双子叶植物细胞的转化方法与流程

农业,林业,园林,畜牧业,肥料饲料的机械,工具制造及其应用技术双子叶植物细胞的转化方法1.相关申请2.本技术要求于2019年9月4日提交的并且通过援引以其全文并入本文的临时申请pct/cn2019/104384的优先权。技术领域3.本发明总体上涉及植物生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于改进双子叶植物中的转化的方法，例如改进双子叶植物中的转化频率和/或减少多倍体事件。背景技术：4.番茄(solanum lycopersicum l.)是仅次于马铃薯的第二重要的蔬菜作物。食用番茄被认为对人类健康和营养有显著贡献，因为番茄富含矿物质、维生素、以及番茄红素和β-胡萝卜素色素。5.番茄的转化系统建立于20世纪80年代，此后相继报道了各种转化系统。在大多数转化系统中，使用来自6至8日龄种苗(seedling)的子叶或下胚轴作为外植体。尽管有将4到6周龄植物的叶子用作外植体的报道，但培养条件和培养基可能与用于子叶或下胚轴的培养条件和培养基不同，在应用于不同品种之前可能需要进一步优化。6.使用子叶和下胚轴作为外植体进行番茄转化的一个主要挑战是具有异常倍性的染色体的转基因事件比例很大(ellul等人.2003)，在3个品种中使用子叶作为外植体时，显示30％-80％的转基因事件具有异常的倍性(sigareva等人.2004)。转基因和组织培养再生的非转基因中二倍体植物百分比为：带柄子叶63％-78％，下胚轴22％-58％，组织培养的叶外植体90％-100％(虽然许多基因型的叶外植体再生能力最低)。7.多倍体事件通常是不育的并且表型正常，在早期阶段与二倍体事件无法区分。因此，对降低多倍体事件比例以使转化更有效且更高通量的方法存在需求。技术实现要素：8.本披露提供了转化诸如番茄和西瓜的双子叶植物的改进方法。如本文所述，开发了提高双子叶植物例如番茄和西瓜的转化效率的方法。在一些实施例中，这些方法导致番茄中约2％-30％之间和西瓜中约70％的转化频率。在一些实施例中，本文所述的方法导致提高的转化效率、降低的转化植物中的非整倍性、高通量输出的能力、更低的成本、更快的转化过程和/或基因型非依赖性转化。9.因此，在一些方面，本披露提供了一种转化双子叶植物细胞的方法，该方法包括：(a)获得双子叶植物种子(例如成熟的番茄种子或成熟的西瓜种子)；将该双子叶植物种子浸泡在合适的浸种培养基(seed-soak medium)中；(b)将步骤(b)的浸泡过的双子叶植物种子分割成多个双子叶植物外植体；用包含目的核酸的土壤杆菌接种步骤(c)的该多个双子叶植物外植体，从而获得土壤杆菌接种的双子叶植物外植体；以及(e)共培养土壤杆菌接种的双子叶植物外植体以产生转化的双子叶植物细胞。在其他方面，本披露提供了一种转化双子叶植物细胞的方法，该方法包括：(a)获得双子叶植物种子(例如成熟的番茄种子或成熟的西瓜种子)；(b)将该双子叶植物种子浸泡在合适的浸种培养基中；(c)将步骤(b)的浸泡过的双子叶植物种子分割成多个双子叶植物外植体；以及(d)使用基因枪粒子递送系统将目的核酸递送到该多个双子叶植物外植体中以产生转化的双子叶植物细胞。10.在一些实施例中，双子叶植物种子是成熟种子。在一些实施例中，双子叶植物种子是干燥的成熟种子。在一些实施例中，双子叶植物种子是从新鲜果实收获的新鲜种子或从干果收获的有活力种子。在一些实施例中，双子叶植物种子是从新鲜果实收获的新鲜成熟种子或从干果收获的有活力成熟种子。11.在一些实施例中，步骤(e)的共培养在黑暗中进行多天的时段(例如，至少1、2、3、4、5、6、7或更多天)。在一些实施例中，在大约22℃(例如21℃-23℃之间)的温度下，多天的时段为1至5天，优选2天。12.在一些实施例中，该方法进一步包括(f)从步骤(e)的共培养物或步骤(d)的递送中取出这些双子叶植物外植体，并使所述外植体复苏；以及(g)在至少一种选择培养基上孵育从步骤(f)复苏的双子叶植物外植体，其中该至少一种选择培养基允许转化的双子叶植物外植体存活。在一些实施例中，选择培养基是实例中描述的选择培养基或包含与实例中描述的选择培养基大致相同的组分。在一些实施例中，步骤(f)的复苏步骤是在黑暗中在大约25℃于复苏培养基中进行至少一天的时段(例如1至7天)，任选地其中该复苏培养基包含ms盐和维生素、0.01mg/l iaa、1mg/l玉米素、150mg/l特美汀(timentin)和150mg/l羧苄青霉素。在一些实施例中，复苏培养基是实例中描述的复苏培养基或包含与实例中描述的复苏培养基大致相同的组分。13.在一些实施例中，该方法进一步包括将步骤(g)所选的转化的双子叶植物外植体置于生长培养基上。在一些实施例中，生长培养基是实例中描述的生长培养基或包含与实例中描述的生长培养基大致相同的组分。14.在一些实施例中，合适的浸种培养基包括选自由水、b5、木本植物培养基(woody)和ms组成的组的培养基。在一些实施例中，浸种培养基是实例中描述的发芽培养基或包含与实例中描述的发芽培养基大致相同的组分。15.在一些实施例中，在步骤(d)的接种或递送之前去除或损坏双子叶植物种子的种皮。在一些实施例中，通过人工手段或机械手段去除或损坏种皮。16.在一些实施例中，步骤(b)的浸泡步骤在大约1小时至大约72小时的范围内、有或没有光下进行。17.在一些实施例中，该方法进一步包括将所选的转化的双子叶植物外植体生长成种苗，并且任选地对所述种苗进行取样以用于分子分析(例如，以检测目的核酸的种苗细胞掺入，例如通过taqman测定或下一代测序)。18.在一些实施例中，步骤(c)中的分割包括对步骤(b)的浸泡过的双子叶植物种子进行切割或压碎。19.在一些实施例中，步骤(c)中的切割或压碎包括使用剃须刀片、手术刀、搅拌机、毛刺研磨机、压机、一系列刀片、研钵和研杵、切片机、刀或其组合，包括包含前述任何一项或多项的机器。20.在一些实施例中，转化的双子叶植物细胞选自由以下组成的组：番茄细胞、西瓜细胞、菠菜细胞、大豆细胞、花生细胞、向日葵细胞、芸苔属(brassica)物种细胞、葫芦属(cucurbit)物种细胞、苜蓿细胞、拟南芥(拟南芥属)细胞和茄科物种细胞。在一些实施例中，转化的双子叶植物细胞是转化的双子叶植物细胞番茄细胞或西瓜细胞。21.在一些实施例中，多个双子叶植物外植体是至少2、3或更多个分离的外植体，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个分离的外植体，但优选10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个分离的外植体。在一些实施例中，多个双子叶植物外植体是14、15、16、17或18个分离的外植体。22.在一些实施例中，分离的外植体大小约为0.2mm-8.0mm。23.在一些实施例中，至少一种选择培养基包含抗生素选择剂、代谢选择剂或除草剂选择剂。在一些实施例中，选择剂是草甘膦、草铵膦、壮观霉素或卡那霉素。在一些实施例中，抗生素选择剂选自由以下组成的组：壮观霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、四环素等。在一些实施例中，代谢选择剂是不可代谢的糖。在一些实施例中，除草剂选择剂是草甘膦、草铵膦、双丙氨膦、als、草丁膦(ppt)。在一些实施例中，不可代谢的糖选自由以下组成的组：6-磷酸甘露糖、帕拉金糖和松二糖。24.在一些实施例中，该方法产生较少的异常四倍体转化体(例如，小于15％、小于10％、小于5％、小于1％的异常四倍体转化体)。在一些实施例中，该方法导致至少2％(例如，在约2-30％之间)的转化频率。25.在其他方面，本披露提供了一种方法，该方法包括任一个实例中描述的过程的一些或全部步骤。26.在其他方面，本披露提供了通过本文描述的任何方法产生或可获得的转化的双子叶植物细胞。27.在其他方面，本披露提供了通过本文描述的任何方法产生或可获得的种苗。28.在其他方面，本披露提供了通过本文描述的任何方法产生或可获得的植物。29.在其他方面，本披露提供了衍生自本披露的植物、种子或其部分的商品。在一些实施例中，商品选自由以下组成的组：完整或加工过的种子、果实、糖、蛋白质分离物、果汁、浓缩物、液体、糖浆、糊状物、酱汁或其他由植物生产的食物或产品。30.在其他方面，本披露提供了一种方法，该方法包括(a)将通过本文描述的任何方法产生或可获得的种苗生长成包含转化细胞的植株；以及(b)将包含转化细胞的植株与另一植株杂交以产生后代植株，任选地其中该另一植株不包含转化细胞。在其他方面，本披露提供了通过该方法产生的后代植物。31.在其他方面，本披露提供了一种再生双子叶植物的方法，该方法包括：(a)获得双子叶植物种子；(b)将该双子叶植物种子在合适的浸渗培养基(imbibition medium)中浸渗；(c)分割步骤(b)的整个浸渗的双子叶植物种子以产生多个双子叶植物外植体；(d)在再生培养基上培养来自步骤(c)的该多个双子叶植物外植体，其中该再生培养基允许双子叶植物外植体存活。在一些实施例中，双子叶植物种子是成熟的双子叶植物种子。在一些实施例中，该方法包括任一个实例中描述的过程的一个或多个步骤。32.定义33.尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。34.除非下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在此采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域的普通技术人员而言很清楚的那些技术的变化或等效技术的替换。35.本文引用的所有的专利、专利公布、非专利公布对于引用中提及的有关句子或段落的传授内容通过引用以其全文并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。36.如在此所使用的，术语“一个(a)”或“一种(an)”或“该(the)”可以是指一个或多于一个，除非上下文清楚地并明确地另外指明。例如，“一个”内源核酸可以意指一个内源核酸或多个内源核酸。37.术语“约”本文用于意指大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐述的数值来限定这个范围。一般而言，术语“约”本文用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。38.如本文所用，“外植体”是指源自植物或植物部分(例如种子)的组织、一个组织片或多个组织片。外植体可以是植物的一部分，例如未成熟胚、叶分生组织，或者可以源自植物或种子的枝条、叶、未成熟胚或任何其他组织的一部分。39.如本文所用，术语“成熟种子”是指处于发育阶段的种子，该种子可以在没有额外的土壤帮助的情况下发芽。在一些实施例中，“成熟种子”是授粉后至少14天的种子。40.术语“核酸”或“多核苷酸”在本文可互换使用，并且是指可以对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的dna聚合物或聚脱氧核糖核苷酸或rna聚合物或多核糖核苷酸)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含生物rna或dna不典型的碱基的寡核苷酸，例如2'-o-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另有说明，否则除任何明确指示的多核苷酸之外，本发明的具体核酸或多核苷酸任选地还包含或编码互补多核苷酸。核酸可以存在于载体中，例如细胞、病毒或质粒中。41.术语“植物”是指任何植物，特别是农艺上有用的植物(例如种子植物)，并且“植物细胞”是该植物的结构单元和生理单元(包含细胞壁)，还可以指原生质体。该植物细胞可以是处于分离的单细胞或经培养的细胞的形式、或作为高等组织化的单位(例如像，植物组织、或分化成植物发育的任一阶段存在的结构的植物器官)的一部分。植物可以是单子叶植物或双子叶植物物种。42.术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下各项的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽和种子；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花朵、果实、茎、芽、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。术语“植物部分”还包括外植体。43.术语“后代(progeny)”是指具体杂交的一个或多个后裔。典型地，后代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自体受精(即，同一个植株充当雄性和雌性配子两者的供体)。该一个或多个后裔可以是例如f1、f2或任何后续世代。44.如本文所用，术语“转化”是指将核酸转移到宿主细胞中，优选导致遗传稳定的整合，包括整合到染色体和可遗传的染色体外事件。在一些具体的实施例中，引入植物、植物部分和/或植物细胞中是经由细菌介导的转化、粒子轰击转化(也称为基因枪粒子转化)、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米粒子介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、晶须介导的核酸递送、微量注射、超声波处理法、浸润法、聚乙二醇介导的转化、原生质体转化或导致向植物、植物部分和/或其细胞引入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物学机制，或其组合进行的。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括miki等人(“procedures for introducing foreign dna into plants[将外源dna引入植物中的程序]”在plant molecular biology and biotechnology[植物分子生物学和生物技术]的方法中，glick,b.r.和thompson,j.e.编辑(crc press,inc.[crc出版有限公司]，波卡拉顿，1993)，第67-88页)和rakowoczy-trojanowska(2002，cell.mol.biol.lett.[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。[0045]在被引入细胞中的多核苷酸的上下文中，“稳定引入”或“稳定引入的”是指所引入的多核苷酸被稳定地合并到该细胞的基因组中，并且因此该细胞用该多核苷酸进行了稳定转化。[0046]如本文所使用的，“稳定转化”或“被稳定地转化的”意为将核酸引入到细胞中并且整合到该细胞的基因组中。按照这样，整合的核酸能够被其后代遗传，更具体地，被多个连续世代的后代遗传。如本文所使用的，“基因组”还包括核基因组、线粒体基因组与质粒基因组，并且因此包括该核酸到例如叶绿体基因组的整合。如本文所使用的，稳定转化也可以是指以染色体外方式(例如，作为微型染色体)维持的转基因。[0047]“选择性标记”或“选择性标记基因”是指一种基因，该基因在一种植物细胞中的表达给予该细胞一种选择优势。“正向选择”是指转化的细胞，该转化的细胞获得其以前不能使用或不能有效使用的底物代谢能力，典型地通过转化并表达正向选择性标记基因。因此，这种转化的细胞从非转化组织的群中生长出来。正向选择可以是来自植物生长调节剂的无活性形式的许多类型，然后通过转移的酶转化为活性形式来转化碳水化合物来源，这些碳水化合物来源不被非转化细胞(例如甘露糖)有效利用，其然后在转化后可得到酶，例如磷酸甘露糖异构酶，使其能够被代谢。与转化的细胞相比，不转化的细胞生长缓慢或根本不生长。与非转化细胞生长能力相比，其他类型的选择可能是由于用选择性标记基因的细胞转化，该选择性标记基因获得在阴性选择试剂(例如抗生素或除草剂)存在下生长的能力。转化细胞所具有的选择优势还可以是由于在所谓“阴性选择”中失去以前具有的基因。在这种情况下，所添加的化合物只对未失去亲本细胞(通常是转基因)中存在的特异性基因(阴性选择性标记基因)的细胞具有毒性。[0048]“转基因植物”是具有一个或多个含有异源dna序列的植物细胞的植物。具体实施方式[0049]本披露涉及双子叶植物和植物细胞例如番茄和西瓜植物和植物细胞的转化方法。在一些实施例中，本文所述的方法导致提高的转化效率、降低的转化植物中的非整倍性、高通量输出的能力、更低的成本、更快的转化过程和/或基因型非依赖性转化。[0050]在一些实施例中，转化双子叶植物或植物细胞的方法包括如本文描述的一个或多个步骤，例如实例中描述的一个或多个步骤，例如实例1-9中任一个中的一个或多个或所有步骤。[0051]在一些实施例中，转化双子叶植物或植物细胞的方法包括获得双子叶植物种子；将该双子叶植物种子浸泡在合适的浸种培养基中；将浸泡过的双子叶植物种子分割成多个双子叶植物外植体；并且向该多个双子叶植物外植体中的至少一些中引入目的核酸。在一些实施例中，双子叶植物种子是成熟的双子叶植物种子。分割可以是分成大小相等的外植体或大小不等的外植体。在一些实施例中，外植体大小大致相同。在一些实施例中，合适的浸种培养基选自由水、b5、木本植物培养基和ms组成的组。b5、木本植物培养基和ms可以从本领域已知的任何来源获得，例如从phytotechnology laboratories公司获得(例如，目录号m524、g398+g219或l449)。[0052]在一些实施例中，向多个双子叶植物外植体中的至少一些中的引入是借助细菌介导的转化(例如土壤杆菌转化)、粒子轰击转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米粒子介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、晶须介导的核酸递送、微量注射、超声波处理法、浸润法、聚乙二醇介导的转化，以及导致向多个双子叶植物外植体中的至少一些中引入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物学机制，或任何前述手段的组合进行的。优选地，向多个双子叶植物外植体中的至少一些中的引入是借助细菌介导的转化(例如土壤杆菌转化)或粒子轰击转化进行的。[0053]土壤杆菌介导的转化是用于转化植物的常用方法，这是由于它具有相对较高的转化效率和增加的转化通量以及因为它对于许多不同物种的广泛实用性。土壤杆菌介导的转化通常涉及将携带外来目的dna的二元载体转移至适当的土壤杆菌菌株，这可能取决于由宿主土壤杆菌菌株在共同存在的ti质粒上或在染色体上携带的vir基因的互补物(参见例如，uknes等人1993,plant cell[植物细胞]5:159-169)。将重组二元载体转移至土壤杆菌可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌——一种辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到靶土壤杆菌菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将重组二元载体转移至土壤杆菌中(参见例如，和willmitzer 1988,nucleic acids res[核酸研究]16:9877)。[0054]通过重组土壤杆菌进行的植物转化通常涉及该土壤杆菌与来自该植物的外植体的共培养。典型地在携带位于这些二元质粒t-dna边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。在一些实施例中，共培养包括实例中描述的一个或多个步骤，例如实例1-9中任一个中的一个或多个步骤。[0055]另一种用于转化植物、植物部分以及植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物学活性的粒子，也称为基因枪粒子轰击。参见例如，美国专利号4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供掺入在其内部中的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有目的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕以使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物活性粒子(例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自包含一个或多个力图导入的核酸)推入植物组织中。[0056]在一些实施例中，可以例如使用目的核酸中存在的选择性标记来选择用目的核酸转化的植物、植物部分和植物细胞。在一些实施例中，使用实例中描述的一个或多个选择步骤来选择用目的核酸转化的植物、植物部分和植物细胞。在一些实施例中，选择性标记是在一个或多个实例中使用的选择性标记，如实例1-9中任一个中的一个或多个选择性标记。[0057]选择性标记的实例包括但不限于，提供对以下抗生素抗性或耐受性的基因，如卡那霉素(dekeyser等人1989,plant phys[植物生理学]90:217-23)、壮观霉素(svab和maliga 1993,plant mol biol[植物分子生物学]14:197-205)、链霉素(maliga等人1988,mol gen genet[分子基因遗传]214:456-459)、潮霉素b(waldron等人1985,plant mol biol[植物分子生物学]5:103-108)、博来霉素(hille等人1986,plant mol biol[植物分子生物学]7:171-176)、磺胺剂(sulphonamides)(guerineau等人1990,plant mol biol[植物分子生物学]15:127-136)、链丝菌素(jelenska等人2000,plant cell rep[植物细胞报告]19:298-303)、或氯霉素(de block等人1984,embo j 3:1681-1689)。其他选择性标记包括提供对除草剂抗性或耐受性的基因，如赋予除草剂(包括磺胺尿素类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、和嘧啶基硫代苯酸盐类(thiobenzoates))耐受性的乙酰乳酸合酶(als)的s4和/或hra突变；5-烯醇-丙酮-莽草酸-3-磷酸-合酶(epsps)基因，包括但不限于描述在美国专利号4,940,935、5,188,642、5,633,435、6,566,587、7,674,598中的那些(连同全部相关的应用)和草甘膦n-乙酰转移酶(gat)，其赋予对草甘膦的耐受性(castle等人2004,science[科学]304:1151-1154，和美国专利申请公开号20070004912、20050246798、和20050060767)；bar，其赋予对草铵膦的耐受性(参见例如美国专利号5,561,236)；芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxy alkanoate dioxygenase)或aad-1、aad-12、或aad-13，其赋予对2,4-d的耐受性；如假单胞菌hppd的基因，其赋予对hppd耐受性；卟啉酮氧化酶(ppo)突变体和变体，其赋予对过氧化除草剂的抗性，这些除草剂包括氟磺胺草醚、氟羧草醚钠、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵、氟噻甲草酯、嘧啶肟草醚、丙炔氟草胺、氟烯草酸、唑酮草酯、甲磺草胺；以及赋予对麦草畏耐受性的基因，如麦草畏单加氧酶(herman等人2005,j biol chem[生物化学杂志]280:24759-24767和美国专利号7,812,224，以及相关的申请和专利)。选择性标记的其他实例可以在sundar和sakthivel(2008,j plant physiology[植物生理学杂志]165:1698-1716)中发现，通过引用结合在此。[0058]其他选择系统包括使用药物、代谢物类似物、代谢中间体和酶用于转基因植物的正向选择或有条件的正向选择。实例包括但不限于编码其中甘露糖是选择剂的磷酸甘露糖异构酶(pmi)的基因，或编码其中d-木糖是选择试剂的木糖异构酶的基因(haldrup等人1998,plant mol biol[植物分子生物学]37:287-96)。最后，其他选择系统可以使用无激素培养基作为选择剂。一个非限制性实例玉米同源盒基因kn1，其异位表达导致转化效率3倍增加(luo等人2006,plant cell rep[植物细胞报告]25:403-409)。各种选择性标记和编码他们的基因的实例披露在miki和mchugh(j biotechnol[生物技术杂志],2004,107:193-232；通过引用结合)中。[0059]在本披露的一些实施例，选择性标记可以是植物来源的。可以是植物衍生的选择性标记的实例包括但不限于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)。酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)催化植物中芳香族氨基酸生物合成常见的莽草酸通路中的重要步骤。除草剂草甘膦抑制epsps，因此杀死植物。可以通过引入修饰的epsps转基因产生转基因草甘膦耐受植物，该植物不由草甘膦影响(例如美国专利6,040,497；通过引用结合)。在草甘膦的存在下可以被用作选择性标记的修饰的植物epsps的其他实例包括稻epsps的p106l突变(zhou等人2006,plant physiol[植物生理学]140:184-195)和在蟋蟀草epsps中的p106s突变(baerson等人2002,plant physiol[植物生理学]129:1265-1275)。不是植物来源的并可以被赋予草甘膦耐受性的epsps的其他来源包括但不限于来自鼠伤寒沙门氏菌的epsps p101s突变(comai等人1985,nature[自然]317:741-744)以及来自土壤杆菌属菌株的cp4的cp4 epsps的突变的版本(funke等人2006,pnas 103:13010-13015)。尽管植物epsps基因是细胞核，但是成熟酶位于叶绿体(mousdale和coggins 1985,planta[植物]163:241-249)。epsps合成为包含转运肽的前蛋白，随后该前体随后转运至叶绿体基质中并进行蛋白质水解以产生成熟酶(della-cioppa等人1986,pnas 83:6873-6877)。因此，为了产生对草甘膦具有耐受性的转基因植物，可以引入正确地易位至叶绿体的epsps的适当的突变形式。然后此类转基因植物具有天然的、基因组的epsps基因，连同突变的epsps转基因。然后草甘膦可以被用作在转化和再生过程中的选择剂，由此仅用突变的epsps转基因成功地转化的那些植物或植物组织存活。[0060]在一些实施例中，该方法进一步包括允许双子叶植物外植体在转化后复苏。在一些实施例中，复苏步骤发生在一个或多个选择步骤之前。在一些实施例中，复苏步骤发生在一个或多个选择步骤之后。在一些实施例中，复苏步骤发生在一个或多个选择步骤之前和之后。在一些实施例中，在黑暗中持续至少一天(例如，至少1、2、3、4、5、6、7或更多天)进行复苏。在一些实施例中，复苏发生在复苏培养基中，如实例中描述的培养基，如实例1-9中任一个中的一种或多种复苏培养基。[0061]在一些实施例中，在获得或选择转化的双子叶植物外植体之后，该方法进一步包括将所选的或获得的转化的双子叶植物外植体置于生长培养基上。在一些实施例中，生长培养基是实例中描述的培养基，如实例1-9中任一个中的一种或多种生长培养基。[0062]在下文中，将通过以下实例详细描述本发明。然而，以下实例是对本发明的说明，本发明的范围不受以下实例限制。[0063]实例[0064]实例1：番茄中的转化方法[0065]以下是转化双子叶植物的实例方法。该方法以番茄为例。如相关实例中所示，该方法在某些实例中进行了更改。[0066](1)种子消毒[0067]a.将授粉后至少14天的干燥成熟番茄种子在含0.04％silwet-77的10％clorox中浸泡20min。然后用无菌水冲洗种子至少3次。[0068](2)种子浸渗[0069]a.将经消毒的番茄种子转移至发芽培养基(gamborg b5培养基，含20g/l蔗糖、8g/l琼脂，ph 5.6)或用无菌水浸泡过的无菌滤纸。然后将种子在黑暗中在25℃下孵育1至3天(在子叶从种皮萌现之前)。优选孵育一天。[0070](3)接种准备[0071]在接种前至少3天，将储存在-80℃的含有目的载体的土壤杆菌菌株eha101用适当的抗生素在固体lb(lennox)琼脂(caisson laboratories公司，目录号lbp04)上划线，并在接种前1天在新的固体lb(lennox)培养基上重新划线一次。收集土壤杆菌并将其重悬浮于含有400μm乙酰丁香酮(as)和1mm二硫苏糖醇(dtt)的液体感染培养基(ms培养基，含有0.5mg/l bap、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、4g/l mes，ph5.5)中。将土壤杆菌悬浮液的od660调整为0.5。[0072](4)外植体准备和感染[0073]有两种方法用于制备外植体：[0074]a.用手术刀将浸渗的种子切割成小块，用作转化的外植体。在切割之前或之后去除种皮。外植体的大小一般在0.1mm至2mm之间，优选约0.5mm。将外植体浸渗到土壤杆菌悬浮液中接种约2小时，但预计5分钟至6小时的接种就足够了。或[0075]b.使用搅拌机(gastro 350)将浸渗的种子切割成小块，用作外植体。搅拌机的容器和刀用75％酒精消毒。将浸渗的种子和一些水放入容器中。在混合之前任选地去除种皮。将浸渗的种子使用搅拌机以18,000rpm的速度进行切割。用筛子分离大小合适的外植体。将外植体浸渗到土壤杆菌悬浮液中接种约2小时，但预计5分钟至6小时的接种就足够了。[0076](5)共培养[0077]a.接种后，用滴管或移液管从外植体除去土壤杆菌悬液。将外植体转移到共培养培养基板(1/2ms培养基，含有0.5mg/l bap、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、4g/l mes、200μm、1mg/l硝酸银、7g/l琼脂，ph 5.4)(在培养基顶部放一张滤纸)，或转移到用液体共培养培养基(1/4ms培养基，含有0.25mg/l bap、10g/l蔗糖、5g/l葡萄糖、2g/l mes、100μm乙酰丁香酮、0.5mg/l硝酸银，ph 5.4)浸泡过的滤纸。外植体均匀分散在培养基上。将板用封口膜密封并在黑暗中在22℃下孵育2-3天。[0078](6)复苏[0079]a.将外植体转移至复苏培养基(ms培养基，含有20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、1mg/l玉米素、0.01mg/l iaa、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、10g/l琼脂，ph 5.8)。将外植体在25℃在黑暗中培养4天。[0080](7)选择1[0081]a.将外植体转移至选择培养基1(ms培养基，含有1x b5维生素、30g/l蔗糖、1mg/l玉米素、0.01mg/l iaa、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、10g/l琼脂，ph 5.8，具有对应于选择性标记的选择剂，例如，壮观霉素100mg/l或草甘膦)。将外植体在25℃16小时/8小时(光照/黑暗)下培养3周。[0082](8)选择2[0083]a.将带有绿芽的外植体转移到选择培养基2(ms培养基，含有1x b5维生素、30g/l蔗糖、0.2mg/l玉米素、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、10g/l琼脂，ph 5.8，具有对应于选择性标记的选择剂，例如100mg/l壮观霉素或草甘膦)。将外植体在25℃下保持16小时/8小时(光照/黑暗)。每3周将外植体传代到新的选择培养基2中，必要时继续传代[0084](9)生根[0085]a.将选定的绿芽转移到生根培养基(ms培养基，含有0.1g/l肌醇、1mg/l硫胺素、0.5mg/l吡哆醇、0.5mg/l烟酸、1mg/l甘氨酸、10g/l蔗糖、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、8g/l琼脂，ph 5.8)。将芽在24℃-25℃保持16小时/8小时(光照/黑暗)以促进生根。[0086]以下实例中使用的载体如下：[0087][0088][0089]以下方案描述了以下实例的植物材料的收集和分析：[0090]植物叶片材料和基因组dna提取[0091]每株植物收集两个叶圆片并放入96孔块中。基因组dna按照promega公司的magbeads植物基因组提取方案进行提取。[0092]测定设计和qpcr[0093]针对载体中存在的选择性标记的编码序列将测定使用primer express 3.0(生命技术公司(life technologies,inc.))设计为用于检测提取的基因组dna中载体序列的存在。用番茄基因组数据库对扩增子进行blast测序，以确保测定特异性。引物和探针购自生命技术公司。[0094]每个25μl qpcr反应包含12.5μl 2x sigma jumpstart主混合物(master mix)(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich corporation)，p2893)、5μl dna、0.5μl测定(最终浓度：引物300nm，和探针100nm)和6.5μl水。qpcr在abi 7900ht实时pcr系统中在如下条件下进行：95℃持续5min；40个循环，为95℃持续5sec然后60℃持续30sec。[0095]数据分析[0096]使用sds 2.4软件分析数据。循环阈值(ct)是通过选择阈值线生成的，该阈值线位于所有扩增图的指数扩增区域，并且明显高于背景荧光且高于可以观察到重复之间的分裂或分叉效应的水平。基线设置在比阈值线与第一条扩增曲线交叉的循环数早三到五个循环的循环数(例如，最早的ct＝24，将基线交叉设置在ct＝24-3＝21)。[0097]实例2：来自番茄的浸渗1天的种子和浸渗7天的种苗的外植体的转化[0098]使用的品种：赚钱宝(moneymaker)[0099]使用的载体：24416[0100]来自授粉后至少14天、浸渗1天的种子的外植体转化程序如实例1中描述的。[0101]来自7天种苗的外植体转化程序：[0102]1.种子消毒：如实例1中描述的。[0103]2.种子浸渗：将经消毒的种子转移到装有适量发芽培养基(0.5x ms培养基，含有10g/l蔗糖、10g/l植物凝胶(phytagel)，ph5.8)的生长容器中。将种子在25℃下保持16小时/8小时(光照/黑暗)持续7天。[0104]3.土壤杆菌：如实例1所述制备土壤杆菌悬浮液。[0105]4.外植体准备和感染：将下胚轴和子叶切成约5mm长的节段。将这些节段接种在土壤杆菌悬浮液中约5分钟。[0106]5.共培养：如实例1中描述的。[0107]6.复苏：如实例1中描述的。[0108]7.选择1：如实例1中描述的。[0109]8.选择2：如实例1中描述的。[0110]9.生根：如实例1中描述的。[0111]转化结果如下表所示。转化频率(tf)等于确认阳性植物的数量除以转化开始时的外植体总数，再乘以100即可获得百分比。[0112]表1.转化效率[0113][0114][0115]表2.从7天种苗外植体复苏的异常倍性植物的大％[0116][0117]表3.来自在水中和固体发芽培养基上浸渗1天的种子的外植体的比较[0118][0119]实例3：不同外植体类型的转化[0120]使用的品种：先正达品种1[0121]使用的载体：24133[0122]外植体来源：授粉后至少14天、浸渗1天的番茄种子[0123]如实例1中描述的进行转化程序。[0124]表4.结果[0125][0126]实例4：不同来源的外植体的转化[0127]使用的品种：先正达品种1[0128]使用的载体：24133[0129]如实例1中描述的进行转化程序。[0130]表5.结果[0131][0132]实例5：使用不同的选择剂进行转化[0133]外植体来源：授粉后至少14天、浸渗1天的番茄种子如实例1中描述的进行转化程序。[0134]表6.结果[0135][0136]实例6：具有不同遗传背景的多个品种的转化[0137]使用的载体：24133[0138]外植体来源：授粉后至少14天、浸渗1天的番茄种子[0139]如实例1中描述的进行转化程序。表7中的结果表明，该转化方法适用于具有不同遗传背景的几个品种。[0140]表7.结果[0141][0142]实例7：浸渗1天的西瓜种子转化[0143]外植体来源：授粉后至少14天、浸渗1天的西瓜种子[0144]以下是用于西瓜的实例转化过程。[0145]1.种子消毒：去除种皮。用15％clorox+0.1％ul tween 20消毒15min，然后用无菌水洗涤》3次。[0146]2.种子浸渗：如实例1中描述的，持续1天。[0147]3.土壤杆菌：如实例1中描述的。[0148]4.外植体准备和感染：除以下内容外，如实例1中描述的。将胚轴和子叶分开。将子叶接种在土壤杆菌悬浮液(od＝0.5)中至少2小时。[0149]5.共培养：除以下内容外，如实例1中描述的。接种后，将外植体转移到共培养培养基中，用封口膜密封培养皿。共培养培养基为带滤纸的空培养皿，并添加了1ml液体共培养培养基。在22℃保持在黑暗中持续3天。[0150]6.复苏：共培养后，将外植体转移至复苏培养基(ms培养基，含有1x b5维生素、1x ms铁、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.01mg/l iaa、2mg/l玉米素、1mg/l bap、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、10g/l琼脂，ph＝5.8)。在25℃保持在黑暗中持续4天[0151]7.选择1：复苏后，转移至选择培养基(ms培养基，含有1x b5维生素、1x ms铁、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.01mg/l iaa、2mg/l玉米素、1mg/l bap、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、150mg/l壮观霉素、10g/l琼脂，ph＝5.8)。在25℃下保持16小时/8小时(光照/黑暗)持续约14天。然后传代到新的选择培养基中，并在25℃下保持16小时/8小时(光照/黑暗)持续约21天。[0152]8.选择2：选择1后，转移至选择培养基(ms培养基，含有1x b5维生素、1x ms铁、30g/l蔗糖、0.2mg/l激动素、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、150mg/l壮观霉素、10g/l琼脂，ph＝5.8)并在25℃下保持16小时/8小时光照/黑暗约14天。[0153]9.生根：将再生的芽转移到盆中新的生根培养基(ms基础盐和维生素，加上1x b5维生素，加上1x ms铁、30g/l蔗糖、0.2mg/l激动素、0.2mg/l naa、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、150mg/l壮观霉素、10g/l琼脂，ph＝5.8)中，用于生根。[0154]表8.结果[0155][0156]实例7：番茄的基因枪转化[0157]使用的品种：阿里萨克莱格[0158]使用的载体：线性化片段包含选择性标记和来自24133的gus报告基因盒[0159]外植体来源：浸渗1天的种子[0160]以下是番茄基因枪转化的实例。[0161]1.种子消毒：如实例1中描述的。[0162]2.种子浸渗：如实例1中描述的，在发芽培养基中[0163]3.外植体准备：割开种子并分离对半分的胚。将胚切成块，用作外植体。将外植体转移至渗透培养基(osmotic medium)(ms培养基，含有1x ms铁、30g/l蔗糖、60g/l甘露醇、10g/l琼脂，ph＝5.8)。每个渗透培养基板包含来自20粒种子的外植体。将外植体重新排列到渗透培养基板的中心，不要重叠。将外植体在25℃保持在黑暗中持续4-8小时。[0164]4.金颗粒制备：将dna包覆到金颗粒上的方法遵循sanford等人(1992)。将2mg 0.6μm的金颗粒用1ml无水乙醇超声洗涤，然后替换为ddh2o并在试管中再次超声处理。沉淀目标并完全除去水分后，将金悬浮在50μl h2o中。将0.6pmol dna、250μl cacl2(2.5m)和50μl亚精胺(0.1m)添加到金悬浮液中，并用水调节至最终500μl的体积。轻轻混合并在冰上保持》30min。离心沉淀金并去除上清液，用1ml乙醇洗涤dna包覆的金两次。将金重悬于60μl乙醇中。重悬金粒子，并将悬浮液转移到微载体以进行基因枪转化[0165]5.基因枪：使用的基因枪粒子递送系统的类型：bio-rad，pds-1000。停止筛(stop screen)和外植体之间的距离设置为6cm，压力设置为1100psi，真空设置为28英寸汞柱。每个板发射一次。[0166]6.基因枪法后：将外植体保持在渗透培养基上过夜。然后在1ml液体1/4ms培养基(1/4ms培养基，含有1mg/l玉米素、10g/l蔗糖、5g/l葡萄糖、2g/l mes、20mg/l乙酰丁香酮、0.5mg/l硝酸银)中洗涤。将外植体转移到复苏培养基(ms培养基，含有1x ms铁、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、10g/l聚乙烯吡咯烷酮、1mg/l玉米素、0.01mg/l iaa、150mg/l特美汀、150mg/l羧苄青霉素、10g/l琼脂)。将外植体在25℃保持在黑暗中持续4天[0167]7.选择1：如实例1中描述的。[0168]8.选择2：如实例1中描述的。[0169]9.生根：如实例1中描述的。[0170]表9.结果[0171][0172]实例8：用于转化的机械制备外植体[0173]使用的品种：阿里萨克莱格[0174]外植体类型：混合[0175]使用的载体：24416[0176]转化过程是如实例1中描述的，外植体制备方法除外且如下所述。[0177]表10.切割方法和结果[0178][0179]实例9：使用从成熟番茄果实收获的新鲜种子作为外植体来源[0180]品种先正达品种1[0181]外植体类型：混合[0182]使用的载体：24133[0183]描述了从新鲜种子转化外植体的过程：[0184]1.从温室中生长的植物收获成熟的果实。[0185]2.成熟果实的表面用高温金属工具消毒。具体而言，将勺子放入干燥的灭菌器(250℃)中。1-2分钟后，用热勺压在番茄果实表面。重复几次。[0186]3.切开经消毒菌的表面，用勺子取出新鲜种子。[0187]4.将新鲜种子切成小外植体，去除种皮进行接种。[0188]5.将外植体接种在土壤杆菌悬浮液中0.5-1小时，并完全去除土壤杆菌悬浮液。[0189]6.添加灭菌滤纸到固体共培养板，并将外植体转移至板中且在滤纸上在22℃保持在黑暗中共培养2天。[0190]7.其他步骤与实例1中描述的相同。[0191]表11.结果[0192][0193]参考文献[0194]us 5422259 a[0195]us 5986181 a[0196]wo 0113707 a1[0197]us 2002157139 a1[0198]ellul,p.,garcia-sogo,b.,pineda,b.,rios,g.,roig,l.a.and moreno,v.(2003)the ploidy level of transgenic plants in agrobacterium-mediated transformation of tomato cotyledons(lycopersicon esculentum mill.)is genotype and procedure dependent[corrected].theor appl genet,106,231-238.[0199]sigareva,m.,spivey,r.,willits,m.g.,kramer,c.m.and chang,y.f.(2004)an efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants.plant cell rep,23,236-245.









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