:84的融合蛋白的核酸(cdna)包含如下核酸序列：41.atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacagaagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:85)。附图说明42.图1示出示例性胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的示意图。43.图2示出在第0天用seq id no:31的同二聚体以0.2mg/kg静脉内给药的n＝3只狗从第0天到第3天的平均空腹血糖水平％。44.图3示出seq id no：31、seq id no：32、seq id no：33、seq id no：34和seq id no：35的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。45.图4示出seq id no:31、seq id no:36、seq id no:37和seq id no:38的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。46.图5示出在第0天用seq id no:36的同二聚体以0.2mg/kg静脉内给药的n＝3只狗从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％。47.图6示出在第0天用seq id no:36的同二聚体以0.33mg/kg静脉内给药的n＝6只狗从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％。48.图7示出在第0天(0.30mg/kg)、第28天(0.33mg/kg)、第35天(0.33mg/kg)、第42天(0.50mg/kg)、第49天(1.00mg/kg)和第56天(1.00mg/kg)用seq id no:36的同二聚体皮下给药的n＝3只狗的平均抗药抗体效价(μg/ml)。49.图8示出seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41和seq id no:42的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。50.图9示出在第0天(0.33mg/kg)、第7天(0.50mg/kg)、第14天(0.50mg/kg)和第21天(0.50mg/kg)用seq id no:42的同二聚体皮下给药的n＝1只狗的平均抗药抗体效价(μg/ml)。51.图10示出在第0天(0.33mg/kg)和第14天(0.16mg/kg)用seq id no:43的同二聚体皮下给药的n＝1只犬的平均抗药抗体效价(μg/ml)。52.图11示出在第0天用seq id no:43的同二聚体以0.33mg/kg皮下给药的n＝2只狗从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％。53.图12示出seq id no：43、seq id no：44、seq id no：45、seq id no：46、seq id no：47和seq id no：48的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。54.图13示出seq id no：43、seq id no：49、seq id no：50、seq id no：51和seq id no：52的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。55.图14示出seq id no:43、seq id no:48、和seq id no:53的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。56.图15示出seq id no:43、seq id no:51、seq id no:52和seq id no:54的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。57.图16示出seq id no：26、seq id no：28、seq id no：43、seq id no：55、seq id no：56和seq id no：57的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。58.图17示出在第0天用seq id no:28的同二聚体以0.16mg/kg皮下给药的n＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％。59.图18示出在第0天(0.16mg/kg)、第14天(0.16mg/kg)、第28天(0.16mg/kg)、和第42天(0.16mg/kg)用seq id no:28的同二聚体皮下给药的n＝1只狗的抗药抗体效价(μg/ml)。60.图19示出在第0天以0.33mg/kg用seq id no:26的同二聚体皮下给药的n＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％。61.图20示出在第0天(0.33mg/kg)、第15天(0.16mg/kg)、第31天(0.16mg/kg)和第45天(0.15mg/kg)用seq id no:26的同二聚体皮下给药的n＝1只狗从第0天到第60天的空腹血糖水平％。62.图21示出在第0天(0.33mg/kg)、第15天(0.16mg/kg)、第31天(0.16mg/kg)和第45天(0.15mg/kg)用seq id no:26的同二聚体皮下给药的n＝1只狗的抗药抗体效价(μg/ml)。63.图22示出在第0天用seq id no:58的同二聚体以0.16mg/kg皮下给药的n＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％。64.图23示出在第0天用seq id no:59的同二聚体以0.16mg/kg皮下给药的n＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％。65.图24示出seq id no:61和seq id no:62的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。66.图25示出在第0天用seq id no:61的同二聚体以0.16mg/kg皮下给药的n＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％，以及在第0天用seq id no:62的同二聚体以0.16mg/kg皮下给药的n＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％。67.图26示出除了给狗喂食的时间之外，用seq id no:30的同二聚体皮下给药的n＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％。68.图27示出seq id no:76、seq id no:91、和seq id no:78的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。69.图28示出seq id no：75、seq id no：76、seq id no：91、seq id no：92、seq id no：93、seq id no：94和seq id no：95的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。70.图29示出seq id no：76、seq id no：78、seq id no：80、seq id no：82、seq id no：84和seq id no：86的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。71.图30示出seq id no：87、seq id no：96、seq id no：78、seq id no：97、seq id no：89和seq id no：98的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。72.图31示出全氨基酸序列，包括融合蛋白的前导序列(seq id no：78)及其相应的核酸序列(seq id no：79)。73.图32示出全氨基酸序列，包括融合蛋白的前导序列(seq id no：80)及其相应的核酸序列(seq id no：81)。74.图33示出全氨基酸序列，包括融合蛋白的前导序列(seq id no：82)及其相应的核酸序列(seq id no：83)。75.图34示出全氨基酸序列，包括融合蛋白的前导序列(seq id no：84)及其相应的核酸序列(seq id no：85)。76.图35示出全氨基酸序列，包括融合蛋白的前导序列(seq id no：87)及其相应的核酸序列(seq id no：88)。77.图36示出全氨基酸序列，包括融合蛋白的前导序列(seq id no：89)及其相应的核酸序列(seq id no：90)。78.图37示出全氨基酸序列，包括融合蛋白的前导序列(seq id no：86)及其相应的核酸序列(seq id no：100)。79.图38示出以300μg/kg用seq id no:87和seq id no:89的同二聚体皮下注射之前禁食1小时的n＝12只balb/c小鼠从第0小时到第10小时的平均空腹血糖水平％。具体实施方式80.需要较低频率给药(例如，每周注射一次)的胰岛素治疗对患者而言负担较小，从而致使更佳的依从性、更佳的葡萄糖控制以及最终更佳的长期健康结果。如本文所公开的，所提出的用于人临床应用的超长效胰岛素治疗包括利用人fc片段来延长其体内作用的胰岛素-fc融合蛋白。适用于糖尿病超长效治疗的胰岛素-fc融合蛋白应满足各种设计目标。适用于糖尿病超长效治疗的胰岛素-fc融合蛋白应当可以在哺乳动物细胞例如人胚肾(hek，例如hek293)细胞中制备，并具有所需同二聚体产物的可接受的效价(例如，对于瞬时转染的hek细胞大于50mg/l的同二聚体效价、对于瞬时转染的hek细胞大于75mg/l、对于瞬时转染的hek细胞大于100mg/l、对于瞬时转染的hek细胞大于150mg/l等)。认为只有同二聚体效价大于150mg/l的人胰岛素-fc融合蛋白构型可用于本发明，因为经验表明，在瞬时转染的hek细胞中，低于该水平的同二聚体效价不太可能在稳定转染的中国仓鼠卵巢(cho)细胞中导致商业生产同二聚体效价，以满足相对商品化的人胰岛素市场的低制备成本要求。81.此外，胰岛素-fc融合蛋白必须以如在4℃ im-9ir结合测定中测量的可感亲和力(例如，ic50小于5000nm，ic50小于4000nm，ic50小于3000nm，ic50小于2400nm，ic50更优选地小于2000nm等)与ir结合。根据经验，只有表现出ir活性ic50值小于5000nm的分子才被认为可能表现出必要的生物活性。在一些优选的实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白表现出ir活性ic50值小于2400nm，更优选地小于2000nm。胰岛素-fc融合蛋白构型还必须在体内表现出持续的生物活性(例如，表现出降低葡萄糖的活性大于约2小时、6小时、9小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间)以证明较低的给药频率是合理的。胰岛素-fc融合蛋白构型还必须显示出延长的体内系统停留时间(例如，血清半衰期必须大于3天或更长)。给定胰岛素-fc融合蛋白构型的持续生物活性和延长的停留时间可以通过其结合fcrn受体的能力来预测，fcrn受体负责延长抗体和fc融合蛋白的体内消除半衰期。通常通过致使胰岛素-fc融合蛋白达到其最大结合的一半(即ec50值)的胰岛素-fc融合蛋白的浓度来测量fcrn受体活性，如在使用于酶标仪上测量的od 450nm值的测定(例如酶联免疫吸附测定(elisa))中所测量的。根据经验，表现出人fcrn受体ec50值小于或等于1500ng/ml(更优选地小于1000ng/ml)的胰岛素-fc融合蛋白构型最有可能表现出足够长的半衰期以证明每周给药一次是合理的。82.最后，为了用于治疗诸如糖尿病的慢性疾病，胰岛素-fc融合蛋白构型必须不诱导抗药物抗体的产生，尤其是在反复给药后中和分子生物活性的抗体。给定胰岛素-fc融合蛋白构型诱导不良免疫原性反应的倾向可以首先通过其结合fc(γ)ri受体的能力来预测，fc(γ)ri受体在许多免疫系统效应功能中起关键作用，所述免疫系统效应功能包括调理分子的吞噬作用、炎性介质的释放和抗体依赖性细胞毒性。fc(γ)ri受体活性通常在通过酶联免疫吸附测定(elisa)测定中以给定的胰岛素-fc融合蛋白浓度在酶标仪上获得的450nm波长处的吸光度值(od450)来测量。根据经验，在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下表现出人fc(γ)ri受体测定od450比率小于或等于0.50的胰岛素-fc融合蛋白构型(其中该比率的参考胰岛素-fc融合蛋白构型是seq id no:76)可能表现出足够低的免疫原性以证明每周一次反复给药是合理的。给定胰岛素-fc融合蛋白构型诱导不良免疫原性反应的倾向也可以通过其结合补体成分1q(c1q)的能力来预测，该补体成分激活补体级联，致使吞噬细胞清除结合的分子，炎症吸引额外的吞噬细胞，并激活细胞杀伤攻膜复合物。c1q活性通常通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验中在给定浓度的包被在微孔板上的胰岛素-fc融合蛋白构型下于酶标仪上获得的od450值来测量。根据经验，在1000ng/ml的生物素化-c1q浓度下表现出人c1q受体测定od450比率小于或等于0.35的胰岛素-fc融合蛋白构型(其中该比率的参考胰岛素-fc融合蛋白构型是seq id no:76)可能表现出足够低的免疫原性以证明每周一次反复给药是合理的。83.所提出的用于人临床应用的超长效胰岛素治疗包括利用人fc片段来延长其体内作用的胰岛素-fc融合蛋白。为了了解各种设计的胰岛素-fc融合蛋白构型的行为，首先考虑了可用作狗的超长效胰岛素的胰岛素-fc融合蛋白构型。由于预计人fc片段具有免疫原性并且因此能够在狗中诱导产生抗药物抗体，因此用犬fc片段替代人fc片段。84.然而，出乎意料地发现，人fc片段与胰岛素-fc融合蛋白构型中的任何犬fc片段之间的简单交换不一定产生具有可接受的同二聚体效价(例如，大于50mg/l的同二聚体效价)或足够高的naoc值(例如，大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc)的产物。例如，在一些情况下，只有fc片段的特定同种型(例如，犬iggb)导致具有足够高的同二聚体效价以满足设计目标(例如，犬胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体效价大于50mg/l)和可接受的高naoc值(例如，大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc)的胰岛素-fc融合蛋白构型。在其他情况下，发现胰岛素-fc融合蛋白构型的胰岛素多肽的特定氨基酸在目标物种中具有免疫原性，由此需要定点突变来找到相对少量的如下胰岛素-fc融合蛋白构型：其在目标物种中是非免疫原性和生物活性的，具有可接受地高的naoc值(例如，大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值)和在第三次每周皮下给药后大于0.50的naocr值。85.在另一些的情况下，当将fc片段突变以防止糖基化并由此进一步降低胰岛素-fc融合蛋白构型的免疫原性时，出乎意料地发现只有fc片段中的特定氨基酸突变导致期望的同二聚体效价(例如,犬胰岛素-fc融合蛋白构型的大于50mg/l的同二聚体效价)和naoc值(例如，大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值)。此外，发现需要胰岛素-fc融合蛋白构型的胰岛素组分中的额外突变来产生这些fc突变的、非糖基化的胰岛素fc-融合蛋白构型，其具有期望的同二聚体效价(例如，犬胰岛素-fc融合蛋白构型的大于50mg/l的同二聚体效价)和naoc值(例如，大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值)，同时在第三次每周皮下给药后也实现大于0.50的naocr值。86.对于人超长效胰岛素，为了最大化同二聚体效价并降低制备成本，生产了包含基于人igg分子的不同同种型(例如，igg1和igg2)的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白构型。相当出乎意料地发现，在胰岛素-fc融合蛋白构型中，从基于igg2分子的fc片段转换为基于igg1分子的fc片段使平均同二聚体效价增加了50％以上，而未显著地有损于ir或fcrn结合活性。然而，鉴于在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下所得igg1来源的胰岛素-fc融合蛋白构型的人fc(γ)ri受体测定od450比率(其中该比率的参考胰岛素-fc融合蛋白构型为seq id no:76)远大于0.50及在1000ng/ml的生物素化c1q浓度下所得igg1来源的胰岛素-fc融合蛋白构型的人c1q受体测定od450比率(其中该比率的参考胰岛素-fc融合蛋白构型是seq id no:76)远大于0.35，认为所得igg1来源的胰岛素-fc融合蛋白构型更可能不利地与免疫系统相互作用并产生中和抗体。87.为了减少不需要的免疫原性，将胰岛素-fc融合蛋白构型突变以防止在宿主细胞中合成期间fc片段的糖基化。具体而言，将igg1 fc区重链的ch2结构域中的保守天冬酰胺(n)-糖基化位点突变为不同的氨基酸(例如s、d、a、r和q)，以试图维持提高的胰岛素-fc融合蛋白同二聚体产量，同时减少fc(γ)ri与c1q的相互作用。有趣的是，相对于糖基化亲本构型，s、d、a和r突变的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型提供了改进的同二聚体效价；然而，在保守的天冬酰胺(n)-糖基化位点处具有q突变的胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价太低(即低于人胰岛素-fc融合蛋白构型的150mg/l设计目标)，不足以支持低制备成本要求。此外，对于s、d、a和r突变的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型，fc(γ)ri与c1q的结合显著降低。然而，在这些胰岛素-fc融合蛋白构型中，产量和免疫原性的提高被相对于糖基化亲本构型而言出乎意料地较低的fcrn结合亲和力和显著较低的ir结合所抵消，这表明在体内停留时间和生物活性不可接受的降低。88.正如对包含犬源fc片段的胰岛素-fc融合蛋白构型出乎意料地发现的那样，发现通过改变人胰岛素-fc融合蛋白构型中胰岛素序列中的单个氨基酸，s、d、a和r突变的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型的产量和免疫原性的提高得到维持或改进，而ir和fcrn结合亲和力相对于原始糖基化亲本构型增强(例如，较低的ir测定ic50值)，而非降低。因此，预期所得的非糖基化、突变的胰岛素-fc融合蛋白构型表现出可接受的体内葡萄糖降低效力和延长的停留时间。出乎意料的是，用在保守天冬酰胺(n)-糖基化位点处的q突变改变非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型中的相同氨基酸导致已经很差的同二聚体效价显著降低。89.为了了解如何进一步操纵s、d、a和r非糖基化突变型胰岛素-fc融合蛋白构型的特性，对胰岛素-fc融合蛋白构型的接头区域进行了修饰，将胰岛素多肽与fc片段相连。测试结果表明，在没有接头的情况下，所得犬胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价低得无法接受(即小于50mg/l)。对于包含相同长度接头的胰岛素-fc融合蛋白构型，发现在胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价、ir与fcrn受体结合以及fc(γ)ri与clq结合方面，某些氨基酸序列优于其他氨基酸序列。90.因此，本文提供了特定的可制备、高纯度、长效、生物活性、非免疫原性胰岛素-fc融合蛋白构型，其分别包含突变的胰岛素多肽、非糖基化的fc片段和突变的胰岛素多肽与非糖基化fc片段之间的接头，其中胰岛素-fc融合蛋白构型满足如下设计目标：可接受地高的同二聚体效价(例如，大于150mg/l的同二聚体效价)、ir测定ic50值(例如，小于5000nm、小于2400nm，更优选地小于2000nm的ic50)、人fcrn受体ec50值(例如，小于或等于1500ng/l，更优选地小于1000ng/ml的ec50)、人fc(γ)ri受体od450比率(例如，在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri受体浓度下小于或等于0.50的od450比率，其中该比率的参考胰岛素-fc融合蛋白构型是seq id no:76)和人c1q受体od450比率(例如在1000ng/ml的生物素化c1q浓度下小于或等于0.35的od450比率，其中该比率的参考胰岛素-fc融合蛋白构型是seq id no:76)。预期这些示例性胰岛素-fc融合蛋白构型表现出足够低的免疫原性，足够长的半衰期，以证明每周一次反复给药的合理性，使其适用于治疗糖尿病。91.定义92.如本文所用，冠词“一个”和“一种”指代一个或多于一个例如至少一个冠词的语法对象。当与本文中的术语“包括”结合使用时，所用词语“一个”或“一种”可表示“一个/种”，但其也与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或多于一个/种”的含义一致。93.如本文所用，“约”和“大约”通常表示在给定的测量性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例性的误差程度在给定范围值的20％以内，通常在10％以内，更通常在5％以内。94.如本文所用，有效治疗疾患(例如，本文所述的疾患)的分子、化合物、缀合物或物质的量、“治疗有效量”或“有效量”是指在向受试者单次或多次给药后有效治疗受试者，或以超出在没有这种治疗的情况下所预期那样治愈、减轻、缓解或改善患有疾患(例如，本文所述的疾患)的受试者的分子、化合物、缀合物或物质的量。95.如本文所用，术语“类似物”是指与另一种化合物或缀合物具有相似的化学结构但在至少一个方面不同的化合物或缀合物(例如，本文所描述的化合物或缀合物，例如胰岛素)。96.如本文所用，术语“抗体”或“抗体分子”是指免疫球蛋白分子(ig)、免疫球蛋白(ig)分子的免疫学活性部分，即，包含与抗原特异性结合例如发生免疫反应的抗原结合位点的分子。如本文所用，术语“抗体结构域”是指免疫球蛋白的可变区或恒定区。如本文所用，术语“抗体结构域”是指免疫球蛋白的可变区或恒定区。在本领域中记载有抗体包括若干类，例如在哺乳动物(例如人)的情况下iga、igm或igg。免疫球蛋白的类别可以进一步划分为不同的同种型，例如对于犬而言igga、iggb、iggc和iggd，以及对于人而言igg1、igg2、igg3和igg4。本领域技术人员将认识到给定免疫球蛋白类别的免疫球蛋白同种型将包括彼此不同的氨基酸序列、结构和功能特性(例如，对fc(γ)受体不同的结合亲和力)。“特异性结合”或“与之免疫反应”是指抗体与所需抗原的一种或多种抗原决定簇反应并且对其他多肽具有较低的亲和力，例如不与其他多肽反应。97.如本文所用，术语“曲线下方面积”或“auc”是指在给定剂量的胰岛素-fc融合蛋白给药后受试者的fbgl％(空腹血糖水平)相对于时间的曲线下方的积分面积。如本文所用，术语“曲线上方面积”或“aoc”用作胰岛素-fc融合蛋白的生物效力的量度，使得aoc等于fbgl％相对于时间的曲线下方的总可能面积与auc值之差。如本文所用，“曲线上方的归一化面积”、“归一化aoc”或“naoc”是aoc值除以所给药的胰岛素-fc融合蛋白的实际剂量。如本文所用，术语“归一化aoc比率”或“naocr”是得自胰岛素-fc融合蛋白的特定给药的naoc与得自在一系列给药中的第一次胰岛素-fc融合蛋白给药的naoc的比率。因而，naocr提供了在反复给药胰岛素-fc融合蛋白后生物活性变化的量度。98.如本文所用，术语“生物活性”、“活性”、“生物学活性”、“效力”、“生物活性效力”或“生物效力”是指在目标受试者中胰岛素-fc融合蛋白激活ir和/或降低血糖水平的程度。如本文所用，“体外活性”或“ir活性”是指胰岛素-fc融合蛋白与ir结合的亲和力，并且通常通过在竞争性结合测定中胰岛素-fc融合蛋白置换一半胰岛素ir参考标准的浓度(即ic50)来测量。如本文所用，“体内活性”是指在给药胰岛素-fc融合蛋白后目标受试者的空腹血糖水平降低的程度和持续时间。99.如本文所用，术语“生物合成”、“重组合成”或“重组制备”是指如下过程：通过用编码胰岛素-fc融合蛋白(例如，其中整个胰岛素-fc融合蛋白由单个核酸分子编码)的核酸分子(例如，载体)转染宿主细胞使胰岛素-fc融合蛋白在该宿主细胞中表达。示例性宿主细胞包括哺乳动物细胞，例如hek293细胞或cho细胞。可以使用本领域中的标准方法培养细胞，并且可以使用本领域中的标准方法从细胞培养物中收获和纯化表达的胰岛素-fc融合蛋白。100.如本文所用，术语“细胞表面受体”是指通常见于细胞膜的外表面上并且与可溶性分子例如在供血中循环的分子相互作用的诸如蛋白质的分子。在一些实施方式中，细胞表面受体可以包括激素受体(例如，胰岛素激素受体或胰岛素受体(ir))或结合抗体的fc片段或fc区的fc受体(例如，fc(γ)受体，例如fc(γ)ri，或fc新生儿受体，例如fcrn)。如本文所用，“体外活性”或“fc(γ)受体活性”或“fc(γ)受体结合”或“fcrn受体活性”或“fcrn结合”是指胰岛素-fc融合蛋白与fc受体(例如fc(γ)受体或fcrn受体)结合的亲和力，通常通过使胰岛素-fc融合蛋白达到其最大结合的一半的胰岛素-fc融合蛋白的浓度(即ec50值)来测量，如使用在酶标仪上测量的od450 nm值的测定(例如，酶联免疫吸附测定(elisa)测定)中所测量的。或者，胰岛素-fc融合蛋白与fc受体(例如fc(γ)受体或fcrn受体)的结合亲和力通过在酶联免疫吸附测定(elisa)测定中以给定的胰岛素-fc融合蛋白浓度在酶标仪上获得的od450 nm值来测量。101.如本文所用，术语“c1q”或“补体成分1q”是指参与补体系统的蛋白质复合物，补体系统是先天免疫系统的一部分。c1q与c1r和c1s一起形成c1复合物。c1q在树突状细胞向t细胞和b细胞的特异性抗原呈递中发挥作用。102.如本文所用，术语“空腹血糖水平”或“fbgl”是指目标受试者在不给予食物的时期结束时和在胰岛素-fc融合蛋白给药的前即刻的平均血糖水平。如本文所用，术语“空腹血糖水平百分比”、“空腹血糖水平％”或“fbgl％”是指给定血糖水平与空腹血糖水平的比率乘以100。103.如本文所用，术语“免疫原的”或“免疫原性”是指给定分子(例如，本发明的胰岛素-fc融合蛋白)激发目标受试者的免疫系统使得在分子反复给药之后，受试者产生能够特异性地结合该分子的抗体(即，抗药物抗体)的能力。如本文所用，术语“中和”、“中和抗体”或“中和抗药物抗体”是指抗体干扰化合物在目标受试者中的生物活性的能力。如本文所用，术语“免疫原性表位”、“免疫原性热点”或“热点”是指给定分子(例如，本发明的胰岛素-fc融合蛋白)的负责中度或强结合抗药物抗体的突变或表位。104.如本文所用，术语“胰岛素参考标准”是以下中的任何一种：(i)来自哺乳动物(例如，狗或人)的天然存在的胰岛素；(ii)不包含fc片段的胰岛素多肽；或(iii)标准护理胰岛素(例如，市售胰岛素)。105.如本文所用，术语“单体”是指包含单个多肽的蛋白质或融合蛋白。在一些实施方式中，“单体”是蛋白质或融合蛋白，例如单一多肽，包括胰岛素多肽和fc片段多肽，其中胰岛素和fc片段多肽通过肽键连接以形成单一多肽。在一些实施方式中，单体由单一核酸分子编码。106.如本文所用，“n端”是指由含有游离氨基的氨基酸来起始的蛋白质或多肽的起点，所述游离氨基是氨基酸的α-氨基(例如与一个碳原子共价连接的游离氨基，所述一个碳原子与第二碳原子位置相邻，其中第二碳原子是氨基酸的羰基的一部分)。如本文所用，“c端”是指由含有羧酸基团的氨基酸来终止的蛋白质或多肽的末端，其中羧酸基团的碳原子位于与氨基酸的α-氨基相邻的位置。107.如本文所用，“od450”、“在450nm处的光密度”和“450nm处的吸光度”可以互换使用，并且是指使用酶标仪读取在测定例如基于微孔板的测定、例如酶联免疫吸附测定、例如elisa测定中光在450nm处通过样品的吸光度。108.如本文所用，用于特定测定的“od450比率”是指将在特定时间运行的第一受试胰岛素-fc融合蛋白获得的od450值与在另一时间运行的第二受试胰岛素-fc融合蛋白获得的od450值进行比较的方式。od450比率是通过用第一受试物品的od450值除以参考胰岛素-fc融合蛋白的od450值获得的。类似地，可以通过用第二受试物品的od450值除以与用于计算第一受试物品的od450比率相同的参考胰岛素-fc融合蛋白的od450值来获得第二受试物品的第二od450比率。结果，可以比较第一受试胰岛素-fc融合蛋白和第二受试胰岛素-fc融合蛋白的测定特性。用于计算od450比率的参考胰岛素-fc融合蛋白构型是seq id no:76。109.如本文所用，“药效学”或“pd”通常是指胰岛素-fc融合蛋白在受试者中的生物学效应。具体而言，在本文中，pd是指在给药胰岛素-fc融合蛋白后受试者的空腹血糖水平随时间降低的测量值。110.如本文所用，“药代动力学”或“pk”通常是指胰岛素-fc融合蛋白与受试者身体在其吸收、分布、代谢和排泄方面的特征性相互作用。具体而言，在本文中，pk是指在给药胰岛素-fc融合蛋白后的给定时间，受试者血液或血清中胰岛素-fc融合蛋白的浓度。如本文所用，“半衰期”是指受试者血液或血清中胰岛素-fc融合蛋白的浓度达到其原始值的一半所用的时间，如从药物消除的一阶指数衰减模型计算的。具有较大“半衰期”值的胰岛素-fc融合蛋白在目标受试者中表现出更长的持续作用时间。111.如本文所用的术语氨基酸或核苷酸序列的“序列同一性”“序列同源性”“同源性”或“相同”描述了当将变体的核苷酸序列或氨基酸序列的指定的连续区段对齐并与参考序列的核苷酸序列或氨基酸序列进行比较时，在变体和参考序列中发现相同的核苷酸或氨基酸残基。用于序列比对和确定序列之间同一性的方法在本领域中是已知的，包括使用clustal omega，其组织、比对和比较序列的相似性，其中软件突出显示每个序列位置并比较该位置的所有序列，以及分配如下分数之一：“*”(星号)表示具有单个完全保守残基的序列位置；“:”(冒号)表示在gonnet pam 250矩阵中得分大于0.5的具有高度相似的特性的组之间的保守性；“。”(句点)表示在gonnet pam250矩阵中得分小于或等于0.5的具有弱相似特性的组之间的保守性；“‑”(破折号)表示序列空隙，这表示在某个序列范围内特定的比较集之中不存在局部同源性；空格“”表示在所比较的序列中该特定位置处序列同源性很小或没有序列同源性。参见，例如ausubel et al.,eds.(1995)current protocols in molecular biology,chapter 19(greene publishing and wiley-interscience,new york)；和atlas of polypeptide sequence and structure 5:suppl.3(national biomedical research foundation,washington,d.c.)中的the align program dayhoff(1978)。关于两条核苷酸序列的最佳比对，变体核苷酸序列的连续区段可以具有相对于参考核苷酸序列而言额外的核苷酸或缺失的核苷酸。同样，为了两条氨基酸序列的最佳比对目的，变体氨基酸序列的连续区段可以具有相对于参考氨基酸序列而言额外的氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。在一些实施方式中，用于与参考核苷酸序列或参考氨基酸序列比较的连续区段将包含至少6、10、15或20个连续核苷酸或氨基酸残基，并且可以是30、40、50、100，或更多个核苷酸或氨基酸残基。可以通过分配空位罚分来进行与在变体的核苷酸序列或氨基酸序列中包含空位相关的增加的序列同一性的校正。用于序列比对的方法在本领域中是已知的。112.在一些实施方式中，两条序列之间的同一性百分比或“同源性”的确定是使用数学算法完成的。例如，氨基酸序列的同一性百分比是使用smith-waterman同源性搜索算法确定的，该算法使用具有空位开放罚分12和空位延伸罚分2的仿射6空位搜索，blosum矩阵62。smith-waterman同源搜索算法描述于smith和waterman(1981)adv.appl.math 2:482-489中，该文献通过援引并入本文。在一些实施方式中，核苷酸序列的同一性百分比是使用smith-waterman同源性搜索算法确定的，该算法使用空位开放罚分25和空位延伸罚分5。可以使用例如timelogic的decypher hardware accelerator来进行这样的序列同一性确定。113.如本文所用，术语“同源性”用于通过将例如β链、螺旋和折叠的共同结构特征和共同空间分布进行定位来对两种或更多种蛋白质进行比较。因此，同源蛋白质结构通过空间分析来定义。测量结构同源性涉及计算空间的几何拓扑特征。用于生成和分析三维(3d)蛋白质结构的一种方法是同源性建模(也称为比较建模或基于知识的建模)，其工作原理是根据3d相似性反映2d相似性这一事实来查找相似序列。同源结构并不意味着序列相似性是必要条件。114.如本文所用，术语“受试者”和“患者”旨在包括患有疾病或疾患例如糖尿病或本文所描述的其他疾病或疾患的犬科动物和人，或者正常受试者。115.如本文所用，术语“效价”或“产量”是指由每体积的细胞培养物生物合成(例如，在哺乳动物细胞中，例如在hek293细胞或cho细胞)的融合蛋白产物(例如，本文描述的胰岛素-fc融合蛋白)的量。产物的量可以在生产过程的任何步骤(例如，在纯化之前或之后)确定，但产量或效价总是以每体积原始细胞培养物来描述。如本文所用，术语“产物产量”或“总蛋白质产量”是指由细胞表达并经由至少一个亲和层析步骤(例如蛋白质a或蛋白质g)纯化的胰岛素-fc融合蛋白的总量，并且包括胰岛素-fc融合蛋白单体、胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体和胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的高阶分子聚集体。如本文所用，术语“同二聚体百分比”或“同二聚体％”是指作为所需同二聚体的融合蛋白产物(例如，本文所述的胰岛素-fc融合蛋白)的比例。如本文所用，术语“同二聚体效价”是指蛋白质a纯化步骤后报告的每体积细胞培养物的总蛋白质产量与同二聚体％的乘积。116.如本文所用，术语“治疗”或“处理”患有疾病或疾患的受试者是指使受试者接受治疗方案，例如给药融合蛋白诸如本文所描述的融合蛋白，使得疾病或疾患的至少一种症状被治愈、治好、缓解、减轻、改变、补救、改进或改善。治疗包括给药有效量以缓解、减轻、改变、补救、改进、改善或影响疾病或疾患，或者疾病或疾患的症状。该治疗可以抑制疾病或疾患的症状恶化或劣化。117.胰岛素-fc融合蛋白组分和结构118.本公开涉及包含经由肽接头与物种特异性fc片段连接的胰岛素多肽的融合蛋白(即，胰岛素-fc融合蛋白)组合物，及其用于治疗糖尿病(例如，在人和/或狗中)的用途。如本文所用，术语“融合蛋白”和“胰岛素-fc融合蛋白”是指包含通过肽键共价连接的例如来自不同来源(不同的蛋白质、多肽、细胞等)的多于一个部分的蛋白质。按照如下所述，胰岛素-fc融合蛋白通过(i)将编码每个部分的基因连接成单个核酸分子和(ii)在宿主细胞(例如，hek或cho)中表达核酸分子编码的蛋白质共价连接：(n端)‑‑胰岛素多肽‑‑接头‑‑fc片段‑‑(c端)。完全重组合成方法优于单独合成胰岛素多肽和fc片段然后化学缀合的方法。化学缀合步骤和随后的纯化过程增加了制备复杂性，降低了产品产量，并且增加了成本。119.如本文所用，术语“二聚体”是指包含两条共价连接的多肽的蛋白质或融合蛋白。在一些实施方式中，两个相同的多肽共价连接(例如，通过二硫键)形成“同二聚体”(在图1中以图示示出)。二硫键示于图1中；实际上，二硫键的总数可以大于或小于图1中所示的数目。在一些实施方式中，同二聚体由单一核酸分子编码，其中通过如下所述在细胞内重组地制备同二聚体：首先形成胰岛素-fc融合蛋白单体，然后一在细胞内进一步处理，将两个相同的胰岛素-fc融合蛋白单体组装成同二聚体。120.如本文所用，术语“多聚体”、“多聚”或“多聚态”是指非共价缔合形式的fc融合蛋白二聚体，其可以与fc融合蛋白二聚体平衡或者可以作为fc融合蛋白二聚体的永久聚集形式(例如，fc融合蛋白同二聚体的二聚体、fc融合蛋白同二聚体的三聚体、fc融合蛋白同二聚体的四聚体，或包含五个或更多个fc融合蛋白同二聚体的更高阶聚集体)。可以预期，多聚形式的fc融合蛋白可能具有与胰岛素-fc融合蛋白同二聚体不同的物理、稳定性或药理学活性。121.胰岛素多肽122.胰岛素多肽可以是例如由胰腺内朗格汉斯胰岛中的β细胞产生的胰岛素或胰岛素类似物。胰岛素通过调节血液中葡萄糖的吸收而起作用。在受到刺激(诸如蛋白质和葡萄糖水平增加)时，胰岛素从β细胞中释放出来并与ir结合，启动影响哺乳动物(例如人)代谢的许多方面的信号级联。这一过程的中断与若干疾病直接相关，特别是糖尿病、胰岛素瘤、胰岛素抵抗、代谢综合征和多囊卵巢综合征。本公开的胰岛素类似物可能与胰岛素的结构有关，但含有一种或更多种修饰。在一些实施方式中，相对于胰岛素，胰岛素类似物包含至少一种氨基酸置换、缺失、插入或化学修饰，这可能影响胰岛素-fc融合蛋白构型的特定特征或特性。例如，相对于参考标准，本文所描述的修饰或改变可影响胰岛素-fc融合蛋白构型的结构、稳定性、ph敏感性、生物活性或对细胞表面受体(例如，胰岛素激素受体)的结合亲和力。123.胰岛素的氨基酸序列在整个进化过程特别是在脊椎动物中是高度保守的。例如，天然犬和猪胰岛素与人胰岛素仅相差一个氨基酸，天然牛胰岛素与人胰岛素仅相差三个氨基酸，而天然猫胰岛素与人胰岛素仅相差四个氨基酸。如本文所用，术语“b链或b链类似物”、“c肽”或“c链”和“a链或a链类似物”是指胰岛素多肽的肽区段，如图1中所示。胰岛素是一种51个氨基酸的激素，含有通过二硫键(例如，由一个或更多个b链半胱氨酸侧链硫醇和一个或更多个a链半胱氨酸侧链硫醇形成的二硫键)连接的两条肽链(即，b链和a链)。胰岛素的a链长度为21个氨基酸，胰岛素的b链长度为30个氨基酸。在胰岛素的天然形式中，a链包含由两个a链半胱氨酸侧链硫醇形成的一个链内二硫键。为了参考的目的，如下示出seq id no:1的人胰岛素b链和seq id no:2的人胰岛素a链的序列：124.fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seq id no:1)125.giveqcctsicslyqlenycn(seq id no:2)。126.如本文所用，术语“胰岛素”或“胰岛素多肽”涵盖成熟胰岛素、前胰岛素原、胰岛素原和天然存在的胰岛素或其类似物。在一些实施方式中，胰岛素多肽可以是全长胰岛素多肽或其片段。在一些实施方式中，胰岛素多肽可包含来自成熟胰岛素、前胰岛素原、胰岛素原或天然存在的胰岛素的一个或更多个片段。127.胰岛素通常构建为n端‑‑b链：c链：a链‑‑c端多肽，其中c链被切割以使其具有生物活性。出于参考的目的，如下示出包括c链(即人胰岛素原)在内的整个人胰岛素分子的序列，c链加有下划线：128.fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpktrreaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslqkrgiveqcctsicslyqlenycn(seq id no:3)。129.单链胰岛素多肽转化为具有生物活性的双链多肽通常在朗格汉斯胰岛的β细胞内完成，然后由两种内切蛋白酶‑‑i型内切蛋白酶和ii型内切蛋白酶进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌，i型内切蛋白酶pc1和pc3破坏c肽-b链连接，并且ii型内切蛋白酶pc2精确地在正确的位点处切割c肽-a链键。然而，用于生物合成治疗性分子诸如胰岛素的细胞系统(例如，细菌、酵母和哺乳动物(例如，hek和cho)细胞系统)不具备此途径，因此转化必须在使用化学或酶促方法表达和收获单链多肽后进行。所有在表达和收获后切割c链的已知技术都依赖于首先修饰c链，使其恰好在a链n端之前的赖氨酸处终止。然后，使用选自胰蛋白酶或lys-c家族的酶，该酶特异性地在赖氨酸残基的c端剪切肽键，在c链的c端赖氨酸和从b链n端起第29位c端赖氨酸处切割单链胰岛素多肽。在一些情况下，使用所得的生物活性双链胰岛素而不重新连接从b链n端起第30位的剪切氨基酸，在一些情况下，使用额外的酶促方法将从b链n端起第30位处剪切的氨基酸添加回分子中。这样的过程对胰岛素而言有效，因为胰岛素在其全部双链多肽形式中只含有一个赖氨酸。然而，该过程不能用于本文所涵盖的胰岛素-fc融合蛋白，因为所有已知的fc片段都含有多个赖氨酸残基。因此，酶促切割过程会将fc片段消化成非功能部分，从而消除fc片段延长体内胰岛素多肽作用的能力。因此，本发明的胰岛素-fc融合蛋白必须包含不需要c链切割并因此以其单链形式具有生物活性的胰岛素多肽。130.许多生物活性单链胰岛素多肽在本领域中已有描述。在所有情况下，单链胰岛素多肽包含特定长度和组成的c链以及在特定氨基酸位点发生突变的a链和b链，以实现静电平衡、防止聚集和增强ir结合和/或下游信号传导以达到与天然双链胰岛素相当水平的生物活性。在本文中，肽区段上突变的位置使用区段的名称(例如，b链、c链、a链)以及从区段n端开始计数的氨基酸数来表示。例如，符号“b16”是指从b链氨基酸序列的n端起第16个氨基酸。符号“a8”是指从a链n端起第8个氨基酸。此外，如果氨基酸在特定位置从其天然形式突变为新氨基酸，则该位置附有用于该新氨基酸的单字母氨基酸代码。例如，b16a是指从b链氨基酸序列n端起第16个氨基酸的丙氨酸突变，a8h是指从a链氨基酸序列n端起第8个氨基酸的组氨酸突变。131.us9855318b2描述了一种单链胰岛素类似物，其具有序列ggsgggg(seq id no:72)的c链(“第一接头”)、a链中的置换以及b链中的置换和缺失(非天然氨基酸加有下划线，缺失的天然氨基酸用下划线z示出)：132.fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycz(seq id no:7_null)。133.以下是对如上所示序列的重述，但从胰岛素多肽序列的符号中删除了以符号z示出的不存在的氨基酸。同样，如前文所述，非天然氨基酸加有下划线。尽管有两种不同的符号，成对的序列指的是完全相同的胰岛素多肽。134.fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenyc(seq id no:7)135.在一些实施方式中，出乎意料地发现如下所述的胰岛素-fc融合蛋白构型：其中在seq id no:7中b链的n端第16位(即b16)的丙氨酸置换为谷氨酸从而产生seq id no:10，导致同二聚体效价、ir结合亲和力和胰岛素-fc融合蛋白的fcrn结合提高，同时保持降低的免疫原性，如通过低fc(γ)ri和clq结合亲和力所测量的。b16处的该特定氨基酸置换最初是因为已知该位置的丙氨酸不太能够激活胰岛素特异性t细胞这一事实所促使的(alleva,d.g.,gaur,a.,jin,l.,wegmann,d.,gottlieb,p.a.,pahuja,a.,johnson,e.b.,motheral,t.,putnam,a.,crowe,p.d.,ling,n.,boehme,s.a.,conlon,p.j.,(2002)diabetes vol.51,no.7pp 2126-2134)。下面列出了seq id no:10，其中每个非天然氨基酸都加有下划线：136.fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenyc(seq id no:10)。137.接头138.在一些实施例中，胰岛素多肽的c端直接连接到fc片段的n端(例如，没有接头或接头不存在)。在其他实施例中，成功构建重组制备的胰岛素-fc融合蛋白需要将胰岛素多肽与fc片段相连的接头。在一些实施方式中，本文所述的胰岛素-fc融合蛋白构型在胰岛素多肽和包含氨基酸(例如，天然或非天然氨基酸)的fc片段之间包含肽接头。在一些实施方式中，肽接头可以由核酸分子编码，例如使得单个核酸分子可以编码胰岛素多肽内的各种肽以及肽接头和fc片段。肽接头的选择(例如，长度、组成、疏水性和二级结构)可能会影响胰岛素-fc融合蛋白构型的可制备性(即同二聚体效价)、化学和酶促稳定性、生物活性(即，naoc值)、与生物活性相关的参数(即，fcrn测定ec50值)和胰岛素-fc融合蛋白的免疫原性(chen,x.,zaro,j.,shen,w.c.,adv drug deliv rev.2013october 15；65(10):1357-1369)。表1列出了用于以提高同二聚体效价和生物活性为目的设计胰岛素-fc融合蛋白构型的若干接头。139.表1:胰岛素-fc融合蛋白中a链与fc片段之间的肽接头ggggagggg(seq id no:11)ggggsgggg(seq id no:12)gggggagggg(seq id no:64)ggggsggggsggggsgggg(seq id no:65)ggggkggggkggggkgggg(seq id no:66)gggggaggggaggggaggggg(seq id no:67)gggggqggggqggggqggggg(seq id no:13)sggggqggggqggggqggggg(seq id no:68)hggggqggggqggggqggggg(seq id no:69pgggggqggggqggggqggggg(seq id no:70)gggggqggggqggggqgggggqgggg(seq id no:99)140.在一些实施方式中，肽接头包含如下序列：gggggqggggqggggqggggg(seq id no:13)。在另一些实施方式中，肽接头包含如下序列：ggggsgggg(seq id no:12)。在一些优选的实施方式中，肽接头包含如下序列：gggggaggggaggggaggggg(seq id no:67)或序列：ggggagggg(seq id no:11)。141.在构建具有肽接头如seq id no:13之一的重组制备的胰岛素-fc融合蛋白构型时，必须注意胰岛素a链的c端与肽接头的n端之间可能发生的不希望的酶促切割。从胰岛素多肽切割接头和fc片段将使胰岛素-fc融合蛋白构型不能提供延长的生物活性持续时间。天冬酰胺-甘氨酸键之间存在已知的酶切位点(vlasak,j.,ionescu,r.,(2011)mabs vol.3,no.3pp253-263)。在包括seq id no：13的优选肽接头在内的许多肽接头实施方式中，n-端氨基酸是甘氨酸。此外，胰岛素a链的c端(即，从a链n端起第21个氨基酸(即a21))是天冬酰胺。因此，在seq id no:7、seq id no:9和seq id no:10的胰岛素多肽中省略了a21天冬酰胺，以在胰岛素-fc融合蛋白构型中消除将在a链和肽接头之间形成的潜在的可酶促切割的天冬酰胺-甘氨酸键。出乎意料的是，由seq id no:8的胰岛素多肽构建的胰岛素-fc融合蛋白构型在a链的c端保留了天冬酰胺，以如下所述证明了可以在哺乳动物细胞中制备：可接受的同二聚体效价(即，对于犬胰岛素-fc融合蛋白而言大于50mg/l的同二聚体效价)、狗体内可接受的生物活性(即，大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc)，以及在多次给药后保持生物活性水平(即在狗中第三次注射后大于0.5的naocr值)。结果表明，与基于先前教导的预期相反，至少对于包含本文公开的fc片段序列的胰岛素-fc融合蛋白质构型而言，不存在在胰岛素多肽和肽接头之间含有天冬酰胺-甘氨酸连接的胰岛素-fc融合蛋白构型酶促切割或失活的风险。142.在另一个实施方式中，发现对于相同的胰岛素多肽和fc片段组合物，将seq id no：13中的谷氨酰胺(q)突变为丙氨酸(a)，产生gggggaggggaggggaggggg(seq id no：67)的肽接头，得到具有更高的同二聚体效价、对ir的结合亲和力增加、对fcrn受体的结合亲和力增加的胰岛素-fc融合蛋白构型。143.在另一个实施方式中，发现对于相同的胰岛素多肽和fc片段组合物，可以缩短seq id no:67的肽接头而不显著影响同二聚体效价或与胰岛素-fc融合蛋白的fcrn受体的结合亲和力，但ir测定ic50值增加60％。缩短的肽接头包含序列：ggggagggg(seq id no：11)。144.fc片段145.术语“fc片段”、“fc区”、“fc结构域”或“fc多肽”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的c端区域。fc片段、区域、结构域或多肽可以是天然序列fc区或变体/突变fc区。尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界可能不同，但它们通常包含重链的铰链区、重链的ch2区和重链的ch3区中的一些或全部。犬或人fc片段的铰链区包含连接重链的ch1结构域和重链的ch2区的氨基酸序列，并且该氨基酸序列含有一个或更多个半胱氨酸，其形成一个或更多个重链间二硫键以由两个相同但独立的fc融合蛋白单体形成fc融合蛋白的同二聚体。铰链区可以包含全部或部分天然存在的氨基酸序列或非天然存在的氨基酸序列。146.fc受体(fcr)是指与抗体的fc片段或fc区结合的受体。在一些实施方式中，fcr是犬或人fcr的天然序列。在一些实施方式中，fcr是结合igg抗体的fc片段或fc区的fcr(γ受体)并且包括但不限于fc(γ)ri、fc(γ)riia、fc(γ)riib和fc(γ)riii亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可替选地剪接形式。“fcr”还包括新生儿受体fcrn，其负责将母本igg分子转移至胎儿(guyer et al.,1976j.immunol.,117:587；和kim et al.,1994,j.immunol.,24:249)并且还负责在体内延长抗体和fc融合蛋白的体内消除半衰期。本领域技术人员将理解来自一个物种的哺乳动物fcr(例如，人源的fcr)能够在体外结合包含相同物种(例如，人源)的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白，并且有时还能够在体外结合来自其他哺乳动物物种(例如犬源)的fc片段。在一些实施方式中，人源的fcr在体外(例如，在测定中)用于测量包含人源的或犬源的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白构型的结合特性，从而评估它们的fcr结合特性。在一些实施方式中，犬源fcr在体外(例如，在测定中)用于测量包含犬源fc片段的胰岛素-fc融合蛋白构型的结合。147.在一些实施方式中，省略了经常见于天然犬和人igg同种型fc片段氨基酸序列的c端赖氨酸(即，代表fc片段序列的最后一个氨基酸的赖氨酸)以防止在制备过程中意外产生fc片段(seq id no:14)和/或接头，但没有表现出所需同二聚体的足够低的聚集程度和足够高的效价的包含犬igga fc片段的胰岛素-fc融合蛋白实施方式。然而，在胰岛素-fc融合蛋白构型中用犬iggb fc片段(seq id no:15)替换犬igga fc片段(seq id no:14)产生了以所需同二聚体的相对高效价聚集显著更少的化合物。此外，在狗中，包含seq id no:4的胰岛素多肽和犬iggb fc片段(seq id no:15)的胰岛素-fc融合蛋白构型具有生物活性，在多日内表现出降低葡萄糖的生物活性(即，naoc值大于150fbgl％·天数·kg/mg)。157.在包含seq id no:7的胰岛素多肽和seq id no:13的肽接头的胰岛素-fc融合蛋白构型中确认了犬iggb fc片段优于犬igga fc片段，这两者都与seq id no:4的胰岛素多肽和seq id no:11的肽接头相当不同。使用来自犬igga(seq id no：14)、犬iggb(seq id no：15)、犬iggc(seq id no：16)或犬iggd(seq id no：17)免疫球蛋白的fc片段合成包含seq id no:7的胰岛素多肽和seq id no:13的肽接头的胰岛素-fc融合蛋白构型。使用常规纯化方法，只有包含犬igga和犬iggb的胰岛素-fc融合蛋白构型显示出任何明显的蛋白质产量。然而，如此前所述，胰岛素-fc融合蛋白的犬igga构型以低生物活性水平高度聚集，而胰岛素-fc融合蛋白的犬iggb构型表现出低聚集度(即高同二聚体％)，所需同二聚体的高效价(即，犬胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价大于50mg/l)，并且在狗中具有明显水平的长期降葡萄糖生物活性(即，naoc值大于150fbgl％·天数·kg/mg)。使用另一种纯化方法，胰岛素-fc融合蛋白的犬iggc构型以低聚集度恢复，但它在狗中的生物活性最低(即，naoc值小于150fbgl％·天数·kg/mg)，这大概是因为它对fcrn受体的低亲和力。因此，就狗特异性产物而言，无论选择何种胰岛素多肽，对于在狗中使用的所有胰岛素-fc融合蛋白构型，犬iggb(seq id no：15)都是优选fc片段。158.鉴于与犬igga同种型相比，犬iggb同种型与犬fc(γ)受体以更高的亲和力相互作用，在反复注射包含犬iggb的胰岛素-fc融合蛋白构型后可能存在不希望的免疫原性的风险。因此，对犬iggb fc片段的各种突变进行了研究，以努力保持更大的胰岛素-fc融合蛋白同二聚体效价，同时降低对犬fc(γ)ri受体的亲和力。159.一种用于降低fc(γ)ri相互作用的方法涉及在宿主细胞中合成胰岛素-fc融合蛋白期间使fc片段去糖基化或防止fc片段糖基化。每个igg片段在fc区的每条重链的ch2结构域中包含保守的天冬酰胺(n)-糖基化位点。在此，用于指代保守的n-糖基化位点的符号是“cng”。从合成的胰岛素-fc融合蛋白中去除附接的聚糖的一种方法是突变cng位点，以在宿主细胞生产的过程中完全防止聚糖的附接。在此，用于描述cng突变的符号是cng-(置换的氨基酸)。例如，如果cng位点的天冬酰胺突变为丝氨酸，则将该突变标记为“cng-s”。160.cng位点距胰岛素-fc融合蛋白构型b链n端的绝对位置取决于胰岛素多肽的长度、接头的长度和fc片段中在cng位点之前任何省略的氨基酸。在本文中，用于指代给定胰岛素-fc融合蛋白序列中cng位点的绝对位置(如从胰岛素-fc融合蛋白b链的n端开始计数测量的)的符号是“nb(数字)”。例如，如果cng位点见于从b链n端起计数的第155个氨基酸位置，则将该位点的绝对位置称为“cng-nb155”。作为另一实例，如果cng位点位于从b链n端起计数的第155个氨基酸位置，并且该位点的天冬酰胺突变为丝氨酸，则将该突变标记为“cng-nb155-s”。161.在含有seq id no:4的胰岛素多肽和具有cng-q、cng-s、cng-d和cng-k突变的犬iggb fc片段的胰岛素-fc融合蛋白实施方式中，出乎意料地发现只有含有cng-k和cng-s突变的化合物表现出大于50mg/l的犬胰岛素-fc融合蛋白的所需同二聚体效价和最低的fc(γ)ri结合亲和力。另一方面，在包含seq id no:7的胰岛素多肽和具有cng-s突变的犬iggb fc片段的胰岛素-fc融合蛋白实施方式中，出乎意料地发现与包含天然犬iggb fc的对应的胰岛素-fc融合蛋白构型相比，在狗中，所得胰岛素-fc融合蛋白的生物活性显著降低(即，对于包含天然糖基化位点氨基酸例如cng-n的胰岛素-fc融合蛋白对应物而言，naoc值显著降低)。当如上文针对胰岛素多肽seq id no:10所描述，将b16氨基酸突变为丙氨酸时，cng-s突变体中胰岛素-fc融合蛋白的生物活性出乎意料地恢复(即，naoc值显著增加)。总之，在胰岛素-fc融合蛋白构型的fc片段上cng突变的选择与胰岛素多肽的组成之间存在出乎意料且显著的相互作用，因此需要进行实验来鉴定优选的胰岛素-fc融合蛋白实施方式。在一些特定的胰岛素-fc融合蛋白实施方式中，优选含有cng-s突变的犬iggb fc突变体，并且cng-s带有下划线的序列如下所示：162.dcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:18)。163.通常，人fc igg2同种型优于其他同种型，原因是其缺乏fc(γ)效应因子功能，因此其诱导不希望的免疫原性的倾向性较低。作为说明，在fc(γ)ri结合和clq结合elisa的一次实施中，包含人igg1片段的seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白实施方式表现出在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下的人fc(γ)ri结合测定od450为2.078，并且在1000ng/ml的生物素化-c1q浓度下表现出人c1q结合测定od450为3.006，如此高的值表明seq id no:76在患者中表现出免疫原性的可能性。相比之下，在fc(γ)ri结合和clq结合elisa的相同实施中，包含seq id no:7的胰岛素多肽、seq id no:13的肽接头和人igg2 fc片段(seq id no:74)的胰岛素-fc融合蛋白构型(seq id no:75)在3,000ng/ml的生物素化fc(γ)ri浓度下表现出人fc(γ)ri结合测定od450为0.093，在1,000ng/ml的生物素化c1q浓度下人c1q结合测定od450为0.928，表明seq id no：75在患者中表现出免疫原性的可能性显著降低。164.对于胰岛素-fc融合蛋白构型的od 450测量的绝对值而言，一次elisa实施与下一次elisa实施中的该值可以不同，例如由于测定实施中的微小变化。这使得不同elisa实施中不同胰岛素-fc融合蛋白构型的od450绝对值测量的比较不可靠，即使在测试中的胰岛素-fc融合构型的浓度保持恒定时也是如此。相比之下，对于不同的elisa实施中相同的两种胰岛素-fc融合蛋白构型，elisa实施中一种胰岛素-fc融合蛋白构型的od450测量值与相同elisa实施中的第二种胰岛素-fc融合蛋白构型的od450测量值之比(再次保持胰岛素-fc融合蛋白浓度恒定)将是相对稳定的。因此，针对人fc(γ)ri结合测定和c1q结合测定的od450的胰岛素-fc融合蛋白设计目标已表示为od450比率，其中该比率为分析下的胰岛素-fc融合蛋白的绝对od450值与参考胰岛素-fc融合蛋白构型的绝对od450值之比，其中两种测量均在相同的elisa实验中进行。对于所有受试样品，将fc(γ)ri结合elisa od450中的胰岛素-fc融合蛋白构型样品生物素化-fc(γ)ri浓度设置为3000ng/ml，并且将c1q结合elisa od450中的胰岛素-fc融合蛋白构型样品生物素化-c1q浓度设置为1000ng/ml。165.将seq id no：76的胰岛素-fc融合蛋白构型(包含人igg1 fc片段)用作fc(γ)ri结合elisa和clq结合elisa od450比率计算的参考胰岛素-fc融合蛋白。使用上文给出的所测量的od450值的seq id no:75的胰岛素-fc融合蛋白构型(包含人igg2 fc片段)的fc(γ)ri结合elisa od450比率是：[0166][0167]使用上文给出的所测量的od450值的seq id no:75的胰岛素-fc融合蛋白构型的c1q结合elisa od450比率是：[0168][0169]相对于seq id no：76(higg1)的胰岛素-fc融合蛋白构型，seq id no：75(higg2)的胰岛素-fc融合蛋白构型的fc(γ)ri结合elisa od450比率和clq结合elisa od450比率代表一个理想的基准，其用于创建设计目标，以评估不同胰岛素-fc融合构型的fc(γ)ri结合和c1q结合，以降低不希望的免疫原性倾向。因此，为人fc(γ)ri结合(其中测试中的胰岛素-fc融合蛋白的生物素化-fc(γ)ri浓度为3000ng/ml)建立的设计目标是od450比率《0.50，并且该建立用于人c1q结合(其中测试中的胰岛素-fc融合蛋白的生物素化c1q浓度为1000ng/ml)的设计目标是od450比率《0.35。[0170]由包含人igg2 fc片段的这种胰岛素-fc融合蛋白构型(seq id no：75)的两次单独合成得到的平均同二聚体效价为117mg/l。[0171]通过比较，在包含与seq id no:7相同的胰岛素多肽、与seq id no:13相同的肽接头和人iggl片段(seq id no:73)的胰岛素-fc融合蛋白实施方式中(seq id no:76)发现胰岛素-fc融合蛋白表现出来自两个单独合成的180mg/l的平均同二聚体效价，这比包含人igg2片段的胰岛素-fc融合蛋白构型类似物获得的效价高50％以上。鉴于与人igg2同种型相比，人igg1同种型与人fc(γ)ri受体以更高的亲和力相互作用，在反复注射包含人igg1的胰岛素-fc融合蛋白构型后可能存在不希望的免疫原性的风险。[0172]因此，对人igg1 fc片段的各种突变进行了研究，以努力保持更大的胰岛素-fc融合蛋白同二聚体效价，同时降低对人fc(γ)ri受体和c1q的亲和力。[0173]如前文所述，一种用于降低fc(γ)ri相互作用的方法涉及在宿主细胞中合成胰岛素-fc融合蛋白期间使fc片段去糖基化或防止fc片段糖基化。从合成的胰岛素-fc融合蛋白中去除附接的聚糖的一种方法是突变cng位点，以在宿主细胞生产的过程中完全防止聚糖的附接。[0174]突变的人igg1 fc片段概括构型如下，其中cng位点加有下划线：[0175]dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyx1styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:77),其中实例x1是s、d、a、r或q。[0176]包含seq id no:7的胰岛素多肽、seq id no:13的肽接头和seq id no:77的人igg1 fc片段的人igg1 fc片段如下所示，其中x1是s(即，具有cng-nb155-s突变)：[0177]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:91)。[0178]出乎意料地发现，相对于糖基化母本物质(seq id no:76)，seq id no:91的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白实施方式产生改进的同二聚体效价。此外，对于seq id no:91的胰岛素-fc融合蛋白实施方式相对于seq id no:76的参考胰岛素-fc融合蛋白，在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率为小于0.50，对于seq id no:91的胰岛素-fc融合蛋白构型相对于seq id no:76的参考胰岛素-fc融合蛋白，在1000ng/ml的生物素化c1q浓度下人c1q结合测定od450比率为小于0.35。然而，所得seq id no:91的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白相对于其亲本seq id no:76的糖基化胰岛素-fc融合蛋白表现出降低的ir结合(增加的ir测定ic50值)和降低的fcrn结合亲和力(增加的ec50值)，这表明在体内停留时间和生物活性分别很可能发生了不可接受的降低。[0179]胰岛素-fc融合蛋白[0180]本文提供了胰岛素-fc融合蛋白构型，其包含胰岛素多肽、fc片段和胰岛素多肽与fc片段之间的接头。在一些实施方式中，胰岛素多肽沿如下从n端到c端的方向包含结构域：(n端)‑‑b链‑‑c链‑‑a链‑‑(c端)。在一些实施方式中，胰岛素多肽位于fc片段的n端侧。在一些实施方式中，融合蛋白沿如下从n端到c端的方向包含结构域：(n端)‑‑胰岛素多肽‑‑接头‑‑fc片段‑‑(c端)(例如，(n端))‑‑b链‑‑c链‑‑a链‑‑接头‑‑fc片段‑‑(c端))，如图1所示。[0181]犬胰岛素-fc融合蛋白[0182]在一些实施方式中，使用seq id no:13的优选接头将seq id no:5的优选的非糖基化、生物活性胰岛素多肽与seq id no:15的优选的犬iggb fc片段组合以产生一族高同二聚体效价-产量、非聚集、生物活性、非免疫原性seq id no：20的犬胰岛素-fc融合蛋白构型，其表现出大于50mg/l的同二聚体效价、在狗中大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值，以及在狗中在一系列反复注射中的第三次注射后大于0.5的naocr值。如下示出seq id no:20，其中非天然氨基酸加有下划线：[0183]fvnqhlcgsx1lvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqccx2stcsldqlenycx3gggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:20),其中x1不是d,x2不是h,x3不存在或者是n。[0184]在包含seq id no:20的优选犬胰岛素-fc融合蛋白实施方式中，x1是h，x2是t，x3不存在或者是n。该选择产生高同二聚体效价-产量、非聚集、生物活性、非免疫原性seq id no：21的犬胰岛素-fc融合蛋白构型，其表现出大于50mg/l的同二聚体效价、在狗中大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值，以及在狗中在一系列反复注射中的第三次注射后大于0.5的naocr值。如下示出seq id no:21，其中非天然氨基酸加有下划线：[0185]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycx3gggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:21),其中x3不存在或者是n。[0186]在一些优选实施方式中，seq id no:21中不存在x3以产生高同二聚体产量、非聚集、生物活性、非免疫原性的seq id no：26的犬胰岛素-fc融合蛋白，其表现出大于50mg/l的同二聚体效价、在狗中大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值，以及在狗中在一系列反复注射中的第三次注射后大于0.5的naocr值。如下示出seq id no:26，其中非天然氨基酸加有下划线：[0187]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:26)。[0188]在一些优选实施方式中，seq id no:21中x3是n以产生高同二聚体效价-产量、非聚集、生物活性、非免疫原性的seq id no：28的犬胰岛素-fc融合蛋白，其表现出大于50mg/l的同二聚体效价、在狗中大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值，以及在狗中在一系列反复注射中的第三次注射后大于0.5的naocr值。如下示出seq id no:28，其中非天然氨基酸加有下划线：[0189]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycngggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:28)。[0190]在一些优选的实施方式中，使用seq id no:13的优选接头将seq id no:18的优选的非糖基化、cng-s突变的犬iggb fc片段与seq id no:9的优选的b16a突变的胰岛素多肽序列组合以产生高同二聚体效价-产量、非聚集、生物活性、非免疫原性的seq id no：22的犬胰岛素-fc融合蛋白，其表现出大于50mg/l的同二聚体效价、在狗中大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值，以及在狗中在一系列反复注射中的第三次注射后大于0.5的naocr值。如下示出seq id no:22，其中非天然氨基酸加有下划线：[0191]fvnqhlcgsx1lvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqccx2stcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:22),其中x1不是d，x2不是h。[0192]在一个优选实施方式中，seq id no:22中x1是h并且x2是t以产生高同二聚体效价-产量、非聚集、生物活性、非免疫原性的seq id no：30的犬胰岛素-fc融合蛋白，其表现出大于50mg/l的同二聚体效价、在狗中大于150fbgl％·天数·kg/mg的naoc值，以及在狗中在一系列反复注射中的第三次注射后大于0.5的naocr值。如下示出seq id no:30，其中非天然氨基酸加有下划线：[0193]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:30)。[0194]seq id no:30的高可制备性和有效的超长效犬胰岛素-fc融合蛋白实施方式的意外发现引导发明人尝试为人类患者生产类似的可制备并且有效的超长效胰岛素-fc融合蛋白构型。[0195]人胰岛素-fc融合蛋白[0196]进行了进一步的实验以确定其他非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型是否表现出相同的行为。人igg1 fc片段一般构型如下，其中cng位点加有下划线：[0197]dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyx1styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:77),其中x1是s、d、a、r或q。[0198]胰岛素-fc融合蛋白实施方式包含seq id no:7的胰岛素多肽(无b16a突变)、seq id no:13的接头和具有cng突变选择以防止糖基化的人iggl fc片段构型(seq id no:77，其中x1是s、d、a、r或q)，如下所示：[0199]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:91)[0200]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqydstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:92)[0201]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:93)[0202]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyrstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:94)[0203]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:95)[0204]在含有seq id no:7的胰岛素多肽的实施方式中，使用seq id no:13的优选接头和seq id no:77的人igg1 fc片段，其中x1是s(cng-nb155-s–seq id no:91)、d(cng-nb155-d-seq id no:92)、a(cng-nb155-a–seq id no:93)、r(cng-nb155-r–seq id no:94)或q(cng-nb155-q–seq id no:95)，出乎意料地发现这些非糖基化的胰岛素-fc融合蛋白中的每一个相对于糖基化的母本物质(seq id no:76)提供改进的同二聚体效价。此外，对于seq id no:91、seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94和seq id no:95的去糖基化胰岛素-fc融合蛋白中的每一个，在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率(其中od450比率计算中使用的参考胰岛素-fc融合蛋白是seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白)均小于0.50，在1,000ng/ml的生物素化-c1q浓度下人c1q结合测定od450比率(其中od450比率计算中使用的参考胰岛素-fc融合蛋白是seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白)也小于0.35。然而，相对于糖基化母本物质(seq id no:76)，seq id no:91、seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94和seq id no:95的去糖基化胰岛素-fc融合蛋白都表现出较低的ir结合亲和力(较高的ir测定ic50值)和较低的fcrn结合亲和力(较高的ec50值)，这表明这些化合物很可能在体内生物活性和停留时间方面表现出不可接受的降低。出乎意料地，在包含seq id no:7的胰岛素多肽的实施方式中，使用seq id no:13的优选接头和seq id no:77的人iggl fc片段，其中x1是q(seq id no:95)，所得非糖基化胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体效价为136mg/l，因此该胰岛素-fc融合蛋白构型不满足150mg/l同二聚体效价的设计目标。[0205]图28示出seq id no：75(包含天然人igg2)和seq id no：76(包含天然人igg1)与包含seq id no:77的变体的seq id no：91、seq id no：92、seq id no：93、seq id no：94和seq id no：95的序列的并排序列比较。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。[0206]应用从关于此前讨论的犬胰岛素-fc融合蛋白构型的出乎意料的结果的学习，将在seq id no:91、seq id no:92、seq id no:93和seq id no:94的胰岛素-fc融合蛋白实施方式中的胰岛素多肽的b链上的第16个氨基酸(b16)突变为丙氨酸，得到seq id no:78(具有cng-nb155-s)、seq id no:80(具有cng-nb155-d)、seq id no:82(具有cng-nb155-a)、seq id no:84(具有cng-nb155-r)。当如上所描述将b16氨基酸突变为丙氨酸得到seq id no：10的胰岛素多肽时，在seq id no:78、seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白构型中，可接受的胰岛素受体结合出乎意料地恢复(即，ir结合和fcrn受体结合亲和力显著提高)，而并未有损于同二聚体效价的增加或fc(γ)ri和clq结合亲和力的降低。[0207]在一个优选的实施方式中，seq id no:78的人胰岛素-fc融合蛋白构型包含seq id no:10的胰岛素多肽、seq id no:13的接头和seq id no：77的人igg1 fc片段的cng-nb155-s突变体。seq id no：78的胰岛素-fc融合蛋白表现出大于150mg/l的同二聚体效价。如下示出seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白，其中b16a和cng-nb155-s突变加有下划线：[0208]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:78)。[0209]与犬胰岛素-fc融合蛋白构型的意外发现相似，与缺乏b16a突变的seq id no:91的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白实施方式的生物活性相比，seq id no:78的包含b16a突变和具有cng-nb155-s突变的人igg1 fc片段的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白实施方式的生物活性出乎意料地恢复(即，ir结合和fcrn受体结合亲和力显著提高)。seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白实施方式示出ir测定ic50值小于2400nm、更优选地小于2000nm，人fcrn测定ec50值小于1500ng/l、更优选地小于1000ng/ml，在3,000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率(其中od450比率计算中使用的参考胰岛素-fc融合蛋白是seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白)小于0.50，在1,000ng/ml的生物素化-c1q浓度下人c1q结合测定od450比率(其中od450比率计算中使用的参考胰岛素-fc融合蛋白是seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白)小于0.35。[0210]在一个优选的实施方式中，seq id no:80的胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no:10的胰岛素多肽、seq id no:13的接头和seq id no:77(x1是d)的fc片段的cng-nb155-d突变体。seq id no:80的胰岛素-fc融合蛋白表现出同二聚体效价大于150mg/l，ir测定ic50值小于2400nm，人fcrn测定ec50值小于1000ng/ml，在3,000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率小于0.50，在1,000ng/ml的生物素化-c1q浓度下人c1q结合测定od450比率小于0.35。如下示出seq id no:80，其中b16a和cng-nb155-d突变加有下划线：[0211]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqydstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:80)。[0212]在一个优选的实施方式中，seq id no:82的胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no:10的胰岛素多肽、seq id no:13的接头和seq id no:77(x1是a)的fc片段的cng-nb155-a突变体。seq id no:82的胰岛素-fc融合蛋白表现出同二聚体效价大于150mg/l，ir测定ic50值小于2400nm，人fcrn测定ec50值小于1000ng/ml，在3,000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率小于0.50，在1,000ng/ml的生物素化-c1q浓度下人c1q结合测定od450比率小于0.35。如下示出seq id no:82，其中b16a和cng-nb155-a突变加有下划线：[0213]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:82)。[0214]在一个优选的实施方式中，seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no:10的胰岛素多肽、seq id no:13的接头和seq id no:77(x1是r)的fc片段的cng-nb155-r突变体。seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白表现出同二聚体效价大于150mg/l，ir测定ic50值小于2400nm，人fcrn测定ec50值小于1000ng/ml，在3,000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率小于0.50，在1,000ng/ml的生物素化-c1q浓度下人c1q结合测定od450比率小于0.35。如下示出seq id no:84，其中b16a和cng-nb155-r突变加有下划线：[0215]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyrstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:84)。[0216]与seq id no:78的情况相同，当将胰岛素多肽的b链上的第16个氨基酸(b16)突变为丙氨酸(得到seq id no:10的胰岛素多肽)时，包含具有cng-nb155-d、cng-nb155-a、cng-nb155-r和cng-nb155-q突变的人iggl fc片段的的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型(seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94和seq id no:95)的生物活性恢复(即，ir结合和fcrn受体结合亲和力显著提高)，而未有损于seq id no:92、seq id no:93和seq id no:94的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价的增加或fc(γ)ri和c1q结合亲和力的降低(如此前所述，seq id no:95的胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价未满足150mg/l的设计目标)。[0217]然而，包含seq id no:10的胰岛素多肽、seq id no:13的接头和seq id no:77(x1是q)的fc片段的cng-nb155-q突变体的seq id no:86的胰岛素-fc融合蛋白未表现出seq id no:95的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型的fc(γ)ri和c1q结合亲和力降低，但是，seq id no:86的胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价从seq id no:95的同二聚体效价进一步降低至111mg/l，这不满足胰岛素-fc融合蛋白同二聚体效价大于150mg/l的设计目标。如下示出seq id no:86，其中b16a和cng-nb155-q突变加有下划线：[0218]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:86)。[0219]这些结果表明，在人igg1 fc片段上cng突变的选择与胰岛素多肽的组成之间存在出乎意料且显著的相互作用，因此需要进行实验以鉴定与所得胰岛素-fc融合蛋白的ir和fcrn结合亲和力有关的优选构型。[0220]在一些构型中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白构型在n端不包括前导氨基酸序列。在其他构型中，本文所述的胰岛素-fc融合蛋白构型例如在n端包括前导序列。在一些实施方式中，示例性前导序列包括氨基酸序列：mewswvflfflsvttgvhs(seq id no:24)。在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白构型由包含前导序列的核酸分子编码，例如用于在细胞(例如，真核细胞，例如哺乳动物细胞)中表达(例如，重组表达)。在某些实施方式中，前导序列例如在细胞培养物中在表达期间被切割。编码前导序列的示例性核酸序列包括如下核酸序列：[0221]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcc(seq id no:23)。在一些实施方式中，seq id no:23的示例性核酸编码seq id no:24的示例性前导序列。[0222]在包括seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白构型的优选实施方式中，该核酸序列(前导序列加有下划线)是：[0223]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacagcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:79)。[0224]在包括seq id no:80的胰岛素-fc融合蛋白构型的优选实施方式中，该核酸序列(前导序列加有下划线)是：[0225]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:81)。[0226]在包括seq id no:82的胰岛素-fc融合蛋白构型的实施方式中，该核酸序列(前导序列加有下划线)是：[0227]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:83)。[0228]在包括seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白构型的优选实施方式中，该核酸序列(前导序列加有下划线)是：[0229]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacagaagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:85)。[0230]在包括seq id no:86的胰岛素-fc融合蛋白构型的优选实施方式中，该核酸序列(前导序列加有下划线)是：[0231]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtaccaaagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:100)。[0232]在一些应用中，可能需要共价修饰胰岛素-fc融合蛋白以进一步改进其特性。例如，可以将胰岛素-fc融合蛋白与不同长度的聚乙二醇(peg)分子缀合，以进一步延长其循环半衰期，如dozier,j.；distefano,m.site-specific pegylation of therapeutic proteins.int.j.mol.sci.2015,16(10),25831-25864)中所描述。一种这样的缀合方法依赖于一类称为转谷氨酰胺转移酶(tgase)的酶，该酶在伯胺(例如，在peg分子的末端)和谷氨酰胺的羧胺基(例如，目标蛋白上的q，例如，目标胰岛素-fc融合蛋白上的q)经由酰基转移反应形成共价键(dozier,j.；distefano,m.,page 25853)。seq id no:86和seq id no:95的胰岛素-fc融合蛋白的nb153位的q是优选的tgase缀合位点，但因为每个胰岛素-fc融合蛋白包含gggggqggggqggggqggggg(seq id no:13)接头，该接头也将在q残基处缀合。因此，为了最大限度地减少接头q位点上不需要的tgase缀合，对接头中用于谷氨酰胺(q)突变的丙氨酸(a)进行了测试。因此，在一个优选的实施方式中，seq id no：87的胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no：10的胰岛素多肽、gggggaggggaggggaggggg(seq id no：67)的接头和seq id no:77(x1是s)的fc片段的cng-nb155-s突变体。seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白表现出同二聚体效价大于150mg/l，ir测定ic50值小于2400nm，人fcrn测定ec50值小于1000ng/ml，在3,000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率小于0.50，在1,000ng/ml的生物素化-c1q浓度下人c1q结合测定od450比率小于0.35。如下示出seq id no:87，其中b16a和cng-nb155-s突变以及接头序列加有下划线：[0233]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggaggggaggggagggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:87)。[0234]在包括seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白的实施方式中，该核酸序列(前导序列加有下划线)是：[0235]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtgcaggaggcggtggagccggtggaggtggggctggaggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacagcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:88)。[0236]已知fc融合蛋白缀合物中的接头长度影响融合蛋白的特性，范围从产量到生物活性。因此，对具有较短接头的胰岛素-fc融合蛋白构型进行了测试以确定由接头长度而导致的产量或功能的任何增加或损失。在另一个优选的实施方式中，seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no:10的胰岛素多肽、ggggagggg(seq id no:11)的接头和seq id no:77(x1是s)的fc片段的cng-nb155-s突变体。seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白表现出同二聚体效价大于150mg/l，ir测定ic50值小于2400nm，人fcrn测定ec50值小于1000ng/ml，在3,000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下人fc(γ)ri测定od450比率小于0.50，在1,000ng/ml的生物素化-c1q浓度下人c1q结合测定od450比率小于0.35。[0237]如下示出seq id no:89，其中b16a和cng-nb155-s突变以及接头序列加有下划线：[0238]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycggggaggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:89)。[0239]在包括seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白的实施方式中，该核酸序列(前导序列加有下划线)是：[0240]atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtgccggaggcgggggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacagcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttag(seq id no:90)。[0241]在一般优选的构型中，将seq id no：77(x1是s、d、a或r)的免疫原性较低、非糖基化、cng突变的人igg1 fc片段与seq id no:10的优选的b16a突变的胰岛素多肽和各种接头(seq id no:11、seq id no:13、seq id no:67)组合产生一族高同二聚体效价-产量、生物活性、非免疫原性人胰岛素-fc融合蛋白构型，预计该人胰岛素-fc融合蛋白构型表现出足以实现在糖尿病患者中长期每周一次给药的体内效力和持续作用时间。[0242]胰岛素-fc融合蛋白生产[0243]在一些实施方式中，如在实施例部分中更详细地描述的，可以用细胞表达融合蛋白。[0244]表达和纯化[0245]在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白可以重组表达，例如在真核细胞中，例如哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。用于表达的示例性哺乳动物细胞包括hek细胞(例如，hek293细胞)或cho细胞。cho细胞可以细分为不同的株或亚类(例如cho dg44、cho-m和cho-k1)，并且这些细胞株中的一些可以通过基因工程改造以与实施例部分所描述的特定类型的核酸分子(例如，包含dna的载体)或特定细胞生长培养基组合物一起优化使用。在一些实施方式中，用编码胰岛素-fc融合蛋白的核酸分子(例如，载体)转染细胞(例如，其中整个胰岛素-fc融合蛋白由单一核酸分子编码)。在一些实施方式中，用编码胰岛素-fc融合蛋白的载体转染hek293细胞，但仅导致在宿主细胞停止表达明显水平的胰岛素-fc融合蛋白(即瞬时转染)之前暂时表达胰岛素-fc融合蛋白一段时间(例如，3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天或更长时间)。用编码胰岛素-fc融合蛋白的核酸序列瞬时转染的hek293细胞通常允许更快速地生产重组蛋白，这有助于制备和筛选多种胰岛素-fc融合蛋白候选物。在一些实施方式中，只要细胞被适当培养，即用永久掺入宿主细胞dna并导致胰岛素-fc融合蛋白的一致和永久表达(即，稳定转染)的载体转染cho细胞。用编码胰岛素-fc融合蛋白的核酸稳定转染的cho细胞和cho细胞系通常需要更长的时间来开发，但它们通常产生更高的总蛋白质产量并且更适合制备低成本产品(例如，用于相对商品化的人胰岛素市场的产品)。可以使用本领域的标准方法培养细胞和细胞系。[0246]在一些优选的实施方式中，使用包含具有如下各项的cdna序列中的任意一个的hek细胞来表达胰岛素-fc融合蛋白：seq id no:79(对应于seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)、seq id no:81(对应于seq id no:80的胰岛素-fc融合蛋白的实施方式)、seq id no:83(对应于seq id no:82的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)、seq id no:85(对应于seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)、seq id no:88(对应于seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)和seq id no:90(对应于seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)。在一些优选的实施方式中，使用包含具有如下各项的cdna序列中的任意一个的cho细胞来表达胰岛素-fc融合蛋白：seq id no:79(对应于seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)、seq id no:81(对应于seq id no:80的胰岛素-fc融合蛋白的实施方式)、seq id no:83(对应于seq id no:82的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)、seq id no:85(对应于seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)、seq id no:88(对应于seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)和seq id no:90(对应于seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白实施方式)。[0247]在一些实施方式中，从细胞中纯化或分离(例如，通过细胞裂解)胰岛素-fc融合蛋白。在其他实施方式中，由细胞分泌并且从细胞在其中生长的细胞培养基中纯化或分离胰岛素-fc融合蛋白。胰岛素-fc融合蛋白的纯化可以包括使用柱层析(例如，亲和层析)或使用基于某些分子的大小、电荷和/或亲和力差异的其他分离方法。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的纯化涉及筛选或富集含有fc片段的蛋白质，例如，通过使用蛋白质a珠或蛋白质a柱使含有fc片段的蛋白质在中性溶液ph下以高亲和力结合至与蛋白质a珠共价结合的蛋白质a。然后可以通过溶液变量的变化(例如溶液ph值的降低)从蛋白质a珠洗脱结合的胰岛素-fc融合蛋白。其他分离方法诸如离子交换色谱法和/或凝胶过滤色谱法也可以替代地或另外地使用。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的纯化进一步包括对蛋白质制备物进行过滤或离心。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的进一步纯化包括渗滤、超滤和通过各种尺寸的多孔膜的过滤，以及使用赋形剂的最终配制。[0248]可以使用多种方法来表征纯化的胰岛素-fc融合蛋白，例如纯度、总蛋白质产量、结构和/或活性，所述各种方法例如280nm处的吸光度(例如，用于确定总蛋白质产量)、尺寸排阻或毛细管电泳(例如，用于确定分子量、聚集百分比和/或纯度)、质谱(ms)和/或液相色谱(lc-ms)(例如，用于确定纯度和/或糖基化)，和/或elisa(例如，用于确定与抗胰岛素抗体的结合程度，例如亲和力)。示例性的表征方法也在实施例部分中进行了描述。[0249]在一些实施方式中，在瞬时转染的hek细胞中产生和蛋白质a纯化后的胰岛素-fc融合蛋白的总蛋白质产量大于5mg/l、10mg/l或20mg/l。在一些优选实施方式中，在瞬时转染的hek细胞中产生和蛋白质a纯化后的人胰岛素-fc融合蛋白的总蛋白质产量大于100mg/l(例如，大于150mg/l)。在一些实施方式中，在瞬时转染的hek细胞中产生和蛋白质a纯化后，胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体％大于70％(例如，大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)。在一些优选实施方式中，在瞬时转染的hek细胞中产生和蛋白质a纯化后的人胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体效价大于100mg/l(例如，大于150mg/l)，该同二聚体效价的计算为胰岛素-fc融合总蛋白质产量与同二聚体％的乘积。认为只有同二聚体效价大于150mg/l的人胰岛素-fc融合蛋白构型可用于本发明，因为经验表明，低于该水平的同二聚体效价不太可能在cho细胞中导致商业生产效价，以满足相对商品化的人胰岛素市场的低制备成本要求。[0250]在一些实施方式中，在稳定转染的cho细胞(例如，cho细胞系或cho细胞克隆)中产生和蛋白质a纯化后的胰岛素-fc融合蛋白的总蛋白质产量为大于100mg胰岛素-fc融合蛋白/l(例如，mg/l的培养基)。在一些优选实施方式中，在稳定转染的cho细胞(例如，cho细胞系或cho细胞克隆)中产生和蛋白质a纯化后的胰岛素-fc融合蛋白的总蛋白质产量为大于150mg胰岛素-fc融合蛋白/l培养基(例如，大于200mg/l、大于300mg/l、大于400mg/l、大于500mg/l、大于600mg/l或更多)。在一些实施方式中，在稳定转染的cho细胞(例如，cho细胞系或cho细胞克隆)中产生和蛋白质a纯化后的胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体％大于70％(例如，大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)。在一些实施方式中，在稳定转染的cho细胞(例如，cho细胞系或cho细胞克隆)中产生和蛋白质a纯化后的胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体效价大于150mg/l(例如，大于200mg/l、大于300mg/l、大于400mg/l、大于500mg/l、大于600mg/l或更多)，该同二聚体效价的计算为胰岛素-fc融合总蛋白质产量与同二聚体％的乘积。[0251]胰岛素-fc融合蛋白的功能特征[0252]本文描述了用于与胰岛素受体相互作用以降低目标受试者(例如，狗或人)中的血糖的方法，其中所述方法包括向受试者给药胰岛素-fc融合蛋白，例如本文所描述的融合蛋白。在一些实施方式中，受试者已被诊断为患有糖尿病(例如，对于狗而言犬糖尿病，或者对于人而言1型糖尿病或2型糖尿病)。[0253]在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白以明显的亲和力与ir结合，如通过实施例12所述的4℃ im-9ir结合测定中的ic50(例如，ic50小于5000nm、ic50小于4000nm、ic50小于3000nm、ic50小于2400nm、ic50小于2000nm)所测量的。根据经验，仅认为表现出ir活性ic50值小于5000nm、优选地小于2400nm、更优选地小于2000nm的化合物可能在目标受试者中表现出生物活性。一般而言，优选较高亲和力的ir结合(即，较低的ic50值)。然而，众所周知，胰岛素和胰岛素类似物(例如，本文所描述的胰岛素多肽)的清除主要通过与ir结合随后ir在细胞内内化和降解来调控。因此，具有过高ir结合亲和力(即，ic50过低，例如小于500nm的ic50)的胰岛素-fc融合蛋白构型可能过快地从循环中清除，导致葡萄糖降低生物活性在目标受试者中的持续时间低于期望的持续时间。[0254]在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白构型以高于根据实施例19测量的胰岛素-fc融合蛋白参考标准的亲和力与fcrn受体结合。在一些实施方式中，为如本文所描述并通过人fcrn受体测定法测量的胰岛素-fc融合蛋白构型的fcrn受体亲和力ec50值小于或等于1500ng/ml，更优选地小于或等于1000ng/ml。[0255]在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白在受试者中给药后能够降低葡萄糖水平(例如，血糖水平)。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的葡萄糖降低活性高于胰岛素参考标准的葡萄糖降低活性。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的活性持续时间可以通过空腹血糖相对于给药前空腹血糖水平的降低例如统计学上的显著降低来测量。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的活性持续时间(例如，受试者的空腹血糖水平相对于给药前水平在统计学上显著降低的持续时间)超过约2小时。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的活性持续时间(例如，受试者的空腹血糖水平相对于给药前水平在统计学上显著降低的持续时间)超过约6小时、9小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白是长效的(例如，具有长的半衰期，例如在血清中)。[0256]在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白在目标受试者中的血清半衰期比胰岛素参考标准或对照制剂的血清半衰期长。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白在目标受试者中的血清半衰期(例如，在给药后受试者的血液中)超过约2小时。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白在目标受试者中的血清半衰期为约0.5天、1天、2天或2.5天。在一些优选实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白在目标受试者中的血清半衰期为约3天或更长。[0257]在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白的效力和生物活性持续时间的组合可以通过计算归一化到以mg/kg(naoc)计的给定剂量的空腹血糖百分比(fbgl％)曲线上方的面积来量化，单位为fbgl％·天数·kg/mg。在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白的naoc大于150fbgl％·天数·kg/mg(例如大于200fbgl％·天数·kg/mg、大于250fbgl％·天数·kg/mg或更大)。再次，根据经验，在naoc值大于150fbgl％·天数·kg/mg时，目标受试者的剂量需求将低到足以实现可接受的治疗成本。在一些实施方式中，在目标受试者中反复给药后，胰岛素-fc融合蛋白的naoc必须保持(即，胰岛素-fc融合蛋白第三次给药后的naoc与第一次给药后的naoc的比率)大于0.5(例如，大于0.6、大于0.7、大于0.8、大于0.9或更大)。[0258]在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白构型以低于根据实施例15测量的胰岛素-fc融合蛋白参考标准的亲和力与fc(γ)受体结合。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的fc(γ)受体亲和力与胰岛素-fc融合蛋白参考标准(即，seq id no：76的胰岛素-fc融合蛋白)的fc(γ)受体亲和力的比率小于0.50(例如，小于0.40、小于0.30、小于0.20)。在一些实施方式中，如通过在3000ng/ml生物素化fc(γ)ri下的人fc(γ)ri受体测定od450比率(相对于seq id no：76的参考胰岛素-fc融合蛋白)所测量的，胰岛素-fc融合蛋白的fc(γ)受体亲和力小于或等于0.50。[0259]在一些实施方式中，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白构型以低于根据实施例16测量的胰岛素-fc融合蛋白参考标准的亲和力与c1q结合。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白的c1q结合亲和力与胰岛素-fc融合蛋白参考标准(即，seq id no：76的胰岛素-fc融合蛋白)的c1q结合亲和力的比率小于0.50(例如，小于0.40、小于0.30、小于0.20)。在一些实施方式中，如通过在1000ng/ml生物素化c1q的浓度下的人c1q结合测定od450比率(相对于seq id no：76的参考胰岛素-fc融合蛋白)所测量的，胰岛素-fc融合蛋白的c1q结合亲和力小于或等于0.35。[0260]治疗方法和受试者选择的特征[0261]本文描述了用于治疗糖尿病(例如，人的1型糖尿病或2型糖尿病)的方法，该方法包括将胰岛素-fc融合蛋白(例如，本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白构型)给药于目标受试者。[0262]在一些实施方式中，本文所描述的任何方法中使用的参考标准包括参考治疗或参考疗法。在一些实施方式中，参考包括用于糖尿病治疗的标准护理剂(例如，用于犬糖尿病的标准护理剂或用于人1型糖尿病的标准护理剂或用于人2型糖尿病的标准护理剂)。在一些实施方式中，参考标准是市售胰岛素或胰岛素类似物。在一些实施方式中，参考标准包括长时程胰岛素(long-lasting insulin)、中时程胰岛素、短时程胰岛素、速效胰岛素、短效、中效、长效胰岛素。在一些实施方式中，犬胰岛素的参考标准包括中效、长效胰岛素。在一些实施方式中，犬胰岛素的参考标准包括胰岛素nph、胰岛素甘精或重组人胰岛素。在一些实施方式中，人胰岛素的参考标准包括(novo nordisk,denmark)、(novo nordisk,denmark)、(eli lilly,indianapolis,in)、(eli lilly,indianapolis,in)、和或通用重组人胰岛素。[0263]在一些实施方式中，本文所描述的任何方法中使用的参考标准包括糖尿病疗法(例如犬糖尿病疗法或人糖尿病疗法)的结果，例如本文所描述的结果。[0264]在一些实施方式中，参考标准是在开始治疗(例如本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白治疗)之前目标受试者中的标志物(例如，血糖或hba1c)水平；其中目标受试者患有糖尿病。在一些实施方式中，在开始治疗之前，目标受试者的血糖水平大于200mg/dl(例如大于250mg/dl、300mg/dl、350mg/dl、400mg/dl或更高)。在一些实施方式中，在开始治疗之前，狗的果糖胺水平大于250微摩尔/l、350微摩尔/l(例如大于400微摩尔/l、450微摩尔/l、500微摩尔/l、550微摩尔/l、600微摩尔/l、650微摩尔/l、700微摩尔/l、750微摩尔/l或更高)。在一些实施方式中，在开始治疗之前，人目标受试者的hba1c水平大于7mmol/l(例如大于7.5mmol/l、8mmol/l、9mmol/l、10mmol/l、11mmol/l、12mmol/l，或更高)。在一些实施方式中，参考标准是疾病的存在、进展或严重程度的量度。在一些实施方式中，参考标准是在开始治疗(例如本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白治疗)之前疾病症状的存在或严重程度的量度；其中目标受试者患有糖尿病。[0265]药物组合物及其给药途径[0266]本文提供了包含如本文所描述的胰岛素-fc融合蛋白构型的药物组合物，其可以用于降低目标受试者的血糖。药物组合物中胰岛素-fc融合蛋白的量和浓度以及向目标受试者给药的药物组合物的量可以基于临床相关因素来选择，诸如受试者的医学相关特征(例如，年龄、体重、性别、其他医学病症等)、化合物在药物组合物中的溶解度、化合物的效力和活性以及药物组合物的给药方式。对于给药途径和剂量方案的更多信息，请读者参阅chapter 25.3in volume 5of comprehensive medicinal chemistry(corwin hansch；chairman of editorial board),pergamon press 1990。[0267]本公开的制剂包括那些适合肠胃外给药的制剂。如本文所用，短语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过静脉内或皮下注射。[0268]可用于本公开的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油诸如橄榄油和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。例如，通过使用包覆材料诸如卵磷脂通过在分散体的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂例如吐温样表面活性剂可以保持适当的流动性。在一些实施方式中，药物组合物(例如，如本文所描述)包含吐温样表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20、吐温-20或吐温-80。在一些实施方式中，药物组合物(例如，如本文所描述)包含浓度为约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.1％、或约0.01％和约0.5％的吐温样表面活性剂，例如吐温-80。[0269]在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白在水性载体中的浓度为约3mg/ml。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白在水性载体中的浓度为约6mg/ml。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白在水性载体中的浓度为约8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml或更高。[0270]在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白以团注、输注或静脉推注的形式给药。在一些实施方式中，融合蛋白通过注射器注射、泵、笔、针或留置导管给药。在一些实施方式中，胰岛素-fc融合蛋白通过皮下弹丸注射给药。引入方法也可以通过可充电或可生物降解的装置来提供。近年来，已经开发了各种缓释聚合物装置并在体内进行了测试，以用于药物包括蛋白质类生物药物的受控递送。包括可生物降解的聚合物和不可降解的聚合物两者在内的多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)可以用于形成用于在特定靶位点持续释放化合物的植入物。[0271]剂量[0272]可以改变本文所描述构型的胰岛素-fc融合蛋白的实际剂量水平以获得有效实现特定目标受试者(例如，犬或人)的所需治疗反应的活性成分量。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的特定融合蛋白或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定融合蛋白组合使用的其他药物、化合物和/或材料、接受治疗的受试者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中公知的类似的因素。[0273]一般而言，胰岛素-fc融合蛋白的合适剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。一般而言，用于目标受试者的胰岛素-fc融合蛋白的静脉内和皮下剂量范围为每天每千克体重约0.001至约1mg(例如mg/kg)，例如约0.001至1mg/kg/天，约0.01至0.1mg/kg/天，约0.1至1mg/kg/天，或约0.01至1mg/kg/天。在另一些实施方式中，融合蛋白以每周每千克体重0.025至4mg、例如0.025至1.0mg/kg/周的剂量给药。[0274]本公开内容涵盖将胰岛素-fc融合蛋白配制在任何上述药物组合物和制剂中。此外，本公开内容涵盖经由任何上述给药途径给药。本领域技术人员可以根据所治疗的病症和接受治疗的受试者的整体健康、年龄和体型来选择合适的制剂和给药途径。[0275]实施例[0276]通过以下实施例对本技术进行进一步说明，不应解释为以任何方式进行限制。[0277]通用方法、测定及材料[0278]实施例1：在hek293细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白的方法及合成[0279]按照如下所述合成胰岛素-fc融合蛋白。使用专用软件(lakepharma，belmont，ca)构建目的基因序列，并将其克隆到高表达哺乳动物载体中。在转染前24小时将hek293细胞接种在摇瓶中，并使用无血清的化学成分确定的培养基培养。使用用于瞬时转染的(lakepharma,belmont,ca)标准操作规程将编码目的胰岛素-fc融合蛋白的dna表达构建体瞬时转染到hek293细胞悬液中。20小时后，对细胞进行计数以确定活力和活细胞数，并通过(pall fortébio llc,fremont,ca)测量效价。在整个瞬时转染生产运行过程中获得额外的读数。在第5天或之后收获培养物。[0280]实施例2：在cho细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白的方法及合成[0281]cho细胞系最初来源于cho-k1(lakepharma,belmont,ca)，使用本领域中已知的方法通过重组技术敲除内源谷氨酰胺合成酶(gs)基因。针对cho表达和gs选择设计和优化稳定表达dna载体，并将其整合到高表达哺乳动物载体(lakepharma，belmont，ca)中。在开始扩增实验之前，确认每个完成的构建体的序列。在37℃培养箱中于加湿的5％co2下在化学成分确定的培养基(cd opticho；invitrogen，carlsbad，ca)中培养适应悬液的cho细胞。在培养cho细胞中未使用血清或其他动物来源的产品。[0282]使用系统(maxcyte,inc.,gaithersburg,md)通过电穿孔用80μg dna转染在指数生长期期间培养于cd opticho培养基中的约8000万个悬浮-适应cho细胞，以针对每种胰岛素-fc融合蛋白产生稳定的cho细胞系(dna构建体包含胰岛素-fc融合蛋白的全长序列)。24小时后，对转染的细胞进行计数，并对其针对稳定整合胰岛素-fc融合基因进行选择。将转染的细胞以0.5×106个细胞/ml的细胞密度接种到摇瓶中的含有0-100μm甲硫氨酸磺酰亚胺(msx)的cd opticho选择培养基中，并在37℃和5％co2下孵育。在选择过程中，每2至3天将细胞离心并重悬于新鲜的选择培养基中，直到cho稳定池(pool)恢复其生长速率和活力。监测细胞培养物的生长和效价。[0283]将细胞培养至2.5×106个细胞/ml。在收获细胞库(cell banking)时，存活率高于95％。然后将细胞离心，将细胞沉淀物重悬于含有7.5％二甲亚砜(dmso)的cd opticho培养基中，至细胞计数达到15×106个细胞/ml/小瓶。将小瓶冷冻保存在液氮中储存。[0284]按照如下所述使用cho细胞进行小规模生产。在37℃下，在含有100μm msx的cd opticho生长培养基中将细胞扩增生产，并根据需要每2至4天补料一次，cd opticho生长培养基根据需要添加葡萄糖和额外的氨基酸，保持约14至21天。通过离心机旋转使从稳定池生产运行中收获的条件培养基上清液澄清。使蛋白质通过用结合缓冲液预平衡的蛋白质a(mabselect，ge healthcare，little chalfont，英国)柱。然后使洗涤缓冲液通过柱，直到测量到od280值(nanodrop，thermo scientific)处于或接近背景水平。使用低ph缓冲液洗脱胰岛素-fc融合蛋白，收集洗脱级分，并记录每种级分的od280值。合并含有目标胰岛素-fc融合蛋白的级分并任选地使用0.2μm膜过滤器进一步过滤。[0285]任选地将细胞系进一步亚克隆为单克隆，并且任选地采用有限稀释法(本领域技术人员已知的方法)进一步选择表达高效价胰岛素-fc-融合蛋白的克隆。在获得表达高效价单克隆胰岛素-fc融合蛋白的细胞系后，如上所述在不含msx的生长培养基中或任选地在含有msx的生长培养基中完成胰岛素-fc融合蛋白的生产，以获得含有重组的、cho制备的胰岛素-fc融合蛋白的细胞培养上清液。任选地随时间增加msx浓度以为能够产生较高产品效价的克隆赋予额外的选择性。[0286]实施例3：在cho细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白的方法及合成[0287]cho细胞系最初来源于cho-k1(lakepharma,belmont,ca)，使用本领域中已知的方法通过重组技术敲除内源谷氨酰胺合成酶(gs)基因。针对cho表达和gs选择设计和优化稳定表达dna载体，并将其整合到高表达哺乳动物载体(lakepharma，belmont，ca)中。在开始扩增实验之前，确认每个完成的构建体的序列。在37℃培养箱中于加湿的5％co2下在化学成分确定的培养基(cd opticho；invitrogen，carlsbad，ca)中培养适应悬液的cho细胞。在培养cho细胞中未使用血清或其他动物来源的产品。[0288]使用系统(maxcyte,inc.,gaithersburg,md)通过电穿孔用80μg dna转染在指数生长期期间培养于cd opticho培养基中的约8000万个悬浮-适应cho细胞，以针对每种胰岛素-fc融合蛋白产生稳定的cho细胞系(dna构建体包含胰岛素-fc融合蛋白的全长序列)。24小时后，对转染的细胞进行计数，并对其针对稳定整合胰岛素-fc融合基因进行选择。将转染的细胞以0.5×106个细胞/ml的细胞密度接种到摇瓶中的含有0-100μm甲硫氨酸磺酰亚胺(msx)的cd opticho选择培养基中，并在37℃和5％co2下孵育。在选择过程中，每2至3天将细胞离心并重悬于新鲜的选择培养基中，直到cho稳定池(pool)恢复其生长速率和活力。监测细胞培养物的生长和效价。[0289]将细胞培养至2.5×106个细胞/ml。在收获细胞库(cell banking)时，存活率保持在高于95％。然后将细胞离心，将细胞沉淀物重悬于含有7.5％二甲亚砜(dmso)的cd opticho培养基中，至细胞计数达到15×106个细胞/ml/小瓶。将小瓶冷冻保存在液氮中储存。[0290]按照如下所述使用cho细胞进行小规模生产。在37℃下，在含有100μm msx的cd opticho生长培养基中将细胞扩增生产，并根据需要每2至4天补料一次，cd opticho生长培养基根据需要添加葡萄糖和额外的氨基酸，保持约14至21天。通过离心机旋转使从稳定池生产运行中收获的条件培养基上清液澄清。使蛋白质通过用结合缓冲液的预平衡的蛋白质a(mabselect，ge healthcare，little chalfont，英国)柱。然后使洗涤缓冲液通过柱，直到测量到od280值(nanodrop，thermo scientific)处于或接近背景水平。使用低ph缓冲液洗脱胰岛素-fc融合蛋白，收集洗脱级分，并记录每种级分的od280值。合并含有目标胰岛素-fc融合蛋白的级分并任选地使用0.2μm膜过滤器进一步过滤。[0291]任选地将细胞系进一步亚克隆为单克隆，并且任选地采用有限稀释法(本领域技术人员已知的方法)进一步选择表达高效价胰岛素-fc-融合蛋白的克隆。在获得表达高效价单克隆胰岛素-fc融合蛋白的细胞系后，如上所述在不含msx的生长培养基中或任选地在含有msx的生长培养基中完成胰岛素-fc融合蛋白的生产，以获得含有重组的、cho制备的胰岛素-fc融合蛋白的细胞培养上清液。任选地随时间增加msx浓度以为能够产生较高产品效价的克隆赋予额外的选择性。[0292]实施例4：胰岛素-fc融合蛋白的纯化。[0293]按照如下所述进行胰岛素-fc融合蛋白的纯化。从瞬时转染的hek、稳定转染的hek或稳定转染的cho生产运行中收获含有分泌的胰岛素-fc融合蛋白的条件培养基上清液并通过离心澄清。使含有所需胰岛素-fc融合蛋白的上清液通过蛋白a柱，用包括0.15-0.50m氯化钠在内的各种洗涤缓冲液洗涤，然后用低ph溶液洗脱。之后，将含有所需蛋白质的洗脱级分合并，并且缓冲液更换成200mm hepes、100mm nacl、50mm naoac、ph 7.0缓冲液。使用0.2μm膜过滤器进行最终过滤步骤。最终蛋白质浓度由溶液在280nm处的光密度计算。必要时通过离子交换色谱(例如使用阴离子交换珠树脂或阳离子交换珠树脂)、凝胶过滤色谱或其他方法进行进一步任选的纯化。[0294]实施例5：胰岛素-fc融合蛋白的纯化。[0295]按照如下所述进行胰岛素-fc融合蛋白的纯化。从瞬时转染的hek、稳定转染的hek或稳定转染的cho生产运行中收获含有分泌的胰岛素-fc融合蛋白的条件培养基上清液并通过离心澄清。使含有所需胰岛素-fc融合蛋白的上清液通过蛋白a柱，用包括0.15-0.50m氯化钠在内的各种洗涤缓冲液洗涤，然后用低ph溶液洗脱。之后，将含有所需蛋白质的洗脱级分合并，并且缓冲液更换成200mm hepes、100mm nacl、50mm naoac、ph 7.0缓冲液。使用0.2μm膜过滤器进行最终过滤步骤。最终蛋白质浓度由溶液在280nm处的光密度计算。必要时通过离子交换色谱(例如使用阴离子交换珠树脂或阳离子交换珠树脂)、凝胶过滤色谱或其他方法进行进一步任选的纯化。[0296]实施例6：通过非还原和还原ce-sds确认结构。[0297]在gxii(perkin elmer,waltham,ma)中对纯化的胰岛素-fc融合蛋白溶解在200mm hepes、100mm nacl、50mm naoac、ph 7.0缓冲液中的溶液进行毛细管电泳十二烷基硫酸钠(ce-sds)分析,并绘制电泳图。在非还原条件下，根据已知分子量(mw)蛋白质标准运行样品，洗脱峰代表胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的“表观”mw。[0298]在还原条件下(例如，使用β-巯基乙醇破坏胰岛素-fc融合同二聚体的二硫键)，将所得胰岛素-fc融合蛋白单体的表观mw与胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的分子量的一半进行比较以确定胰岛素-fc融合蛋白的结构纯度可能是准确的。[0299]实施例7：通过非还原和还原ce-sds确认结构。[0300]在gxii(perkin elmer,waltham,ma)中对纯化的胰岛素-fc融合蛋白溶解在200mm hepes、100mm nacl、50mm naoac，ph 7.0缓冲液中的溶液进行毛细管电泳十二烷基硫酸钠(ce-sds)分析,并绘制电泳图。在非还原条件下，根据已知分子量(mw)蛋白质标准运行样品，洗脱峰代表胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的“表观”分子量mw。[0301]在还原条件下(例如使用β-巯基乙醇破坏胰岛素-fc融合同二聚体的二硫键)，将所得胰岛素-fc融合蛋白单体的表观mw与胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的分子量的一半进行比较以确定胰岛素-fc融合蛋白的结构纯度可能是准确的。[0302]实施例8：利用对含聚糖化合物进行聚糖去除通过lc-ms进行序列鉴定。[0303]在胰岛素-fc融合蛋白天然糖基化的情况下，为了通过质谱(ms)准确估计胰岛素-fc融合蛋白的质量，首先处理样品以去除可能干扰ms分析的天然聚糖。首先使用zeba脱盐柱(pierce，thermofisher scientific，waltham，ma)将溶解在200mm hepes、100mm nacl、50mm naoac、ph 7.0缓冲液中的100μl的2.5mg/ml胰岛素-fc融合蛋白缓冲液更换到含有5mm edta的0.1m tris、ph 8.0缓冲液中。向该溶液中加入1.67μl pngase f酶(prozyme n-聚糖酶)，以去除融合蛋白中存在的n-连接聚糖(例如，连接到位于cng-n位点的天冬酰胺侧链的聚糖),并将混合物在培养箱中于37℃孵育过夜。然后经由lc-ms(novabioassays,woburn,ma)分析样品，得到对应于不含聚糖的所需同二聚体的分子的分子量。然后进一步校正该质量，因为用于从cng-天冬酰胺切割聚糖的酶促过程也使天冬酰胺侧链脱氨基形成天冬氨酸，并且在这样做时，经酶促处理的同二聚体总体获得2da，对应于同二聚体中存在的每条链1da的质量。因此，实际分子量是所测量的质量减去2da，以校正分析样品中胰岛素-fc融合蛋白结构的酶促修饰。[0304]在胰岛素-fc融合蛋白氨基酸组成阻止cng位点发生天然糖基化的情况下，采用lc-ms(novabioassays，woburn，ma)直接获得胰岛素-fc融合蛋白质量的准确估计值，而无需用pngase酶预处理分子。[0305]实施例9：利用对含聚糖化合物进行聚糖去除通过lc-ms进行序列鉴定。[0306]在胰岛素-fc融合蛋白天然糖基化的情况下，为了通过质谱(ms)准确估计胰岛素-fc融合蛋白的质量，首先处理样品以去除可能干扰ms分析的天然聚糖。首先使用zeba脱盐柱(pierce，thermofisher scientific，waltham，ma)将溶解在200mm hepes、100mm nacl、50mm naoac、ph 7.0缓冲液中的100μl的2.5mg/ml胰岛素-fc融合蛋白缓冲液更换到含有5mm edta的0.1m tris、ph 8.0缓冲液中。向该溶液中加入1.67μl pngase f酶(prozyme n-聚糖酶)，以去除融合蛋白中存在的n-连接聚糖(例如，连接到位于cng-n位点的天冬酰胺侧链的聚糖),并将混合物在培养箱中于37℃孵育过夜。然后经由lc-ms(novabioassays,woburn,ma)分析样品，得到对应于不含聚糖的所需同二聚体的分子的分子量。然后进一步校正该质量，因为用于从cng-天冬酰胺切割聚糖的酶促过程也使天冬酰胺侧链脱氨基形成天冬氨酸，并且在这样做时，经酶促处理的同二聚体总体获得2da，对应于同二聚体中存在的每条链1da的质量。因此，实际分子量是所测量的质量减去2da，以校正分析样品中胰岛素-fc融合蛋白结构的酶促修饰。[0307]在胰岛素-fc融合蛋白氨基酸组成阻止cng位点发生天然糖基化的情况下，能够采用lc-ms(novabioassays，woburn，ma)直接获得胰岛素-fc融合蛋白质量的准确估计值，而无需用pngase酶预处理分子。[0308]实施例10：通过尺寸排阻色谱法得到同二聚体％。[0309]使用连接至2998光电二极管阵列的waters 2795ht hplc(waters corporation,milford,ma)在280nm波长处进行胰岛素-fc融合蛋白的尺寸排阻色谱(sec-hplc)。将100μl或更少的含目的胰岛素-fc融合蛋白的样品注入到mabpac sec-1,5μm,4×300mm柱(thermofisher scientific,waltham,ma)中，流速为0.2ml/min，流动相包含50mm磷酸钠、300mm nacl和0.05％w/v叠氮化钠，ph 6.2。mabpac sec-1柱根据分子大小分离原理工作。因此，较大的可溶性胰岛素-fc聚集体(例如，胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的多聚体)在较早的截留时间洗脱，而未聚集的同二聚体在较晚的截留时间洗脱。在经由分析用的sec-hplc将同二聚体混合物与聚集的多聚同二聚体分离时，以非聚集同二聚体百分比计的胰岛素-fc融合蛋白溶液的纯度被确定。[0310]实施例11：通过尺寸排阻色谱法得到同二聚体％。[0311]使用连接至2998光电二极管阵列的waters 2795ht hplc(waters corporation,milford,ma)在280nm波长处进行胰岛素-fc融合蛋白的尺寸排阻色谱(sec-hplc)。将100μl或更少的含目标胰岛素-fc融合蛋白的样品注入到mabpac sec-1,5μm,4×300mm柱(thermofisher scientific,waltham,ma)中，流速为0.2ml/分钟，流动相包含50mm磷酸钠、300mm nacl和0.05％w/v叠氮化钠，ph 6.2。mabpac sec-1柱根据分子大小分离原理工作。因此，较大的可溶性胰岛素-fc聚集体(例如，胰岛素-fc融合蛋白同二聚体的多聚体)在较早的截留时间洗脱，而未聚集的同二聚体在较晚的截留时间洗脱。在经由分析用sec-hplc将同二聚体混合物与聚集的多聚同二聚体分离时，以非聚集同二聚体百分比计的胰岛素-fc融合蛋白溶液的纯度被确定。[0312]实施例12：在4℃下示例性胰岛素-fc融合蛋白的体外im-9胰岛素受体(ir)结合。[0313]在完全rpmi 5％fbs培养基中培养表达人ir的人im-9细胞(attc#ccl-159)并维持70-80％的融合度。将im-9细胞培养物以250×g(～1000rpm)离心10分钟以沉淀细胞。用hbss或pbs缓冲液洗涤细胞一次，重悬于冷facs染色培养基(hbss/2mm edta/0.1％叠氮化钠+4％马血清)中至浓度为8×106个细胞/ml，并保持在冰上或4℃直到制备成测试溶液。在1.2ml管中于facs缓冲液中以1:3连续稀释将胰岛素-fc蛋白稀释为2×浓度(每次稀释的体积为约60μl)，将溶液在冰上保持冷却，直到准备移液。[0314]将生物素化的rhi在facs染色培养基中稀释至1.25μg/ml的浓度。将40μl的连续稀释的受试化合物和8μl的1.25μg/ml的生物素-rhi添加到v底微量滴定板的每个孔中，通过缓慢涡旋混合，并置于冰上。然后通过多通道移液器将40μl的im-9细胞悬液(8×106个细胞/ml)添加到每个孔中，再次轻轻混合并在冰上孵育30分钟，以允许在im-9细胞上竞争性结合ir。然后通过将v型底板以3000rpm离心3分钟并吸出上清液用275μl冰冷的facs洗涤缓冲液(hbss/2mm edta/0.1％叠氮化钠+0.5％马血清)洗涤细胞两次。接着在冰上将细胞在40μl含有1:100稀释的streptavidin-pe(life technologies)的facs染色培养基中重悬20分钟。然后用275μl冰冷的facs缓冲液洗涤细胞一次，最后在室温下用3％多聚甲醛固定10分钟。然后用275μl冰冷的facs缓冲液洗涤细胞一次，并重悬于250μl的facs缓冲液中用于分析。[0315]然后在guava 8-ht流式细胞仪(millipore)上分析含有细胞的v型底板。对于每种浓度的受试化合物，通过facs fl-2通道上细胞的中值荧光强度(mfi)对与ir结合的生物素化rhi进行定量。对照孔仅用生物素化-rhi标记并用于计算由每种受试化合物浓度得到的抑制百分比(％)。将受试化合物对im-9细胞上生物素化rhi结合的抑制百分比与受试化合物的对数浓度作图，并使用graphpad prism(graphpad software,la jolla,ca)计算受试化合物的所得ic50值。因此，受试化合物的较低ic50值表明在较低浓度下较高水平的生物素化-rhi抑制，这表明胰岛素-fc融合蛋白与ir更强的结合。对照化合物诸如未标记的重组人胰岛素(rhi)也用作内部标准以产生rhi ic50，可以得到给定化合物ic50与rhi ic50的比率(ic50(化合物)/ic50(rhi))。较低的ic50比率与rhi的结合更相似(与ir的结合更强)，而相对于rhi，较高的ic50比率与ir的结合较弱。[0316]实施例13：在4℃下示例性胰岛素-fc融合蛋白的体外im-9胰岛素受体(ir)结合。[0317]在完全rpmi 5％fbs培养基中培养表达人ir的人im-9细胞(attc#ccl-159)并维持70-80％的融合度。将im-9细胞培养物以250×g(～1000rpm)离心10分钟以沉淀细胞。用hbss或pbs缓冲液洗涤细胞一次，重悬于冷facs染色培养基(hbss/2mm edta/0.1％叠氮化钠+4％马血清)中至浓度为8×106个细胞/ml，并保持在冰上或4℃直到制备成测试溶液。在1.2ml管于facs缓冲液中以1:3连续稀释将胰岛素-fc蛋白稀释为2×浓度(每次稀释的体积为约60μl)，将溶液在冰上保持冷却，直到准备移液。[0318]将生物素化的rhi在facs染色培养基中稀释至1.25μg/ml的浓度。将40μl连续稀释的受试化合物和8μl的1.25μg/ml的生物素-rhi添加到v底微量滴定板的每个孔中，通过缓慢涡旋混合，并置于冰上。然后通过多通道移液器将40μl im-9细胞悬液(8×106个细胞/ml)添加到每个孔中，再次轻轻混合并在冰上孵育30分钟，以允许在im-9细胞上竞争性结合ir。然后通过将v型底板以3000rpm离心3分钟并吸出上清液用275μl冰冷的facs洗涤缓冲液(hbss/2mm edta/0.1％叠氮化钠+0.5％马血清)洗涤细胞两次。接着在冰上将细胞在40μl含有1:100稀释的streptavidin-pe(life technologies)的facs染色培养基中重悬20分钟。然后用275μl冰冷的facs缓冲液洗涤细胞一次，最后在室温下用3％多聚甲醛固定10分钟。然后用275μl冰冷的facs缓冲液洗涤细胞一次，并重悬于250μl facs缓冲液中用于分析。[0319]然后在guava 8-ht流式细胞仪(millipore)上分析含有细胞的v型底板。对于每种浓度的受试化合物，通过facs fl-2通道上细胞的中值荧光强度(mfi)对与ir结合的生物素化rhi进行定量。对照孔仅用生物素化-rhi标记并用于计算由每种受试化合物浓度得到的抑制百分比(％)。将受试化合物对im-9细胞上生物素化rhi结合的抑制百分比与受试化合物的对数浓度作图，并使用graphpad prism(graphpad software,la jolla,ca)计算受试化合物的所得ic50值。因此，受试化合物的较低ic50值表明在较低浓度下较高水平的生物素化-rhi抑制，这表明胰岛素-fc融合蛋白与ir的结合更强。对照化合物诸如未标记的重组人胰岛素(rhi)也用作内部标准以产生rhi ic50，可以得到给定化合物ic50与rhi ic50的比率(ic50(化合物)/ic50(rhi))。较低的ic50比率与rhi的结合更相似(与ir的结合更强)，而相对于rhi，较高的ic50比率与ir的结合较弱。[0320]实施例14：体外人fc(γ)ri结合亲和力测定。[0321]按照如下所述采用elisa测定法使用人fc(γ)ri(即rhfc(γ)ri)在ph 7.4下进行胰岛素-fc融合蛋白与fc(γ)ri的结合。在ph 9.6的碳酸氢钠缓冲液中将胰岛素-fc融合蛋白稀释至10μg/ml，并在4℃下涂覆在maxisorp(nunc)微量滴定板上过夜，然后用pbst缓冲液(pbs/0.05％tween-20)洗涤微孔板条5次，并用superblock封闭试剂(thermofisher)封闭。在pbst/10％superblock缓冲液中制备从3000ng/ml到4.1ng/ml的生物素化rhfc(γ)ri(重组人fc(γ)ri；r&d systems)的系列稀释液，并以100μl/孔上样到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白的微孔板条上。将微量滴定板在室温下孵育1小时，然后用pbst洗涤微孔板条5次，然后以100μl/孔上样在pbst/10％superblock缓冲液中以1:10000稀释的链霉亲和素-hrp。孵育45分钟后，用pbst再洗涤微孔板条5次。添加tmb以显示结合的fc(γ)ri蛋白并用elisa终止试剂(boston bioproducts)终止。在elisa读板器中在450nm处读板，并将od450值(与rhfc(γ)ri与胰岛素-fc蛋白的结合成比例)与添加到每个孔中的rhfc(γ)ri的对数浓度作图，以使用graphpad prism软件生成结合曲线。对于曲线有些相似的化合物分组，可以使用在较高浓度之一例如3000ng/ml的rhfc(γ)ri浓度下的od450来鉴定涂覆的胰岛素-fc融合蛋白化合物之间的差异。为了比较在不同时间运行的多种胰岛素-fc融合蛋白之间的差异，将人fc(γ)ri测定od450比率计算为在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下获得的受试胰岛素-fc融合蛋白化合物的od450值除以在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下获得的seq id no:76的参考胰岛素-fc融合蛋白的od450值。[0322]实施例15：体外人fc(γ)ri结合亲和力测定。[0323]按照如下所述采用elisa测定法使用人fc(γ)ri(即rhfc(γ)ri)在ph 7.4下进行胰岛素-fc融合蛋白与fc(γ)ri的结合。在ph 9.6的碳酸氢钠缓冲液中将胰岛素-fc融合蛋白稀释至10μg/ml，并在4℃下涂覆在maxisorp(nunc)微量滴定板上过夜，然后用pbst缓冲液(pbs/0.05％tween-20)洗涤微孔板条5次，并用superblock封闭试剂(thermofisher)封闭。在pbst/10％superblock缓冲液中制备从3000ng/ml到4.1ng/ml的生物素化rhfc(γ)ri(重组人fc(γ)ri；r&d systems)的系列稀释液，并以100μl/孔上样到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白的微孔板条上。将微量滴定板在室温下孵育1小时，然后用pbst洗涤微孔板条5次，然后以100μl/孔上样在pbst/10％superblock缓冲液中以1:10000稀释的链霉亲和素-hrp。孵育45分钟后，用pbst再洗涤微孔板条5次。添加tmb以显示结合的fc(γ)ri蛋白并用elisa终止试剂(boston bioproducts)终止。在elisa读板器中在450nm处读板，并将od450值(与rhfc(γ)ri与胰岛素-fc蛋白的结合成比例)与添加到每个孔中的rhfc(γ)ri的对数浓度作图，以使用graphpad prism软件生成结合曲线。对于曲线有些相似的化合物分组，可以使用在较高浓度之一例如3000ng/ml的rhfc(γ)ri浓度下的od450来鉴定涂覆的胰岛素-fc融合蛋白化合物之间的差异。为了比较在不同时间运行的多种胰岛素-fc融合蛋白之间的差异，将人fc(γ)ri测定od450比率计算为在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下获得的受试胰岛素-fc融合蛋白化合物的od450值除以在3000ng/ml的生物素化-fc(γ)ri浓度下获得的seq id no:76的参考胰岛素-fc融合蛋白的od450值。[0324]实施例16：体外c1q结合亲和力测定[0325]按照如下所述采用elisa测定法使用人补体成分c1q在ph 7.4下进行胰岛素-fc融合蛋白与补体成分c1q的结合。在ph 9.6的碳酸氢钠缓冲液中将胰岛素-fc融合蛋白稀释至10μg/ml，并在4℃下涂覆在maxisorp(nunc)微量滴定板上过夜，然后用pbst缓冲液(pbs/0.05％tween-20)洗涤微孔板条5次，并用superblock封闭试剂(thermofisher)封闭。在pbst/10％superblock缓冲液中制备从1000ng/ml到1.4ng/ml的生物素化补体成分c1q(人补体成分c1q；sigma-aldrich)的系列稀释液，并以100μl/孔上样到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白的微孔板条上。将微量滴定板在室温下孵育1小时，然后用pbst洗涤微孔板条5次，然后以100μl/孔上样在pbst/10％superblock缓冲液中以1:12000稀释的链霉亲和素-hrp。孵育45分钟后，用pbst再洗涤微孔板条5次。添加tmb以显示结合的补体c1q蛋白并用elisa终止试剂(boston bioproducts)终止。在elisa读板器中在450nm处读取板的吸光度(od450)，并将od450值(与补体成分c1q与胰岛素-fc蛋白的结合成比例)与添加到每个孔中的补体成分c1q的对数浓度作图，以使用graphpad prism软件生成结合曲线。对于曲线有些相似的化合物分组，可以使用在较高浓度之一例如1000ng/ml的补体成分c1q浓度下的od450来鉴定涂覆的胰岛素-fc融合蛋白化合物之间的差异。为了进一步比较在不同时间运行的多种胰岛素-fc融合蛋白之间的差异，将人c1q测定od450比率计算为在1000ng/ml的生物素化-c1q浓度下获得的受试胰岛素-fc融合蛋白化合物的od450除以在1000ng/ml的生物素化-c1q浓度下获得的seq id no:76的参考胰岛素-fc融合蛋白的od450。[0326]实施例17：体外c1q结合亲和力测定[0327]按照如下所述采用elisa测定法使用人补体成分c1q在ph 7.4下进行胰岛素-fc融合蛋白与补体成分c1q的结合。在ph 9.6的碳酸氢钠缓冲液中将胰岛素-fc化合物稀释至10μg/ml，并在4℃下涂覆在maxisorp(nunc)微量滴定板上过夜，然后用pbst缓冲液(pbs/0.05％tween-20)洗涤微孔板条5次，并用superblock封闭试剂(thermofisher)封闭。在pbst/10％superblock缓冲液中制备从1000ng/ml到1.4ng/ml的生物素化补体成分c1q(人补体成分c1q；sigma-aldrich)的系列稀释液，并以100μl/孔上样到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白的微板条上。将微量滴定板在室温下孵育1小时，然后用pbst洗涤微板条5次，然后以100μl/孔上样在pbst/10％superblock缓冲液中以1:12000稀释的链霉亲和素-hrp。孵育45分钟后，用pbst再洗涤微孔板条5次。添加tmb以显示结合的补体c1q蛋白并用elisa终止试剂(boston bioproducts)终止。在elisa读板器中在450nm处读取板的吸光度(od450)，并将od450值(与补体成分c1q与胰岛素-fc蛋白的结合成比例)与添加到每个孔中的补体成分c1q的对数浓度作图，以使用graphpad prism软件生成结合曲线。对于曲线有些相似的化合物分组，可以使用在较高浓度之一例如1000ng/ml的补体成分c1q浓度下的od450来鉴定涂覆的胰岛素-fc融合蛋白化合物之间的差异。为了进一步比较在不同时间运行的多种胰岛素-fc融合蛋白之间的差异，将人c1q测定od450比率计算为在1000ng/ml的生物素化-c1q浓度下获得的受试胰岛素-fc融合蛋白化合物的od450除以在1000ng/ml的生物素化-c1q浓度下获得的seq id no:76的参考胰岛素-fc融合蛋白的od450。[0328]实施例18：胰岛素-fc融合蛋白对犬fcrn受体的亲和力的体外测量。[0329]通过在溶液ph5.5下进行的elisa技术测量含有犬igg来源的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白与犬fcrn受体的体外结合亲和力。微酸性的ph是含有fc片段的分子与fcrn受体结合的优选结合环境。在体内，细胞在其表面和内体内部表达fcrn。当含有fc片段的分子通过自然过程(例如胞饮作用或胞吞作用)进入细胞时，内体中的ph值变为较低的ph，其中fcrn受体与含有fc片段的分子结合，否则这些分子将在内体-溶酶体区室中降解，从而允许这些分子再循环回到ph值更接近中性(例如，ph7.0-7.4)的细胞表面。中性ph不利于与fcrn受体结合，并允许将含有fc片段的分子释放回循环中。这是含有fc片段的分子在体内表现出延长的循环药代动力学半衰期的主要机制。[0330]在ph9.6碳酸氢钠缓冲液中将包含犬源fc片段的胰岛素-fc融合蛋白稀释至10μg/ml，并在室温下以一式两份涂覆在maxisorb elisa板条上，保持1至2小时。然后用pbst(pbs/0.1％tween-20)缓冲液洗涤该条4次，并用superblock封闭试剂(thermofisher)封闭。然后用ph 5.5mes/nacl/tween(50mm mes/150mm nacl/0.1％tween-20)缓冲液再洗涤2次用于fcrn结合的条，然后加入fcrn试剂(生物素化犬fcrn；immunitrack)。在ph 5.5mes/nacl/tween/10％superblock缓冲液中制备浓度为1000ng/ml至0.45ng/ml的生物素化fcrn试剂的系列稀释液(1:3x稀释)，并使用多通道移液器以100μl/孔上样到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白化合物的条上。然后将测定板在室温下孵育1小时。用ph 5.5mes/nacl/tween缓冲液洗涤fcrn结合条4次，然后以100μl/孔上样在ph5.5 mes/nacl/10％superblock缓冲液中以1:10000稀释的链霉亲和素-hrp。孵育45分钟后，用ph 5.5mes/nacl/tween缓冲液再洗涤条4次。最后加入tmb以显示结合的生物素化犬fcrn试剂，并用elisa终止试剂终止显色。在elisa读板器中以450nm的波长读取该板。将od值(与犬-fcrn与胰岛素-fc融合蛋白受试化合物的结合成比例)相对于添加到每个孔中的fcrn的对数浓度作图，以使用graphpad prism软件生成结合曲线。计算每条结合曲线的ec50值以比较不同化合物。[0331]实施例19：胰岛素-fc融合蛋白对人fcrn受体的亲和力的体外测量。[0332]通过在溶液ph5.5下进行的elisa技术测量含有人igg来源的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白与人fcrn受体的体外结合亲和力。微酸性的ph是含有fc片段的分子与fcrn受体结合的优选结合环境。在体内，细胞在其表面和内体内部表达fcrn。当含有fc片段的分子通过自然过程(例如胞饮作用或胞吞作用)进入细胞时，内体中的ph值变为较低的ph，其中fcrn受体与含有fc片段的分子结合，否则这些分子将在内体-溶酶体区室中降解，从而允许这些分子再循环回到ph值更接近中性(例如，ph7.0-7.4)的细胞表面。中性ph不利于与fcrn受体结合，并允许将含有fc片段的分子释放回循环中。这是含有fc片段的分子在体内表现出延长的循环药代动力学半衰期的主要机制。[0333]在ph9.6碳酸氢钠缓冲液中将包含fc片段的胰岛素-fc融合蛋白稀释至10μg/ml，并在室温下以一式两份涂覆在maxisorb elisa板条上，保持1至2小时。然后用pbst(pbs/0.1％tween-20)缓冲液洗涤该条5次，并用superblock封闭试剂(thermofisher)封闭。然后用ph 5.5mes/nacl/tween(50mm mes/150mm nacl/0.1％tween-20)缓冲液再洗涤用于fcrn结合的条3次，然后加入fcrn试剂(生物素化人fcrn；immunitrack)。在ph 5.5mes/nacl/tween/5％superblock缓冲液中制备浓度为6000ng/ml至8.23ng/ml的生物素化fcrn试剂的系列稀释液(1:3x稀释)，并使用多通道移液器以100μl/孔上样到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白化合物的条上。然后将测定板在室温下孵育1.5小时。用ph 5.5mes/nacl/tween缓冲液洗涤fcrn结合条4次，然后以100μl/孔上样在ph5.5 mes/nacl/5％superblock缓冲液中以1:10000稀释的链霉亲和素-hrp。孵育45分钟后，用ph 5.5mes/nacl/tween缓冲液再次洗涤条5次。最后加入tmb以显示结合的生物素化fcrn试剂，并用elisa终止试剂终止显色。在elisa读板器中以450nm的波长读取该板。将od450值(与人-fcrn与胰岛素-fc融合蛋白受试化合物的结合成比例)相对于添加到每个孔中的fcrn的对数浓度作图，以使用graphpad prism软件生成结合曲线。计算每条结合曲线的ec50值以比较不同化合物。[0334]实施例20：胰岛素-fc融合蛋白对人fcrn受体的亲和力的体外测量。[0335]通过在溶液ph 5.5下进行的elisa技术测量含有人igg来源的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白与人fcrn受体的体外结合亲和力。微酸性的ph是含有fc片段的分子与fcrn受体结合的优选结合环境。在体内，细胞在其表面和内体内部表达fcrn。当含有fc片段的分子通过自然过程(例如胞饮作用或胞吞作用)进入细胞时，内体中的ph值变为较低的ph，其中fcrn受体与含有fc片段的分子结合，否则这些分子将在内体-溶酶体区室中降解，从而允许这些分子再循环回到ph值更接近中性(例如，ph7.0-7.4)的细胞表面。中性ph不利于与fcrn受体结合，并允许将含有fc片段的分子释放回循环中。这是含有fc片段的分子在体内表现出延长的循环药代动力学半衰期的主要机制。[0336]在ph9.6碳酸氢钠缓冲液中将包含fc片段的胰岛素-fc融合蛋白稀释至10μg/ml，并在室温下以一式两份涂覆在maxisorb elisa板条上，保持1至2小时。然后用pbst(pbs/0.1％tween-20)缓冲液洗涤该条5次，并用superblock封闭试剂(thermofisher)封闭。然后用ph 5.5mes/nacl/tween(50mm mes/150mm nacl/0.1％tween-20)缓冲液再洗涤用于fcrn结合的条3次，然后加入fcrn试剂(生物素化人fcrn；immunitrack)。在ph 5.5mes/nacl/tween/5％superblock缓冲液中制备浓度为6000ng/ml至8.23ng/ml的生物素化fcrn试剂的系列稀释液(1:3x稀释)，并使用多通道移液器以100μl/孔上样到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白化合物的条上。然后将测定板在室温下孵育1.5小时。用ph 5.5mes/nacl/tween缓冲液洗涤fcrn结合条4次，然后以100μl/孔上样在ph5.5 mes/nacl/5％superblock缓冲液中以1:10000稀释的链霉亲和素-hrp。孵育45分钟后，用ph 5.5mes/nacl/tween缓冲液再洗涤条5次。最后加入tmb以显示结合的生物素化fcrn试剂，并用elisa终止试剂终止显色。在elisa读板器中以450nm的波长读取该板。将od450值(与人-fcrn与胰岛素-fc融合蛋白受试化合物的结合成比例)相对于添加到每个孔中的fcrn的对数浓度作图，以使用graphpad prism软件生成结合曲线。计算每条结合曲线的ec50值以比较不同化合物。[0337]实施例21：在狗中单次给药犬胰岛素fc融合蛋白后确定体内药效(pd)的一般规程。[0338]按照如下所述测定在狗中胰岛素-fc融合蛋白对空腹血糖水平的影响。使用n＝1、2、3或更多只健康、未接受过抗体的体重为约10至15kg的狗，每种胰岛素-fc融合蛋白用于一只狗。每天也两次观察动物的过敏反应、嗜睡、窘迫、疼痛等的迹象，并且任选地对于一些化合物，经皮下注射继续治疗另外三周或更长时间，以观察化合物的降糖能力是否随着时间的推移降低，其为中和性抗药物抗体的潜在诱导的关键标志。在第0天，通过静脉内或皮下给药向动物单次注射药物组合物，该药物组合物包含在10至50mm磷酸氢钠、50至150mm氯化钠、0.005至0.05％v/v tween-80和任选地浓度为0.02至1.00mg/ml的抑菌剂(例如苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯)溶液中浓度为1至10mg/ml的胰岛素fc融合蛋白同二聚体，溶液ph在7.0-8.0之间，剂量为0.08-0.80mg胰岛素-fc融合蛋白/kg(或约相当于1.2-12.3nmol/kg或约相当于0.4-4.0u/kg胰岛素当量，以摩尔计)。在第0天，在注射前即刻以及注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉采集血液。[0339]对于每个时间点，至少收集1ml全血。使用葡萄糖计(aviva plus)立即确定葡萄糖水平读数，这需要大约一滴血。绘制从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％(fbgl％)以评价给定胰岛素-fc融合蛋白的生物活性。[0340]实施例22：在狗中反复给药犬胰岛素fc融合蛋白后测定体内药效(pd)的一般规程。[0341]按照如下所述测定反复注射后评估胰岛素-fc融合蛋白对空腹血糖水平的影响。使用健康的、未接受过抗体的体重为约10kg至20kg的狗，向每只动物给药一定剂量的胰岛素-fc融合蛋白。每天两次观察动物的过敏反应、嗜睡、窘迫、疼痛及其他不良副作用的迹象，并且任选地对于一些化合物，继续治疗最高达另外二至五次皮下注射，以观察化合物的降糖能力是否随着时间的推移降低，其表明体内可能存在中和性抗药物抗体。在第0天，向动物单次皮下注射药物组合物，该药物组合物包含在10至50mm磷酸氢钠、50至150mm氯化钠、0.005至0.05％v/v tween-80和任选地浓度为0.02至1.00mg/ml的抑菌剂(例如苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯)溶液中的胰岛素fc融合蛋白，溶液ph在7.0-8.0之间，剂量为0.08-0.80mg胰岛素-fc融合蛋白/kg(或约相当于1.2-12.3nmol/kg或约相当于0.4-4.0u/kg胰岛素当量，以摩尔计)。在第0天，在注射前即刻以及注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉采集血液。[0342]随后的皮下注射频率不超过每周一次，并且在一些情况下，根据给定胰岛素-fc融合蛋白制剂的药效，以不同的时间间隔进行注射。根据已证实的胰岛素-fc融合蛋白的药效，将每种胰岛素-fc融合蛋白的后续注射调整为更高或更低的剂量。例如，如果发现第0天第一次注射的剂量在降低血糖方面无效，则将随后注射的胰岛素-fc融合蛋白的剂量水平上调。以类似的方式，如果发现第0天第一次注射的剂量以太强的方式降低葡萄糖，则随后下调注射的胰岛素-fc融合蛋白的剂量水平。还发现可以根据需要以类似的方式调节中间剂量或最终剂量。对于每个剂量，在注射前即刻以及注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6、7天(任选地14天)从合适的静脉采集血液。对于每个时间点，至少收集1ml全血。使用葡萄糖计(aviva plus)立即确定葡萄糖水平读数，这需要大约一滴血。将整个研究中的平均空腹血糖水平百分比(fbgl％)相对于时间作图，从而可以确定融合蛋白的生物活性。[0343]为了确定每一剂量的生物活性，按照如下所述进行了曲线上方面积(aoc)分析。在构建fbgl％相对于时间的数据后，然后将数据输入数据分析软件(graphpad prism,graphpad software,san diego ca)。首先使用该软件进行曲线下方面积分析(auc)，以整合每一剂量的fbgl％相对于时间曲线下方的面积。为了将auc数据转换为所需的aoc数据，使用了如下等式：aoc＝tpa–auc；其中tpa是通过将每个剂量寿命(例如，7天、14天等)乘以100％获得的总可能面积(其中100％表示fbgl％相对于时间曲线的y＝100％)。例如，给定7天的剂量寿命和500fbgl％·天数的计算auc，计算得出aoc如下：aoc＝(100fbgl％x7天)–(500fbgl％·天数)＝200fbgl％·天数。对一系列注射剂量中的每个注射剂量进行分析，以获得注射1、注射2、注射3等的aoc值。[0344]由于胰岛素-fc融合蛋白的剂量可能如此前所述改变，将给定胰岛素-fc融合蛋白的所有计算的aoc值归一化为该胰岛素-fc融合蛋白的特定剂量通常更方便。这样做可以方便地比较胰岛素-fc融合蛋白在多次注射中的降糖效力，即使剂量水平在给定研究的注射中发生变化也如此。给定剂量的归一化aoc(naoc)计算如下：naoc＝aoc/d，单位为fbgl％·天数·kg/mg；其中d是注射到动物体内的实际剂量，单位为mg/kg。对给定动物的一系列注射中的每次注射计算naoc值，并在接受相同胰岛素-fc融合蛋白制剂的动物组中取平均值。[0345]对于给定的动物，通过获取每次注射(例如，注射1、2、3、…n)的naoc值并用给定注射的每个naoc除以来自注射1的naoc来计算一系列注射中的每次注射的naoc比率(naocr)，如下：naocr＝(naoc(第n次注射)/naoc(第1次注射))。通过评估在一系列注射中第n次注射的给定胰岛素-fc融合蛋白制剂的naocr，能够确定给定胰岛素-fc融合蛋白的体内降糖活性经一系列n次给药是否基本保持其生物活性(例如，第n次给药后的naocr大于0.5)或给定胰岛素-fc融合蛋白的体内降糖活性经一系列n次给药是否已失去其效力的大部分(例如，第n次给药后的naocr小于0.5)，表明在体内可能形成中和抗药物抗体。在一些优选实施方式中，第三次皮下注射后的naoc与第一次皮下注射后的naoc的比率大于0.5(即，第三次皮下注射的naocr大于0.5)。elisa微孔板(nunc)，并且以与实施例25的抗药抗体elisa测定中所述相似的方式封闭被涂覆的板，除了文库中的每种化合物都涂覆在单独的elisa微孔板孔的各个条上。文库中的化合物包含一系列具有不同胰岛素多肽氨基酸组成的胰岛素-fc融合蛋白，包括各种b链、c链和a链氨基酸突变、不同的接头组成和不同的fc片段组成，包括人源的一些。单独地，直接用1:2系列稀释的犬igg(jackson immunoresearch laboratories,west grove pa)涂覆一些板条孔，用于分别计算犬igg单位中的抗药物抗体(ada)，如实施例24中所述。[0360]首先在实施例24的抗药抗体elisa测定中对从接受反复给药胰岛素-fc融合蛋白的个体狗获得的血清进行筛选。将在实施例24的测定中显示出中等或高阳性(例如中等或高效价的抗体)血清样品在pbst/sb/20％hs样品稀释缓冲液(pbs+0.1％tween 20+10％superblock+20％马血清)中连续稀释(1:200至1:8000)，并在室温下添加到涂覆有胰岛素-fc融合蛋白化合物的文库的板上，保持1小时。孵育后，用pbst洗涤该板5次。为了检测能够与涂覆的化合物文库发生交叉反应的犬抗体，在pbst/sb中稀释与犬igg交叉反应的hrp缀合的山羊抗猫igg f(ab')2(jackson immunoresearch laboratories,west grove pa)至1:10000并以100μl/孔添加到样品和标准孔两者中，并在室温下避光孵育45分钟。用pbst洗涤板5次，然后用去离子水洗涤1次，然后通过在室温下避光添加100μl/孔tmb底物(invitrogen，thermofisher scientific，waltham ma)显色15-20分钟。然后通过添加100μl/孔的elisa终止溶液(boston bioproducts，ashland ma)停止显色，并在30分钟内使用spectramax读板器在450nm处读取吸光度。通过使用softmax pro软件(molecular devices,san jose ca)将4-pl伪标准曲线中的od值相对于直接涂覆的犬igg抗体对照进行插值，确定血清样品中存在的抗化合物交叉反应抗体浓度。[0361]通过将来自测定的所得抗体浓度与涂覆的胰岛素-fc融合蛋白文库的已知氨基酸组成相关联，可以在测定中确定特定氨基酸突变或表位是否导致总抗体信号中的部分、大部分或全部以及是否未导致总抗体信号，表明与各种胰岛素-fc融合蛋白同二聚体未结合、弱结合或强结合。在本文中将负责中度或强结合的突变或表位称为免疫原性“热点”。[0362]实施例28：用于获得具有高同二聚体效价和可接受水平的急性和反复给药生物活性的犬胰岛素-fc融合蛋白的设计过程。[0363]满足发明详述中描述的设计目标的过程包括以下步骤。首先，将seq id no:4或seq id no:5的胰岛素多肽与特定igg同种型的物种特异性fc片段和接头组合，使得所得胰岛素-fc融合蛋白最有可能产生长效的具有最小免疫原性的生物活性产物(例如，选择具有最小fc(γ)受体i结合的物种特异性igg同种型)。制备编码所需融合蛋白的dna序列，将其克隆到载体(lakepharma,san carlos,ca)中，然后根据实施例1中所描述的规程使用该载体瞬时转染hek细胞。然后根据实施例4纯化胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例10测量总蛋白质产量和同二聚体％。只有同二聚体效价大于50mg/l的候选物才被认为是可接受的，因为低于该水平的效价不可能产生满足兽用产品严格的低制备成本要求的商业生产效价。然后如实施例12中所描述，通过体外胰岛素受体结合研究针对生物活性指标筛选选定的胰岛素-fc融合蛋白。根据经验，认为只有表现出ir活性ic50值小于5000nm的化合物才可能在目标物种中表现出生物活性。尽管体外ir ic50值是一种有用的定性筛选工具，但它利用了表达人胰岛素受体的人im-9细胞，因此它可能无法捕获犬ir与人ir之间亲和力的微小差异中的一些。此外，胰岛素受体结合以外的因素可能会影响化合物的体内生物活性(例如，对犬fcrn的亲和力以延长体内药代动力学消除半衰期)。因此，将从制备和ir活性ic50值的角度来看可接受的选定的胰岛素-fc融合蛋白进一步筛选用于狗的生物活性，以筛选出任何具有低于所需效力和/或生物活性持续时间的物质(例如，naoc小于150fbgl％·天数·kg/mg)。再次，根据经验，在naoc值大于150fbgl％·天数·kg/mg时，目标物种的剂量需求将低到足以实现可接受的治疗成本。最后，添加了一个额外的评估标准，该标准在本领域中很少提及。如以下实施例中更详细讨论的，许多胰岛素-fc融合蛋白实施方式在第一次给药后在目标物种中表现出可接受的naoc水平，但在反复给药后出乎意料地未能维持该生物活性水平。此外，在大多数情况下，目标物种中反复给药生物活性的降低与中和抗药物抗体的产生相关。这种产生抗药物抗体的倾向和不能维持活性使得这种胰岛素-fc融合蛋白不能用于治疗慢性疾病诸如犬糖尿病。因此，认为只有表现出可接受水平的反复给药生物活性(例如，第三次给药相对于第一次给药的naocr值大于0.5)和最低水平的抗药物抗体的胰岛素-fc融合蛋白可以被接受用于本发明。[0364]实施例29：用于获得具有高同二聚体效价和可接受水平的急性和反复给药生物活性的人胰岛素-fc融合蛋白的设计过程。[0365]满足发明详述中描述的设计目标的过程包括以下步骤。首先，将seq id no:7或seq id no:10的胰岛素多肽与特定igg同种型(igg2或igg1)的人fc片段和接头组合，使得所得胰岛素-fc融合蛋白最有可能产生长效的生物活性产物。制备编码所需融合蛋白的dna序列，将其克隆到载体(lakepharma,san carlos,ca)中，然后根据实施例1中所描述的规程使用该载体瞬时转染hek细胞。然后根据实施例4纯化胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例10测量总蛋白质产量和同二聚体％，并计算同二聚体效价。只有同二聚体效价大于150mg/l的候选物才被认为是可接受的，因为低于该水平的同二聚体效价不可能转变成高同二聚体效价cho稳定转染细胞系，因此不可能产生满足相对商品化的人胰岛素市场的低制备成本要求的商业生产效价。然后如实施例12中所述，通过体外ir结合研究针对生物活性指标筛选选定的胰岛素-fc融合蛋白构型。根据经验，认为只有表现出ir活性ic50值小于2400nm、更优选地小于2000nm的化合物才可能在体内表现出生物活性。体外ir ic50值是一种有用的定性筛选工具，因为该测定利用表达人ir的人im-9细胞，并且预期与结合降低(更高的ir ic50值)的化合物相比，对于给定剂量而言，更高的结合(更低的ir ic50值)提供更高的体内效力。此外，ir结合以外的因素可能会影响化合物的体内生物活性。例如，fc融合蛋白对人fcrn受体的亲和力与化合物的体内药代动力学消除半衰期有关。如通过体外人fcrn结合测定法测量的，胰岛素-fc融合蛋白的延长的体内半衰期数天或更长时间与小于1500ng/ml、更优选地小于1000ng/ml的ec50值密切相关(实施例19)。[0366]通过测试人fc(γ)ri受体和人c1q结合亲和力，进一步针对其在体内的免疫原性潜力筛选在制备、ir活性ic50值和人fcrn活性ec50值方面可接受的选定胰岛素-fc融合蛋白构型。与这些免疫系统成分结合更牢固的分子更有可能经历抗原细胞呈递(apc)增加，并表现出如通过抗药物抗体测量的更强的免疫原性特征。抗药物抗体是不希望有的，其可能阻碍分子的体内药代动力学半衰期，可能中和药物的活性，或者可能同时发挥这两种功能。潜在的抗药物抗体对胰岛素-fc体内性能的影响可能是相当成问题的。因此，进行了工作以针对fc(γ)ri(实施例14)和c1q(实施例16)筛选候选胰岛素-fc融合蛋白，以减轻不希望有的抗原呈递和潜在的抗药抗体诱导免疫原性的风险(guilliams,martin&bruhns,pierre&saeys,yvan&hammad,hamida&lambrecht,bart.(2014).the function of fc gamma receptors in dendritic cells and macrophages.nature reviews.immunology.14.10.1038/nri3582)。为人fc(γ)ri结合(其中测试中的胰岛素-fc融合蛋白的生物素化-fc(γ)ri浓度为3000ng/ml)建立的设计目标是od450比率《0.50(相对于seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白构型)，并且建立用于c1q结合(其中测试中的胰岛素-fc融合蛋白的生物素化c1q浓度为1000ng/ml)的设计目标是od450比率《0.35(相对于seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白构型)。[0367]如别处所述，出乎意料地发现与含有人igg2 fc的构型相比，含有人igg1 fc的胰岛素-fc融合蛋白构型产量高得多，因此在可制备性方面是优选的。然而，含有人igg1 fc的胰岛素-fc融合蛋白构型，当在cng位点处含有天然n-连接的糖基化时，通常显示出与fc(γ)ri和c1q两者的非常高的结合，并且与这些部分中的一个或两个的强结合与体内增强的抗原呈递和免疫原性的高潜力相关(kouser,l.,madhukaran,s.p.,shastri,a.,saraon,a.,ferluga,j.,al-mozaini,m.,&kishore,u.(2015).emerging and novel functions of complement protein c1q.frontiers in immunology,6,317.doi:10.3389/fimmu.2015.00317)。因此，通过首先筛选天然糖基化位点(cng)突变以防止生物合成过程中天然糖基化的化合物，对higg1同种型、含fc的胰岛素-fc融合蛋白构型的若干变体进行了测试。然后将这些分子进一步突变以通过操纵胰岛素多肽组成来改进它们的特性。最后，对若干不同组成和长度的接头变体进行了研究，以鉴定是否可以进一步优化各种设计特性。在通过多轮优化进行筛选后，认为只有表现出可接受水平的同二聚体效价、ir结合、fcrn结合、fc(γ)ri结合和clq结合的胰岛素-fc融合蛋白构型可被接受用于本发明。[0368]结果-包含犬fc片段的胰岛素-fc融合蛋白[0369]实施例30：包含犬fc igga同种型的犬胰岛素-fc融合蛋白。[0370]尝试使用seq id no:11的肽接头产生包含seq id no:4的胰岛素多肽序列和犬igga同种型(seq id no:14)的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白。[0371]所得胰岛素-fc融合蛋白的全氨基酸序列如下：[0372]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggrctdtppcpvpeplggpsvlifppkpkdilritrtpevtcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqsreqqfngtyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhidlpspiertiskargrahkpsvyvlppspkelsssdtvsitclikdfyppdidvewqsngqqeperkhrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqqgdpftcavmhetlqnhytdlslshspg(seq id no:31)。[0373]根据实施例1在hek细胞中合成seq id no：31的胰岛素-fc融合蛋白，并根据实施例4进行纯化。蛋白质a纯化步骤后的蛋白产量为22mg/l。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认胰岛素-fc融合蛋白的结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量同二聚体％并确定为24％，表明高度的同二聚体聚集体。因此得到的同二聚体效价仅为5mg/l。总之，在hek细胞中制备seq id no：31的胰岛素-fc融合蛋白得到高水平的聚集体和低同二聚体效价(5mg/l)，这不满足同二聚体效价大于50mg/l的设计目标。[0374]然而，评估了seq id no：31的胰岛素-fc融合蛋白的生物活性。首先，根据实施例12测量seq id no:31的胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素受体结合，得到2,733nm的ic50值，表明该化合物可能在体内具有生物活性(即ic50小于5000nm)。[0375]接着，根据实施例21，在向n＝3只犬单次静脉内给药化合物之后测量seq id no：31的胰岛素-fc融合蛋白的体内药效(pd)。图2示出seq no：31的空腹血糖水平百分比作为时间的函数。根据实施例22的规程将seq id no:31的naoc计算为105fbgl％·天数·kg/mg。使用实施例23的方法，将seq id no:31的体内半衰期计算为小于1天。相对较低的naoc可能是样品中大量聚集体(即低同二聚体％)的结果，但留在循环中的可溶性同二聚体的药代动力学消除半衰期仍然小于一天，其被认为不太可能支持每周一次的给药。[0376]实施例31：包含犬igga同种型的胰岛素-fc融合蛋白的fc片段区的突变。[0377]为了增加同二聚体含量％、提高生物活性和延长seq id no:31的胰岛素-fc融合蛋白的半衰期，将突变插入fc片段ch3区以试图阻止分子间缔合(例如，分子之间的fc片段-fc片段相互作用)并促进与fcrn受体的更强结合(例如，对fcrn的更高亲和力)以增加再循环和全身循环时间。按照实施例1在hek细胞中合成如下胰岛素-fc融合蛋白，按照实施例4纯化，并按照实施例6、实施例8和实施例10进行检测，检测结果示于下表2中。seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35与seq id no:31的序列比对和氨基酸序列的差异示于图3中。[0378]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggrctdtppcpvpeplggpsvlifppkpkdilritrtpevtcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqsreqqfngtyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhidlpspiertiskargrahkpsvyvlppspkelsssdtvsitclikdfyppdidvewqsngqqeperkhrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqqgdpftcavlhealhshytqkslslspg(seq id no:32)[0379]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggrctdtppcpvpeplggpsvlifppkpkdilritrtpevtcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqsreqqfngtyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhidlpspiertiskargrahkpsvyvlppspkelsssdtvsitclikdfyppdidvewqsngqqeperkhrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqqgdpftcavlhetlqshytdlslshspg(seq id no:33)[0380]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggrctdtppcpvpeplggpsvlifppkpkdilritrtpevtcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqsreqqfngtyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhidlpspiertiskargrahkpsvyvlppspkelsssdtvsitclikdfyppdidvewqsngqqeperkhrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqqgdpftcavmhetlqshytdlslshspg(seq id no:34)[0381]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggrctdtppcpvpeplggpsvlifppkpkdilritrtpevtcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqsreqqfngtyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhidlpspiertiskargrahkpsvyvlppspkelsssdtvsitclikdfyppdidvewqsngqqeperkhrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqqgdpftcavlhetlqnhytdlslshspg(seq id no:35)[0382]表2中列出了基于犬igga变体的胰岛素-fc融合蛋白以及相应的蛋白质产量、同二聚体％和同二聚体效价。结果表明，igga fc片段的各种突变并没有提高同二聚体％和同二聚体效价，而是产生了高度聚集的蛋白质，其同二聚体效价极低，低于5mg/l。因此，无法评估化合物的体内生物活性和药代动力学。[0383][0384]实施例32：使用其他犬fc片段同种型的犬胰岛素-fc融合蛋白。[0385]如上所述，认为犬igga是fc片段的优选同种型从而为狗产生非免疫原性胰岛素-fc融合蛋白，原因是其在犬中缺乏fc(γ)i效应因子功能(与人中的人igg2同种型很像)。然而，用犬igga fc片段制备的胰岛素-fc融合蛋白高度聚集，具有不可接受的低同二聚体效价和不可接受的低水平的生物活性及作用持续时间。因此，来自其他犬igg同种型(seq id no:15的犬iggb)、seq id no:16的犬iggc和seq id no:17的犬iggd)的fc片段被评估为seq id no:31的胰岛素-fc融合蛋白的犬igga fc片段的替代物。使用与制备seq id no:31的胰岛素-fc融合蛋白所用相同的seq id no:4的胰岛素多肽和seq id no:11的肽接头合成包含基于犬iggb、iggc和iggd同种型的fc片段的三种胰岛素-fc融合蛋白。根据实施例1在hek293细胞中制备蛋白质。然后根据实施例4使用蛋白质a柱纯化胰岛素-fc融合蛋白。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认胰岛素-fc融合蛋白的结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量同二聚体％。它们的序列如下所示，它们与seq id no:31的序列比对比较示于图4中：[0386]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:36)[0387]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggcnncpcpgcgllggpsvfifppkpkdilvtartptvtcvvvdldpenpevqiswfvdskqvqtantqpreeqsngtyrvvsvlpighqdwlsgkqfkckvnnkalpspieeiisktpgqahqpnvyvlppsrdemskntvtltclvkdffppeidvewqsngqqepeskyrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqislshspg(seq id no:37)[0388]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggcispcpvpeslggpsvfifppkpkdilritrtpeitcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqpreqqfnstyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhiglpspiertiskargqahqpsvyvlppspkelsssdtvtltclikdffppeidvewqsngqpepeskyhttapqldedgsyflysklsvdksrwqqgdtftcavmhealqnhytdlslshspg(seq id no:38)[0389]所得蛋白质产量、同二聚体％和同二聚体效价在表3中给出。出乎意料的是，只有包含基于犬iggb同种型的fc片段的seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白显示出满足大于50mg/l的设计标准的同二聚体效价。seq id no:37的包含基于犬iggc同种型的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白根本未产生任何化合物，并且seq id no:38的包含基于犬iggd同种型的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白表现出明显的蛋白质产量，但具有高度聚集，因此同二聚体效价低得无法接受。[0390]根据实施例12的规程对seq id no:36和seq id no:38的胰岛素-fc融合蛋白的体外胰岛素受体结合进行了测试。seq id no:38的胰岛素-fc融合蛋白显示出ic50大于5000nm，表明该化合物极不可能在体内示出生物活性。然而，seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白显示出ic50为28nm，表明该序列在体内可能具有生物活性。[0391][0392]*dnm＝未测量[0393]实施例33：包含seq id no：4的胰岛素多肽与犬iggb同种型fc片段的胰岛素-fc融合蛋白的体内效力。[0394]鉴于实施例32中的有希望的同二聚体效价和胰岛素受体活性结果，在n＝3只健康、未接受过抗体的重约10kg的比格狗的每一只中静脉内注射后，根据实施例21对seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行了测试。在一个独立的实验中，向n＝3只健康、未接受过抗体的比格狗皮下给药该化合物。图5示出单次静脉内给药seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白的fbgl％与时间的关系。图6示出单次皮下给药seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白的fbgl％与时间的关系，这两者都证明了在狗中seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白具有显著的生物活性。[0395]根据实施例22的规程计算naoc以确定胰岛素-fc融合蛋白的相对生物活性和作用持续时间。静脉内注射的seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白的naoc为399fbgl％·天数·kg/mg，其为静脉注射的seq id no:31的胰岛素-fc融合蛋白的naoc的3.8倍，说明与包含犬igga fc片段的胰岛素-fc融合蛋白相比，包含犬iggb fc片段的胰岛素-fc融合蛋白的生物活性显著增加。皮下注射的seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白的naoc为366fbgl％·天数·kg/mg，表明经由皮下给药的生物活性水平与经由静脉内给药获得的生物活性水平相似。[0396]实施例34：反复皮下给药包含seq id no：4的胰岛素多肽与犬iggb同种型fc片段的胰岛素-fc融合蛋白之后的体内免疫原性筛选。[0397]按照实施例22中描述的方法在狗中对seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白的反复皮下给药生物活性进行了测试。在第0天、第35天和第42天向n＝3只动物皮下给药，并根据实施例22测量每次给药后7天窗口的fbgl％。根据实施例22的规程计算每个反复皮下注射的naoc和naocr。如表4所示，在狗中反复皮下给药出乎意料地揭示了第三次给药时生物活性的显著衰减，如测量的naocr的显著降低(即，第三次注射的naoc仅为第一次注射的naoc的0.40，或40％)。[0398][0399]不受任何特定解释的束缚，假定在狗中第三次反复皮下给药后seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白的生物活性显著降低的原因是由于抗药物抗体的产生中和了其生物活性。抗药物抗体可针对胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素多肽、接头或fc片段部分。免疫原性反应表现为抗原呈递细胞、t辅助细胞、b细胞及其相关细胞因子之间的相互作用，这可能导致产生针对药物的内源性抗体(例如，抗药物抗体)。结合抗体是能够结合胰岛素-fc融合蛋白的所有同种型，并且这些可以在如实施例24中所描述的免疫测定中检测到。抑制胰岛素-fc融合蛋白的功能活性的中和抗体通常针对生物活性所必需的表位。为了评估是否是这种情况，根据实施例24对在给药每个剂量之前和在实施例11和实施例12中描述的实验结束时收集的血清进行了测试以量化抗药物抗体的水平。如图7所示，抗药物抗体水平确实随着化合物的多次皮下给药而增加，这表明中和抗药物抗体的产生可能是第三次注射seq id no：36的胰岛素fc融合蛋白后naocr降低的原因。[0400]实施例35：非糖基化胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no：4的胰岛素多肽和犬iggb同种型fc片段以降低免疫原性的潜在风险。[0401]如实施例32和实施例33所示，seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白在狗中显示出可接受的同二聚体含量％、同二聚体效价和生物活性；然而，其对诸如糖尿病的慢性疾病的用途因反复皮下给药后生物活性的降低(实施例34)和抗药物抗体(实施例34)的产生而折中。不受任何特定理论的束缚，产生抗药物抗体和生物活性降低的一个可能原因是犬iggb fc片段与犬免疫系统的各种受体(例如fc(γ)受体，例如fc(γ)ri)的相互作用增加。然而，犬iggb同种型是四种犬igg同种型中在用于fc片段时产生满足可制备性和单剂量生物活性设计目标的胰岛素-fc融合蛋白(实施例28)的唯一一种。如发明详述中所描述，一种用于减少fc(γ)相互作用的方法涉及使fc片段cng位点突变以防止在宿主细胞中合成期间的糖基化。因此，对seq id no:36的fc片段区进行cng位点突变以降低fc片段在体内对fc(γ)受体的结合亲和力，如通过实施例14中描述的在体外人fc(γ)ri测定中的结合所测量。采用实施例8的lc-ms方法进行聚糖缺乏的验证，但是省略了pngase f处理步骤。seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白中cng位点的位置是cng-nb139。seq id no：36的突变包括包含cng-nb139-q突变的seq id no：39、包含cng-nb139-s突变的seq id no：40、包含cng-nb139-d突变的seq id no：41、以及包含cng-nb139-k突变的seq id no：42。如下列出cng突变的胰岛素-fc融合蛋白的全氨基酸序列(nb139位置加有下划线)，所得序列比对示于图8中(clustal omega)：[0402]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfqgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:39)[0403]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:40)[0404]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfdgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:41)[0405]fvnqhlcgsdlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcchsicslyqlenycnggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfkgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:42)。[0406]根据实施例1在hek293细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认胰岛素-fc融合蛋白的结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量同二聚体％。如表5所示，seq id no:40、seq id no:41和seq id no:42的胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体效价满足设计目标，而包含cng-nb139-q突变的seq id no:39的胰岛素-fc融合蛋白出乎意料地不满足同二聚体效价的设计目标。[0407][0408][0409]为了确定其余三种化合物中哪一种最有可能表现出降低的免疫原性，根据实施例15的规程测量fc(γ)受体结合。低fc(γ)受体结合最有可能与最小免疫原性相关。表6比较了这些胰岛素-fc融合蛋白的fc(γ)受体i结合与seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白的fc(γ)受体结合，出乎意料地证明了seq id no:41的含有cng-d突变的胰岛素-fc融合蛋白表现出的fc(γ)受体结合活性是seq id no:40的含有cng-s突变和seq id no:42的含有cng-k突变的胰岛素-fc融合蛋白的约两倍。因此，认为只有包含后两种含有cng-s突变和cng-k突变的化合物的胰岛素-fc融合蛋白才适用于狗中的反复给药生物活性测试。[0410][0411]实施例36：用非糖基化cng-k和cng-s犬iggb同种型fc片段评价seq id no：4的胰岛素多肽的体内生物活性和免疫原性。[0412]为了确定在狗中seq id no：40的含有cng-s突变的胰岛素-fc融合蛋白是否改进了反复给药生物活性性能，根据实施例22的规程在第0天、第7天、第14天和第28天向n＝1只狗皮下给药该化合物。当狗的fbgl％下降过低时，给狗喂食以将血糖升高到安全水平。第一次注射的naoc为191fbgl％·天数·kg/mg，表明seq id no：40的胰岛素-fc融合蛋白在体内具有令人满意的生物活性。还根据实施例22的一般规程测量每次后续给药的naoc和naocr，由从给药时间至在下一次给药之前的时间计算。表7中示出的naoc和naocr说明seq id no：40的胰岛素-fc融合蛋白表现出在四次给药方案的第3次给药和第4次给药显著降低的naocr。因此，在狗中，seq id no:40的包含cng-s突变的胰岛素-fc融合蛋白不能证明反复给药的生物活性，尽管其其fc(γ)ri结合比seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白低四倍。[0413][0414]为了确定在狗中seq id no：42的含有cng-k突变的胰岛素-fc融合蛋白是否改进了反复给药生物活性性能，根据实施例22的规程在第0天、第7天、第14天和第28天向n＝1只狗皮下给药该化合物。当狗的fbgl％下降过低时，给狗喂食以将血糖升高到安全水平。第一次注射的naoc为449％fbgl·天数·kg/mg，表明seq id no：42的胰岛素-fc融合蛋白在体内具有令人满意的生物活性。化合物的药代动力学特性也通过实施例23的方法使用elisa测量，并且将二室模型与数据拟合从而确定其消除半衰期为约0.9天。还根据实施例22的一般规程测量每次后续给药的naoc和naocr，由从给药时间至在下一次给药之前的时间计算。表8中示出的naoc和naocr说明seq id no：42的胰岛素-fc融合蛋白在四次给药中维持大于0.6的naocr。因此，出乎意料地，seq id no：42的含有cng-k突变的胰岛素-fc融合蛋白是seq id no：36的胰岛素-fc融合蛋白的唯一非糖基化突变体，使得在狗中显著提高了反复给药的生物活性。[0415][0416][0417]根据实施例24，还在整个治疗过程(28天)和另外两周测量抗药物和抗胰岛素抗体的水平。图9说明在狗中反复皮下给药seq id no:42的胰岛素-fc融合蛋白仍产生抗药物抗体，但抗药物抗体效价远低于由seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白产生的那些(实施例32)。[0418]实施例37：筛选含有抗药物抗体的犬血清并鉴定在胰岛素多肽的b10d和a8h位置处的潜在免疫原性表位。[0419]将犬iggb fc片段的cng位点突变为lys(即，cng-k)确实提高了包含seq id no:4的胰岛素多肽和seq id no:11的肽接头的胰岛素融合蛋白的反复给药生物活性(实施例36)，但所得的seq id no:42的胰岛素-fc融合蛋白仍产生抗药物抗体(实施例36)。因此，推测seq id no:4的胰岛素多肽可以出乎意料地包含狗的免疫系统所针对的特定表位(即，免疫原性“热点”)。因此，根据实施例27的一般规程评估实施例24中描述的血清样品中存在的抗体的结合特异性。针对涂覆的胰岛素-fc融合蛋白文库对来自反复给药seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白的含有抗体的血清样品的分析(实施例32)证明在seq id no:5的胰岛素多肽序列内存在出乎意料的两个主要“热点”：从b链的n端起第10位的天冬氨酸突变(即b10)，以及单独地，在从a链n端起第8位的组氨酸突变(即a8)。结果表明，在狗中，包含含有这两个特定氨基酸突变的胰岛素多肽氨基酸组合物的胰岛素-fc融合蛋白可能具有免疫原性，因此可能在反复注射后产生中和生物活性的抗药物抗体。因此，确定不包含b10天冬氨酸和a8组氨酸的胰岛素多肽对于需要在狗中长期反复给药的胰岛素-fc融合蛋白而言是优选的(例如，用于治疗犬糖尿病)。[0420]实施例38：一种胰岛素-fc融合蛋白，包含seq id no:4的胰岛素多肽和非糖基化的犬iggb同种型fc片段，其中胰岛素多肽的b10d和a8h突变被恢复为天然组合物以降低潜在的免疫原性风险。[0421]为了评估替换“热点”突变是否会提高包含seq id no:4的胰岛素多肽和犬iggb同种型片段的胰岛素-fc融合蛋白的免疫原性和反复给药生物活性，合成了示例性胰岛素-fc融合蛋白(seq id no:43)，其中胰岛素多肽的b10和a8氨基酸分别恢复为如下给出的其天然组氨酸和苏氨酸组合物(seq id no:63)，其中非天然氨基酸加有下划线。[0422]fvnqhlcgshlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycn(seq id no:63)。[0423]此外，考虑到非糖基化cng突变体的额外潜在益处，seq id no：43的胰岛素-fc融合蛋白包含cng-q突变。seq id no：43的胰岛素-fc融合蛋白的全氨基酸序列如下所示：[0424]fvnqhlcgshlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycnggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfqgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:43)。[0425]根据实施例1在hek293细胞中制备seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。所得蛋白产量仅为21mg/l。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量的同二聚体％为98.0％，表明蛋白质相对不含聚集体。[0426]尽管同二聚体效价相对较低，为21mg/l，但分别根据实施例22、实施例23和实施例24的规程在狗中评估了seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性和免疫原性。图10表明在seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白中将b10d和a8h突变恢复为其天然氨基酸(即，b10h和a8t)确实显著降低了亲本化合物(seq id no:36)的免疫原性。[0427]然而，如图11所示，seq id no：43的含有天然b10和a8氨基酸的胰岛素-fc融合蛋白没有生物活性(即，naoc基本上为零)。[0428]实施例39：尝试将额外的b链和a链突变并入seq id no:63的胰岛素多肽中以提高包含犬iggb fc片段的相关胰岛素-fc融合蛋白的生物活性。[0429]与seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白(实施例33)相比，seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白不产生抗药物抗体(实施例38)的事实为如下理论提供了强有力的证据，seq id no：4的胰岛素多肽中的b10d和a8h突变可能是负责产生抗药物抗体的免疫原性表位。然而，与seq id no:36相比，seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白缺乏体内效力，这表明这两个氨基酸突变也是实现可接受的生物活性水平的原因。如根据实施例12的方法通过胰岛素受体结合测定所测量的，seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白缺乏体内效力与其高ic50(如下表9所示)相关。因此，需要进一步努力以提高胰岛素-fc融合蛋白的生物活性(即，将胰岛素受体结合测定ic50值降低至小于5000nm，或更优选地小于4000nm，或者甚至更优选地小于3000nm)，同时通过在胰岛素多肽中保留天然b10和a8氨基酸来维持低免疫原性。[0430]众所周知，胰岛素b链和a链的各个部分是与ir强结合所必需的(hubbard s.r.,“structural biology:insulin meets its receptor”,nature.2013；493(7431):171-172)。因此，部分b链或a链被修饰，同时保持b10和a8与天然胰岛素中的相同，而c链和肽接头保持不变。根据实施例1在hek293细胞中制备这些胰岛素-fc融合蛋白中的一些并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认其结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量其同二聚体含量％，并根据实施例12测量其胰岛素受体结合亲和力。其序列如下所示，所得与seq id no:43的序列比对示于图12中(clustal omega)。[0431]fvnqhlcgshlvqalylvcgergffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:44)[0432]fvnqhlcgselvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:45)[0433]fvnqhlcgshlvealalvcgeagffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:46)[0434]fvnqhlcgshlvealalvcgergfyytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:47)[0435]fvnqhlcgshlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:48)[0436][0437]no:52)[0445][0446][0447]根据实施例1在hek293细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认其结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量其同二聚体含量％，根据实施例12测量其胰岛素受体结合亲和力。结果显示在表10中。仅在一种情况下，包含最长的c链(ggggggsgggg–seq id no:71)的(seq id no:50)，与seq id no：43的胰岛素-fc融合蛋白相比，c链突变显著提高了胰岛素受体结合亲和力(ic50小于3000nm)。然而，这些c链突变的胰岛素-fc融合蛋白均未表现出大于50mg/l的制备设计目标的同二聚体效价。事实上，在一种情况下(seq id no：49)，c链突变出乎意料地导致显著降低的同二聚体效价。[0448]实施例41：尝试将肽接头突变并入含有seq id no:63的胰岛素多肽和犬iggb fc片段的胰岛素-fc融合蛋白中以提高生物活性。[0449]不受任何特定理论的束缚，认为seq id no：43的胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素受体结合差的另一个可能原因涉及胰岛素多肽和胰岛素受体之间的空间位阻，该位阻是由大得多的fc片段分子通过肽接头附接至胰岛素多肽的紧密接近引起的。认为较短的肽接头或更紧密折叠的肽接头可能会加剧这个问题，而较长的肽接头或耐自身折叠的肽接头(例如，具有更高分子挺度的接头)可以通过在胰岛素多肽与fc片段之间构建更多空间来缓解这个问题。胰岛素多肽与fc片段之间增加的空间也会增加胰岛素受体与fc片段之间的距离，从而减少胰岛素受体结合过程中的干扰。假设用于构建seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白的seq id no:11的肽接头(即ggggagggg)可能太短和/或太灵活，因为构成接头的氨基酸不含侧链(即，它仅包含甘氨酸和丙氨酸氨基酸)。因此，为了检验该假设，合成了seq id no：43的胰岛素-fc融合蛋白的另外两种胰岛素-fc融合蛋白变体。seq id no：48的胰岛素-fc融合蛋白含有与用于构建seq id no：43的胰岛素-fc融合蛋白相同的肽接头，但具有其中在从a链n端开始第21位(即a21)的天冬酰胺不存在(即，des-a21)的胰岛素多肽。并入该特定突变是为了观察a链和肽接头之间的连接是否影响蛋白质产量和/或分子的生物活性。seq id no:53的另一胰岛素-fc融合蛋白包含该des-a21n a链突变和肽接头，其长度为用于构建seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白的长度的超过两倍。在这个较长的肽接头中，丙氨酸不受欢迎，而被谷氨酰胺取代，其含有一个极性酰胺侧链。预计谷氨酰胺置换会增加肽接头的亲水性，并可能阻止接头自身折叠。序列如下所示，所得与seq id no：43的序列比对示于图14中(clustal omega)。[0450]fvnqhlcgshlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:53)[0451]fvnqhlcgshlvealalvcgergffytdptgggprrgiveqcctsicslyqlenycggggaggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:48)[0452][0453]根据实施例1在hek293细胞中制备两种胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认其结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量其同二聚体含量％，根据实施例12测量其胰岛素受体结合亲和力。结果在表11中给出。如通过ic50值显著降低测量的，并入不同组成的较长肽接头(对于seq id no:53而言gggggqggggqggggqggggg(seq id no:13)vs.对于seq id no:43而言ggggagggg(seq id no:11))确实改进了胰岛素受体结合，这表明更长的接头可能是增加胰岛素受体与其他胰岛素-fc融合蛋白结合的一种策略。然而，并入更长的接头仍然没有将同二聚体效价提高到比大于50mg/l的制备设计目标高。[0454]实施例42：尝试缺失seq id no:63的胰岛素多肽b链的部分以提高包含犬iggb fc片段的相关胰岛素-fc融合蛋白的同二聚体效价。[0455]实施例41的结果证明可以修饰肽接头以提高seq id no：43的胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素受体结合亲和力，seq id no：43含有天然b10和a8氨基酸。然而，肽接头突变未能将同二聚体效价增加到足以满足制备设计目标。由于同二聚体效价是若干特性的函数，包括细胞内合成和细胞内加工，因此推测胰岛素-fc分子可能在合成期间和合成之后在同二聚体的两个单体之间分子内地或在两个或更多个单独的同二聚体之间分子间地自缔合(即聚集)。这种聚集将导致在实施例1、实施例4和实施例10中描述的生产过程中从细胞培养物上清液中获得的同二聚体效价低得无法接受。胰岛素-fc融合蛋白分子之间的这种潜在相互作用可能部分归因于胰岛素公知的自缔合和形成聚集体的倾向。本领域中已知的一种降低胰岛素自缔合倾向的方法涉及使b链c端附近的氨基酸突变。例如，赖脯胰岛素(b28k；b29p突变)和门冬胰岛素(b28d突变)是公知的商业双链胰岛素，具有防止缔合和聚集的非no:51、seq id no:54、和seq id no:52)的胰岛素受体亲和力提高。[0462]实施例43：尝试将b链、c链和a链突变、b链截短和接头突变与seq id no:43的胰岛素-fc融合蛋白组合以进一步提高同二聚体效价和生物活性。[0463]如实施例39、实施例40、实施例41和实施例42所示，没有单一策略成功地将包含非免疫原性天然b10和a8氨基酸的胰岛素多肽与犬iggb fc片段结合以形成具有可接受的胰岛素受体活性和同二聚体效价的胰岛素-fc融合蛋白。因此，将更长的c链、更长的肽接头和b链的c端氨基酸截短的构思相组合。此外，为了潜在地进一步降低自缔合和聚集的倾向，使用疏水性较低的氨基酸包括具有在生理ph值下带负电荷或正电荷的侧基的那些在天然胰岛素疏水氨基酸残基位点引入了额外的点突变。示例性突变包括酪氨酸变为丙氨酸、酪氨酸变为谷氨酸、异亮氨酸变为苏氨酸和苯丙氨酸变为组氨酸。此外，为了简化分析，在所有情况下，犬iggb fc片段的cng位点都恢复为其天然天冬酰胺。这些胰岛素-fc融合蛋白变体的序列如下所示，所得与seq id no:43的序列比对示于图16中(clustal omega)：[0464]fvnqhlcgshlvealelvcgergffytpktggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:55)[0465]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycnhggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:56)[0466]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycngggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:28)[0467]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:26)[0468]fvnqhlcgshlvealelvcgergffyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:57)[0469][0470][0471]根据实施例1在hek293细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认其结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量其同二聚体含量％，并根据实施例12测量其胰岛素受体结合亲和力。结果在表13中给出。结果表明，降低某些b链和a链氨基酸的疏水性、使用更长和更灵活的c肽序列、截短若干c端b链氨基酸和使用更长的肽接头的组合导致满足最低同二聚体效价和胰岛素受体结合活性设计标准的若干有用的胰岛素-fc融合蛋白。与seq id no:43或seq id no:55相比，seq id no:56、seq id no:28、seq id no:26和seq id no:57示出更优选的胰岛素受体ic50值(小于3000nm)和更优选的hek同二聚体效价值(大于100mg/l)。出乎意料地，仅仅改变几个氨基酸导致胰岛素受体亲和力的多倍提高，并且在seq id no:26的胰岛素-fc融合蛋白的情况下，与seq id no:43的原始胰岛素-fc融合蛋白相比，同二聚体效价显著增加。[0472]实施例44：由seq id no:7的胰岛素多肽、seq id no:13的肽接头和seq id no:15的犬iggb fc片段构建的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性、反复给药生物活性和免疫原性。[0473]鉴于来自实施例43的阳性同二聚体效价和胰岛素受体结合活性结果，在狗中对两种最有希望的胰岛素-fc融合蛋白(seq id no:26和seq id no:28)进行了测试以评估反复给药的生物活性和免疫原性。每种化合物包含seq id no:13的更长、更亲水的肽接头和seq id no:15的更可制备、更少聚集的犬iggb fc片段。最重要的是，两种胰岛素-fc融合蛋白都包含具有推定较低免疫原性的天然b10和a8氨基酸的胰岛素多肽(即一般seq id no：6)。在seq id no:28的胰岛素-fc融合蛋白的情况下，在位置a21处存在天冬酰胺(即，胰岛素多肽包含seq id no:8)。在seq id no:26的胰岛素-fc融合蛋白的情况下，在位置a21处不存在天冬酰胺(即，胰岛素多肽包含seq id no:7)。[0474]按照实施例21的规程，在n＝1只狗中对seq id no:28的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行了测试。图17示出的单次皮下给药结果证明，seq id no:28的胰岛素-fc融合蛋白事实上在体内具有生物活性，根据实施例22的规程计算的naoc为1076fbgl％·天数·kg/mg。通过实施例23的方法使用elisa测量seq id no:28的胰岛素-fc融合蛋白的药代动力学特性，并将二室模型与数据拟合从而确定其消除半衰期为3.5天。[0475]然后根据实施例15的规程，通过在初次注射后的第14天、第28天和第42天，继续向n＝1只狗皮下给药seq id no：28的胰岛素-fc融合蛋白来评估反复给药的生物活性。当狗的fbgl％下降过低时，给狗喂食以将血糖升高到安全水平。根据实施例22的一般规程测量每次后续给药的naoc和naocr，由从给药时间至在下一次给药之前的时间计算。表14中示出的naoc和naocr说明seq id no：28的胰岛素-fc融合蛋白在四次给药中维持大于0.8的naocr从而满足反复给药生物活性设计目标。[0476][0477]根据实施例24的规程测试seq id no：28的胰岛素-fc融合蛋白的免疫原性。图18证明seq id no：28的胰岛素-fc融合蛋白在体内未表现出明显的免疫原性，这与在整个反复给药实验中保持体内生物活性一致。[0478]还针对在狗中反复给药的生物活性性能对seq id no:26的胰岛素-fc融合蛋白进行了评估，该胰岛素-fc融合蛋白在胰岛素多肽链的a21处不存在天冬酰胺。根据实施例22的规程，在第0天、第14天、第28天和第42天将化合物皮下给药至n＝1只狗。当狗的fbgl％下降过低时，给狗喂食以将血糖升高到安全水平。第一次注射的naoc为令人印象深刻的2278fbgl％·天数·kg/mg，表明seq id no：26的胰岛素-fc融合蛋白在体内具有令人满意的生物活性，其为seq id no:28的胰岛素-fc融合蛋白的效力的几乎两倍。通过实施例23的方法使用elisa测量胰岛素-fc融合蛋白的药代动力学特性，并且将二室模型与数据拟合从而确定其消除半衰期为约4.1±0.7天。图19和图20示出接受seq id no:26的同二聚体的动物的单剂量血糖对照和多剂量、多周血糖对照。还根据实施例22的一般规程测量每次后续给药的naoc和naocr，由从给药时间至在下一次给药之前的时间计算。表15中示出的naoc和naocr说明seq id no：26的胰岛素-fc融合蛋白在四次给药中维持大于或等于1.0的naocr从而满足实施例29中所描述的反复给药生物活性设计目标。[0479]根据实施例24的规程测试seq id no：26的胰岛素-fc融合蛋白的免疫原性。图21证明seq id no：26的胰岛素-fc融合蛋白在体内未表现出明显的免疫原性，这与在整个反复给药实验中保持体内生物活性一致。[0480][0481]如在本发明详述中讨论的，天冬酰胺-甘氨酸键之间存在已知的酶切位点(vlasak,j.,ionescu,r.,(2011)mabs vol.3,no.3pp 253-263)。在seq id no:26的具有seq id no:13的肽接头的胰岛素-fc融合蛋白中包含的seq id no:7的胰岛素多肽中的a链的第21个氨基酸(即a21)处省略天冬酰胺，消除了酶促切割a链c端与肽接头n端之间的天冬酰胺-甘氨酸键的可能性。然而，seq id no：28的胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no：13的肽接头和seq id no：8的胰岛素多肽，其将天冬酰胺保持在a21处。因此，预期seq id no：28的胰岛素-fc融合蛋白在合成过程中或皮下给药后在体内被酶消化。然而，相当出乎意料地，seq id no：28的胰岛素-fc融合蛋白可在hek细胞中制备，具有可接受的同二聚体效价，并且在体内表现出可接受的生物活性，没有酶消化有损于其生物活性的迹象。[0482]实施例45：犬iggb同种型fc片段对于包含seq id no:7的优选胰岛素多肽和seq id no:13的优选肽接头的胰岛素-fc融合蛋白的最佳可制造性和体内效力的确认。[0483]如实施例43和实施例44中所述，发现一种新的胰岛素多肽和肽接头组合产生非免疫原性、高产量、高纯度和高生物活性的胰岛素-fc融合蛋白，关于犬iggb fc片段在同二聚体效价和生物活性方面是否仍然是优选的同种型的问题依然存在，如实施例32和实施例33中的胰岛素-fc融合蛋白的情况那样。因此，设计了另外的胰岛素-fc融合蛋白，其中seq id no:26的胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素多肽(seq id no:7)和肽接头(seq id no:13)保持不变，并且seq id no:15的犬iggb fc片段被seq id no:14的犬igga fc片段、seq id no:16的犬iggc fc片段或seq id no:17的犬iggd fc片段替换。这些所得胰岛素-fc融合蛋白变体的序列如下所示：[0484]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfngtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:26)[0485]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggrctdtppcpvpeplggpsvlifppkpkdilritrtpevtcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqsreqqfngtyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhidlpspiertiskargrahkpsvyvlppspkelsssdtvsitclikdfyppdidvewqsngqqeperkhrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqqgdpftcavmhetlqnhytdlslshspg(seq id no:58)[0486]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggcnncpcpgcgllggpsvfifppkpkdilvtartptvtcvvvdldpenpevqiswfvdskqvqtantqpreeqsngtyrvvsvlpighqdwlsgkqfkckvnnkalpspieeiisktpgqahqpnvyvlppsrdemskntvtltclvkdffppeidvewqsngqqepeskyrmtppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqislshspg(seq id no:59)[0487]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggcispcpvpeslggpsvfifppkpkdilritrtpeitcvvldlgredpevqiswfvdgkevhtaktqpreqqfnstyrvvsvlpiehqdwltgkefkcrvnhiglpspiertiskargqahqpsvyvlppspkelsssdtvtltclikdffppeidvewqsngqpepeskyhttapqldedgsyflysklsvdksrwqqgdtftcavmhealqnhytdlslshspg(seq id no:60)。[0488]根据实施例1在hek293细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a或蛋白质g柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认其结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量其同二聚体含量％，并根据实施例12测量其胰岛素受体结合亲和力。另外，根据实施例15测量胰岛素-fc融合蛋白对犬fcrn受体的亲和力。如表16所示，seq id no：26的包含犬iggb fc片段的胰岛素-fc融合蛋白表现出这些序列的最高同二聚体效价。当使用蛋白质a柱纯化时，seq id no：58的包含犬igga fc片段的胰岛素-fc融合蛋白表现出较差的同二聚体效价；然而，当使用蛋白质g柱纯化时，同二聚体效价显著提高，超过了大于50mg/l的设计目标。对于seq id no：59的包含犬iggc fc片段的胰岛素-fc融合蛋白也是如此。当用蛋白质a或蛋白质g柱纯化时，seq id no：60的包含犬iggd fc片段的胰岛素-fc融合蛋白不产生任何化合物。因此，如用seq id no:36的含有不同胰岛素多肽(seq id no:4)和肽接头(seq id no:11)的胰岛素-fc融合蛋白所证明的，在同二聚体效价方面，犬iggb是优选的fc片段(参见实施例32)。[0489][0490][0491]dnm＝未测量；#＝经蛋白质a纯化；＝通过蛋白质g纯化。[0492]根据实施例21的规程对经由蛋白质g纯化的seq id no：58的包含犬igga fc片段的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行测试。图22中示出的结果表明seq id no:58的胰岛素-fc融合蛋白在体内仅具有一定的生物活性，根据实施例22计算的naoc仅为174fbgl％·天数·kg/mg。[0493]根据实施例21的规程对经由蛋白质g纯化的seq id no：59的包含犬iggc fc片段的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行测试。图23中示出的结果表明seq id no:59的胰岛素-fc融合蛋白在体内仅具有一定的生物活性，根据实施例22计算的naoc仅为39fbgl％·天数·kg/mg。[0494]因此，如用seq id no:36的含有不同胰岛素多肽(seq id no:4)和肽接头(seq id no:11)的胰岛素-fc融合蛋白所证明的，在生物活性方面，犬iggb是优选的fc片段(参见上文的实施例32和实施例33以及表16)。[0495]实施例46：非糖基化胰岛素-fc融合蛋白包含seq id no：8的胰岛素多肽、seq id no：13的肽接头和犬iggb fc片段以降低免疫原性的潜在风险。[0496]虽然seq id no:26的胰岛素-fc融合蛋白满足所有设计目标(实施例28)，但在延长治疗期(例如，6个月、1年、2年或更长时间)方面可能存在或不存在免疫原性风险，如果发生这种情况，可能会影响使用该胰岛素-fc融合蛋白治疗糖尿病。如发明详述以及实施例34和实施例35中所述，反复给药后生物活性降低的一个可能原因是犬iggb fc片段与狗的免疫系统的不希望的相互作用，导致产生中和抗药物抗体。然而，实施例45中示出的结果出乎意料地证明，犬iggb同种型是四种犬igg同种型中产生期望的可制备性和生物活性的唯一选择。因此，探索了进一步的fc突变以获得具有低fc(γ)ri受体结合的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白，这将降低长期、慢性免疫原性风险。[0497]如发明详述中所述，一种用于减少fc(γ)ri相互作用的方法涉及使fc片段cng位点突变以防止在宿主细胞中合成期间的糖基化。因此，对seq id no:26的fc片段区进行cng位点突变以降低fc片段在体内对fc(γ)受体的结合亲和力，如通过实施例15中描述的在体外人fc(γ)ri测定中的结合所测量。seq id no：26的胰岛素-fc融合蛋白中cng位点的位置是cng-nb151。seq id no：26的突变包括包含cng-nb151-s突变的seq id no：62和包含相同cng-nb151-s突变以及nb119-a突变的seq id no：61。将nb119-a并入是为了进一步尝试减少与fc(γ)ri的相互作用，正如lo,m.et al.“effector attenuating substitutions that maintain antibody stability and reduce toxicity in mice”,j.biol.chem.(2017),pp.1-20.the full amino acid sequences of the resulting insulin-f中仅用于小鼠抗体所描述的。下文中列出了所得胰岛素-fc融合蛋白的全氨基酸序列(为清楚起见，nb119和nb151位点加有下划线)连同它们的序列比对(clustal omega)一起示于图24中：[0498]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvaldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:61)[0499]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:62)。[0500]根据实施例1在hek293细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认其结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量其同二聚体含量％，并根据实施例12测量其胰岛素受体结合亲和力。如表17所示，并入fc片段上的cng-nb151-s突变降低了同二聚体％，表明聚合水平高得不可接受(即，同二聚体％下降到略高于70％)。[0501][0502]按照实施例21的规程，在n＝1只狗中对seq id no:61和seq id no:62的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行了测试。图25中示出的单次皮下给药的结果表明，两种化合物的体内生物活性显著低于seq id no:26的胰岛素-fc融合蛋白(seq id no:62的naoc＝574fbgl％·天数·kg/mg；seq id no：61的naoc＝921fbgl％·天数·kg/mg)。结果表明，在fc片段上并入cng-nb151-s突变以产生seq id no：26的胰岛素-fc融合蛋白的非糖基化变体出乎意料地降低了所得化合物的体内生物活性。[0503]为了降低聚集程度和提高seq id no:62的含有cng-nb151-s位点突变的胰岛素-fc融合蛋白的生物活性，对各种胰岛素-多肽b链变体进行了研究，认为该区中的突变是聚合的原因。根据实施例1在hek293细胞中制备胰岛素-fc融合蛋白并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认其结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量其同二聚体含量％。出乎意料地发现，在测试的b链变体中，一种在从b链n端起的第16个氨基酸(即b16)处含有酪氨酸到丙氨酸置换的胰岛素fc融合蛋白(seq id no：30)具有高同二聚体效价(105mg/l)和低聚集(99％同二聚体)，得到同二聚体效价为104mg/l。根据实施例12测量的胰岛素受体结合是可接受的，ic 50为2040nm。根据实施例16测量的fcrn受体结合亲和力ec50值为1194ng/ml。通过实施例23的方法使用elisa测量seq id no:30的胰岛素-fc融合蛋白的药代动力学特性，并且将二室模型与数据拟合从而确定其消除半衰期为约4.1±0.7天。seq id no：30的序列如下所示(为清楚起见，b16a和cng-nb151-s突变加有下划线)。[0504]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdcpkcpapemlggpsvfifppkpkdtlliartpevtcvvvdldpedpevqiswfvdgkqmqtaktqpreeqfsgtyrvvsvlpighqdwlkgkqftckvnnkalpspiertiskargqahqpsvyvlppsreelskntvsltclikdffppdidvewqsngqqepeskyrttppqldedgsyflysklsvdksrwqrgdtficavmhealhnhytqeslshspg(seq id no:30)。[0505]然后在狗中评估seq id no：30的胰岛素-fc融合蛋白的反复给药生物活性性能。根据实施例22的规程，在第0天、第7天、第14天和第28天将化合物皮下给药至n＝1只狗。当狗的fbgl％下降过低时，给狗喂食以将血糖升高到安全水平。出乎意料地，与seq id no:62的胰岛素-fc融合蛋白相比，第一次注射seq id no:30的含有b16a突变的胰岛素-fc融合蛋白的naoc显著地更高(1185fbgl％·天数·kg/mg)。第一次给药的体内生物活性图示于图26中。化合物的药代动力学特性也通过实施例23的方法使用elisa测量，并且将二室模型与数据拟合从而确定其消除半衰期为3.5天。还根据实施例22的一般规程测量每次后续给药的naoc和naocr，由从给药时间至在下一次给药之前的时间计算。表18中示出的naoc和naocr说明seq id no：30的胰岛素-fc融合蛋白在四次给药中维持大于或等于0.6的naocr从而满足反复给药生物活性设计目标。总之，结果表明有必要突变胰岛素b链序列以获得seq id no：26的合适的、非糖基化的cng-s变体。因此，对于包含cng突变的犬iggb fc片段的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白，优选seq id no：10的胰岛素多肽。[0506][0507]最后，根据实施例15的规程，通过测量它们的fc(γ)受体结合活性来测试选择的化合物与免疫系统相互作用的可能性。表19将这些胰岛素-fc融合物的fc(γ)受体i结合与seq id no:36的胰岛素-fc融合蛋白的fc(γ)受体结合进行了比较。可以看出，非糖基化的胰岛素-fc融合蛋白(通过cng-s突变实现)表现出与seq id no:36的最低的fc(γ)受体结合比率。[0508][0509][0510]实施例47：使用经由稳定转染的cho细胞系制备的包含犬iggb来源的fc片段的优选胰岛素-fc融合蛋白的示例性基于cho的生产运行(production runs)。[0511]按照实施例2所描述构建用编码seq id no:26或seq id no:30的载体稳定地转染的单独cho细胞系。在设置为37℃和5％二氧化碳的培养箱-振动器中以50万个细胞/ml接种分批式摇瓶14天生产运行(0.5-2.0l培养基规模)，并按照上述实施例2中所描述进行运行，除了用dynamis取代cd opticho作为培养基(thermofisher)和使用高效养料c(thermofisher)作为养料。从生产运行的第3天开始以3％v/v添加养料，在第4天，将摇瓶温度调节为32℃，并将培养箱-振动器中的二氧化碳浓度从5％降低到2％。在运行期间，细胞增加到800-1400万个细胞/ml，在第14天收获生产运行以除去细胞，纯化培养上清液并测试以获得如实施例4、实施例6、实施例8和实施例10中所述的胰岛素-fc融合蛋白。表20描述了从使用稳定转染的cho细胞系的生产运行中获得的制备数据。[0512][0513]实施例48：使用经由稳定转染的cho细胞系制备的包含犬iggb来源的fc片段的优选胰岛素-fc融合蛋白的示例性基于cho的生产运行。[0514]按照实施例2中所述构建用编码seq id no:28的载体稳定转染的cho细胞系。在设置为37℃和5％二氧化碳的培养箱-振动器中以50万个细胞/ml接种分批式摇瓶14天生产运行(0.5-2.0l培养基规模)，并按照实施例2中所描述进行运行，除了用dynamis取代cd opticho作为培养基(thermofisher)和使用高效养料c(thermofisher)作为养料。从生产运行的第3天开始以3％v/v添加养料，在第4天，将摇瓶温度调节为32℃，并将培养箱-振动器中的二氧化碳浓度从5％降低到2％。在第14天收获生产运行以除去细胞，纯化培养上清液并测试以获得如实施例4、实施例6、实施例8和实施例10中所描述的胰岛素-fc融合蛋白。预期所得到的生产运行产生大于200mg/l的蛋白质产量、大于95％的同二聚体和大于190mg/l的seq id no:28的同二聚体效价。[0515]结果-包含人fc片段的胰岛素-fc融合蛋白[0516]实施例49：包含人fc igg1和igg2同种型的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白。[0517]尝试使用seq id no:13的肽接头产生包含seq id no:7的胰岛素多肽序列和人igg2同种型(seq id no:74)的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白。所得胰岛素-fc融合蛋白的全氨基酸序列如下：[0518]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:75)。[0519]进一步尝试使用seq id no:13的肽接头产生包含seq id no:7的胰岛素多肽序列和人igg1同种型(seq id no:73)的fc片段的胰岛素-fc融合蛋白。所得胰岛素-fc融合蛋白的全氨基酸序列如下：[0520]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:76)。[0521]根据实施例1在hek细胞中合成seq id no：75和seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白构型，并根据实施例4进行纯化。如表21所示，在对于每个胰岛素-fc融合蛋白构型而言两次单独合成和蛋白质a纯化步骤之后，总蛋白产量给出平均同二聚体效价。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认胰岛素-fc融合蛋白构型的结构，并根据实施例8通过lc-ms并去除聚糖进一步鉴定序列。根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量同二聚体％并确定为如下表21所示。总之，在hek细胞中制备seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白产生了可接受的聚集和同二聚体效价水平，这满足同二聚体效价大于150mg/l的设计目标，而hek细胞中制备的seq id no：75的胰岛素-fc融合蛋白不满足同二聚体效价设计目标。[0522]接着，评估了seq id no：76的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性潜力。首先，根据实施例12测量seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白的ir结合，得到1799nm的ic50值，表明该化合物可能在体内具有生物活性(即ic50小于2400nm)。fcrn测定ec50值为578ng/ml，表明当在犬筛选研究(例如，如实施例28中所描述)或在人糖尿病患者中测量时，具有延长的体内生物活性特性的可能性很大。[0523]接下来，通过利用实施例14和实施例16的方法测量每种化合物与fc(γ)ri和clq的体外结合来筛选不需要的免疫原性潜力的倾向。seq id no：75的胰岛素-fc融合蛋白证明，fc(γ)ri和c1q测定od450比率(其中od450比率中的参考胰岛素-fc融合蛋白为seq id no:76)分别为0.045和0.309，表明seq id no:75的同二聚体确实满足fc(γ)ri结合(测定od450比率小于0.50)和clq结合(测定od450比率小于0.35)的设计目标(实施例29)。然而，如上所述，在hek细胞中seq id no：75的胰岛素-fc融合蛋白的产量不满足同二聚体效价设计目标。[0524][0525][0526]#＝来自两个独立实验的平均值[0527]^＝来自三个独立实验的平均值[0528]*＝参考胰岛素-fc融合蛋白与其自身的比率[0529]实施例50：包含人igg1同种型的胰岛素-fc融合蛋白的fc片段区的cng突变。[0530]为了保持同二聚体含量％、ir结合亲和力和可接受的seq id no：76的胰岛素-fc融合蛋白对fcrn受体的结合亲和力，将cng-s突变插入fc片段ch3区以尝试降低与fc(γ)ri和c1q的结合，得到seq id no:91的胰岛素-fc融合蛋白构型如下：[0531]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:91)。[0532]根据实施例1在hek细胞中合成seq id no：91的非糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型，根据实施例4纯化，并根据实施例6、实施例8、实施例10、实施例12、实施例14和实施例16进行测试，结果如表22所示，连同seq id no：76的亲本糖基化胰岛素-fc融合蛋白构型的结果，示出总蛋白质产量、同二聚体％和同二聚体效价。结果表明，在seq id no:76的人igg1 fc片段内的cng-s突变产生的seq id no:91的胰岛素-fc融合蛋白构型确实导致fc(γ)ri亲和力和c1q亲和力所期望的降低。相对于seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价，seq id no:91的胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价显著增加。尽管同二聚体效价提高，但seq id no:91的胰岛素-fc融合蛋白构型给出的ir测定ic50值大于2400nm(在小于2400nm的设计标准之外)并显著高于seq id no:76(即，更低的ir亲和力)，表明该胰岛素-fc融合蛋白构型不太可能表现出可接受的效力或满足设计目标(实施例29)。[0533][0534]#＝来自两个独立实验的平均值[0535]dnt＝未测试。[0536]实施例51：使用突变的胰岛素多肽(seq id no：10)、接头(seq id no：13)和具有cng-s突变的fc igg1同种型的人胰岛素-fc融合蛋白。[0537]如上所述，cng-s、igg1同种型fc片段突变产生的胰岛素-fc融合蛋白构型对fc(γ)ri和c1q的亲和力显著降低，但该胰岛素-fc融合蛋白构型的ir受体亲和力低得无法接受(即ic50值大于2400nm)。因此，对胰岛素多肽进行突变，并针对ir ic50测定筛选所得物质，以致力于观察突变是否导致ir亲和力提高。在从b链n端起的第16个氨基酸处进行从酪氨酸到丙氨酸的转换(即b16a)，得到seq id no:10的胰岛素多肽。将seq id no:10的突变胰岛素多肽和seq id no:13的肽接头与seq id no:77的cng突变的fc片段一起使用得到seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白构型，其中x1是s。对胰岛素-fc融合蛋白构型中的fc片段区进行cng-s突变以降低体内fc片段对fc(γ)受体的结合亲和力，如通过在实施例15中描述的体外人fc(γ)ri测定中的结合所测量的。seq id no：78的胰岛素-fc融合蛋白中cng-s位点的位置是cng-nb155，在cng位点处包含从“n”到“s”的突变。[0538]根据实施例1在hek293细胞中制备seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白构型并根据实施例4使用蛋白质a柱纯化。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白的结构，并根据实施例8通过lc-ms不进行去除聚糖进一步鉴定序列。在不进行酶促去糖基化的情况下通过实施例8的lc-ms方法评估seq id no:78的化合物mw。seq id no：78的目标质量为65046.9da，实测质量为65046.7da，确认了seq id no：78的化合物氨基酸组成和同二聚体结构是准确的。[0539]根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量同二聚体％。cng突变的胰岛素-fc融合蛋白的全氨基酸序列如下所列(nb155位置加有下划线)：[0540]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:78)。[0541]seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白构型的所得总蛋白质产量、同二聚体％和同二聚体效价在表23中给出，并与seq id no:76和seq id no:91进行了比较。相对于seq id no:76，在非糖基化cng-s突变的胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素多肽序列中包括b16a突变提高了同二聚体效价。根据实施例12的规程测试seq id no：78的胰岛素-fc融合蛋白的体外ir结合。与其中胰岛素多肽含有b16e突变(seq id no：7)的seq id no：91相比，在seq id no：78的胰岛素-fc融合蛋白中将b16a突变包含到seq id no：10的胰岛素多肽中使得ir亲和力显著提高(即，较低的ir ic50测定值)。这尤其出乎意料，因为不同胰岛素-fc融合蛋白(us10,597,435中的seq id no：3)中的该b16a突变提供大于5000nm的ir ic50测定值并且在体内未示出降低葡萄糖的生物活性。在氨基酸序列中突出差异的seq id no:76、seq id no:78和seq id no:91的序列比对示于图27中。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。[0542][0543][0544]此外，在seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素多肽中包含b16a突变(得到seq id no:10)导致如通过实施例19中的规程测量的可接受的fcrn结合，表明该胰岛素-fc融合蛋白可能表现出延长的体内药代动力学半衰期，并表现出延长的体内降糖生物活性特性。注意到与不含b16a突变的类似胰岛素-fc融合蛋白(seq id no:91)相比，seq id no:78的fcrn结合亲和力更高(如通过在fcrn结合测定中较低的ec50测量所证明的)，进一步强调除了ir受体亲和力外，包含b16a突变出乎意料地影响fcrn受体亲和力。认为fcrn受体亲和力这种增量的增加可能是期望的，因为更高的fcrn亲和力通常与更长的体内治疗药代动力学半衰期相关。[0545]通过实施例14和实施例16的方法测量seq id no：78的胰岛素-fc融合蛋白的fc(γ)ri和clq结合特性，并显示为可接受的。对于seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白的c1q结合亲和力也低得多，表明相对于seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白，c1q结合降低大于80％。因此，seq id no:78的胰岛素-fc融合蛋白满足可制备性、体内效力、延长的体内生物活性和低免疫原性潜力的设计目标(实施例29)。[0546]实施例52：包含人igg1同种型的胰岛素-fc融合蛋白的fc片段区的替选cng突变。[0547]进一步尝试产生如下所述的胰岛素-fc融合蛋白构型：具有延长的体内生物活性和低免疫原性潜力，同时保持与seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白相似的同二聚体含量％和ir结合亲和力，以及对fcrn受体可接受的结合亲和力，将替选cng突变插入fc片段ch3区以尝试降低与fc(γ)ri和c1q的结合，得到seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94和seq id no:95。按照实施例1在hek细胞中合成胰岛素-fc融合蛋白实施方式，按照实施例4纯化，并按照实施例6、实施例8、实施例10、实施例12、实施例14和实施例16进行检测，结果示于下表24中。seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94和seq id no:95与seq id no:75、seq id no:76和seq id no:91的序列比对突出了氨基酸序列的差异，示于图28中(clustal omega)。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。[0548]胰岛素-fc融合蛋白实施方式的全氨基酸序列如下所示，其中cng突变加有下划线。[0549]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqydstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:92)[0550]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:93)[0551]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyrstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:94)[0552]fvnqhlcgshlvealelvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:95)。[0553]上述包含seq id no:77(其中x1是d、a、r和q)的人iggl fc片段的胰岛素-fc融合蛋白实施方式与seq id no:76一起列于表24中，示出相应的总蛋白质产量、同二聚体％和同二聚体效价。结果表明，包含在seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94和seq id no:95的人igg1 fc片段内的cng位点的各种突变确实导致fc(γ)ri亲和力和c1q亲和力发生所期望的降低。相对于seq id no:76，seq id no:92、seq id no:93和seq id no:94的同二聚体效价显著增加。seq id no:95的同二聚体效价太低而不能满足设计目标(实施例29)，因此未测定胰岛素受体结合。尽管同二聚体效价提高，但seq id no:92、seq id no:93和seq id no:94给出的ir测定ic50值在所有情况下均大于2400nm并且显著高于(即，较低的ir亲和力)seq id no：76的ir测定ic50值。所有情况下的ir测定ic50值均大于设计标准(小于2400nm)，表明这些胰岛素-fc融合蛋白实施方式不太可能表现出可接受的效力和商品成本。seq id no:91、seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94和seq id no:95均不满足设计目标(实施例29)。[0554][0555][0556]#＝来自两个独立实验的平均值[0557]dnt＝未测试。[0558]实施例53：使用胰岛素多肽(seq id no：10)、接头(seq id no：13)和包含各种cng突变的fc igg1同种型的人胰岛素-fc融合蛋白。[0559]如上所述，cng-位点、igg1同种型fc片段突变产生的胰岛素-fc融合蛋白对fc(γ)ri和c1q的亲和力显著降低，但这些化合物的ir受体亲和力低得无法接受(即ic50值大于2400nm)。因此，对seq id no:78中的胰岛素多肽进行的相同突变(在从b链n端起的第16个氨基酸处进行从酪氨酸到丙氨酸的转换(即b16a)，得到seq id no:10的胰岛素多肽)，并针对ir ic50测定来筛选所得的胰岛素-fc融合蛋白构型，以努力查看是否任何突变的胰岛素多肽导致提高的ir亲和力。使用seq id no:10的突变胰岛素多肽和seq id no：13的肽接头制备如下所示的seq id no：80、seq id no：82、seq id no：84和seq id no：86的胰岛素-fc融合蛋白构型。这些胰岛素-fc融合蛋白构型中的每一个包含对fc片段区进行的cng位点突变以降低体内fc片段对fc(γ)受体的结合亲和力，如通过在实施例15中描述的体外人fc(γ)ri测定中的结合所测量的。在seq id no：80、seq id no：82、seq id no：84和seq id no：86的胰岛素-fc融合蛋白构型中cng位点的位置是cng-nb155。seq id no：80的胰岛素-fc融合蛋白在cng位点处包含从“n”到“d”的突变。seq id no：82的胰岛素-fc融合蛋白在cng位点处包含从“n”到“a”的突变。seq id no：84的胰岛素-fc融合蛋白在cng位点处包含从“n”到“r”的突变。seq id no：86的胰岛素-fc融合蛋白在cng位点处包含从“n”到“q”的突变。[0560]根据实施例1在hek293细胞中制备蛋白质。意料之外地，seq id no：86的包含cng-nb155-q突变和b16a突变的胰岛素-fc融合蛋白构型的同二聚体效价显著低于所需以满足同二聚体效价的设计目标。然后根据实施例4使用蛋白质a柱纯化seq id no：80、seq id no：82和seq id no：84的胰岛素-fc融合蛋白构型。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认胰岛素-fc融合蛋白构型的结构，并根据实施例8通过lc-ms不去除聚糖进一步鉴定序列。在不进行酶促去糖基化的情况下通过实施例8的lc-ms方法测定seq id no:80的胰岛素-fc融合蛋白的化合物mw。seq id no：80的目标质量为65102.9da，实测质量为65102.8da，确认了seq id no：80的化合物氨基酸组成和同二聚体结构是准确的。在不进行酶促去糖基化的情况下通过实施例8的lc-ms方法测定seq id no:82的胰岛素-fc融合蛋白的化合物mw。seq id no：82的目标质量为65014.9da，实测质量为65014.9da，确认了seq id no：82的化合物氨基酸组成和同二聚体结构是准确的。在不进行酶促去糖基化的情况下通过实施例8的lc-ms方法测定seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白的化合物mw。seq id no：84的目标质量为65185.1da，实测质量为65184.8da，确认了seq id no：84的化合物氨基酸组成和同二聚体结构是准确的。[0561]根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量同二聚体％。下面列出cng突变的胰岛素-fc融合蛋白构型的全氨基酸序列(seq id no:80、seq id no:82、seq id no:84和seq id no:86，其中nb155位置加有下划线)，并且在图29中示出所得与seq id no:76和seq id no:78的序列比对(clustal omega)。“*”表示整条序列在给定序列位置处完全同源，而“：”、“。”或空格分别指序列在给定序列位置处保守的、中等的或非常不同的氨基酸突变。[0562]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqydstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:80)[0563]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:82)[0564]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyrstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:84)[0565]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycgggggqggggqggggqgggggdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:86)。[0566]所得总蛋白质产量、同二聚体％和同二聚体效价在表25中给出。除如上所述的seq id no:86之外，相对于seq id no:76，在非糖基化cng突变的胰岛素-fc融合蛋白实施方式的胰岛素多肽序列中包括b16a突变提高了同二聚体效价。cng-nb155-d组合物在222mg/l处表现出最高同二聚体效价。根据实施例12的规程测试胰岛素-fc融合蛋白的体外ir结合。与seq id no:78的情况一样，与其中胰岛素多肽含有b16e突变的seq id no:92、seq id no：93和seq id no：94的胰岛素-fc融合蛋白构型相比，将b16a突变包含到seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白实施方式的胰岛素多肽中导致ir亲和力的显著提高(即，较低的ir ic50测定值)。[0567]此外，在seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白的胰岛素多肽中包含b16a突变导致如通过实施例19中的规程测量的对这些胰岛素-fc融合蛋白而言可接受的fcrn结合，表明这些化合物可能表现出延长的体内药代动力学半衰期，并表现出延长的体内降糖生物活性特性。注意到与不含b16a突变的类似胰岛素-fc融合蛋白构型(seq id no:92、seq id no:93和seq id no:94)相比，含b16a突变的胰岛素-fc融合蛋白构型(seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84)的fcrn结合亲和力更高(例如，在fcrn结合测定中较低的ec50)，进一步强调除了ir受体亲和力外，包含b16a突变出乎意料地影响fcrn受体亲和力。认为fcrn受体亲和力的这种增量的增加可能是期望的，因为更高的fcrn亲和力通常与更长的体内治疗药代动力学半衰期相关。[0568]通过实施例14和实施例16的方法测量seq id no：80、seq id no:82和seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白构型的fc(γ)ri和clq结合特性，并显示为可接受的。此外，fc(γ)ri结合亲和力随着cng-nb155-r(seq id no:84)突变而显著降低，表明相对于seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白，fc(γ)ri结合降低了80％以上。对于seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白，c1q结合亲和力也低得多，表明相对于seq id no:76的胰岛素-fc融合蛋白，所有这些胰岛素-fc融合蛋白实施方式示出c1q结合降低大于80％。因此，seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白满足可制备性、体内效力、延长的体内生物活性和低免疫原性潜力的设计目标(实施例29)。[0569][0570][0571]#＝来自两个独立实验的平均值[0572]dnt＝未测试。[0573]实施例54：具有胰岛素多肽seq id no：10、包含cng-s突变的fc igg1同种型和各种接头的人胰岛素-fc融合蛋白。[0574]如上所述，在cng位点的igg1同种型fc片段突变和胰岛素多肽上的突变导致物质特性的出乎意料地变化，包括ir、fcrn、fc(γ)ri受体和c1q结合。为了更好地理解接头组合物如何影响这些特性，将包含seq id no:10的b16a-突变的胰岛素多肽、具有cng-s突变的非糖基化higg1 fc片段(seq id no:77，其中x1是s)和seq id no:13的接头序列的一种特定胰岛素-fc融合蛋白构型(seq id no:78)选择为修改接头长度和组成的起点，如下表26所示。[0575][0576][0577]根据实施例1在hek293细胞中制备seq id no:96、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:87和seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白实施方式。然后根据实施例4使用蛋白质a柱纯化胰岛素-fc融合蛋白构型。根据实施例6通过非还原和还原ce-sds确认胰岛素-fc融合蛋白构型的结构，并根据实施例8通过lc-ms不去除聚糖进一步鉴定序列。采用实施例8的lc-ms方法进行聚糖缺乏的验证，但是省略了pngase f处理步骤。在不进行酶促去糖基化的情况下通过实施例8的lc-ms方法测定seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白构型的化合物mw。目标质量为64704.6da，实测质量为64704.4da，确认了seq id no：87的化合物氨基酸组成和同二聚体结构是准确的。在不进行酶促去糖基化的情况下通过实施例8的lc-ms方法测定seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白构型的化合物mw。目标质量为63279.2da，实测质量为63278.8da，确认了seq id no：89的化合物氨基酸组成和同二聚体结构是准确的。[0578]根据实施例10通过尺寸排阻色谱测量同二聚体％。按照实施例12中所描述测量体外im-9ir结合ic50，按照实施例15所描述使用体外人fc(γ)ri测定测量fc(γ)受体结合亲和力，按照实施例16所描述测量clq结合亲和力，按照实施例19所述测量对人fcrn受体的亲和力。结果在表27中给出。[0579]id no:89)[0586]fvnqhlcgshlvealalvcgergfhyggggggsgggggiveqcctstcsldqlenycdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqysstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:98)。[0587]结果表明，在没有接头的胰岛素-fc融合蛋白构型中，其中胰岛素多肽的c-端直接连接到fc片段(seq id no:98)的n-端，同二聚体效价低得无法接受(即38mg/l)。在具有包含至少九个氨基酸长度的甘氨酸-谷氨酰胺接头组合物的胰岛素-fc融合蛋白构型(seq id no:97、seq id no:78和seq id no:96)中，似乎没有出现物理化学性质随接头长度变化而变化的任何显著趋势。将seq id no:87的包含甘氨酸-丙氨酸组合物接头的胰岛素-fc融合蛋白构型与seq id no:78的包含甘氨酸-谷氨酰胺组合物接头的胰岛素-fc融合蛋白构型进行的比较表明，对于21个氨基酸的相同接头长度，seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白构型表现出改进的同二聚体效价、更强的ir结合和更强的fcrn结合，同时具有几乎相同的fc(γ)ri和c1q结合特性。因此，虽然seq id no:96、seq id no:97、seq id no:87和seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白构型均满足设计目标(实施例29)，但seq id no:87的同二聚体是一个优选的实施方式。[0588]实施例55：包含b16a胰岛素多肽突变体、具有cng-nb155-x位点突变的人igg1同种型fc片段和接头(seq id no：13)的胰岛素-fc融合蛋白的体内效力。[0589]鉴于实施例53中的有希望的同二聚体效价、ir活性和fcrn活性结果，在n＝3只健康、未接受过抗体的重约10kg的比格狗的每一只中皮下注射后，根据实施例22对seq id no:78、seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行了测试。对于单次皮下给药seq id no:78、seq id no:80、seq id no:82和seq id no:84的每种胰岛素-fc融合蛋白而言构建fbgl％相对于时间的图，预期fbgl％相对于时间的数据将证明seq id no:78、seq id no：80、seq id no：82和seq id no：84的胰岛素-fc融合蛋白在狗中具有显著的生物活性。[0590]实施例56：包含b16a胰岛素多肽突变体、具有cng-nb155-s突变的人igg1同种型fc片段和接头(seq id no：11)的胰岛素-fc融合蛋白的体内效力。[0591]鉴于实施例54中的有希望的同二聚体效价、ir活性和fcrn活性结果，在n＝3只健康、未接受过抗体的重约10kg的比格狗的每一只中皮下注射后，根据实施例22对seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行了测试。对于单次皮下给药seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白而言构建fbgl％相对于时间的图，预期fbgl％相对于时间的数据将证明seq id no：89的胰岛素-fc融合蛋白在狗中具有显著的生物活性。[0592]实施例57：包含b16a胰岛素多肽突变体、具有cng-nb155-s突变的人igg1同种型fc片段和接头(seq id no：67)的胰岛素-fc融合蛋白的体内效力。[0593]鉴于实施例54中的有希望的同二聚体效价、ir活性和fcrn活性结果，在n＝3只健康、未接受过抗体的重约10kg的比格狗的每一只中皮下注射后，根据实施例22对seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白的体内生物活性进行了测试。对于单次皮下给药seq id no:87的胰岛素-fc融合蛋白而言构建fbgl％相对于时间的图，预期fbgl％相对于时间的数据将证明seq id no：87的胰岛素-fc融合蛋白在狗中具有显著的生物活性。[0594]实施例58：使用经由稳定转染的cho细胞系制备的包含人igg1来源的fc片段的优选胰岛素-fc融合蛋白的示例性基于cho的生产运行。[0595]按照实施例2中所描述构建用编码seq id no:78、seq id no:80、seq id no:82、seq id no:84、seq id no:87和seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白构型的载体稳定转染的分离的cho细胞系。在设置为37℃和5％二氧化碳的培养箱-振动器中以50万个细胞/ml接种分批式摇瓶14天生产运行(0.5-2.0l培养基规模)，并按照实施例2中所描述进行运行，除了用dynamis取代cd opticho作为培养基(thermofisher)和使用高效养料c(thermofisher)作为养料。从生产运行的第3天开始以3％v/v添加养料，在第4天，将摇瓶温度调节为32℃，并将培养箱-振动器中的二氧化碳浓度从5％降低到2％。在运行期间，细胞密度将增加到800-1400万个细胞/ml，在第14天收获生产运行以除去细胞，纯化培养上清液并测试以获得如实施例4、实施例6、实施例8和实施例10中所述的胰岛素-fc融合蛋白。预计与瞬时转染的hek293细胞中所获得的数据相比，来自使用稳定转染的cho细胞系的seq id no：78、seq id no：80、seq id no：82、seq id no:84、seq id no:87和seq id no:89的胰岛素-fc融合蛋白构型的单独生产运行的制备和体外测试数据表现出更高的同二聚体效价，ir、fcrn受体、fc(γ)ri受体结合以及c1q结合特性满足设计目标(实施例29)。[0596]实施例59：在小鼠中单次给药人胰岛素fc融合蛋白后的体内药效(pd)。[0597]按照如下所述测定胰岛素-fc融合蛋白对空腹血糖水平的影响。从每组n＝3只balb/c小鼠或糖尿病wt nod小鼠(jackson laboratories)收集数据。动物在实验前一小时禁食，然后在时间＝0小时，小鼠接受单次皮下给药药物组合物，该药物组合物含有胰岛素fc-融合蛋白同二聚体，浓度为300μg/kg胰岛素-fc融合蛋白在10-50mm磷酸氢钠、50-150mm氯化钠、0.005-0.05％v/v tween-80的溶液中；和任选的抑菌剂(例如苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯)，浓度为0.02至1.00mg/ml，最终溶液ph值在7.0至8.0之间，使用氢氧化钠和/或盐酸调节。[0598]对于每个时间点，采集血液样品，并立即使用血糖仪(2宠物血糖仪)确定血糖水平读数，这需要大约一滴血。绘制从0到9小时的平均空腹血糖水平％(fbgl％)以评价给定胰岛素-fc融合蛋白构型的生物活性。对于单次皮下给药的seq id no:87和seq id no:89，图38示出的结果表明两种化合物在小鼠中均示出显著的生物活性。[0599]实施例60：在小鼠中单次给药人胰岛素fc融合蛋白后的体内药效(pd)。[0600]按照如下所述评价胰岛素-fc融合蛋白对空腹血糖水平的影响。从每组n＝3只balb/c小鼠或糖尿病wt nod小鼠(jackson laboratories)收集数据。动物在实验前一小时禁食，然后在时间＝0小时，小鼠接受单次皮下给药药物组合物，该药物组合物含有胰岛素fc-融合蛋白同二聚体，浓度为300μg/kg胰岛素-fc融合蛋白在10-50mm磷酸氢钠、50-150mm氯化钠、0.005-0.05％v/v tween-80的溶液中；和任选的抑菌剂(例如苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯)，浓度为0.02至1.00mg/ml，最终溶液ph值在7.0至8.0之间，使用氢氧化钠和/或盐酸调节。[0601]对于每个时间点，采集血液样品，并立即使用血糖仪(2宠物血糖仪)确定血糖水平读数，这需要大约一滴血。绘制从0到9小时的平均空腹血糖水平％(fbgl％)以评价给定胰岛素-fc融合蛋白构型的生物活性。预计seq id no：78、seq id no：80、seq id no：82或seq id no：84的单次皮下给药将证明这些胰岛素-fc融合蛋白在小鼠中显示出显著的生物活性。[0602]实施例61：示例性胰岛素-fc融合蛋白结构域和序列。[0603]在上述实施例中使用的示例性胰岛素-fc融合蛋白氨基酸序列和相应的dna序列示于图31、图32、图33、图34、图35、图36和图37中。[0604]等同形式[0605]在权利要求书中，诸如“一个”、“一种”和“该”之类的冠词可以表示一个/种或者多于一个/种，另有相反说明或从上下文中明显看出的情况除外。除非另有相反说明或从上下文中明显看出的情况除外，否则如果一个/种、多于一个/种或全部组成员存在于给定产品或方法中、在给定产品或方法中使用或以其他方式与给定产品或方法相关，则认为在组内一个或更多个成员之间包含“或”的权利要求或描述得到满足。本公开包括其中该组中的一个成员恰好存在于给定产品或方法中、在给定产品或方法中使用或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方式。本公开包括其中该组中的多于一个成员或全部成员存在于给定产品或方法中、在给定产品或方法中使用或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方式。[0606]此外，本公开涵盖所有变体、组合和排列，其中将来自一个或更多个所列出的权利要求的一个或更多个限制、要素、条款和描述性术语引入另一权利要求。例如，可以修改从属于另一权利要求的任何权利要求以包括在从属于相同基本权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或更多个限制。在要素以列表形式呈现的情况下，例如以马库什组格式，要素的每个子组也被公开，并且可以从组中删除任何要素。应当理解，一般而言，在本公开或本公开的方面被称为包括特定要素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方式或本公开的方面由所述要素和/或特征组成或者基本上由所述要素和/或特征组成。为简单起见，这些实施方式并未在本文中具体阐述。还应当注意，术语“包含”、“包括”、“含”和“含有”旨在是开放性的，并且其使用允许包含额外的要素或步骤。对于给出的范围而言，包括端点。此外，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中以其他方式显而易见，可以认为表示为范围的值是本公开的不同实施方式中所述范围内的任何特定值或子范围，以范围下限的十分之一计，上下文另有明确说明除外。









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