一种二甲双胍碳点的制备方法及应用

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及药物制备技术领域，具体是一种二甲双胍碳点的制备方法及应用。背景技术：2.神经干细胞可在分化为神经元的过程中功能整合到神经环路，从而实现功能神经的再生。神经干细胞这一特性有望成为多数神经病变治疗中的首选。但病理微环境导致神经干细胞存活率下降，且神经干细胞在体移植后分化为功能神经元的效率偏低，限制了神经干细胞在移植治疗中的广泛应用。二甲双胍作为治疗糖尿病的一线用药，虽被证实能够促进在体神经干细胞增殖，促进神经元分化和轴突生长建立功能突触连接的作用，由于小分子药物易于排出胞外，使其在干细胞移植治疗中的作用随着时间的推进减弱。因此保留小分子化合物活性，且能使小分子化合物在干细胞中缓慢释放的手段是协同治疗作用发挥的关键。3.纳米技术的发展为提高以干细胞为载体的二甲双胍的高效递送提供了新方法和新材料。碳点是一种以碳元素为基本骨架结构的新型荧光纳米材料，其具有尺寸小，荧光性能强且稳定，且生物相容性好等优点。因此将二甲双胍碳点与神经干细胞联合应用发挥协同作用成为移植治疗的全新策略。技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一种二甲双胍碳点的制备方法及应用，以解决背景技术中的问题。5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：6.一种二甲双胍碳点的制备方法，包括以下步骤：步骤s1将盐酸二甲双胍和柠檬酸分别溶解在去离子水中，并超声10min；步骤s2：将步骤s1中形成的两种混合液转移至高压反应釜体系中；反应结束后，取出反应体系冷却至室温，收集并得到反应溶液；步骤s3：将反应溶液采用滤膜过滤，收集并得到滤液；步骤s4：将步骤s3中的滤液用截留分子量为500da的透析袋除去未反应的小分子化合物；透析两天，最后冻干并获取二甲双胍碳点冻干样品。7.在上述技术方案的基础上，本发明还提供以下可选技术方案：8.在一种可选方案中：所述步骤s2中混合液在反应釜内是处于温度180℃下并加热反应8小时，所述步骤s4中的滤膜厚度为0.2微米。9.在一种可选方案中：所述步骤s4中的透析在操作过程中需每12小时更换一次透析水。10.根据上述所述制备方法得到的二甲双胍碳点在神经干细胞移植治疗中的应用。11.在一种可选方案中：所述二甲双胍碳点在神经干细胞移植治疗中的应用中，二甲双胍碳点的作用是促进神经干细胞分化为神经元的比例。12.在一种可选方案中：所述二甲双胍碳点在神经干细胞移植治疗中的应用中，二甲双胍碳点的作用是加速神经干细胞分化为功能性神经元的速度。13.在一种可选方案中：所述二甲双胍碳点在神经干细胞移植治疗中的应用时的浓度为10μm，且相较于理论上同浓度的二甲双胍、柠檬酸及二者混合物促进神经元分化比例更佳。14.相较于现有技术，本发明的有益效果如下：15.1、本发明的二甲双胍碳点制备过程中功能性小分子基本药效结构并未破坏仍能保留其药理活性，其可促进神经干细胞向神经元细胞分化；16.2、本发明制备的二甲双胍碳点的制备用于促进神经干细胞分化为神经元的效率及成熟度，且相较于理论上同浓度的二甲双胍、柠檬酸及二者混合物促进神经元分化比例更佳；主要应用于二者联合移植治疗，用以解决神经干细胞在体移植后分化为功能神经元的效率偏低问题。附图说明17.图1为本发明制备的cmcds的荧光光谱整体结构示意图。18.图2为本发明制备的cmcds的红外光谱图结构示意图。19.图3为本发明的cmcds碳点的粒径以及分布示意图。20.图4为本发明的神经球及神经干单细胞在分化前示意图。21.图5为本发明的神经球及神经干单细胞在分化后示意图。22.图6为本发明的二甲双胍碳点不同浓度在神经干细胞的存活情况示意图。23.图7为本发明的二甲双胍碳点促进神经元的分化比例示意图。24.图8为本发明的未给予cmcds以及给予cmcds组的神经元的分化数量对比示意图。25.图9为本发明的二甲双胍碳点、二甲双胍、柠檬酸及二者混合物促进神经元的分化比例示意图。具体实施方式26.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明所列举的各实施例仅用以说明本发明，并非用以限制本发明的范围。对本发明所作的任何显而易知的修饰或变更都不脱离本发明的精神与范围。27.在一个实施例中，提供一种二甲双胍碳点的制备方法，该方法包括以下步骤：将33.124mg盐酸二甲双胍(分子量＝165.62g/mol)和0.1m柠檬酸(分子量＝192.12g/mol)溶解在10ml去离子水中，超声10min；28.然后采用水热合成法合成了cmcds：将二者混合溶液转移到50毫升的高压反应釜体系中，在180℃下加热8小时；29.反应结束后，取出反应体系冷却至室温，收集反应溶液。将收集溶液用0.2毫米滤膜过滤并收集滤液；30.然后，将上述滤液用截留分子量为500da的透析袋除去未反应的小分子化合物，透析2天，每12小时更换一次透析水，最后冻干获取cmcds待用；31.二甲双胍碳点的表征测试：32.测试一：33.将碳点溶液稀释达到有效的可测浓度后，将其置于石英材质比色皿中；34.采用波长为200-600nm，扫描速度为1200nm/min，狭缝宽度为5nm，进行扫描，获得紫外-可见光光谱；结果显示cmcds的uv-vis光谱在340nm处有一个特征吸收带(参见附图1左)；因已有研究将300-450nm附近的谱带归因于c-n和c＝n基团的n-π*电子跃迁，故其几乎是所有氮掺杂碳点的特征带；35.此外，在225和275nm处还有两条吸收带；225nm处的吸收带归属于c＝c基团的π-π*电子跃迁，275nm处的吸收带归属于c＝o基团的n-π*电子跃迁；36.其中，c＝c是cds中存在的基本官能团之一，而c＝o基团可以认为是氧化的c-c和c＝c；因此，对于任何类型的cds，在紫外-可见吸收光谱中都可以看到这两种电子跃迁；37.将碳点溶液稀释达到有效的可测浓度后，将其置于石英材质比色皿中，狭缝宽度为5nm，随后检测cmcds的荧光光谱；结果表明在340nm激发波长下，在430nm处观察到了最强的荧光发射，这为后续检测cmcds的滞留性提供了基础。38.测试二：39.称量80mg碳点冻干样品与2gkbr粉末混匀，混匀后称量300mg混合物置于压片磨具中，制备获得透明薄膜压片样品；40.在400cm-1至4000cm-1的波段范围内，对样品进行红外光谱的扫描测试，通过傅立叶变换得到红外光谱图；41.采用ftir光谱鉴定cmcds中的官能团，在cmcds表面检测到羧基(3280和1716cm-1)和胺(3480、1190和1078cm-1)基团(参阅附图2)，这表明碳点具有良好水溶性和进一步表面修饰的潜能；1760、1690和1490cm-1处的各峰被鉴定为c＝o伸缩、n-h弯曲和n-o伸展；42.值得注意的是，这两种前体药物都没有n-o键，但cmcds的红外光谱证实了n-o键的存在，这一结果可能与cmcds的合成机制有关。43.测试三：44.采用去离子水将碳点溶液10倍稀释后，吸取10μl滴在直径为3mm的v3超薄类型碳网上。待室温干燥后，采用tem观察其大小及形貌，并采用nano measurer软件统计碳点的平均粒径；45.通过tem观察可见碳点是类球形纳米颗粒，且分散较为均匀(参阅附图3左)。高分辨率tem显示碳点具有晶格条纹，且晶格间距离为0.34nm，符合石墨晶格(002)结构；46.随机选取100个碳点，采用nano measurer软件计算碳点直径，直径分布在2-5nm之间(参阅附图3右)。47.根据上述所述制备方法得到的二甲双胍碳点在治疗神经退行性疾病中的应用；48.二甲双胍碳点在治疗神经退行性疾病中的具体应用，如下：49.①神经干细胞提取：无菌条件下从12.5天的孕鼠的腹中取出子宫，用镊子撕开子宫外膜，取出胚胎小鼠，迅速放入一个干净的培养皿中；去掉胚胎的羊膜，剥开硬脑膜，然后用弯头镊子取出前额皮层或者海马，放入盛有1个已经准备好预冷dmem/f12的小培养皿中；体视显微镜下剥离胎鼠脑组织的各层脑膜和血管，将剥离好的组织再转移入盛有另一个准备好预冷dmem/f12的小培养皿中；将去除血管的组织转移到一个装有3ml预冷dmem/f12的小培养皿中，用小剪刀把脑组织剪碎成1mm3小块(越小越好)；将上述组织连同液体转移到15毫升离心管中，用移液枪轻轻捶打至悬液中无组织块，将细胞悬液转移到200目筛网中过滤，1000rp、3min离心滤液，去除上清，使用神经干细胞完全培养基重悬细胞，进行细胞计数；按照每毫升神经干细胞增殖培养基中2ⅹ105个细胞进行培养；培养2-3天时半量换液，当细胞球直径在150～200μm时进行消化传代；50.神经干细胞增殖培养基，如果用量少，一次配50ml，否则时间长了不好用：下面的配方是配置50ml的增殖培养基需要的试剂量；51.dmem/f12：48.9ml52.b27：1ml；53.bfgf：50ul；54.egf：50ul；55.混匀后，写上标签，保存在冰箱4度备用；56.神经干细胞分化培养基，如果用量少，一次配50ml，否则时间长了不好用：下面的配方是配置50ml的分化培养基需要的试剂量；57.dmem/f12：49ml58.b27：1ml；59.混匀后，写上标签，保存在冰箱4度备用；60.②神经干细胞及其分化潜能鉴定：神经干细胞nestin仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，为神经干细胞的特征性标志物；而sox2作为重要的干细胞因子，已在神经干细胞的鉴定中被广泛应用，二者用于联合鉴定神经干细胞。gfap是胶质纤维酸性蛋白，是星形胶质细胞活化的标志物，常用于鉴定星形胶质细胞；map2微管相关蛋白2，是成熟神经元的标志物，常用于鉴定神经元，二者可一起鉴定神经干细胞的分化潜能。61.神经干细胞鉴定前预处理：62.溶剂配制：将聚-l-鸟氨酸溶解在细胞培养基蒸馏水中，制成10mg/ml储备溶液，然后等分溶液并将其储存在-20℃直至使用。在2-8摄氏度下缓慢解冻层粘连蛋白，并在细胞培养基蒸馏水中制备10μg/ml工作溶液。将工作溶液等分到1.5ml离心管中，并将管储存在-20℃直至使用，避免重复的解冻。注意：如果解冻太快，层粘连蛋白可能会形成凝胶。63.在细胞培养基蒸馏水中按1：500稀释聚-l-鸟氨酸储备溶液，制成20μg/ml工作溶液，然后按12孔板每孔1ml涂覆无菌细胞爬片，将培养板在4℃下孵育过夜，次日用无菌水冲洗培养容器两次。随后用层粘连蛋白工作溶液1ml再次涂覆带细胞爬片的细胞培养板，将培养板在37℃下孵育2小时。用不含钙或镁的d-pbs冲洗培养板，并将培养板与d-pbs覆盖储存至使用，使用前吸弃所有d-pbs。64.注意：可以提前涂覆培养板，可将其用parafilm紧紧包裹储存在室温下长达1周。保持培养板中有足量的d-pbs，确保盘子不会变干。65.神经干细胞鉴定：66.免疫荧光染色步骤：67.步骤1：室温下，用预冷的pbs漂洗待染色的细胞一次；68.步骤2：室温下，在4％多聚甲醛(溶于pbs中，ph 7.4)中孵育细胞10分钟；用冰pbs洗涤细胞3次；69.步骤3：用pbs(含0.1-0.25％triton x-100)孵育样品10分钟；70.步骤4：用pbs洗涤细胞3次，每次5分钟；71.步骤5：用1％bsa、22.52mg/ml甘氨酸的pbst(pbs+0.1％tween 20)孵育细胞30分钟，封闭抗体的非特异性结合；72.步骤6：用稀释的两种一抗(溶于1％bsa的pbst中)在4℃过夜孵育；73.步骤7：吸弃一抗，用pbs洗涤细胞3次，每次5分钟；74.步骤8：室温下，用两种二抗(溶于1％bsa中)避光孵育细胞1小时；75.步骤9：吸取二抗溶液，用pbs避光洗涤细胞3次，每次5分钟；76.步骤10：用1μg/ml hoechst孵育细胞5分钟；77.步骤11：用pbs漂洗细胞；78.步骤12：用一滴抗荧光淬灭剂封闭细胞爬片；79.步骤13：用指甲油密封细胞爬片，避免样品变干和在显微镜下移动；80.步骤14：4℃下避光保存。81.取培养至第3代的神经球，稀释至适量铺于预处理过的12孔培养板中，待贴壁后立即固定，进行后续荧光染色；神经球用stemprotmaccutasetm细胞解离试剂在37℃下消化5分钟解离为单细胞，将单细胞铺于预处理的培养板中，培养两天后固定染色，并进行拍照。82.结果显示(参见附图4)神经球及神经干单细胞的nestin及sox2的比例高达95％以上，证明提取培养的神经干细胞纯度较好，可用于后续实验；83.铺于培养板内的神经干单细胞在神经干增殖培养基中培养两天后，更换为不含egf及bfgf的神经分化培养基，每2-3天半量换液，分化14天后鉴定其分化潜能；结果可见(参见附图5)神经干细胞有分化为神经元及星形胶质细胞的潜能，为后续二甲双胍碳点促分化提供了理论依据；84.cck8检测二甲双胍碳点的毒性：为评价二甲双胍碳点的生物安全性，取第三代对数生长期的神经球传递铺板，24h后将其与不同浓度的二甲双胍碳点共孵育1，3，7和14天，利用cck8法检测二甲双胍碳点对于神经干细胞分化活性的影响。85.cck8法是用于检测细胞增殖情况的常用方法，原理为该试剂中含有wst-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐]；[0086]它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-methoxy pms)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比；[0087]因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。本实验探究二甲双胍对细胞分化活性的影响，故先将处于对数期生长的神经球用accutase消化后，将细胞以1×104个细胞/孔的密度铺于预处理的96孔板内，24h后将其与不同浓度的二甲双胍碳点溶液混合，每隔2天换液，并补充相应浓度的二甲双胍碳点，并在接种后第1、3、7和14天，用cck8法检测细胞存活率。具体操作：在96孔板的每孔中加入10μl cck8，培养箱中继续孵育2-4小时后，酶标仪450nm处检测吸光度。[0088]图6为二甲双胍碳点不同浓度在神经干细胞的存活情况；其中，a：1天细胞的存活情况；b：3天细胞的存活情况；c：7天细胞的存活情况；d：14天细胞的存活情况；*p《0.05，**p《0.01and***p《0.001；结果表明，分化的神经干细胞与不同浓度的二甲双胍碳点共同孵育，随着时间的延长100μg/ml浓度均为安全剂量。提示二甲双胍碳点具有良好的生物安全性，可以应用于干细胞转化与纳米工程相结合治疗神经退行性疾病的治疗中；[0089]二甲双胍碳点促分化作用：[0090]首先将二甲双胍碳点配制为按二甲双胍质量计算为1mm的母液，预先配制分化培养基，并放于37℃恒温水浴锅预热。向分化培养基中加入不同剂量二甲双胍碳点母液配制成浓度梯度(0μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm、40μm)工作液。第一次更换分化培养基时，全部吸出神经干细胞增殖培养基，将分化培养基沿孔板侧壁缓慢加入(24孔板：500μl/孔；6孔板：2ml/孔)并放于5％co2、37℃细胞培养箱中培养。每隔3d后半量更换分化培养基，终浓度为0μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm、40μm，再放于5％co2、37℃细胞培养箱中继续培养，一共培养14天。[0091]rna提取与检测：六孔板细胞用预冷的pbs清洗一次，然后每孔按1ml加入trizol，收集细胞于1.5ml无酶离心管内，每个管中加入200μl氯仿，上下颠倒混匀15s，4℃12000g离心15min；上清液小心转移至另一无酶离心管中，加入0.5ml异丙醇，振摇，置室温10min，4℃且12000g离心10min，ep管底部可见白色沉淀物。弃上清，加入75％乙醇1ml，振摇，充分洗涤沉淀，4℃11000g离心5min。吸尽乙醇，空气干燥至rna变为半透明时加20ul无酶水中，吹打混匀。所提取的总rna用nanodrop测定rna含量和纯度，所有样本的260/280nm吸光度的比值均应为1.8-2.0。参照全式金家说明书的方法按照400ng总量逆转录rna。[0092]准备引物：将正向反向的引物单独用tebuffer配成100μm的母液保存。开始做pcr时再用rnase-free water稀释成5μm工作液。参照罗氏sybr green试剂盒说明书检测rna含量的变化。[0093]结果如图7所示，10μm的二甲双胍碳点能够促进神经元的分化数量(dcx未成熟的神经元标志物、map2成熟神经元标志物及βiii-tubulin神经元标志物，长期存在于神经元内)，而其不会引起星形胶质细胞的分化数量的改变；[0094]二甲双胍碳点促分化作用的免疫荧光染色，细胞处理方法见上面，免疫荧光步骤参见神经干细胞部分。结果图8可见，10μm的二甲双胍碳点能够促进神经元的分化比例于未给予cmcds组，而10μm给药浓度优于其他组。[0095]二甲双胍、柠檬酸、二者混合物及二甲双胍碳点均按照二甲双胍碳点制备的比例配制为相应的1mm母液。预先配制分化培养基，并放于37℃恒温水浴锅预热。向分化培养基中加入上述四种溶液(每种溶液按二甲双胍碳点10μm中相应的药量计算)。第一次更换分化培养基时，全部吸出神经干细胞增殖培养基，将分化培养基沿孔板侧壁缓慢加入(24孔板：500μl/孔；6孔板：2ml/孔)并放于5％co2、37℃细胞培养箱中培养。每隔3d后半量更换分化培养基，终浓度为仍为按二甲双胍碳点10μm中相应的药量计算，再放于5％co2、37℃细胞培养箱中继续培养，一共培养14天。[0096]结果如图9所示，二甲双胍碳点相较于同浓度二甲双胍、柠檬酸及二者混合物能更好的促进神经元分化比例(dcx未成熟的神经元标志物、map2成熟神经元标志物及βiii-tubulin神经元标志物，长期存在于神经元内)，且不会引起星形胶质的分化比例的改变。[0097]以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。









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