一种罗非鱼皮抗氧化肽及制备方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种以罗非鱼皮为原料所制备的罗非鱼皮抗氧化肽及制备方法。背景技术：2.生物体在受到有害刺激时会产生过多的活性氧自由基，继而对体内细胞和线粒体展开攻击，使其结构和功能发生改变，引发衰老等疾病。抗氧化剂可通过酶促反应或非酶促反应清除过多的活性氧自由基，现有的抗氧化剂有合成及天然两种。合成抗氧化剂价格低廉、抗氧化活性高，但研究表明其具有致癌、致畸、致突变等不良后果；天然抗氧化剂主要是抗氧化肽，不仅可以清除自由基，还具有机体防御、免疫调节及促进矿物质吸收等功能。3.罗非鱼是一种广泛养殖的淡水鱼，目前只有罗非鱼肉被广泛接受，而罗非鱼的骨骼、内脏和皮肤等没有得到开发。尤其是罗非鱼皮虽含有丰富的胶原蛋白，但迄今为止并没有关于以罗非鱼皮为原料制备抗氧化肽的相关报道。技术实现要素：4.本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种罗非鱼皮抗氧化肽及制备方法。5.本发明的技术解决方案是：一种罗非鱼皮抗氧化肽，所述罗非鱼皮抗氧化肽的氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr。6.一种罗非鱼皮抗氧化肽的制备方法，依次按照如下步骤进行：a. 将罗非鱼皮清洗搅碎后加入碱性蛋白酶进行酶解，得到罗非鱼皮酶解液，所述酶解条件是ph8.0~12.0、温度35~65℃、加酶量为总质量的1~6%、料液比为1：20~80g/ml、酶解时间为5.0~15.0h；b. 将罗非鱼皮酶解液沸水浴灭酶并快速冷却，4℃条件下10000r/min离心10~20min，取上清液；c. 将上清液进行超滤膜过滤，得分子量≤1000的组分；d. 利用反相高效液相色谱仪对分子量≤1000的组分进行分离，得到分子量为702da，氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr的罗非鱼皮抗氧化肽。7.优选罗非鱼皮抗氧化肽的制备方法，依次按照如下步骤进行：a. 将罗非鱼皮清洗搅碎后加入碱性蛋白酶进行酶解，得到罗非鱼皮酶解液，所述酶解条件是ph10.0、温度51℃、加酶量为总质量的2.51%、料液比为1：5 0g/ml、酶解时间为9.0h；b. 将罗非鱼皮酶解液沸水浴灭酶15min并快速冷却，4℃条件下10000r/min离心15min，取上清液；c. 将上清液进行超滤膜过滤，得分子量≤1000的组分；d. 利用反相高效液相色谱仪对分子量≤1000的组分进行分离，得到分子量为702da，氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr的罗非鱼皮抗氧化肽。8.所述d步骤的分离条件是：色谱柱为prep-ods(h)kit，250×20mmi.d；流动相为a相-质量浓度为5%的乙腈溶液，b相-质量浓度为80%的乙腈溶液，a相和b相的乙腈溶液中均含质量百分比为0.1%的tfa；以b相10%、0-10min、b相10-80%、10-15min及b相80-10%、30-40min进行梯度洗脱；上样量为700μl，流速为7ml/min，检测波长为220nm。9.本发明是以罗非鱼皮为原料，通过控制碱性蛋白酶的酶解条件，得到具有特定肽链长度的活性多肽，该活性多肽价格低廉且具有较高的抗氧化活性，dpph、abts和羟基自由基ic50（半抑制浓度）分别为8.52±0.69、9.14±0.08、23.44±1.60 mg/ml。同时，本发明提高了罗非鱼皮的利用率，增加了罗非鱼副产物附加值。附图说明10.图1是本发明实施例各超滤组分抗氧化活性示意图。11.图2为本发明实施例分离产物h1-h8的rp-hplc洗脱图。12.图3为本发明实施例分离产物h1-h8的抗氧化活性示意图。13.图4为本发明实施例分离产物h8总离子流图。14.图5为本发明实施例活性多肽质谱图。具体实施方式15.实施例1：本发明的一种罗非鱼皮抗氧化肽的制备方法，依次按照如下步骤进行：a. 将5g罗非鱼皮清洗搅碎后加入碱性蛋白酶进行酶解，得到罗非鱼皮酶解液，所述酶解条件是ph10.0（用1mol/l naoh调节）、温度51℃、加酶量为总质量的2.51%、料液比为1 g：50ml、酶解时间为9.0h；b. 将罗非鱼皮酶解液沸水浴灭酶15min并快速冷却，4℃条件下10000r/min离心15min，取上清液；c. 将上清液进行超滤膜过滤，得分子量≤1000的组分；d. 利用反相高效液相色谱仪对分子量≤1000的组分进行分离，得到分子量为702da，氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr的罗非鱼皮抗氧化肽。分离条件是色谱柱为prep-ods(h)kit，250×20mmi.d；流动相为a相-质量浓度为5%的乙腈溶液，b相-质量浓度为80%的乙腈溶液，a相和b相的乙腈溶液中均含质量百分比为0.1%的tfa；以b相10%、0-10min、b相10-80%、10-15min及b相80-10%、30-40min进行梯度洗脱；上样量为700μl，流速为7ml/min，检测波长为220nm。16.实施例2：本发明的一种罗非鱼皮抗氧化肽的制备方法，依次按照如下步骤进行：a. 将5g罗非鱼皮清洗搅碎后加入碱性蛋白酶进行酶解，得到罗非鱼皮酶解液，所述酶解条件是ph8.0（用1mol/l naoh调节）、温度65℃、加酶量为总质量的1%、料液比为1 g：80ml、酶解时间为15.0h；b. 将罗非鱼皮酶解液沸水浴灭酶15min并快速冷却，4℃条件下10000r/min离心20min，取上清液；c. 将上清液进行超滤膜过滤，得分子量≤1000的组分；d.利用反相高效液相色谱仪对分子量≤1000的组分进行分离，得到分子量为702da，氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr的罗非鱼皮抗氧化肽。分离条件是色谱柱为prep-ods(h)kit，250×20mmi.d；流动相为a相-质量浓度为5%的乙腈溶液，b相-质量浓度为80%的乙腈溶液，a相和b相的乙腈溶液中均含质量百分比为0.1%的tfa；以b相10%、0-10min、b相10-80%、10-15min及b相80-10%、30-40min进行梯度洗脱；上样量为700μl，流速为7ml/min，检测波长为220nm。17.实施例3：本发明的一种罗非鱼皮抗氧化肽的制备方法，依次按照如下步骤进行：a. 将5g罗非鱼皮清洗搅碎后加入碱性蛋白酶进行酶解，得到罗非鱼皮酶解液，所述酶解条件是ph12.0（用1mol/l naoh调节）、温度35℃、加酶量为总质量的6%、料液比为1 g：20ml、酶解时间为5.0h；b. 将罗非鱼皮酶解液沸水浴灭酶15min并快速冷却，4℃条件下10000r/min离心10min，取上清液；c. 将上清液进行超滤膜过滤，得分子量≤1000的组分；d.利用反相高效液相色谱仪对分子量≤1000的组分进行分离，得到分子量为702da，氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr的罗非鱼皮抗氧化肽。分离条件是色谱柱为prep-ods(h)kit，250×20mmi.d；流动相为a相-质量浓度为5%的乙腈溶液，b相-质量浓度为80%的乙腈溶液，a相和b相的乙腈溶液中均含质量百分比为0.1%的tfa；以b相10%、0-10min、b相10-80%、10-15min及b相80-10%、30-40min进行梯度洗脱；上样量为700μl，流速为7ml/min，检测波长为220nm。18.实施例1~3所用碱性蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司（中国·上海），酶活力单位200u/mg。19.实验：按照实施例1中a、b步骤的方法对罗非鱼皮进行酶解并得到上清液，将上清液进行超滤膜过滤，分别得到分子量≥5000da、3500-5000da、1000-3500da及≤1000da的组分，分别测定各组分的抗氧化活性，结果如图1所示。20.图1表明分子量≤1000da的组分（m4）具有较高的抗氧化活性。21.将分子量≤1000da的组分按照d步骤法方法利用反相高效液相色谱进行分离，可得如图2所示各吸收峰对应洗脱组分h1-h8。分别测定各组分h1-h8的抗氧化活性，结果如图3所示，结果表明组分h8抗氧化活性最高。22.利用maldilc-ms/ms鉴定组分h8，其总离子流图如图4所示，其中一条氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr；质谱图如图5所示，分子量为702da。23.按照现有技术的方法合成制备氨基酸序列为gly-gly-tyr-asp-glu-tyr的蛋白肽，经过抗氧化活性检测，dpph、abts和羟基自由基ic50（半抑制浓度）分别为8.52±0.69、9.14±0.08、23.44±1.60 mg/ml。24.所述抗氧化活性的测试方法如下：（1）dpph自由基清除能力将不同浓度样品各取100ul与100ul dpph溶液（0.05mg/ml,乙醇配置）充分混匀，在室温下避光孵育30分钟，测量517nm处的吸光度。乙醇代替dpph溶液作为对照组，乙醇代替样品作为空白组。采用谷胱甘肽（gsh）作为阳性对照。样品的dpph自由基清除活性计算如下：其中as、ac和ab分别代表样品组、对照组和空白组的吸光度。25.（2）abts自由基清除能力制备含有7mmol/l abts和2.45mmol/l过硫酸钾的储备溶液作为abts溶液，在室温下避光过夜15h以产生abts+。abts工作溶液在蒸馏水中稀释，在734nm处的吸光度为0.70±0.02。将不同浓度100ul样品分别和400ulabts工作溶液充分混匀，室温避光孵育10分钟，测量734nm处的吸光度。用蒸馏水代替样品作为空白组。采用gsh作为阳性对照。样品的abts自由基清除活性计算如下：其中as和ab分别代表样品和空白组的吸光度。26.（3）羟基自由基清除能力将不同浓度样品各取100ul与100ul 9mmol/l feso4、100ul 9mmol/l水杨酸乙醇溶液、100ul8.8mmol/lh2o2充分混匀，在37℃水浴中孵育30分钟，测量510nm处的吸光度。蒸馏水代替h2o2和样品用作对照组和空白组。采用gsh作为阳性对照。样品的羟基自由基清除活性计算如下：其中as、ac和ab分别代表样品组、对照组和空白组的吸光度。









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