细胞转瓶的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明是关于生物装置特别是细胞转瓶的技术领域，涉及对细胞转瓶的改进。背景技术：2.一种市售的细胞转瓶产品呈圆柱状，外表光滑，如图1所示。细胞转瓶产品主要是通过细胞转瓶本身的摩擦力在细胞培养转瓶机上旋转，从而实现均匀、大批量培养细胞产物等。但图1所示的细胞转瓶与细胞培养转瓶机(例如cellroll转瓶机)的旋转轴摩擦力小，导致培养时转瓶易打滑或不旋转，最终造成细胞产物和表达后的产量均不理想；该产品仅两端支撑接触面(如图1a和图1b所示)，接触面积小，摩擦力不理想，且细胞瓶长度较大，中间没有支持，瓶子的强度不足，容易造成破损。3.另一种市售的细胞转瓶包括瓶口1和瓶体2，瓶体具有4个支撑部3，如图2a所示，将瓶体分为三段，支撑位置外表光滑。转瓶的竖直方向上有加强筋4，加强筋处的外表面凸起，内部凹陷(参见图2b和2c)。加强筋使得支撑强度增强，但加强筋处的瓶子内表面凹陷，培养时导致细胞贴壁不均匀。4.因此，现有的细胞转瓶存在培养时转瓶易打滑、细胞贴壁不均匀、表达后的产量不理想等技术问题，亟需一种新型的细胞转瓶以解决上述问题、改善细胞培养。技术实现要素：5.有鉴于此，本发明提出了一种新的细胞转瓶，以便改善细胞培养。6.根据本发明的一种细胞转瓶，包括瓶口和瓶体，所述瓶体具有大体圆柱形的形状，其特征在于，所述瓶体具有三个支撑部，分别位于所述瓶体的上部、中部和底部。7.所述支撑部的外表面为摩擦结构，优选地经过磨砂处理，而所述支撑部的内表面平整光滑。所述支撑部的面积大，使得支撑部与转瓶架的接触面大。与市售产品相比，本发明的细胞转瓶的支撑部的面积较大。8.所述细胞转瓶由聚苯乙烯材料制成。当然也可以由其他合适的材料制备而成。9.所述细胞转瓶的满口容量是4000-5000ml，优选地为4100-4900ml、4200-4800ml、4300-4700ml或4400-4600ml，更优选地为4500ml。细胞转瓶的重量为300-500克，优选地为340-440克、350-430克、360-420克或370-410克，更优选地390克。10.所述细胞转瓶用于贴壁细胞的培养，或用于悬浮细胞培养。所述贴壁细胞包括但不限于vero细胞、293/293t细胞、car-t细胞、cef细胞、猪肺泡巨噬细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、df-1细胞、st细胞、pk15细胞、marc145细胞，优选为st细胞、vero细胞、cef细胞。所述悬浮细胞包括但不限于cho细胞、昆虫细胞和bhk21细胞，优选为bhk21细胞。11.本发明的细胞转瓶支撑强度高、不易破损。使用本发明的细胞转瓶来进行细胞培养，不易打滑，细胞贴壁均匀，培养的细胞密度高，细胞产物和表达后的产量较理想。附图说明12.图1a是一种市售的细胞转瓶(称为市售产品i)的主视图；图1b是图1a的细胞转瓶沿着a-a的纵向剖视图；13.图2a是另一种市售的细胞转瓶(称为市售产品ii)的主视图；图2b是图2a的细胞转瓶沿着a-a的纵向剖视图；图2c是图2a的细胞转瓶沿着b-b的横向剖视图；14.图3a是本发明的细胞转瓶的主视图；图3b是本发明细胞转瓶的仰视图；15.图4是使用图2a的市售细胞转瓶(称为市售产品ii)培养st细胞72h后的照片，标记的框内部分显示出加强筋处内表面凹陷区域细胞聚集严重；16.图5是使用本发明细胞转瓶培养st细胞72h后的照片，显示转瓶的内表面平整，细胞贴壁均匀。具体实施方式17.下面，参照附图对本发明的具体实施方式进行详细的说明。18.参见图3，根据本发明的一个实施方式的细胞转瓶包括瓶口1和瓶体2，瓶体具有大体圆柱形的形状。细胞转瓶长度为480mm-500mm，宽度为110-130mm，优选120mm。瓶体具有三个支撑部3，分别位于瓶体上部、中间和底部，支撑面较大。中间的支撑部具有两个不同弧度的弧面。与图2a的市售细胞转瓶不同，本发明细胞转瓶的支撑部的外表面为摩擦结构，例如经过磨砂处理，而支撑部的内表面平整光滑，使得旋转培养时不易打滑，贴壁细胞培养均匀，细胞产物和表达后的产量均理想。瓶子三个支撑部加强了转瓶的强度，在运输移动和使用时转瓶不容易破裂。该细胞转瓶由聚苯乙烯(ps)材料制成，当然也可以由本领域技术人员已知的其他适合的材料来制造，例如聚碳酸酯(pc),聚亚苯基砜树脂(ppsu),聚氯乙烯(pvc),聚乙烯(pe)和聚丙烯(pp)等医用透明塑料。根据本发明的一个实施方式的细胞转瓶的满口容量是大约4500ml，重量为大约390克。19.细胞转瓶在使用时横放在转瓶架上。由于本发明的细胞转瓶的支撑部具有摩擦结构，因此在转动过程中不易打滑。20.本发明的细胞转瓶主要用于贴壁细胞的培养，也可用于悬浮细胞培养(cho细胞、昆虫细胞和bhk21细胞等悬浮细胞)。可应用的细胞包括但不限于人胚胎干细胞(hescs)，成纤维细胞，角蛋白细胞，血管内皮细胞，肝细胞，血管平滑肌细胞，肝细胞祖细胞，原代鸡胚神经细胞，骨髓干细胞，巨噬细胞，293细胞，l929细胞，永久性睾丸生殖细胞，贴壁cho和bhk细胞，3t3，vero，cos，hela，nt2，mg63，m24，a375转移性黑色素瘤，神经胶质瘤u251和d54，ht1080纤维肉瘤细胞，sf9昆虫细胞。21.所述贴壁细胞包括但不限于vero细胞、293/293t细胞、car-t细胞、cef细胞、猪肺泡巨噬细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、df-1细胞、st细胞、pk15细胞、marc145细胞，优选为st细胞、vero细胞、cef细胞。22.对比实施例一23.1.1试验材料细胞：st细胞和vero细胞鸡胚：10日龄spf鸡胚病毒：猪瘟病毒c株(购自中国兽医药品监察所)；乙脑病毒sd-2011株(参见中国专利申请号cn201110203864.x，其通过引用结合到本文中)；马立克氏病毒cvi988株(购自中国兽医药品监察所)转瓶：市售产品i、市售产品ii、本发明的转瓶24.1.2试验方法25.1.2.1使用过程中的观察26.使用如图1a所示的市售产品i，可以观察到在转瓶架上的细胞转瓶在转动的过程中会发生打滑或不旋转现象，使用中有时会发生破裂。使用如图2a所示的市售产品ii，没有观察到在转瓶架上的细胞转瓶打滑或不旋转现象，使用中有时会发生破裂。使用本发明的细胞转瓶，同样没有观察到细胞转瓶在转瓶架上打滑或不旋转现象，使用中不容易发生破裂。27.1.2.2细胞生长速度测试28.按照常规方法分别消化猪睾丸细胞(st细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)，制备成细胞悬液，st细胞按照8万/cm2和vero细胞按照6万/cm2的细胞密度接种入市售产品i的细胞转瓶、市售产品ii的细胞转瓶以及本发明的细胞转瓶，每个组分别接种3个细胞转瓶(即每个组3个重复)。将细胞转瓶置于37℃温室培养，培养72h后分别消化计数，对比不同试验组细胞增殖速度。29.1.2.3病毒增殖对比试验30.1.2.3.1猪瘟病毒增殖对比试验31.按照常规方法消化st细胞，按照8万/cm2的细胞密度接种入前述三种类型的细胞转瓶，每个组分别接种3个细胞转瓶，同步接种猪瘟病毒c株，接毒剂量moi＝0.1，将细胞转瓶置于37℃温室培养，培养96h后收毒一次，同一组的3瓶细胞病毒液混合在一起，补液后继续培养72h收获一次，以后每72h补液收获一次，共收获5次。收获的病毒液使用免疫荧光法(ifa法)检测病毒含量，对比不同试验组5个收次病毒含量算术平均值之间的差异。32.1.2.3.2乙脑病毒增殖对比试验33.按照常规方法分别消化vero细胞，并按照6万/cm2的细胞密度接种入前述三种细胞转瓶(即分为三个组)，每个组分别接种3个细胞转瓶，将细胞转瓶置于37℃温室培养，培养72h弃去细胞上清液，按照1％维持液体积接种乙脑病毒，并补加接毒维持液继续置于37℃温室中培养，接毒后培养72h后收获毒液，同一组的3瓶细胞病毒液混合在一起。使用组织半数感染量测定病毒含量，对比不同试验组病毒含量之间的差异。34.1.2.3.3马立克氏病毒cvi988增殖对比试验35.按照常规方法消化10日龄spf鸡胚制备细胞悬液，按照50万/cm2的细胞密度接种入前述三种细胞转瓶(即分为三个组)，每个转瓶补加细胞生长液(含8％胎牛血清的细胞培养基)至500ml，每个组分别接种3个细胞转瓶，同步接种马立克氏病毒cvi988株，接毒剂量moi＝0.1，将细胞转瓶置于37℃温室培养，培养72h后，消化细胞，同一组的3瓶细胞混合在一起，每组细胞用150ml冻存液稀释(冻存液含10％dmso，20％胎牛血清和80％细胞培养基)，使用程序降温仪待温度降至-70℃以下后转入液氮保存。取液氮冻存的含有cvi988病毒的cef细胞，使用组织半数感染量法检测病毒含量，对比不同试验组病毒含量之间的差异。36.1.3试验结果37.1.3.1细胞增殖对比试验38.st细胞和vero细胞增殖在不同种类的塑料细胞转瓶中的细胞增殖对比试验结果见表1，其中本发明细胞转瓶中的细胞密度贴壁均匀，细胞培养3日的细胞密度也最高，本发明转瓶与其他两个市售产品培养3日的细胞密度统计分析差异极显著(p《0.01)，市售产品ii在加强筋的内表面凹陷区域，细胞聚集严重(详见图4，st细胞培养72h的照片)，造成培养3日后的细胞密度最低。本发明细胞转瓶的细胞均匀度较好(详见图5，st细胞培养72h的照片)。市售产品i中的细胞均匀度也较好，与本发明细胞转瓶的细胞均匀度差异不明显，但本发明细胞转瓶的贴壁速度较快，培养3日后细胞密度也最高，市售产品i中的细胞密度较低。39.1.3.2病毒增殖对比试验40.st细胞、vero细胞和鸡胚成纤维细胞(cef细胞)在3种塑料细胞转瓶中繁殖猪瘟病毒c株、乙脑病毒和马立克氏病毒的试验结果见表1，其中本发明的细胞转瓶培养的细胞，不仅细胞贴壁均匀，所培养的病毒含量也是最高的。尤其使用本发明转瓶培养st细胞繁殖猪瘟病毒时，5个收次病毒含量较为稳定，病毒含量均在106.5tcid50/ml以上，最高病毒含量为107.2tcid50/ml，本发明转瓶与其他两个市售产品繁殖的病毒含量统计分析差异极显著(p《0.01)，而市售产品ii由于细胞贴壁不均匀，不同收次病毒含量差异较大，在第一次收获时，细胞转瓶的部分区域仍未长满单层，造成病毒含量仅为105.5tcid50/ml，直到第三收次病毒含量才能达到106.0tcid50/ml以上，累计连续收获5次，平均病毒含量为106.2tcid50/ml，是三个组效价最低的(本发明转瓶与其他两个市售产品对比差异极显著，p《0.01)。41.表1.不同细胞转瓶培养细胞和繁殖病毒试验结果42.因此，从上述实验结果可以看出，本发明的细胞转瓶培养的细胞，不仅细胞均匀，细胞密度高，而且所培养的病毒含量高，不同收次的病毒含量稳定。43.对比实施例二44.1.1试验材料细胞：bhk21贴壁细胞和bhk21悬浮细胞病毒：伪狂犬病毒(prv病毒)转瓶：本发明转瓶(细胞贴壁面积850cm2)45.1.2试验方法46.1.2.1不同细胞的细胞生长速度测试47.按照常规方法消化bhk21贴壁细胞制备成细胞悬液，按照8万/cm2细胞密度接入本发明的细胞转瓶(3个重复，每个转瓶接入6800万个细胞)；bhk21悬浮细胞也按照相同细胞数6800万接入本发明转瓶(3个重复)，将细胞转瓶置于37℃温室培养，培养72h后，bhk21贴壁细胞按照常规方法消化计数，bhk21悬浮细胞直接取样计数，对比不同细胞培养72h细胞密度的差异。48.1.2.2病毒增殖对比试验49.按照常规方法消化bhk21贴壁细胞，按照8万/cm2的细胞密度接种入3个本发明细胞转瓶，培养3日后弃去细胞上清液，按照moi＝0.01接种hn1201株的ge基因缺失株(简称为hn1201-δge株，可以参见中国专利申请cn201410059931.9，其通过引用结合于本文中)病毒液，补加维持液至原培养体积，将接毒后的细胞转瓶置于37℃温室继续培养，24h后每隔4h观察细胞病变情况，待细胞出现80％以上细胞病变时收毒，3瓶细胞病毒液混合在一起，使用组织半数感染量测定病毒含量。培养3日的bhk21悬浮细胞，不用消化直接取样计数，并静置培养瓶待细胞沉降后，弃去上层无细胞的上清液，补加接毒维持液将细胞稀释至170万个/ml(细胞密度与培养3日bhk21贴壁细胞相同)接入3个本发明的细胞培养瓶，同步按照moi＝0.01接种hn1201-δge株病毒液，将接毒后的细胞转瓶置于37℃温室继续培养，24h后每隔4h观察一次细胞病变情况，待细胞出现80％以上细胞病变时，同一组的3瓶细胞病毒液混合在一起，使用组织半数感染量测定病毒含量，对比本发明的细胞转瓶培养贴壁细胞和悬浮细胞繁殖prv病毒含量之间的差异。50.1.3试验结果51.1.3.1细胞增殖对比试验52.bhk21贴壁细胞和bhk21悬浮细胞增殖使用本发明细胞转瓶的细胞增殖对比试验结果见表2，按照相同细胞数接种培养3日后bhk21悬浮细胞密度具有更高的细胞密度，贴壁细胞培养72h增殖5倍，而悬浮细胞增殖9.4倍，细胞增殖速度为贴壁细胞的1.9倍。53.1.3.2病毒增殖对比试验54.在使用bhk21悬浮细胞和贴壁细胞用于伪狂犬病毒(hn1201-δge株)培养时，按照相同细胞密度和moi接毒，贴壁细胞出现80％细胞病变效应(cpe)时间为接毒后36h，而bhk21悬浮细胞80％cpe时间为较晚，为接毒后48h，收获的病毒含量也有较大的差异，bhk21悬浮细胞繁殖病毒含量更高，说明本发明的转瓶也可用于悬浮细胞培养，且用于悬浮细胞培养时有更高的病毒含量。55.表2.不同类型细胞转瓶培养细胞和繁殖病毒的试验结果56.因此，从上述实验结果可以看出，本发明的细胞转瓶培养的细胞，不仅适于贴壁细胞培养，还是适于悬浮细胞培养，在bhk21悬浮细胞培养时意外的发现bhk21悬浮细胞所培养的病毒含量更高，bhk21悬浮细胞主要用于生物反应器大规模培养，但需要比较昂贵的生物反应器和配套设备才能实现批量培养。对常规转瓶生产线，不需增加设备，仅适用该发明的细胞转瓶和悬浮bhk21细胞即可实现产品质量的提升。且使用转瓶培养悬浮细胞在传代较为容易，不需要胰酶消化，仅需要稀释传代即可。57.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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