一种玉米ZmNAC78基因的应用

有机化合物处理,合成应用技术dna连接酶1μl、10×t4 dna连接酶缓冲液1μl；15.将得到的连接的产物转化大肠杆菌感受态细胞，将转化菌液涂布于含卡那霉素的lb固体培养基上，在温度为37℃的条件下培养12h后，挑选阳性克隆进行培养，用引物zmnac78-f和zmnac78-r进行菌斑pcr鉴定，鉴定到1080bp条带即为阳性克隆，得到玉米zmnac78基因过表达载体，即pcambia3300-zmnac78质粒；16.所述菌斑pcr鉴定的pcr扩增的反应体系为：taq酶1μl、引物zmnac78-f 2μl、引物zmnac78-r 2μl、10x buffer 2.5μl、dntp mix5μl、无菌水补足至25μl；17.所述菌斑pcr鉴定的pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环后，72℃延伸10min；18.所述引物zmnac78-f的核苷酸序列如seq id no:7所示；19.所述引物zmnac78-r的核苷酸序列如seq id no:8所示；20.s3、zmnac78基因的玉米遗传转化：21.用s2中得到的pcambia3300-zmnac78质粒转化农杆菌，侵染玉米自交系b104的幼胚，经过诱导培养、共培养培养、筛选培养、分化培养、生根培养和移栽成苗，得到zmnac78转基因的阳性植株；22.s4、zmnac78转基因的阳性植株的鉴定：s3中得到的zmnac78转基因的阳性植株通过bar试纸检测阳性植株，然后通过pcr扩增检测带酶切位点和myc标签序列的zmnac78基因，然后实时定量pcr检测，与玉米自交系b104相比，zmnac78基因表达水平升高，则为玉米zmnac78基因过表达植株。23.本发明与现有技术相比具有以下优点：24.本发明的玉米zmnac78基因在玉米植株中过表达，用于提高玉米抗旱性。25.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。附图说明26.图1是本发明的实施例2的zmnac78基因在干旱胁迫下表达水平检测图。27.图2是本发明的实施例2的zmnac78-oe过表达植株中zmnac78表达水平检测图。28.图3本发明的实施例2的zmnac78-oe过表达转基因植株抗旱性分析图。29.图4本发明的实施例2的zmnac78-oe过表达转基因植株干旱胁迫下生存率图。30.图5本发明的实施例2的zmnac78-oe过表达转基因植株叶片失水率图。31.图6本发明的实施例2的zmnac78-oe过表达转基因植株叶片气孔形态图。32.图7本发明的实施例2的zmnac78-oe过表达转基因植株叶片气孔大小统计图。具体实施方式33.实施例134.本实施例的玉米zmnac78基因的应用，所述玉米zmnac78基因在玉米植株中过表达，用于提高玉米抗旱性；所述玉米zmnac78基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述玉米zmnac78基因的氨基酸序列如seq id no:2所示。35.所述玉米zmnac78基因在玉米植株中过表达的方法为：36.s1、zmnac78-puc57质粒的合成：为方便载体构建，在zmnac78基因的核苷酸序列的两端添加eco31i酶切位点序列，为方便后续蛋白互作研究，同时在3’端终止密码子前添加一段30个核苷酸的myc标签序列，合成带酶切位点和myc标签的zmnac78基因，连入puc57载体中，得到zmnac78-puc57质粒；37.所述zmnac78基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；38.所述带酶切位点和myc标签的zmnac78基因的核苷酸序列如seq id no:3所示；39.所述myc标签序列的核苷酸序列如seq id no:4所示；40.所述zmnac78基因的核苷酸序列5’端添加的eco31i酶切位点序列的核苷酸序列如seq id no:5所示；41.所述zmnac78基因的核苷酸序列3’端添加的eco31i酶切位点序列的核苷酸序列如seq id no:6所示；42.s2、玉米zmnac78基因过表达载体的构建：43.对s1中得到的基因质粒zmnac78-puc57质粒和ubi启动子驱动的过表达载体质粒pcambia3300用eco31i进行酶切，分别得到zmnac78目的片段(1000bp左右)和pcambia3300载体大片段(10000bp左右)，用琼脂糖凝胶回收试剂盒将酶切电泳产物回收后，将所述pcambia3300载体大片段和所述zmnac78目的片段在t4连接酶的作用下，在温度为37℃的条件下连接反应1h，得到连接产物；44.所述连接反应的体系为：pcambia3300载体大片段3μl、zmnac78目的片段5μl、t4 dna连接酶1μl、10×t4 dna连接酶缓冲液1μl；45.将得到的连接的产物转化大肠杆菌感受态细胞，将转化菌液涂布于含卡那霉素的lb固体培养基上，在温度为37℃的条件下培养12h后，挑选阳性克隆进行培养，用引物zmnac78-f和zmnac78-r进行菌斑pcr鉴定，鉴定到1080bp条带即为阳性克隆，得到玉米zmnac78基因过表达载体，即pcambia3300-zmnac78质粒；46.所述菌斑pcr鉴定的pcr扩增的反应体系为：taq酶1μl、引物zmnac78-f 2μl、引物zmnac78-r 2μl、10x buffer 2.5μl、dntp mix5μl、无菌水补足至25μl；47.所述菌斑pcr鉴定的pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环后，72℃延伸10min；48.所述引物zmnac78-f的核苷酸序列如seq id no:7所示；49.所述引物zmnac78-r的核苷酸序列如seq id no:8所示；50.s3、zmnac78基因的玉米遗传转化：51.用s2中得到的pcambia3300-zmnac78质粒转化农杆菌，侵染玉米自交系b104幼胚的幼胚，经过诱导培养、共培养培养、筛选培养、分化培养、生根培养和移栽成苗，得到zmnac78转基因的阳性植株；52.具体的方法为：首先，挑选大小均一的玉米自交系b104幼胚，在无菌操作台中剥取幼胚，34℃高温诱导暗培养3d；再放在培养箱25℃，暗培养7d。将诱导产生的愈伤切去内生芽，接种至继代培养基中25℃暗培养7d，继代两次，备用于农杆菌转化。愈伤组织置于无菌的侵染培养基，洗两次；最后一次洗完倒掉液体加入菌液(od600＝0.4)，侵染30min；农杆菌侵染后，胚在无菌滤纸上吸干农杆菌，转移至共培养基表面，胚轴端与培养基接触(盾片朝上)，23℃暗培养3d。筛选2次，待长出完整的再生苗后转入生根培养基中，28℃，16h光照，进行生根壮苗，根长至2cm左右，进行炼苗移栽；53.s4、zmnac78转基因的阳性植株的鉴定：s3中得到的zmnac78转基因的阳性植株通过bar试纸检测阳性植株，然后通过pcr扩增检测带酶切位点和myc标签序列的zmnac78基因，然后实时定量pcr检测，与玉米自交系b104相比，zmnac78基因表达水平升高，则为玉米zmnac78基因过表达植株(记为zmnac78-oe转基因植株)。54.实施例255.本实施例为实施例1中的玉米zmnac78基因过表达植株(zmnac78转基因植株)的耐旱性分析：56.通过qrt-pcr实验检测，发现zmnac78受干旱胁迫诱导上调表达(图1)。zmnac78-oe转基因植株中zmnac78基因表达水平显著高于对照玉米自交系b104(图2)。为了确认过表达zmnac78-oe玉米是否比玉米自交系b104的玉米抗旱，对两种玉米进行了干旱胁迫处理。正常生长时，土壤水分保持在90-100％，待玉米生长到三叶期时停止浇水。在干旱胁迫之前，b104和过表达zmnac78-oe玉米的长势差别不大，经13天的干旱胁迫后，两者在表型上出现显著差异，玉米自交系b104(图中control)较过表达zmnac78-oe玉米出现严重的叶片打卷萎蔫和逐渐变黄现象。复水后，过表达zmnac78-oe玉米能够恢复到原来的生长状态(图3)，且其存活率显著高于玉米自交系b104(control)(图4)，过表达玉米zmnac78-oe较玉米自交系b104具有更强的抗旱性，说明过表达zmnac78基因增强玉米抗旱性。通过进一步分析，发现zmnac78-oe转基因植株在干旱胁迫下，失水率显著低于对照玉米自交系b104(control)(图5)。通过显微镜观察干旱胁迫下气孔关闭速率，发现zmnac78-oe转基因植株气孔关闭更迅速(图6)。在干旱胁迫处理5min和10min时，zmnac78-oe转基因植株气孔孔径显著小于对照玉米自交系b104(control)(图7)。以上结果说明zmnac78可通过调节气孔运动增强抗旱性。57.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。









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