一种霍利迪连接体解离酶DrRuvC及其编码基因和应用

有机化合物处理,合成应用技术一种霍利迪连接体解离酶drruvc及其编码基因和应用技术领域1.本发明属于生物技术领域，涉及一种霍利迪连接体解离酶drruvc及其编码基因和应用，具体是一种来源于耐辐射奇球菌的新型霍利迪连接体解离酶(drruvc)的制备，并涉及该酶所识别的霍利迪连接体dna保守序列特征及酶活性提高的方法。背景技术：2.霍利迪连接体(holliday junction resolvase)出现于细胞dna同源重组(homologous recombination)后期以及dna复制叉回退(dna replication fork regression)过程中，其主要结构是一个富含同源区域的四链dna中间体。基因组中的霍利迪连接体若不能有效解离，将引起基因组复制的紊乱，因此，细胞中常常编码一个或者多个霍利迪连接体解离酶帮助维持基因组的稳定性和细胞分裂的有序性。3.研究人员在几年前已发现，大肠杆菌中由ruvc基因编码的蛋白——ecruvc，具备霍利迪连接体解离酶活性(saito,a.et al(1995)."identification of four acidic amino acids that constitute the catalytic center of the ruvc holliday junction resolvase."proc natl acad sci u s a92(16):7470-7474)。ecruvc是一个同源二聚体结构，其偏好识别的霍利迪连接体在连接结区域含有保守序列5’‑(a/t)tt(g/c)-3’。ecruvc可对称地在霍利迪连接体连接结上打断单链区域的磷酸二酯键(具体为第二个胸腺嘧啶之后的磷酸二酯键)，从而将一个霍利迪连接体解离成两条带有缺口的双链dna。4.目前已经商品化的霍利迪连接体解离酶多为体外表达的重组型大肠杆菌ecruvc蛋白，例如abcam公司出售的重组型ecruvc蛋白(货号p0a814)。由于ecruvc偏好解离含有5’‑(a/t)tt(g/c)-3’的霍利迪连接体，对含有其他序列的霍利迪连接体解离能力较弱，因此，其作为基因工程中的工具酶，在使用上存在局限性。技术实现要素：5.本发明的目的是提供了一种新型的来源于耐辐射奇球菌的霍利迪连接体解离酶(drruvc)及其编码基因和应用。6.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：从耐辐射奇球菌基因组里扩增编码drruvc的基因片段、构建drruvc表达载体、制备drruvc蛋白、drruvc蛋白酶活的验证、drruvc蛋白最佳底物序列的筛选、drruvc最佳酶活条件的摸索(最适金属离子及浓度、最适ph、最适nacl浓度、最适温度)。7.第一方面，本发明提供霍利迪连接体解离酶drruvc，其氨基酸序列见seq no.4。8.第二方面，本发明提供编码霍利迪连接体解离酶drruvc的基因，其核苷酸序列见seq no.3。9.第三方面，本发明提供含有drruvc编码基因的表达载体。10.第四方面，本发明提供酶drruvc在解离连接结处含有5’‑(g/c)tc(g/c)-3’序列的霍利迪连接体上的应用。11.第五方面，本发明提供一种霍利迪连接体解离方法，具体是将10μl反应体系置于40-45℃反应30分钟，随后根据需求有两种终止反应和鉴定产物的方法：加入等体积终止液a终止反应，于100℃加热20分钟，转移至冰上骤冷，随后利用tbe尿素胶分离产物；或，加入等体积终止液b终止反应，于37度终止反应20分钟后，利用tbe活性胶分离产物。12.所述10μl反应体系中含有1μm的权利要求1所述酶drruvc、500nm的连接结处含有5’‑(g/c)tc(g/c)-3’序列的霍利迪连接体底物、50-150mm nacl、一定浓度金属离子、ph7.6-8.4的20mm tris、0.5mm tcep、5％甘油；13.所述金属离子为mn或mg。14.作为优选，所述终止液a为20mm edta和98％甲酰胺。15.作为优选，所述终止液b为20mm edta和10mg/ml蛋白酶k。16.作为优选，所述金属离子为mn时，反应体系中mn离子浓度为2.5-10mm。17.作为优选，所述金属离子为mg时，反应体系中mg离子浓度为20mm。18.作为优选，反应体系ph为8.0。19.本发明的有益效果是：20.本发明新型霍利迪连接体解离酶drruvc来源于耐辐射奇球菌，在溶液中呈同源二聚体状态，可以特异性结合霍利迪连接体dna，并在连接处对称地造成单链磷酸二酯键断裂，从而将一个霍利迪连接体解离成两条带有缺口的双链dna。其特异识别的霍利迪连接体在连接结区域含有保守序列5’‑tc-3’，酶切位点为胞嘧啶之后的磷酸二酯键。该酶偏爱5’‑(g/c)tc(g/c)-3’序列，最佳催化金属离子为mn2+(2.5-10mm)，最适反应ph在7.6-8.4之间，最适反应nacl浓度在50-150mm之间，最适反应温度在40-45℃之间。21.本发明新型霍利迪连接体解离酶drruvc，偏好底物序列同已有商品化的霍利迪连接体解离酶(ecruvc)不同，可以帮助解决后者存在的底物局限性问题，对开发新型分子生物学的工具酶具有重要意义。附图说明22.图1是利用琼脂糖凝胶检测从耐辐射奇球菌基因组中扩增而来的drruvc基因片段。扩增的目的片段大小约为550bp。23.图2是构建成功后的pet28t-drruvc表达载体图谱。24.图3(a)纯化后的drruvc分子筛(superdex 75)图谱，出峰位置在10ml，对应的分子量大小为40-45kda左右，而drruvc单体的分子量在20kda左右，此图证明了drruvc在溶液中以同源二聚体形式存在；(b)利用15％的sds-page检测drruvc的纯度。25.图4是drruvc对霍利迪连接体解离效果的检测。图片上方是用于该实验的人工合成的霍利迪连接体底物hj98，底物序列中画横线的部分为霍利迪连接体的同源序列区域。灰色背景无边框的序列为商品化ecruvc酶的特异酶切序列，灰色背景有边框的序列是本发明中制备的drruvc酶的特异酶切序列。由于底物中对应序列的5’端带有6-fam荧光基团，故该序列的酶切产物可由15％的tbe尿素胶分离后利用对应波长的荧光扫胶仪检测。其中，ecruvc为abcam公司出售的重组型ecruvc蛋白，作为对照。胶的最左侧泳道为单链dnamarker。26.图5是drruvc对霍利迪连接体解离位点的分析。根据图4结果，设计了更短的霍利迪连接体底物(hj31)以便更为精确地定位drruvc酶切位点。底物序列中画横线的部分为霍利迪连接体的同源序列区域。由于底物中对应序列的5’端带有6-fam荧光基团，故该序列的酶切产物可由15％的tbe尿素胶分离后利用对应波长的荧光扫胶仪检测。其中，ecruvc为abcam公司出售的重组型ecruvc蛋白，作为对照。胶的最左侧泳道为单链dnamarker。底物中箭头标识的位置为根据胶图判断得出的酶切位点，其中drruvc酶切位点在tc之后，而作为对照的ecruvc酶切位点在tt之后。27.图6是对drruvc偏爱的霍利迪连接体连接结区域序列的筛选。设计了在连接结区域有四个可变碱基(n1n2n3n4)的霍利迪连接体底物，酶切产物利用10％的tbe活性胶分离后，利用stains-all染料(生工)对胶进行染色，结果显示，drruvc偏好解离连接结处含有5’‑(g/c)tc(g/c)-3’序列的霍利迪连接体。28.图7是对drruvc酶活条件优化中最佳催化金属离子以及浓度的筛选结果。(a)drruvc在10mm不同金属离子(mgcl2、mncl2、cacl2、znso4、nicl2、cocl2和cucl2)条件下的催化效率比较。(b)drruvc在不同浓度(0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mm)mgcl2和mncl2条件下的催化效率比较。29.图8是对drruvc酶活条件优化中最佳ph的筛选结果。drruvc在不同ph条件下(ph为5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8、9.2)催化效率的比较。30.图9是对drruvc酶活条件优化中最佳nacl浓度的筛选结果。drruvc在不同nacl浓度(50、100、150、200、250、300、350、400、450、500mm)下催化效率的比较。31.图10是对drruvc酶活条件优化中最佳反应温度的筛选结果。drruvc在不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)下催化效率的比较。具体实施方式32.为了使本发明的目的、技术方案和技术效果更加清楚明白，以下结合说明书附图和实施例，对本发明作进一步详细说明。(实施例所涉及的dna序列均由上海捷瑞公司合成，所涉及的试剂药品，若无明确说明，均购自上海生工公司)33.实施例1:drruvc蛋白的制备34.1、drruvc原核表达载体的构建：35.利用引物drruvc_fn(5’‑tacttccaaggtcatatgagggttctggggattgaccc-3’，见seq no.1)和drruvc_rb(5’gagctcgaattcggatcctcagcgccgcagcggg-3’，见seq no.2)从耐辐射奇球菌基因组中直接扩增编码drruvc的基因，经琼脂糖凝胶检测确认扩增出大小正确的片段后(图1)，利用胶回收试剂盒(上海捷瑞)回收该pcr片段，利用ezfusion同源重组酶(上海捷瑞)将该片段连接到已经利用ndei和bamhi限制性内切酶处理并回收的线性化pet28t表达载体上，将连接产物转化dh5α克隆感受态，在含有卡娜抗性(终浓度50mg/l)的lb平板上，挑取单菌落测序，测序正确后，提出质粒，即获得重组表达载体pet28t-drruvc(图2)，该载体可在大肠杆菌表达菌株中异源表达n端带有6个his标签的drruvc蛋白。36.上述线性化pet28t质粒是基于商品化pet28a质粒基础上改造的质粒，主要改动是将原pet28a质粒his标签后面的序列“ggcctggtgccgcgcggcagc”替换成了“gagaacctgtacttccaaggt”，新的序列正好编码了tev酶切位点“enlyfqg”，改造后的表达质粒可在目的蛋白n端融合表达一段短肽“mgsshhhhhhssenlyfqgh”，该短肽有利于后期利用镍柱对目的蛋白进行亲和层析纯化，并且其大小通常不会影响相应的酶活性，此外，也可在必要的时候利用tev酶将该短肽切除，仅在目的蛋白n端留“gh”两个氨基酸，最大程度减少与目标蛋白活性无关的冗余氨基酸。37.编码drruvc的基因，其核苷酸序列具体是：38.atgagggttctggggattgaccccggtctggcgaacctgggcctgggactggtcgaaggggatgtccggcgggccaagcacctgtaccacgtctgcctgaccaccgaaagcgcgtggctgatgccccggcggctgcaatacctgcacgaggaactgacccggctgctcaccgagtaccggcccgacgcggtggcgatcgaggaccagattctgcgccgacaggctgacgtggcgttcaaagtggggcaggcgttcggggtggtgcagctcgcctgtgcgcaggccggggtgccgattcacgcctacggccccatgcaggtcaagaagtcgctggtgggcacgggccgcgccgacaaggagcaggtcatctacatggtcaaggcgagcctgggtattcgcgagctgttcaacaaccacgccgccgacgcgctggctctggcgctgacccacctcgcgcacgcgcccatgcaggagcgcagcgagcggctggcggcggcgggcagggctgcgcgcacaggagacgccccgctgcggcgctga，见seq no.3。39.2、drruvc蛋白的异源表达：将上述表达载体pet28t-drruvc转化到大肠杆菌表达菌株rosetta(de3)中，涂布在含有卡娜抗性(终浓度50mg/l)和氯霉素(终浓度30mg/l)的lb平板上。挑取单菌落接5mllb液体培养基中，37℃过夜培养，将过夜培养物转接至1llb液体培养基中扩大培养，待菌液od至达到0.8时，往培养基中加入0.8mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，同时将菌液转移至18℃进行过夜培养(目的蛋白将在此步骤得到大量表达)，随后收菌，弃上清。40.3、drruvc蛋白的纯化：将步骤2中所得菌体用裂解液(20mm tris[ph8.0]、1m nacl、0.5mm tris[2-carboxyethyl)phosphine[tcep]和5mm咪唑)悬起，利用压力破碎仪将菌液裂解，随后在20000g、4℃离心60分钟，收集上清。将上清利用0.22μm的滤膜过滤后，依次用镍柱(镍柱a液平衡、6％镍柱b液洗掉杂蛋白、100％镍柱b液洗脱)、脱盐柱(脱盐a液平衡和洗脱)、硫酸肝素柱(硫酸肝素a液平衡，0-50％硫酸肝素b液梯度洗脱)和分子筛柱(分子筛a液平衡和洗脱)可以得到非常纯净的目的蛋白。如上操作，每升细菌培养液最终可以得到1mg纯度在99％以上的drruvc蛋白。最终drruvc蛋白的纯度由15％sds-page检测(图3b)。纯化后的drruvc分子筛(superdex75)图谱，出峰位置在10ml，对应的分子量大小为40-45kda左右，而drruvc单体的分子量在20kda左右，证明了drruvc在溶液中以同源二聚体形式存在(图3a)。纯化过程所用的缓冲液配方如下：[0041](1)镍柱a液：20mm tris(ph8.0)、1m nacl、0.5mm tcep和5mm咪唑；镍柱b液：20mm tris(ph8.0)、1m nacl、0.5mm tcep和500mm咪唑。[0042](2)脱盐a液：20mm tris(ph8.0)、100mm nacl、0.5mm tcep。[0043](3)硫酸肝素a液：20mm tris(ph8.0)、100mm nacl、0.5mm tcep；硫酸肝素b液：20mm tris(ph 8.0)、2m nacl、0.5mm tcep。[0044](4)分子筛a液：20mm tris(ph8.0)、100mm nacl、0.5mm tcep。[0045]在工程菌中重组表达的drruvc蛋白，其氨基酸序列如下：[0046]mgsshhhhhhssenlyfqghmrvlgidpglanlglglvegdvrrakhlyhvclttesawlmprrlqylheeltrllteyrpdavaiedqilrrqadvafkvgqafgvvqlacaqagvpihaygpmqvkkslvgtgradkeqviymvkaslgirelfnnhaadalalalthlahapmqerserlaaagraartgdaplrr，见seq no.4。[0047]实施例2:drruvc活性的检测和最佳底物的筛选[0048]1、利用以下序列退火形成人工合成的含有66nt同源序列区域的霍利迪连接体底物，用于drruvc活性的检测(见图4)。其中，fam-j98-1、j98-2、j98-3和j98-4可以退火形成霍利迪连接体底物hj98a,j98-1、fam-j98-2、j98-3和j98-4可以退火形成霍利迪连接体底物hj98b,序列中画横线的部分为霍利迪连接体的同源序列区域。[0049][0050]退火的条件为：将各序列等比例混合，在20mm tris(ph8.0),50mm nacl和0.5mm tcep的缓冲液中，将混合液加热到95度，再在2小时内缓慢降温到室温。[0051]该霍利迪连接体解离的反应过程如下：10μl反应体系中含有1μm的drruvc蛋白(或abcam公司出售的重组型ecruvc蛋白作为对照)、500nm的霍利迪连接体底物hj98a或hj98b、100mm nacl、10mm mgcl2或mncl2、20mm tris(ph8.0)、0.5mm tcep、5％甘油。置于37℃反应30分钟，随后加入等体积终止液a(含20mm edta和98％甲酰胺)终止反应，于100℃加热20分钟，立即转移至冰上骤冷。[0052]由于底物中对应序列的5’端带有6-fam荧光基团，故该序列的酶切产物可由15％的tbe尿素胶(200v恒压40分钟)分离，并利用对应波长的荧光扫胶仪检测。胶的最左侧泳道为单链dnamarker。此外，ecruvc为abcam公司出售的重组型ecruvc蛋白(货号p0a814)，作为对照。[0053]最终反应结果显示，drruvc与ecruvc对hj98a和hj98b的酶切位点有所不同，drruvc酶切位点主要在含有“tc”的序列附近，而ecruvc酶切位点主要在含有“tt”的序列附近(见图4)。可见，drruvc是与ecruvc活性不同的新型霍利迪连接体解离酶。[0054]2、根据步骤1的结果，设计了更短的霍利迪连接体底物hj31以便更为精确地定位drruvc的酶切位点。以fam-j31-1、j31-2、j31-3和j31-4同比例混合退火可形成霍利迪连接体底物hj31(见图5)。涉及的序列如下：[0055][0056]退火的条件为：将各序列等比例混合，在20mm tris(ph8.0),50mm nacl和0.5mm tcep的缓冲液中，将混合液加热到95度，再在2小时内缓慢降温到室温。[0057]该霍利迪连接体解离的反应过程如下：10μl反应体系中含有1μm的drruvc蛋白(或abcam公司出售的重组型ecruvc蛋白作为对照)、500nm的霍利迪连接体底物hj31、100mm nacl、10mm mncl2、20mm tris(ph8.0)、0.5mm tcep、5％甘油。置于37℃反应30分钟，随后加入等体积终止液a(含20mm edta和98％甲酰胺)终止反应，于100度加热20分钟，立即转移至冰上骤冷，随后利用15％的tbe尿素胶(200v恒压50分钟)分离产物，并利用对应波长的荧光扫胶仪检测。胶的最左侧泳道为单链dna marker。此外，ecruvc作为对照。[0058]最终反应结果显示，drruvc与ecruvc对hj31的酶切位点有所不同，drruvc主要打断“tc”中胞嘧啶之后的磷酸二酯键，而ecruvc主要打断“tt”中胸腺嘧啶之后的磷酸二酯键(见图5)。进一步说明drruvc是与ecruvc活性不同的新型霍利迪连接体解离酶。[0059]3、根据步骤1和2的结果，在“tc”附近设计了不同的碱基以便更为精确地确定drruvc偏爱的霍利迪连接体底物序列。以j24-n1n2n3n4-1、24-d1d2d3d4-2、24-n1n2n3n4-3和24-d1d2d3d4-4(其中n1n2n3n4和d1d2d3d4为可变碱基)同比例混合退火，可形成霍利迪连接体底物hj24-n1n2n3n4(见图6)。涉及的序列如下：[0060][0061][0062]退火的条件为：将各序列等比例混合，在20mm tris(ph8.0),50mm nacl和0.5mm tcep的缓冲液中，将混合液加热到95度，再在2小时内缓慢降温到室温。[0063]该霍利迪连接体解离的反应过程如下：10μl反应体系中含有5μm的drruvc蛋白(或abcam公司出售的重组型ecruvc蛋白作为对照)、2.5μm的霍利迪连接体底物hj24-n1n2n3n4、100mm nacl、10mm mncl2、20mm tris(ph8.0)、0.5mm tcep、5％甘油。置于37℃反应30分钟，随后加入等体积终止液b(含20mm edta和10mg/ml蛋白酶k)终止反应，于37度终止反应20分钟后，利用10％的tbe活性胶(100v恒压50分钟)分离产物，并利用stains-all染料(生工)对胶进行染色，随后拍照。[0064]最终反应结果显示，drruvc偏好解离连接结处含有5’‑(g/c)tc(g/c)-3’序列的霍利迪连接体(见图6)。[0065]实施例3：drruvc酶活条件优化[0066]1、drruvc最佳催化金属离子以及浓度的筛选。采用实施例2中的霍利迪连接体hj31作为底物，筛选drruvc最佳催化金属离子及浓度。[0067]其中酶活反应最佳金属离子的筛选过程如下：10μl反应体系中含有1μm的drruvc蛋白、500nm的霍利迪连接体底物hj31、100mm nacl、10mm金属离子(mgcl2、mncl2、cacl2、znso4、nicl2、cocl2和cucl2)、20mm tris(ph8.0)、0.5mm tcep、5％甘油。置于37℃反应30分钟，随后加入等体积终止液a(含20mm edta和98％甲酰胺)终止反应，于100度加热20分钟，立即转移至冰上骤冷，随后利用15％的tbe尿素胶(200v恒压40分钟)分离产物，并利用对应波长的荧光扫胶仪检测。将扫描结果利用imagej软件(national institutes of health,usa)进行条带分析，分别确定每种金属离子催化解离后产物和底物条带的比例，随后利用graphpad prism 9(san diego,usa)绘制各种金属离子在该反应条件下解离效率的柱状图。最终发现mn离子和mg离子有较好的催化效果，其他金属则几乎没有活性(见图7a)。[0068]其中金属离子浓度优化过程如下：10μl反应体系中含有1μm的drruvc蛋白、500nm的霍利迪连接体底物hj31、100mm nacl、不同浓度的mgcl2或mncl2(0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mm)、20mm tris(ph8.0)、0.5mm tcep、5％甘油。置于37℃反应30分钟，随后加入等体积终止液a(含20mm edta和98％甲酰胺)终止反应，于100度加热20分钟，立即转移至冰上骤冷，随后利用15％的tbe尿素胶(200v恒压40分钟)分离产物，并利用对应波长的荧光扫胶仪检测。将扫描结果利用imagej软件进行条带分析，分别确定每个泳道产物和底物条带的比例，随后利用graphpad prism9绘制不同金属离子浓度下解离效率的折线图。最终发现drruvc在mn离子浓度2.5-10mm的时候酶活最强，而在mg离子浓度20mm的时候酶活最强。但是总体来说，mn离子的催化效率要比mg离子强，是drruvc的最佳催化金属离子(见图7b)。[0069]2、drruvc反应条件最佳ph的筛选。过程如下：10μl反应体系中含有1μm的drruvc蛋白、500nm的霍利迪连接体底物hj31、100mm nacl、10mm mncl2、50mm不同ph的缓冲液(其中ph为5.6、6.0、6.4、6.8、7.2的缓冲液由bis-tris和盐酸调制，而ph为7.6、8.0、8.4、8.8、9.2的缓冲液由tris和盐酸调制)、0.5mm tcep、5％甘油。置于37℃反应30分钟，随后加入等体积终止液a(含20mm edta和98％甲酰胺)终止反应，于100度加热20分钟，立即转移至冰上骤冷，随后利用15％的tbe尿素胶(200v恒压40分钟)分离产物，并利用对应波长的荧光扫胶仪检测。将扫描结果利用imagej软件进行条带分析，分别确定每个泳道产物和底物条带的比例，随后利用graphpadprism9绘制不同金属离子浓度下解离效率的折线图。最终发现drruvc在ph范围为7.6-8.4的时候有较强活性，其中以ph8.0时酶活最强(见图8)。[0070]3、drruvc反应条件最佳nacl浓度的筛选。过程如下：10μl反应体系中含有1μm的drruvc蛋白、500nm的霍利迪连接体底物hj31、10mm mncl2、20mm tris(ph8.0)、不同浓度的nacl(终浓度分别为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500mm)、0.5mm tcep、5％甘油。置于37℃反应30分钟，随后加入等体积终止液a(含20mm edta和98％甲酰胺)终止反应，于100度加热20分钟，立即转移至冰上骤冷，随后利用15％的tbe尿素胶(200v恒压40分钟)分离产物，并利用对应波长的荧光扫胶仪检测。将扫描结果利用imagej软件进行条带分析，分别确定每个泳道产物和底物条带的比例，随后利用graphpad prism9绘制不同金属离子浓度下解离效率的折线图。最终发现drruvc在nacl终浓度范围为50-150mm的时候有最强活性(见图9)。[0071]4、drruvc反应条件最佳反应温度的筛选。10μl反应体系中含有1μm的drruvc蛋白、500nm的霍利迪连接体底物hj31、10mm mncl2、20mm tris(ph8.0)、100mm nacl、0.5mm tcep、5％甘油。置于不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)反应30分钟，随后加入等体积终止液a(含20mm edta和98％甲酰胺)终止反应，于100度加热20分钟，立即转移至冰上骤冷，随后利用15％的tbe尿素胶(200v恒压40分钟)分离产物，并利用对应波长的荧光扫胶仪检测。将扫描结果利用imagej软件进行条带分析，分别确定每个泳道产物和底物条带的比例，随后利用graphpad prism9绘制不同金属离子浓度下解离效率的折线图。最终发现drruvc在反应温度范围为40-45℃的时候有最强活性(见图10)。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!