人参皂苷Rh4在制备用于抑制睡眠的药物中的用途的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术人参皂苷rh4在制备用于抑制睡眠的药物中的用途技术领域1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及稀有人参皂苷rh4在制备用于抑制睡眠的药物中的用途。背景技术：2.天然产物在世界范围内被广泛利用，它已被公认为是药物的重要来源。近年来，从某些高安全系数的药用植物中提取的活性成分已成为治疗神经功能障碍新药物的重要来源。人参属于五加科多年生草本植物，是一种长期用于治疗多种疾病的高价值草本植物。人参皂苷是人参的主要活性成分，已经被证明具有多种药理学作用包括抗氧化、抗炎、抗过敏、抗糖尿病和抗癌。近年来，越来越多的证据表明一些种类的人参皂苷对神经系统具有保护作用。例如，与人参皂苷rh4结构相近的人参皂苷rg5和人参皂苷rk1是中枢神经系统抑制剂，可减少兴奋性神经递质glu，促进睡眠(见参考文献1)。参考文献1：shao,j.,zheng,x.,qu,l.,zhang,h.&fan,d.ginsenoside rg5/rk1 ameliorated sleep via regulating the gabaergic/serotoninergic signaling pathway in rodent model.food&function 11(2020).技术实现要素：3.发明人针对人参皂苷rh4的生理作用进行了深入研究发现：1.人参皂苷rh4虽然在结构上与人参皂苷rg5/rk1相近，但在生理作用上与人参皂苷rg5/rk1截然相反——人参皂苷rh4不但不减少、反而增加兴奋性神经递质glu；2.人参皂苷rh4也不具有上调gabaa受体和gabab受体的表达、以及上调5-ht1a受体的表达的活性；3.人参皂苷rh4是中枢神经系统兴奋剂，可抑制睡眠。4.因此，本发明的目的在于提供人参皂苷rh4作为活性成分在制备用于抑制睡眠的药物中的用途。而且，本发明的目的在于提供人参皂苷rh4作为活性成分在制备中枢神经系统兴奋药物中的用途。而且，本发明的目的还在于提供人参皂苷rh4作为活性成分在制备用于提高外周血中谷氨酸含量的药物中的用途。而且，本发明的目的还在于提供人参皂苷rh4作为活性成分在制备用于治疗睡眠过多的药物中的用途。5.即，本发明包括：6.1.人参皂苷rh4在制备用于抑制睡眠的药物中的用途，其中，所述人参皂苷rh4作为该药物的活性成分。7.2.人参皂苷rh4在制备用于提高外周血中谷氨酸含量的药物中的用途，其中，所述人参皂苷rh4作为该药物的活性成分。8.3.人参皂苷rh4在制备用于治疗睡眠过多的药物中的用途，其中，所述人参皂苷rh4作为该药物的活性成分。9.在本说明书中，睡眠过多是指睡眠时间为正常睡眠时间的110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、200％以上。10.4.人参皂苷rh4在制备中枢神经系统兴奋药物中的用途，其中，所述人参皂苷rh4作为该药物的活性成分。11.5.根据项1～4中任一项所述的用途，其中，所述人参皂苷rh4作为该药物的唯一活性成分。12.6.根据项1～4中任一项所述的用途，其中，所述药物的剂型为口服制剂、注射剂或滴注剂。13.7.根据项1～4中任一项所述的用途，其中，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、滴剂、果汁剂、丸剂或者糖浆剂。14.8.根据项1～4中任一项所述的用途，其中，所述注射剂或滴注剂为溶液型、混悬液型、乳浊液型或冻干粉。附图说明15.图1为人参皂苷rh4的结构式。16.图2为显示人参皂苷rh4对cums小鼠gaba相关受体、5-ht1a受体的影响的图。17.图3为显示人参皂苷rh4对血清中谷氨酸含量的影响的图。18.图4为显示人参皂苷rh4的抑制睡眠的生理作用的图。具体实施方式19.以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。20.实施例1：人参皂苷rh4胶囊21.按照如下配比制成胶囊(6000粒，人参皂苷rh4含量：100mg/粒)[0022][0023]实施例2：人参皂苷rh4片剂[0024]按照如下配比制成片剂(5000片，人参皂苷rh4含量：100mg/片)[0025][0026]实施例3：人参皂苷rh4糖浆[0027]按照如下配比制成糖浆(2000支，10ml/支，人参皂苷rh4含量：100mg/支)[0028][0029]实施例4:人参皂苷rh4冲剂[0030]按照如下配比制成糖浆(6000袋，6g/袋，人参皂苷rh4含量：100mg/袋)[0031][0032]实施例5:人参皂苷rh4凝胶[0033]按照如下配比制成软膏(1000管，10g/管，人参皂苷rh4含量：100mg/管)[0034][0035][0036]实施例6：人参皂苷rh4对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠状态影响[0037]1.实验材料[0038]实施例1所制备的人参皂苷rh4胶囊；丙咪嗪片(山东信谊制药有限公司)；戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂有限公司)；c57/bl小鼠，雄性，体重20-25g[0039]2.实验方法[0040]2.1动物分组及给药方式、剂量、时间[0041]动物给药方式均为灌胃，将c57/bl小鼠随机分为空白对照组，丙咪嗪组(15mg/kg)，人参皂苷rh4低剂量组(20mg/kg)、人参皂苷rh4高剂量组(40mg/kg)，人参皂苷rg5高剂量组(40mg/kg)和人参皂苷rk1高剂量组(40mg/kg)。给药时间均为上午的9:00-11:00之间。[0042]2.2以上组小鼠均连续给药7天，在末次给药后30分钟后进行实验。[0043]对于空白对照组、丙咪嗪组、人参皂苷rh4低剂量组、、人参皂苷rh4高剂量组每个组别的小鼠，将其中的一半将进行安乐死，迅速收集眼眶血并离心(12000r，4℃)，提取离心后的上清液，使用谷氨酸检测试剂盒(上海酶联生物有限公司)按其说明书的操作进行了glu含量测定。对于前述组别的另一半小鼠、以及人参皂苷rg5高剂量组和人参皂苷rk1高剂量组的全部小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)诱导其睡眠，记录每只小鼠的睡眠潜伏期以及睡眠时长。睡眠潜伏期为注射戊巴比妥钠后至小鼠翻正反应消失时间的时间；睡眠时长为小鼠翻正反应消失后至其苏醒之间的时间。在注射戊巴比妥钠30分钟后未进入睡眠状态的小鼠被剔除。[0044]2.3统计方法[0045]所有实验数据均使用statistical package for social science版本19.0(spss 19.0)进行分析。使用单因素方差分析(anova)和turkey的多重比较检验分析组间差异。所有实验数据均以平均值±标准差表示。[0046]3.实验结果[0047]作为现有技术的参考文献1表明，与人参皂苷rh4结构相近的人参皂苷rg5和人参皂苷rk1是中枢神经系统抑制剂，可减少兴奋性神经递质glu，促进睡眠。与此相对，本实施例的glu含量测定结果表明，施用人参皂苷rh4后血清中谷氨酸的含量显著增加，并与阳性药丙咪嗪无显著性差异(见图3)。谷氨酸是兴奋性神经递质，由此推测人参皂苷rh4可能具有兴奋神经系统、抑制睡眠的作用，该作用与人参皂苷rg5和人参皂苷rk1的作用截然相反。[0048]睡眠潜伏期以及睡眠持续时间测定实验结果如图4所示。为了评估人参皂苷rh4的对小鼠睡眠的作用，我们使用戊巴比妥钠(45mg/kg)处理小鼠以验证人参皂苷rh4对小鼠睡眠质量的影响。主要检测了小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时长。结果显示，与空白对照组相比，人参皂苷rh4以剂量依赖性延长了小鼠的睡眠潜伏期并与阳性药丙咪嗪无显著性差异(p＜0.01)。同时，人参皂苷rh4显著减少了小鼠的睡眠持续时间且与阳性药丙咪嗪无显著性差异(p＜0.0001)。另外，我们也评估了人参皂苷rg5和人参皂苷rk1对小鼠的睡眠作用，结果显示，与空白对照组相比，人参皂苷rg5和rk1可显著减少小鼠的睡眠潜伏期(p＜0.01)并显著增加小鼠的睡眠持续时间(p＜0.001)。[0049]该实验结果显示，与空白对照组相比，人参皂苷rh4可显著增加小鼠的睡眠潜伏期并且减少小鼠的睡眠时长，显示出兴奋神经系统、抑制睡眠的作用。而施用了人参皂苷rg5和人参皂苷rk1后，小鼠的睡眠潜伏期显著下降并且睡眠时长显著增加，显示出抑制神经系统、促进睡眠的作用。[0050]实施例7：人参皂苷rh4对慢性不可预测压力诱导的抑郁小鼠的gaba相关受体、5-ht1a受体的影响[0051]已知与人参皂苷rh4结构相近的人参皂苷rg5和人参皂苷rk1是中枢神经系统抑制剂，可减少兴奋性神经递质glu，促进睡眠，其生理机制还包括：上调gabaa受体和gabab受体的表达；上调5-ht1a受体的表达(5-ht，5-羟色胺，一种抑制性神经递质)。见参考文献1。本实施例研究了人参皂苷rh4是否具有上述生理机制。[0052]1.实验材料[0053]使用实施例1所制备的人参皂苷rh4胶囊；丙咪嗪片(山东信谊制药有限公司)；c57/bl小鼠，雄性，体重20-25g；gabaaα1抗体(abcam)；gabab抗体(ptg)；5-ht1a抗体(abways)。[0054]2.实验方法[0055]2.1正常小鼠30只，平均分成3组，即正常组(图2中空白对照)，模型组(图2中cums)，cums+rh4组(图2中rh4)。cums操作：连续8周每天给予小鼠一种刺激包括：断食，断水，夹尾4分钟，束缚4h，潮湿垫料4h，斜笼45°4h，摇晃笼子10分钟等。将上述胶囊溶解于生理盐水中，各组均按0.2ml/10g体重灌胃给药。rh4组给药剂量为40mg/kg。每日一次，连续给药14天，空白对照组给予生理盐水。[0056]2.2对于蛋白表达检测，连续给药14天，将双侧海马体冰块切开，-80℃保存直至使用。用液氮粉碎组织，用冰ripa裂解液裂解组织。离心提取上清，用bca试剂盒测定蛋白浓度。将样品与sds样品缓冲液混合，煮沸5分钟。等量的蛋白样品(20mg)经10％sds/page凝胶电泳分离，转移到pvdf膜上。使用相应的一抗过夜孵育。然后，将膜置于辣根过氧化物酶(hrp)偶联的二抗中，室温孵育1小时，并使用ecl引物在凝胶图像系统(tanon 5200,shanghai,china)上检测。使用凝胶图像系统(tanon 5200,shanghai,china)对波段进行量化。[0057]3.实验结果[0058]所有实验结果示于图2。[0059]在行为调节方面，gaba在恐惧回路中的作用已被广泛研究，其中gaba在恐惧的获得、储存和消除中起着关键作用。gaba在大脑中发挥其作用的前提是与相应的受体结合，因此我们检测了gaba在海马体中相应受体的蛋白表达，结果显示与正常组相比，模型组的gabaaa1，gabab受体的蛋白表达量显著下降，施用了人参皂苷rh4后，这两种蛋白的表达量并没有显著增加。此外，我们也检测了5-ht1a受体的蛋白表达量，5-ht1a受体是一种保持血清素活性的调节器，维持5-ht1a受体在大脑的动态平衡能够影响机体的认知和情绪等多种功能，而且被认为在神经发育过程固有的神经元迁移、神经树突生长和突触形成中起关键作用。结果显示与正常组相比，模型组的5-ht1a的蛋白表达量显著下降；施用了人参皂苷rh4后5-ht1a的蛋白表达量并没有显著增长。以上证明了人参皂苷rh4虽具有与rg5/rk1相似的结构，但并不具有影响gaba能神经信号通路以及维持5-ht1a受体蛋白表达的生物学活性。[0060]最后应当说明的是，尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。









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