用于药物代谢动力学研究的心肌细胞及其制备方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于药物代谢动力学研究的心肌细胞及其制备方法。背景技术：2.心血管疾病每年导致大约1700万人死亡，是全球疾病死亡的主要原因，由于复杂的致病机理，心血管疾病目前难以预防。2006年日本科学家山中伸弥团队利用病毒将4个转录因子转入分化的成纤维细胞中获得了诱导多能干细胞，诱导多能干细胞技术的发展避免了胚胎干细胞遇到的伦理学问题，为相关疾病的研究和治疗提供了可能。3.诱导多能干细胞具有分化成各种功能性细胞的潜能，同样地，诱导多能干细胞通过调节相应的信号通路能够产生具有收缩功能的心肌细胞，具有稳定电生理特性的心肌细胞不仅可以用于研究心脏疾病的发病机理、筛选治疗心脏疾病的药物，甚至可以开展心肌细胞治疗心脏疾病的临床研究，进一步拓展心肌细胞在心肌梗死、心脏衰竭等疾病治疗中的贡献。4.心肌细胞作为药物治疗心脏疾病的机理尚未清楚，心肌细胞在体内的存活、滞留、增殖、迁移和分布也有待进一步研究，因此有必要对心肌细胞进行示踪标记。5.目前常用的标记示踪技术主要包括荧光染料标记、分子细胞标记和影像学成像技术标记。荧光染料标记是将能发荧光的染料与细胞膜上特定位点或细胞内蛋白等结合而进行观察；分子细胞学标记包括核苷酸标记法，蛋白标记法等；影像学成像技术标记法是使用影像学手段显示亚细胞、细胞和组织水平的特定分子，反映活体状态下分子水平的变化，在影像学方面对分子的生物学行为进行定量和定性研究，影像学成像技术包括光学成像、磁共振成像、核医学成像、计算机断层成像以及超声成像等技术，光学成像包括荧光成像和生物发光成像，荧光成像是通过外在激发光激发荧光基团到达高能量状态后发射荧光；生物发光成像是将经基因工程修饰并稳定表达荧光素酶的细胞或dna移植如活体后，再给予其底物荧光素，在三磷酸腺苷和氧气共同作用下，荧光素氧化反应发射荧光，荧光素酶作为催化剂加快这一反应过程，光的强度与标记的细胞数目成线性相关。放射性同位素标记技术同样也为细胞移植后组织分布和定量进行在体内检测提供了可能，该技术是移植携带放射性同位素标记的细胞后用单光子发射计算机断层摄影术(spect)或正电子发射断层显像术在体内扫描，根据各组织器官的放射活性比例可以确定细胞在体内的数量分布。6.目前细胞示踪方法众多，每种方法都有其各自优缺点，目前尚未发现一种灵敏度高，受外界干扰小的针对心肌细胞的示踪方法。技术实现要素：7.有鉴于此，本发明实施例一方面提供了一种用于药物代谢动力学研究的心肌细胞，所述心肌细胞携带荧光素酶基因并表达荧光素酶蛋白，所述心肌细胞在含氧及镁离子的环境中，由荧光素酶与其底物结合发生氧化反应，而产生化学发光效应，释放出可被检测的光信号。8.本发明实施例提供的心肌细胞在注射动物体内后在氧和镁离子的参与下由荧光素酶与其底物结合发生氧化反应，而产生化学发光效应，释放出可被检测的光信号，以便于对心肌细胞在体内的存活、滞留、迁移、代谢等研究。9.优选的是，所述用于药物代谢动力学研究的心肌细胞中，所述心肌细胞携带嘌呤霉素抗性基因。携带嘌呤霉素抗性基因的心肌细胞在嘌呤霉素环境中可以进一步提高所述心肌细胞的纯度。10.另一方面，本发明实施例提供一种用于药物代谢动力学研究的心肌细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：11.质粒构建步骤：以piggybac双启动子质粒为模板，去除所述质粒的ef-1α启动子，并将荧光素酶序列插入cmv启动子后形成重组质粒；12.重组质粒导入诱导多能干细胞步骤：向1.0×106个酶解成单细胞的诱导多能干细胞中分别加入1ml浓度为1μg/μl的重组质粒以及1ml浓度为1μg/μl的pcmv hypbase，混合均匀后在电转仪中进行电转，得到携带荧光素酶基因的诱导多能干细胞；13.心肌细胞的分化步骤：将所述携带荧光素酶的诱导多能干细胞加入含有浓度为0.01～0.09mm的chir99021的心肌细胞分化培养基培养48h，将培养基更换为含有浓度为0.01～0.05mm的iwr-1的心肌细胞分化培养基继续培养48h，再用心肌细胞分化培养基继续培养，每隔48h更换一次培养基。14.优选的是，所述心肌细胞制备方法中，在所述重组质粒导入诱导多能干细胞的步骤中，携带荧光素酶基因的诱导多能干细胞在含有嘌呤霉素的培养基中培养并进行5～8次传代。15.进一步优选的是，所述心肌细胞制备方法中，在所述心肌细胞分化的步骤中，chir99021的浓度为0.05mm，iwr-1的浓度为0.03mm。16.优选的是，所述心肌细胞制备方法中，经心肌细胞分化步骤得到的细胞出现可观察到跳动时，将细胞以6.0×105～9.0×105细胞/cm2的密度接种在含有胞嘧啶β-d-呋喃阿拉伯糖苷心肌细胞分化培养基中。17.进一步优选的是，所述心肌细胞制备方法中，携带荧光素酶基因的诱导多能干细胞在含有嘌呤霉素的培养基中培养并进行7次传代。18.更进一步优选的是，所述心肌细胞制备方法中，所述心肌细胞分化培养基中的胞嘧啶β-d-呋喃阿拉伯糖苷浓度为1μm。19.本发明实施例一方面提供了携带荧光素酶基因的心肌细胞，所述心肌细胞在含氧及镁离子的环境中，由荧光素酶与其底物结合发生氧化反应，而产生化学发光效应，释放出可被检测的光信号，为心肌细胞作为药物在治疗心脏疾病方面机理及其在机体内代谢过程的研究提供一种可行的方法；另一方面，本发明实施例提供了用于药物代谢动力学研究的心肌细胞的制备方法，该方法制备的心肌细胞纯度高，荧光数据稳定可靠。附图说明20.图1为心肌细胞表达的荧光素酶的活性；21.图2为携带荧光素酶核酸序列的心肌细胞荧光成像。具体实施方式22.下面结合附图及具体实施例对本发明技术方案进行进一步描述，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法，实验所用的仪器和试剂皆可通过商业途径获得。23.本发明实施例采用的试剂来源如下：24.dpbsꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀgibco25.trypleꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀgibco26.pcmv hypbaseꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀshbcc27.实施例1质粒的构建28.扩增piggybac质粒，以piggybac双启动子质粒为模板，去除所述质粒的ef-1α启动子，并将荧光素酶序列插入cmv启动子之后，完成重组质粒sr39tk-piggybac的构建。29.为了进一步筛选成功导入重组质粒的细胞，在重组质粒上插入嘌呤霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白gfp。30.通过嘌呤霉素的抗性筛选后，对质粒进行无菌及去内毒素处理，以达到转染级要求。31.实施例2诱导多能干细胞的转染32.本发明实施例采用采用南京艾尔普再生医学科技有限公司制备的诱导多能干细胞进行转染，不排除使用其他来源的诱导多能干细胞。33.将诱导多能干细胞酶解为单细胞、计数，配制浓度分别为1μg/μl的重组质粒及pcmv hypbase，向1.0×106个酶解成单细胞的诱导多能干细胞中分别加入1μl的重组质粒以及1μl的pcmv hypbase，混合均匀后在电转仪中进行电转，得到携带突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因序列的诱导多能干细胞。34.实施例3携带荧光素酶的心肌细胞的制备方法35.在实施例2制备的携带突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶的诱导多能干细胞中加入含有浓度为0.05mm的chir99021的心肌细胞分化培养基培养48h后，将培养基更换为含有浓度为0.03mm的iwr-1的心肌细胞分化培养基，培养48h后用心肌细胞分化培养基继续培养，并每隔48h换液，细胞培养至可观察到跳动时检测其心肌细胞及成纤维细胞的含量，其中本发明实施例提供的心肌细胞分化培养基为rpmi1640培养基中添加无胰岛素的b27(rpmi1640培养基和b27的量为100:2)，本发明实施例中的心肌细胞培养基也可以为其他可用于将多能干细胞分化为心肌细胞的培养基。36.当chir99021的终浓度为0.01～0.09mm时且iwr的终浓度为0.01～0.05mm时，心肌细胞的分化效率相对较高。37.经心肌细胞分化步骤得到的细胞出现可观察到跳动时，将细胞以6.0×105～9.0×105细胞/cm2的密度接种在含有浓度为1μm的胞嘧啶β-d-呋喃阿拉伯糖苷心肌细胞分化培养基中进一步纯化。38.实施例4心肌细胞荧光素酶活性的检测39.配制体积比为1:3.6的atp buffer及底物荧光素(luciferrin buffer)，将实施例3制备的心肌细胞裂解后加入以上混匀的atp及荧光素，5秒内在发光仪上读取吸光值，以吸光值表达荧光素酶活性，其中以不携带荧光素酶报告基因的诱导多能干细胞根据实施例3的方法分化的心肌细胞作为对照组。图1显示裂解的心肌细胞中荧光素酶的酶活性，可以看出，本发明实施例提供的心肌细胞相较于对照组有较高的酶活性，说明根据本发明实施例制备的心肌细胞能够表达荧光素酶。40.实施例5携带荧光素酶心肌细胞的荧光检测41.为了验证本发明实施例提供的方法制备的心肌细胞能够表达荧光素酶，在重组质粒构建步骤中，用2a元件连接荧光蛋白gfp的核酸序列和荧光素酶核酸序列，gfp序列和荧光素酶序列共用一个启动子cmv，因此可通过检测心肌细胞的荧光蛋白来确定荧光素酶的表达。42.利用olympus荧光显微镜对实施例3制备的心肌细胞进行荧光检测，聚光镜选择明场，在低倍镜条件下查找细胞，然后切换至20×10，调焦至细胞最清晰，选择绿色荧光激发滤色片，打开光闸进行拍照，本发明实施例采用分化第9天的心肌细胞进行荧光成像，图2a为明场条件下的心肌细胞，图2b为表达gfp的心肌细胞的荧光成像，说明心肌细胞表达gfp荧光蛋白，也说明所述心肌细胞表达了荧光素酶。43.需要指出的是，以上实施例仅用于对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何在本发明基础上做出和本发明本质上相同的改变、修饰、替换、组合应视为等同的置换手段，都包含在本发明的保护范围之内。









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